LAPORAN AKHIR PENGANTAR PENELITIAN BIOKIMIA BAGIAN ENZIM
ISOLASI DAN KARAKTERISASI INVERTASE DARI RAGI KOMERSIAL (Saccharomyces cerevisiae)
KARTIKA NURFADHILAH (G84120034)
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR Usulan Penelitian BOGOR 2015
i
ABSTRAK Protein enzim yang disekresikan oleh ragi salah satunya adalah invertase. Enzim invertase termasuk ke dalam kelompok enzim hidrolase dengan sukrosa sebagai substratnya. Praktikum ini bertujuan ekstraksi, isolasi dan karakterisasi aktivitas (unit aktivitas, aktivitas spesifik) fraksi protein invertase dan penentuan bobot molekul protein invertase dari ragi komersial fermipan (Saccharomyces cerevisiae) menggunakan teknik SDS-PAGE. Enzim diisolasi dengan melisiskan sel menggunakan metode solid shear mechanic dan didapat 5 fraksi (fraksi kasar, 0-20%, 20-40%, 40-60%, 60-80%). Setiap fraksi ditentukan aktivitas menggunakan metode Folin Wu dan protein dengan metode Lowry. Unit aktivitas tertinggi diperoleh pada fraksi 0-20% sebesar 10.106 unit/mL, aktivitas spesifik tertinggi pada fraksi 0-20% sebesar 11.917 unit/mg. Yield enzim sebesar 40.67% pada fraksi 0-20% dan fold purification sebesar 7.604 unit/mg dan 0.308 unit/mg pada fraksi 0-20%. Bobot molekul invertase percobaan menggunakan SDS PAGE 142.233 kDa dan 134.598 kDa. Kata kunci: Folin Wu, invertase, Lowry, Saccharomyces cerevisiae, SDS-PAGE,
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN
iii iii iii
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan dan Alat
2
Prosedur
2
HASIL DAN PEMBAHASAN
4
Hasil
9
Pembahasan
9
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN
13 13 14 14 16
DAFTAR LAMPIRAN
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Diagram alir ekstraksi dan isolasi invertase Volume fraksinasi invertase ragi Pembacaan absorbansi deret standar aktivitas invertase Kurva standar glukosa aktivitas protein invertase Pembacaan absorbansi sampel metode Folin Wu Pembacaan absorbansi deret standar aktivitas spesifik invertase Kurva standar BSA Pembacaan absorbansi sampel konsentrasi protein Lowry Karakterisasi enzim invertase SDS PAGE hasil percobaaan Bobot molekul marker denganmetode SDS-PAGE Kurva standar bobot molekul marker Bobot molekul sampel T1 menggunakan SDS-PAGE Bobot molekul sampel T1 menggunakan SDS PAGE Parameter isolasi protein invertase ragi komersial
17 18 18 18 19 19 20 20 20 21 21 21 21 22
1
PENDAHULUAN Berbagai manfaat mikroorganisme telah diketahui melalui berbagai studi penelitian maupun pustaka. Salah satu mikroorganisme yang telah diidentifikasi, dikarakterisasi adalah Saccharomyces cerevisiae yang lebih umum dikenal ragi (yeast). Ragi (yeast) merupakan mikroorganisme eukariot uniselular. Genus Saccharomyces memiliki 14 spesies diantaranya adalah Saccharomyces cariocanus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces mikatae, Saccharomyces kudriavzevii, Saccharomyces paradoxus , dan Saccharomyces pastorianus. Sel Saccharomyces cerevisiae berkembangbiak secara pembelahan vegetatif (Rastall 2009). Manfaat ragi adalah produksi produk minuman fermentasi (wine dan bir), produk roti, pengolahan limbah makanan, produksi komponen makanan probiotik, dan produksi industri etanol (Stewart 2014). Saccharomyces cerevisiae dapat berfungsi sebagai agen bioremediasi. Bioremediasi adalah penggunaan organism untuk membersihkan lingkungan tercemar polutan. Saccharomyces cerevisiae dapat menyerap berbagai logam berat seperti Cu, Cd, Zn, Ag, Co dan Au (Gandjar 2006), serta penggunaan spesies tersebut dalam industri etanol pada berbagai negara di dunia seperti Brasil, Afrika Selatan dan Amerika Serikat. Hal ini disebabkan Saccharomyces cerevisiae dapat memproduksi etanol dalam jumlah besar dan toleransi terhadap alkohol tinggi (Elsevri dan Putra 2006). Manfaat Saccharomyces cerevisiae dalam bidang biologi molekular diantaranya sebagai sistem model analisis biologi molekular dan genetik yang digunakan sebagai mekanisme dasar selular pada organisme eukariot sederhana yang dapat dianalogikan pada organisme tinggi seperti mamalia (Rastall 2009). Karakteristik biokimia Saccharomyces cerevisiae adalah sebagai spesies fermentatif selain itu kemampuan spesies ini adalah mampu memfermentasi gula heksosa seperti D-glukosa, D-fruktosa, dan D-manosa namun laju fermentasi terbesar adalah menggunakan D-glukosa. Selain mampu memfermentasi glukosa, Saccharomyces cerevisiae dapat memfermentasi sukrosa, maltosa, maltotriosa