PRODUKSI DAN KARAKTERISASI α-AMILASE REKOMBINAN Bacillus licheniformis PADA Saccharomyces cerevisiae
SKRIPSI
OZI JUMADILA 10504065
PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2008
PRODUKSI DAN KARAKTERISASI α-AMILASE REKOMBINAN Bacillus licheniformis PADA Saccharomyces cerevisiae
(PRODUCTION AND CHARACTERIZATION OF RECOMBINANT α-AMYLASE Bacillus licheniformis IN Saccharomyces cerevisiae)
SKRIPSI OZI JUMADILA 10504065
PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2008
Abstract α-Amylase catalyses hydrolysis of α-1,4-glicosidic linkages of starch producing oligosaccharide, dextrin, and glucose. α-Amylase has wide applications, such as in food industry, textil, detergent, and pharmaceutical. The aims of this research were to produce and to characterize recombinant thermostable α-amylase from local strain Bacillus licheniformis expressed in Saccharomyces cerevisiae. The recombinant α-amylase has an optimum temperature of 70°C and has an optimum pH of 8. The molecular weight of this enzyme is about 68 kDa. This recombinant α-amylase is an endoenzyme indicated by the hydrolysis products of maltose (G2), maltotriose (G3), and maltopentaose (G5). Key words : α-Amylase, Bacillus licheniformis, recombinant, Saccharomyces cerevisiae, thermostable.
ii
Abstrak α-Amilase mengkatalisis hidrolisis ikatan glikosidik α-1,4 pada pati menghasilkan oligosakarida, dektrin, dan glukosa. α-Amilase memiliki aplikasi yang luas, seperti pada industri makanan, tekstil, deterjen, dan biomedis. Tujuan dari penelitian adalah melakukan produksi dan karakterisasi α-amilase termostabil rekombinan dari Bacillus licheniformis galur lokal yang diekspresikan dalam ragi Saccharomyces cerevisiae. α-Amilase rekombinan ini memiliki suhu optimum pada 70°C dan memiliki pH optimum 8. Massa molekul enzim rekombinan ini adalah sekitar 68 kDa. α-Amilase rekombinan ini bersifat endoenzim diindikasikan dengan produk hidrolisisnya berupa maltosa (G2), maltotriosa (G3), dan maltopentaosa (G5). Kata kunci : α-Amilase, Bacillus licheniformis, rekombinan, Saccharomyces cerevisiae, termostabil.
iii
Program Studi Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Bandung
Menerangkan bahwa Skripsi yang disusun oleh: Nama : Ozi Jumadila NIM : 10504065
telah disetujui sebagai persyaratan untuk mendapatkan gelar Sarjana Kimia
Bandung,
Juni 2008
Pembimbing
Dessy Natalia Ph.D NIP. 131923763
iv
”Sesungguhnya dalam penciptaan langit dan bumi, silih bergantinya malam dan siang, bahtera yang berlayar di laut membawa apa yang berguna bagi manusia, dan apa yang Allah turunkan dari langit berupa air, lalu dengan air itu Dia hidupkan bumi sesudah mati (kering)nya dan Dia sebarkan di bumi itu segala jenis hewan, dan pengisaran angin dan awan yang dikendalikan antara langit dan bumi, sungguh (terdapat) tandatanda (keesaan dan kebesaran Allah) bagi kaum yang memikirkan.” (Al-Baqarah: 164)
Untuk Ama, Apa, Uni, Uda, Ari, dan Gitti tercinta...