dan D-galaktosa. Fermentasi dekstrin dan pati difermentasi oleh galur lain yaitu Saccharomyces diastaticus (Stewart 2014). Oleh karena itu, ragi akan mensekresikan protein dalam bentuk aktif yaitu enzim untuk mencerna substrat berukuran besar yang akan digunakan sebagai bahan fermentasi di dalam sel. Enzim adalah protein yang mempunyai aktivitas katalis, sebagai protein transpor untuk membawa molekul atau ion spesifik sebagai protein nutrien dan penyimpan ferritin yang merupakan protein penyimpan besi, sebagai protein kontraktil yang memberikan kemampuan kepada sel dan organisme untuk berkontraksi, mengubah bentuk dan bergerak, pembentuk struktural sel, dan pengatur aktivitas fisiologis dan seluler (Stansfield et.al 2003). Protein enzim yang disekresikan oleh ragi salah satunya adalah invertase. Invertase disandikan oleh kelopok family gen SUC yang melibatkan enam struktur sandi gen invertase yaitu SUC1, SUC2, SUC3, SUC4, SUC5 dan SUC7. Keenam sandi gen tersebut terletak dalam kromosom terpisah. Enzim invertase termasuk ke dalam kelompok enzim hidrolase. Enzim hidrolase merupakan enzim pengolahan pangan karena mengkatalisis reaksi hidrolisis substrat dengan adanya air, dan terjadi perubahan arah putaran optik (invertasi). Enzim invertase mengkatalisis substrat berupa
sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa (Heslot dan Gailardin 1991). Sumber enzim invertase adalah Saccharmoyces cerevisiae dan Saccharomyces calrbengensis. Invertase merupakan enzim ekstraselular. Keaktifan invertase dapat diukur dengan berbagai cara seperti perubahan arah rotasi optik substrat, penentuan gula tereduksi yang terbentuk dan kadar glukosa yang dihasilkan oleh invertase (Hasanah dan Putra 2010). Tujuan praktikum adalah ekstraksi, isolasi dan karakterisasi aktivitas (unit aktivitas, aktivitas spesifik) fraksi protein invertase dan penentuan bobot molekul protein invertase dari ragi komersial fermipan (Saccharomyces cerevisiae) menggunakan teknik SDS-PAGE. Manfaat praktikum diantaranya adalah mahasiswa dapat mengekstraksi protein invertase dari ragi serta menentukan unit aktivitas, aktivitas spesifik, derajat pemurnian protein isolasi) dan melatih penggunaan teknik SDS-PAGE dalam menentukan bobot molekul protein.
METODE Waktu dan Tempat Praktikum Praktikum ini dilakukan di Laboratorium Pendidikan Biokimia, Fakultas Matemtika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor dari tanggal 26 Februari hingga 7 April 2015. Waktu praktikum dilaksanakan pada pukul 10.0013.00. Bahan dan Alat Alat-alat yang digunakan adalah mortar, sentrifus Beckman J20, rotor SS34, pipet Pasteur, bulb, tabung sentrifus 50 mL, gelas ukur, gelas piala 600 mL dan 100 mL, tabung reaksi, penangas air, vortex, spektrofotometer mikro, stopwatch, mikropipet, gelas ukur, pipet kaca, syringe, seperangkat peralatan SDS PAGE. Bahan-bahan yang digunakan adalah ragi komersial fermipan (Saccharomyces cerevisiae), pasir kuarsa, toluena, akuades, asam asetat 1 N, padatan amonium sulfat, larutan standar glukosa, larutan sukrosa, reagen Folin Wu (kupritartat dan fosfomolibdat), fraksi enzim invertase, larutan monomer akrilamida (30% b/v), buffer running gel (1.5 M Tris-HCl pH 8.8), 10% SDS, amonium persulfat, 20% v/v gliserol, tank buffer (0.025 M Tris, 0.192 M glisina, 0.1% SDS, pH 8.3), air jenuh n-butanol, larutan pewarna coomasive brilliant blue, dan TEMED. Prosedur Penelitian Ekstraksi invertase ragi komersial Pembuatan ekstrak invertase ragi komersial dilakukan dengan penghancuran sel ragi terlebih dahulu. Sebanyak 10 g ragi komersil ditimbang sebanyak duplo kemudian dimasukkan ke dalam mortar yang telah diisi pasir kuarsa 2-3 g kemudian 10 mL toluena ditambahkan dan ragi digerus perlahingga
3
terbentuk pasta. Sebanyak 30 mL akuades ditambahkan bertahap selama 30 menit kemudian dipindahkan ke dalam tabung sentrifus. Pasta ragi disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 15 menit. Pelet dan supernatan dipisahkan, supernatan dimasukkan ke dalam tabung sementara sebanyak 5 mL alikuot diambil dari fraksi supernatan sebagai ekstrak kasar (crude ekstract). Sisa supernatan dimasukkan kembali ke dalam tabung sentrifugasi untuk persiapan fraksinasi ekstrak invertase ragi. Fraksinasi ekstrak invertase ragi Fraksinasi ekstrak invertase ragi dilakukan menggunakan metode pengendapan amonium sulfat. Fraksi dibuat menjadi 4 fraksi yaitu 0-20%, 2040%, 40-60% dan 60-80%. Amonium sulfat terlebih dahulu digerus untuk menghaluskan padatan. Supernatan yang terbentuk dari sentrifugasi sisa volume supernatan ekstrak kasar dipisahkan dari pelet, kemudian diukur volume supernatan sebagai perbandingan rasio jumlah amonium sulfat yang harus ditambahkan. Supernatan yang telah diukur dipindahkan ke dalam gelas kemudian ditambahkan amonium sulfat sejumlah volume terukur, diaduk tanpa menimbulkan busa. Pengerjaan fraksinasi ekstrak invertase selalu dilakukan dalam keadaan suhu rendah. Supernatan yang telah ditambahkan amonium sulfat hingga jenuh serta didiamkan selama 10 menit kemudian disentrifugasi kembali pada kecepatan 12000 rpm selama 15 menit untuk memperoleh fraksi supernatan untuk fraksi amonium sulfat berikutnya, sementara pelet yang terbentuk disuspensikan kembali menggunakan 2 mL buffer Tris-HCl pH 7.3. Jumlah amonium sulfat ditambahkan = Uji aktivitas invertase ragi dengan metode Folin Wu ` Aktivitas fraksi invertase ragi ditentukan melalui metode Folin Wu pada berbagai fraksi pengendapan amonium sulfat. Kurva standar dibuat dengan standar glukosa (ekivalen dengan produk enzim menghidrolisis sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa. Konsentrasi glukosa yang ditambahkan untuk membuat kurva standar adalah 50 ul, 75 ul, 100 ul, 125 ul, 150 ul, 175 ul dan 200 ul dengan penambahan akuades hingga volume total 500 ul, kemudan ditambahkan kupritartrat 500 ul dan fosfomolibdat 0.5 mL. Selain, dibuat blanko spektro dari standar glukosa yaitu blanko aktivitas deengan komposisi 100 ul sukrosa, kupri-tartrat 0.5 mL dan fraksi protein invertase yang telah dipanaskan 0.4 mL kemudian ditambahkan fosfomolibdat 0.5 mL. Fraksi sampel diencerkan terlebih dahulu hingga 100x kemudian masingmasing fraksi ditambahkan 400 ul ke dalam tabung efendorf berisi sukrosa 100 ul, kemudian diinkubasi selama 10 menit lalu ditambahkan kupri-tartrat 500 ul dalam penangas setelah dingin sampel ditambahkan fosfomolibdat 0.5 mL. Seluruh sampel (blanko, blanko aktivitas, fraksi) diukur absorbansi pada panjang gelombang 660 nm. Aktivitas unit (IU) =
Penentuan kadar protein dengan metode Lowry Penentuan kadar protein menggunakan metode Lowry digunakan standar BSA sebanyak 1000 ug/mL. Pembuatan kurva standar dilakukan dengan menambahkan variasi volume standar BSA dan akuades dengan volume total 250 ul (0:250 ul, 25 ul:225 ul, 75:175ul, 100 ul:150 ul, 125:125 ul, 150:100 ul). Variasi konsentrasi standar kemudian ditambahkan reagen C dan reagen D 2.5 mL secara bersamaan pada selang waktu 1 menit. Untuk sampel, fraksi sampel dari ekstrak kasar hingga fraksi 60-80% diencerkan hingga 50 faktor pengenceran. Masing-masing sampel kemudian dipindahkan secara duplo ke dalam tabung efendorf 250 ul, kemudian ditambahkan reagen C dan reagen D secara bersamaan dalam selang waktu 1 menit. Seluruh sampel dan standar diinkubasi selama 30 menit dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 700 nm. Kadar protein dinyatakan dalam miligram per mililiter. Aktivitas spesifik = Prediksi BM enzim invertase menggunakan SDS PAGE Pembuatan gel poliakrilamda dengan konsentrasi gel 12% untuk running gel sedangkan stacking gel dengan ketebalan 0.75 mm. Pembuatan running gel diantaranya menambahkan 4 mL larutan monomer akrilamida, 4x running buffer pH 8.8 760 ul, 10% SDS 200 ul, ddH2O 3.2 mL, 100 ul 10% amonium persulfat dan 6 ul TEMED. Larutan running gel kemudian dicetak ke dalam plat kaca menggunakan syringe lalu di atas larutan running gel ditambahkan akuades dan ditunggu hingga mengeras. Larutan stacking gel dibuat dengan menambahkan 1 mL larutan monomer akrilamida, 2.6 mL 4x stacking buffer pH 6.81, 1200 ul 10% SDS, 4.2 mL ddH2O, 60 ul 10% amonium persulfat dan 6 ul TEMED. Larutan stacking gel ditambahkan di atas running gel yang telah mengeras kemudian dipasang cetakan sumur. Gel yang telah disiapkan lalu dimasukkan ke dalam chamber lalu menggunakan syringe sampel fraksi yang telah diencerkan dan disiapkan diinjeksikan sekitar 5ul ke dalam sumur dengan sumur 4 sebagai marker kemudian dituangkan buffer sampel dan dipasang pada tegangan 50-100 V. Elektroforesis dilakukan hingga sampel berada 1 cm dari dasar gel, kemudian dilakukan pewarnaan menggunakan larutan coomasive blue selama 24 jam di atas shaker kecepatan rendah. Gel elektroforesis dicuci menggunakan larutan destaining (5:4:1 metanol:akuades:asetat) selama 1 jam hingga gel berwarna jernih kemudian direndam dalam akuades.