v
Ucapan Terima Kasih Puji syukur Alhamdulillah kehadirat Allah SWT atas segala nikmat dan anugerah-Nya yang selalu menyertai hingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Shalawat dan salam kepada Rasulullah SAW atas tuntunnannya kepada umat manusia. Penulis ingin mengucapkan terima kasih atas bantuan dan dukungan selama menyelesaikan skripsi ini kepada: 1. Ibu Dessy Natalia Ph.D atas segala bimbingan, ilmu yang diberikan, waktu yang telah dihabiskan untuk penulis, nasehat, dan kesabaran selama penulis mengerjakan penelitian tugas akhir dan penulisan skripsi. 2. Bapak Dr. Bambang Ariwahjoedi, sebagai dosen wali selama dua tahun di Kimia ITB, atas segala kebaikan, bantuan, dan perhatiannya. 3. Ibu Dra. Samitha Dewi Djayanti, selaku dosen wali selama penulis kuliah di tahun ketiga, atas ilmu, motivasi, dan nasehat kepada penulis. 4. Seluruh Dosen Kimia ITB, atas ilmu dan didikan yang telah diberikan selama empat tahun. 5. Orang tua (Ama dan Apa) dan saudara-saudara tercinta (Uni Onna, Uda Boni, Ari, dan Gitti), atas segala doa, kasih sayang yang selalu diberikan, nasehat, semangat, pengorbanan, dan perhatian yang selalu membangkitkan semangat penulis selama berkuliah di Kimia ITB dan selama penyelesaian tugas akhir. 6. Ni Jay, Ni Chinq, Momoy, Susuak, dan Widya, teman-teman serumah di Bandung, atas segala kegembiraan, kebersamaan, dan semangat yang diberikan. 7. Tina, Putri, Ria, Indah, dan MegaA., atas segala suka cita, keceriaan, kebersamaan, dukungan, dan waktu-waktu indahnya. 8. Rian, Septin, Edu, Edo, Teh Frisda, dan Dini atas suka duka selama bekerja di Laboratorium Biokimia, kebersamaan, pertolongan, dan semangat untuk penulis.
vi
9. Kang Iman P., Kang Iman N., Teh Tina, Bu Fe, Mas Tunjung, Teh Anna, Kang Keni, Teh Dian, Teh Inda, Dini, linda, Teh Indi, Teh Dwita dan teman-teman KK Biokimia atas segala bantuan dan semangatnya. 10. Teman-teman Kimia ITB angkatan 2004 atas segala kebersamaan, saat-saat berkesan, dan segala suka-duka yang telah kita lewati. 11. Teh Alia dan Teh Rahma atas seluruh saat indah selama mentoring, pengalaman, dan nasehat yang diberikan. 12. Seluruh teman-teman di HMK ’Amisca’ ITB atas pengalaman-pengalaman yang sangat berkesan, serta pembelajaran yang sangat berharga. 13. Pak Yayat, Pak Dadan, Pak Edi dan seluruh petugas laboratorium biokimia atas segala bantuannya. 14. Seluruh Karyawan Prodi Kimia ITB atas segala pertolongan yang diberikan. 15. Dan semua pihak yang turut membantu atas segala bantuannya.
Mudah-mudahan semua amal kebaikan yang telah diberikan mendapat balasan yang lebih baik dari Allah SWT. Penulis meminta maaf bila ada perbuatan dan kata-kata penulis yang tidak berkenan. Semoga skripsi ini bermanfaat bagi yang membacanya, walaupun penulis menyadari bahwa skripsi memiliki kekurangan. Untuk itu penulis mengharapkan saran dan kritik dari pembaca. Terima kasih.