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Ekstraksi dan Fraksinasi Protein Invertase Ekstraksi protein invertase dari ragi komersial dilakukan dengan penghancuran sel menggunakan pasir kuarsa bertujuan untuk merusak sel ragi
5
sehingga protein intraselular dalam sel dapat keluar dan dipisahkan. Fraksi supernatan yang diperoleh dari ekstraksi digunakan untuk fraksinasi protein invertase. Tabel 1 menunjukkan volume supernatan fraksinasi invertase. Contoh perhitungan bobot amonium sulfat ditunjukkan pada Lampiran 1. Tabel 1 Volume fraksinasi invertase Sampel
Ekstrak kasar 1 2 7.5 9.5
Supernatan (mL) (NH4)2SO4 (g)
0.855
0-20% 1 7.5
2 24
20-40%
40-60%
1 7.85
1 7.4
0.97 0.9425 2.9520 1.04
2 24
3.1678 1.06
6080% 1 2 -
2 25
3.575 -
-
Proses pemecahan sel dengan mekanik yaitu menggunakan pasir kuarsa yang ditambahkan pelarut organik toluena dilakukan secara duplo (dua kali ulangan). Bobot ragi ulangan 1 adalah 10.0048 gram sedangkan ulangan 2 adalah 10.0227 gram dengan bobot pasir kuarsa yang digunakan adalah 2.64 gram ulangan 1 dan 2.45 gram ulangan 2. Pasta ragi yang terbentuk dari penggerusan ragi komersil dengan kuarsa dan toluena menghasilkan fraksi supernatan sebanyak 7.5 mL ulangan 1 dan 8.5 mL ulangan 2.
Absorbansi Terkoreksi (A)
Uji Aktivitas Invertase Ragi dengan Metode Folin Wu Pembacaan absorbansi deret standar glukosa menghasilkan kurva standar dan persamaan regresi (Gambar 1). Persamaan kurva standar glukosa adalah y = 0.124+3.222 x dengan nilai regresi 99.67% serta variabel y menyatakan absorbansi dan x adalah konsentrasi glukosa dalam satuan mikromolar (mM). Menurut Day dan Underwood (2002), tujuan pembuatan kurva standar adalah menentukan konsentrasi sampel yang sesungguhnya. Kurva standar menggunakan larutan standar yang telah diketahui konsentrasi sebenarnya. 2.5 2 y = -0.124 + 3.22x R= 99.67%
1.5 1 0.5 0 0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Konsentrasi (mM)
Gambar 1 Kurva standar glukosa aktivitas protein invertase
Nilai regresi persamaan garis linier kurva standar glukosa sebesar 99.67% menyatakan bahwa data absorbansi kurva standar cukup baik. Penentuan kadar aktivitas protein invertase menggunakan metode Folin Wu. Perlakuan pemanasan adalah untuk blanko aktivitas dan sampel, sehingga pada blanko aktivitas tidak terjadi pembentukan produk akhir invertase yang mengubah sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa karena fraksi protein dipanaskan terlebih dahulu. Unit aktivitas sebagai jumlah sukrosa yang dihidrolisis per menit. Pengukuran unit aktivitas menggunakan sampel blanko fraksi untuk setiap fraksi amonium sulfat
protein invertase ragi komersial. Tabel 2 menunjukkan pembacaan absorbansi sampel. Tabel 2 Uji aktivitas invertase menggunakan metode Folin Wu Sampel Blanko spektro Blanko ekstrak kasar Blanko fraksi 0-20 Blanko fraks 20-40 Blanko fraksi 40-60 Blanko fraksi 60-80 Fraksi ekstrak kasar 1 Fraksi ekstrak kasar 2 Fraksi 0-20 % 1 Fraksi 0-20% 2 Fraksi 20-40% 1 Fraksi 20-40% 2 Fraksi 40-60% 1 Fraksi 40-60% 2 Fraksi 60-80% 1 Fraksi 60-80% 2
Absorbansi Terkoreksi 0 0.261 0.032 0.055 0.278 0.080 5.014 5.014 5.243 0.224 0.259 0.147 -0.082 -0.196 -0.048 0.139
[glukosa] (mM) 0.119 0.048 0.055 0.124 0.063 1.595 1.595 1.665 0.108 0.118 0.026 0.013 -0.022 0.023 0.081
Blanko aktivitas digunakan untuk mengkalibrasi absorbansi sampel tanpa aktivitas protein invertase. Seluruh sampel baik itu blanko aktivitas maupun fraksi sampel dilakukan secara duplo. Fraksi ekstrak kasar ulangan 1 serta ulangan 2 memiliki konsentrasi glukosa 1.595 sedangkan pada fraksi 0-20% terdapat perbedaan konsentrasi produk ulangan 1 dan ulangan 2. Sampel fraksi 40-60% ulangan kedua menghasilkan konsentrasi produk bernilai negatif yaitu -0.022 mM. Konsentrasi produk terendah pada fraksi 40-60% ulangan 1 sebesar 0.013 mM sedangkan konsentrasi produk tertinggi pada fraksi 0-20% ulangan ke 1 sebesar 1.665 mM.
Absorbansi Terkoreksi (A)
Penentuan Kadar Protein Invertase dengan Metode Lowry Penentuan kadar protein invertase untuk menentukan konsentrasi protein dalam setiap fraksinasi amonium sulfat. Pembacaan deret standar BSA pada panjang gelombang 660 nm menghasilkan kurva standar dan persamaan garis (Gambar 2). Persamaan garis standar BSA adalah y= -0.284.10-4x +0.112 dengan nilai regresi 0.492 serta variabel y menyatakan absorbansi dan x adalah konsentrasi glukosa dalam satuan milligram per milliliter (ug/mL). 0.15 y = -0.284.10-4x + 0.112 R² = 0.492
0.1 0.05 0 -0.05 0 -0.1
100
200
300
400
500
Konsentrasi (ug/mL)
Gambar 2 Kurva standar larutan BSA
600
700
7
Metode penentuan konsentrasi protein menggunakan metode Lowry dengan larutan standar BSA 1000 ug/mL. Absorbansi sampel yang diukur pada panjang gelombang 660 nm disubstitusikan ke dalam persamaan regresi kurva standar untuk memperoleh konsentrasi protein. Tabel 3 menunjukkan konsentrasi protein pada berbagai fraksi amonium sulfat menggunakan metode Lowry. Tabel 3 Penentuan kadar protein invertase menggunakan metode Lowry Sampel Blanko spektro Fraksi kasar 1 Fraksi kasar 2 Fraksi 0-20 % 1 Fraksi 0-20% 2 raksi 20-40% 1 Fraksi 20-40% 2 Fraksi 40-60% 1 Fraksi 40-60% 2 Fraksi 60-80% 1 Fraksi 60-80% 2
Absorbansi Terkoreksi 0 -0.056 -0.050 -0.126 -0.105 -0.102 0.010 -0.094 -0.032 -0.038 0.062
[protein] (ug/mL) 599.144 577.746 848.787 773.894 763.195 363.766 734.667 513.555 534.950 178.316
Konsentrasi protein digunakan untuk menentukan nilai aktivitas spesifik enzim invertase hasil fraksinasi. Blanko spektro digunakan untuk mengkalibrasi absorbansi sampel sehingga diperoleh absorbansi sampel terkoreksi. Fraksi kasar memiliki konsentrasi protein berbeda sebesar 599.155 ug/mL dan 577.746 ug/mL sedangkan fraksi amonium sulfat 0-20% memiliki konsentrasi protein terbesar pada ulangan pertama 848.787 ug/mL. fraksi 20-40% memiliki konsentrasi protein terbesar 763.195 ug/mL pada ulangan pertama, 40-60% sebesar 735.667 ug/mL pada ulangan pertama sedangkan fraksi 60-80% memiliki konsentrasi terbesar 534.950 ug/mL. Penentuan Unit Aktivitas, Aktivitas Spesifik, Yield Enzim dan Fold Purification Invertase Ragi Komersial Konsentrasi protein yang diperoleh melalui metode Lowry digunakan untuk penentuan aktivitas spesifik protein invertase. Aktivitas spesifik didefinisikan sebagai unit aktivitas enzim per milligram protein. Tabel 4 menunjukkan parameter isolasi protein dari ragi komersial yaitu unit aktivitas, aktivitas spesifik, yield enzim dan fold purification. Tabel 4 Parameter isolasi invertase No
Sampel
1 2 3 4 5 6 7 8 10 11
Fraksi kasar 1 Fraksi kasar 2 Fraksi 0-20 % 1 Fraksi 0-20 % 2 Fraksi 20-40 % 1 Fraksi 20-40 % 2 Fraksi 40-60 % 1 Fraksi 40-60 % 2 Fraksi 60-80 % 1 Fraksi 60-80 % 2
Unit Aktivitas (unit/mL) 0.922 0.922 10.106 0.375 0.393 -0.181 -0.693 0.913 -0.250 0.112
[protein] (mg/mL) 0.599 0.578 0.848 0.744 0.763 0.364 0.735 0.514 0.535 0.178
Aktivitas Spesifik (unit/mg) 1.539 1.595 11.917 0.484 0.515 -0.497 -0.942 1.776 -0.467 0.630
Yield Enzim (%) -
Fold Pu19rification (unit/mg) -
1096 40.67 42.62 -19.63 -75.16 99.02 -27.11 12.14
7.604 0.308 0.328 -0.317 -0.601 1.133 -0.298 0.402
Parameter isolasi invertase ragi meliputi unit aktivitas (unit/mL), aktivitas spesifik, yield enzim dan fold purification. Unit aktivitas tertinggi diperoleh pada fraksi 0-20% sebesar 10.106 unit/mL, terendah pada fraksi 60-80% sebesar 0.112 unit/mL. Aktivitas spesifik tertinggi pada fraksi 0-20% sebesar 11.917 unit/mg. Yield enzim tertinggi diperoleh pada fraksi 0-20% sebesar 1096% pada ulangan pertama dan 99.02% pada fraksi 40-60% sedangkan fold purification tertinggi pada fraksi 0-20% sebesar 7.604. Penentuan Bobot Molekul Invertase Ragi (yeast) dengan SDS-PAGE Penentuan bobot molekul protein invertase menggunakan metode SDSPAGE. Berbagai fraksi digerakkan menggunakan aliran listrik dan bergerak menurut bobot molekul masing-masing protein dalam fraksi. Gambar menunjukkan hasil elektroforesis SDS-PAGE. Gambar 3 menunjukkan hasil pita elektroferesis SDS-PAGE menggunakan data sekunder (Sivakumar et al.2013).