Bandung, Juni 2008 Penulis
vii
Daftar Isi ABSTRACT ................................................................................................................ ii ABSTRAK ................................................................................................................ iii UCAPAN TERIMA KASIH....................................................................................... vi DAFTAR ISI............................................................................................................. viii DAFTAR GAMBAR ................................................................................................... x DAFTAR LAMPIRAN............................................................................................... xi 1 PENDAHULUAN ................................................................................................... 1 2 TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................................... 3 2.1 Bioteknologi Enzim ........................................................................................... 3 2.2 α-Amilase sebagai Enzim Pendegradasi Pati ..................................................... 4 2.3 Aplikasi α-Amilase dalam Industri .................................................................... 4 2.4 Mekanisme Katalitik α-Amilase ........................................................................ 6 2.5 Pati ..................................................................................................................... 7 2.6 Saccharomyces cerevisiae sebagai Vektor Rekayasa Metabolisme .................. 9 2.7 α-Amilase Termostabil B. licheniformis .......................................................... 10 2.8 Struktur α-Amilase B. licheniformis ................................................................ 11 2.9 Stabilitas Termal α-Amilase B. licheniformis.................................................. 12 3 PERCOBAAN ....................................................................................................... 14 3.1 Tempat dan Bahan Penelitian .......................................................................... 14 3.2 Peralatan........................................................................................................... 14 3.3 Cara Kerja ........................................................................................................ 15 3.3.1 Peremajaan Kultur S. cerevisiae [YEp-bla] dan Penyiapan Inokulum pada Media YNB .................................................................................................. 15 3.3.2 Uji Kualitatif Aktivitas α-Amilase Rekombinan ......................................... 16 3.3.3 Optimasi Kadar Penginduksi untuk Produksi α-Amilase Rekombinan....... 16 3.3.4 Produksi α-Amilase Rekombinan ................................................................ 16
viii
3.3.5 Fraksinasi Ammonium Sulfat dan Dialisis .................................................. 17 3.3.6 Penentuan Massa Molekul α-Amilase Rekombinan dengan SDS-PAGE ... 17 3.3.7 Penentuan Suhu Optimum α-Amilase Rekombinan .................................... 18 3.3.8 Penentuan Suhu Optimum α-Amilase Rekombinan .................................... 18 3.3.9 Penentuan KM dan Vmaks Kinetika Reaksi α-Amilase Rekombinan............. 19 3.3.10 Analisis Produk Hidrolisis α-Amilase dengan TLC .................................... 19 4 HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................................................. 20 4.1 Uji Kualitatif Aktivitas α-Amilase Rekombinan dari B. licheniformis pada S. cerevisiae……………………………..…………………………………….20 4.2 Optimasi Kadar Penginduksi untuk Produksi α-Amilase Rekombinan........... 21 4.3 Produksi α-Amilase Rekombinan dan Fraksinasi Ammonium Sulfat ............. 22 4.4 SDS-PAGE α-Amilase Rekombinan ............................................................... 23 4.5 Penentuan Suhu Optimum α-Amilase Rekombinan ........................................ 24 4.6 Penentuan pH Optimum α-Amilase Rekombinan............................................ 25 4.7 Penentuan KM dan Vmaks Kinetika Reaksi α-Amilase Rekombinan................. 25 4.8 Analisis Produk Hidrolisis α-Amilase Rekombinan dengan TLC................... 26 5 KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................................. 29 5.1 Kesimpulan ...................................................................................................... 29 5.2 Saran ................................................................................................................ 29 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................ 30 LAMPIRAN .............................................................................................................. 35
ix
Daftar Gambar Gambar 2.1 Mekanisme perpindahan ganda dan pembentukan intermediet kovalen.. 7 Gambar 2.2 Struktur amilosa dan amilopektin molekul pati ....................................... 9 Gambar 2.3 Analisis S1 yang relatif terhadap α-amilase dan upstream RNAs ......... 11 Gambar 2.4 Struktur tersier α-amilase Bacillus licheniformis (BLA) ....................... 12 Gambar 2.5 Struktur BLA dengan kompleks ion logam dan desakarida................... 13 Gambar 4.1 Uji kualitatif aktivitas α-amilase rekombinan........................................ 21 Gambar 4.2 Aktivitas α-amilase rekombinan dengan variasi kadar galaktosa .......... 22 Gambar 4.3 Gel elektroforesis SDS-PAGE α-amilase rekombinan .......................... 23 Gambar 4.4 Aktivitas α-amilase rekombinan terhadap suhu ..................................... 24 Gambar 4.5 Aktivitas α-amilase rekombinan terhadap pH........................................ 25 Gambar 4.6 Kurva 1/v terhadap 1/[pati] kinetika reaksi α-amilase rekombinan....... 26 Gambar 4.7 Analisis kromatografi produk hidrolisis pati.......................................... 27
x
Daftar Lampiran Lampiran A Data Optimasi Penginduksi untuk Produksi α-Amilase Rekombinan... 35 Lampiran B Uji Kadar Protein dengan Metode Bradford ........................................ 37 Lampiran C Data Aktivitas α-Amilase Rekombinan pada Penentuan Suhu dan pH Optimum ............................................................................................... 38 Lampiran D Data Penentuan KM dan Vmaks α-Amilase Rekombinan ........................ 39
xi