Gambar 3 Karakterisasi enzim invertase dengan SDS-PAGE, M-Marker, T1-sampel 1, T2-sampel 2, dari data sekunder (Sivakumar et al. 2013)
Bobot marker dan jarak retardasi (jarak tempuh sampel per jarak total) digunakan untuk membuat kurva standar logaritma bobot molekul (kDa) dan jarak retardasi (Rf). Persamaan garis linier bobot molekul invertase adalah y = 1.401x+2.178 dengan nilai regresi sebesar 0.982. Tabel 5 menunjukkan bobot molekul pita kedua sampel dalam gel poliakrilamida hasil elektroforesis. Gel yang digunakan pada SDS-PAGE percobaan adalah gel poliakrilamida konsentrasi 8%. Sampel dilakukan secara duplo menghasilkan 8 pita untuk sampel 1 dan sampel 2 sebanyak 5 pita. Bobot molekul terkecil pada sampel 1 adalah 24.391 kDa dengan nilai Rf 0.561 cm dan terbesar pada pita nomor 1 yaitu 141.233 kDa dengan nilai Rf 0.018 cm, sedangkan bobot molekul sampel 2 terbesar pada pita nomor 1 sebesar 134.598 kDa dengan nilai Rf 0.035 cm dan bobot molekul terendah pada pita nomor 5 sebesar 24.390 kDa dengan nilai Rf 0.561 cm. Tabel 5 Bobot molekul sampel Nomor pita 1 2 3 4 5 6 7 8
Sampel 1 Rf (cm) BM (kDa) 0.018 142.233 0.105 107.152 0.175 85.427 0.281 60.549 0.333 51.141 0.406 40.348 0.474 32.353 0.561 24.391
Sampel 2 Rf (cm) BM (kDa) 0.035 134.598 0.105 107.152 0.316 54.044 0.491 30.616 0.561 24.390
9
PEMBAHASAN Ekstraksi dan Fraksinasi Invertase Gen SUC2 telah diklonkan dan disekuensing menyandikan dua bentuk invertase pada ragi yaitu bentuk glikosilasi yang disekresikan dari sel, dan invertase intraselular dalam bentuk nonglikosilasi. Sekresi invertase umumnya berada dalam membran periplasma. Invertase ekstraselular terdiri dari dimer 270 kDa dan mengandung 50% massa karbohidrat dalam bentuk 9 rantai oligosakarida manosa dan setiap rantai berikatan dengan residu aspragina pada subunit polipeptida berukuran 60 kDa (Heslot dan Gaillardin 1991). Enzim invertase termasuk ke dalam kelompok enzim hidrolase yang mengkatalisis substrat dengan adanya air dan terjadi perubahan arah putaran optik (invertasi).Nama sistematik invertase adalah -D-fruktofuranosida fruktohidrolase (EC 3.2.1.26). EC3 artinya enzim memecah substrat dengan reaksi hidrolisis, EC 3.2 bermakna bahwa enzim bekerja pada senyawa glikosil, dan EC 3.2.1 bahwa senya senyawa glikosil yang dipecah adalah senyawa O-glikosil dan S-glikosil (Siegrist 2009). Sukrosa dihidrolisis menghasilkan molekul glukosa dan fruktosa (Gambar 4).
Gambar 4 Reaksi katalisis invertase (Siegrist 2009). Komponen dinding sel ragi berbentuk seperti kapsul polisakarida sehingga sulit dihancurkan dan terdapat beberapa cara untuk menghancurkan sel ragi diantaranya pemecahan secara mekanik menggunakan pasir kuarsa steril (bead mill) dan buffer lisis, lisis sel secara enzimatis menggunakan zimolase, glukalase dan litikase atau dipanaskan menggunakan SDS dan fenol (Kumar dan Awasthi 2009). Menurut Javmen et al. (2012), lisis sel ragi dapat dilakukan secara autolisis yaitu sel menghancurkan dirinya sendiri menggunakan enzim yang dimilikinya dengan hidrolsis biopolimer intraselular oleh aktivitas lisosom yang melepaskan enzim hidrolisis ke dalam sitoplasma dan membran sel. Penambahan toluena pada ekstraksi invertase adalah untuk merusak konformasi bilayer membran sel. Tahap pemurnian protein selanjutnya adalah memisahkan fraksi invertase dari berbagai komponen protein lainnya dalam sel yang telah lisis. Invertase yang akan dimurnikan adalah invertase intraselular yang larut dalam sitoplasma, sehingga penggunaan sentrifus adalah untuk memisahkan invertase yang larut dalam air dengan protein yang larut dalam fraksi toluena (nonpolar). Prinsip sentrifugasi adalah suspensi terdapat partikel yang akan mengendap ke dalam dasar wadah karena pengaruh gravitasi, pemisahan partikel dari dalam larutan dikarenakan ukuran partikel, bentuk, densitas, dan viskositas dalam medium serta kecepatan rotor. Laju sedimentasi partikel suspensi dapat ditingkatkan dengan meningkatkan pengaruhi gravitasi terhadap partikel diantaranya dengan meningkatkan kecepatan rotor (Chauhan 2008). Campuran diletakkan pada suatu tempat berupa rotor yang berputar dengan cepat sehingga zat yang mempunyai berat molekul paling besar akan terkumpul dan terpisah dengan spesi zat yang lainnya (Marks et al. 2000).
Fraksi invertase akan berada dalam supernatan (fasa air) dibandingkan fase nonpolar (toluena) karena sifat kelarutan invertase yang larut air. Percobaan dilakukan duplo kemudian supernatan yang diperoleh dari sentrifugasi suspensi lisis sel yeast digunakan untuk rasio penambahan amonium sulfat untuk pemurnian protein invertase. Volume supernatan yang diperoleh memengaruhi jumlah (gram) amonium sulfat yang ditambahkan ke dalam suspensi (Tabel 1). Teknik pemurnian enzim dapat dilakukan dengan pengendapan, filtrasi membran, kromatografi absorbsi dan afinitas pada praktikum digunakan metode pengendapan bertingkat amonium sulfat untuk memurnikan protein invertase ragi. Kelarutan protein dalam lingkungan berair (aqueos) tergantung pada suhu, pH, konsentrasi dan komposisi larutan di mana protein dilarutkan. Protein mempunyai residu asam amino berbeda yang memengaruhi jumlah gugus polar dan bermuatan pada permukaan protein yang berinteraksi dengan pelarut (air), sedangkan residu hidrofobik terlindungi oleh residu polar asam amino sehingga tidak berinteraksi dengan air (Wilson dan Walker 2010). Menurut Grodzki dan Berenstein (2010), prinsip pengendapan menggunakan amonium sulfat yaitu proses salting out protein dari larutan. Penambahan amonium sulfat mencegah pembentukan ikatan hidrogen dengan air dan jembatan garam sehingga sesama molekul protein berinteraksi dan membentuk agregat yang tidak larut dalam larutan. Beberapa kelebihan amonium sulfat adalah amonium sulfat larut pada konsentrasi tinggi (4 M 0° C), densitas amonium sulfat (1.235 g/mL) lebih rendah dibandingkan densitas agregat protein (1.29 g/mL) memungkinkan dipisahkan melalui sentrifugasi, dan protein dapat disimpan dalam bentuk endapan amonium sulfat dalam jangka waktu lama. Kekurangan dari amonium sulfat diantaranya terbentuknya campuran fraksinasi kompleks protein, amonium sulfat bersifat korosif untuk alat-alat industri (penggunaan skala industri), amonium sulfat dapat mengasamkan ekstrak protein dan kontaminasi ion logam berat seperti Pb dan Ag (Bonner 2007). Pengendapan amonium sulfat dilakukan 4 kali sehingga menghasilkan fraksinasi bertingkat amonium sulfat (0-80%). Tingkat fraksinasi berbeda mengindikasikan bahwa pada persentase pengendapan amonium sulfat tingkat tertentu terdapat sejumlah protein yang terendapkan dalam konsentrasi amonium sulfat tertentu. Semakin tinggi tingkat fraksinasi (40-80%) maka protein yang terendapkan semakin spesifik. Ulangan kedua fraksinasi invertase menggunakan amonium sulfat fraksi ke 0-20% hingga 40-60% menunjukkan anomali volume supernatan yang terlalu besar (Tabel 1). Hal ini disebabkan penambahan air secara berlebihan saat saat sentrifugasi dari fraksi ekstrak kasar menuju fraksi 0-20% , menyebabkan penambahan amonium sulfat yang ditambahkan dalam suspensi semakin besar. Uji Aktivitas Invertase dengan Metode Folin Wu Enzim mempunyai reaksi katalitik spesifik. Keberadaan protein invertase yang telah difraksinasi dapat ditentukan dengan mereaksikan enzim dengan substratnya yaitu sukrosa. Aktivitas enzim adalah jumlah produk yang dihasilkan per satuan waktu atau mikromolar produk per menit (Farrell dan Taylor 2006). Aktivitas enzim tergantung pada pH, kekuatan ionik, suhu dan inhibitor maupun aktivitas sehingga aktivitas invertase 1 mol sukrosa sebanding dengan 1 mol
11
fruktosa dan 1 mol glukosa. Konsentrasi glukosa yang dihasilkan ditentukan menggunakan metode Folin Wu sehingga aktivitas enzim merupakan konsentrasi glukosa yang terbentuk dari aktivitas katalitik invertase dalam suspensi fraksinasi. Penentuan kadar glukosa percobaan menggunakan metode Folin-Wu. Prinsip metode Folin-Wu adalah glukosa pereduksi akan teroksidasi oleh larutan tembaga alkali yang mengandung ion kupri membentuk kupro yang akan mengendap menjadi kupro oksida. Kupro oksida akan dioksidasi kembali oleh asam fosfomolidrat membentuk warna biru gelap karena adanya oksida Mo. Banyaknya kuprooksida dalam sampel sebanding dengan konsentrasi glukosa darah (Bintang 2010). Intensitas warna biru dalam sampel diukur pada panjang gelombang 660 nm (Chauhan 2008). Uji aktivitas invertase pada berbagai fraksi menghasilkan konsentrasi glukosa (mM) yang berbeda-beda (Tabel 2). Konsentrasi glukosa tertinggi pada fraksi 0-20% dan terendah pada fraksi 40-60%. Konsentrasi glukosa yang berbeda untuk setiap fraksi dapat disebabkan jumlah protein dalam suspensi maka semakin banyak jumlah protein dalam suspensi, aktivitas invertase semakin tinggi dan konsentrasi glukosa yang dihasilkan semakin besar. Selain itu, faktor inkubasi penambahan fosfomolibdat ke dalam sampel sesaat setelah inkubasi menentukan absorbansi sampel relevan terhadap konsentrasi glukosa. Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry Parameter pemurnian protein atau enzim lainnya adalah konsentrasi protein. Konsentrasi protein menyatakan jumlah mikrogram protein dalam setiap milliliter suspensi fraksinasi. Konsentrasi protein ditentukan menggunakan metode Lowry dengan kurva standar BSA. Prinsip kerja metode Lowry adalah reduksi Cu2+ dari CuSO4 (Reagen Lowry B) menjadi Cu+ oleh rantai samping aromatik asam amino seperti tirosin, triptofan, dan sistein yang terdapat dalam protein. Ion Cu+ dengan fosfomolibdat dan fosfotungstat yang terdapat dalam reagen Folin-Ciocalteu menghasilkan heteropoly-molybdenum yang membentuk kompleks warna biru yang dapat diukur nilai absorbansinya oleh spektrofotometer (Septiani et.al 2004). Reaksi kompleks antara asam amino yang terkandung dalam protein dan reagen-reagen Lowry diantaranya Folin-Ciocalteu menghasilkan warna kebiruan yang dapat dibaca pada panjang gelombang 500-750nm (Soeharsono 2006). Kelebihan metode Lowry adalah lebih sensitif dibandingkan dengan metode Biuret, akan tetapi masih kurang sensitif apabila dibandingkan dengan metode Bradford selain itu adanya beberapa zat yang bisa menganggu analisis protein seperti buffer, gula, deterjen, gliserol, EDTA, senyawa kalium, magnesium dan kalsium sehingga diperlukan larutan blanko untuk mengoreksi nilai absorbansi yang terbaca pada spektrofotometer. Metode Lowry mampu mendeteksi konsentrasi protein sebesar 5 ng (Otles 2010). Konsentrasi protein dalam fraksi suspensi berbeda (0-80%) menghasilkan nilai yang berbeda –beda dan konsentrasi protein dinyatakan dalam mikrogram per milliliter (Tabel 4). Konsentrasi protein invertase tertinggi pada fraksi 0-20% sedangkan konsentrasi protein terendah pada fraksi 60-80%. Konsentrasi yang berbeda setiap fraksi dapat dipengaruhi oleh jumlah protein dalam suspensi setiap fraksi serta proses penambahan reagen Folin Ciocalteu dalam sampel.
Penambahan reagen harus dilakukan segera mungkin karena penambahan reagen Folin Ciocalteu memengaruhi intensitas warna biru sampel. Penentuan Unit Aktivitas, Aktivitas Spesifik, Yield Enzim dan Fold Purification Invertase Ragi Komersial Parameter pemurnian enzim diantaranya unit aktivitas, aktivitas spesifik, yield enzim dan fold purification. Konsentrasi enzim dalam volume sampel dapat dinyatakan jumlah unit aktivitas yang terdapat dalam volume sampel yang dinamakan dengan aktivitas relative (dalam unit per milliliter). Aktivitas spesifik menyatakan aktivitas enzim yang sebagai unit dalam milligram total protein sampel (Farrell dan Taylor 2006). Unit aktivitas dan aktivitas spesifik setiap fraksi amonium sulfat berbeda-beda (Tabel 5). Unit aktivitas dan aktivitas spesifik tertinggi terdapat pada fraksi 0-20% artinya pada fraksi 0-20% terdapat unit invertase tertinggi yang menghasilkan aktivitas katalitik mengkonversi substrat (milligram) sejumlah unit invertase dalam sampel. Menurut Gascon dan Lampen (1967), aktivitas spesifik invertase adalah 2900 unit/mg protein. Dua parameter kuantitas pemurnian enzim lainnya yaitu percent recovery atau yield enzim dan fold purification. Percent recovery merupakan total unit fraksi per total unit fraksi kasar. Hasil Yield enzim dan fold purification untuk setiap fraksi beragam. Yield enzim fraksi 0-20% (duplo) sebesar 40.67% bermakna protein yang terambil atau recovery protein pada fraksi tersebut sebesar 40.67% dari fraksi kasar (fraksi awal) sedangkan fold purification sebagai tingkat kemurnian invertase yang dimurnikan dengan protein lain dalam sampel pada fraksi 0-20% adalah 0.308 unit/mg (duplo) artinya protein tidak cukup terpisahkan (termurnikan dengan baik) karena memiliki nilai fold purification yang rendah (Tabel 5). Menurut Farrell dan Taylor (2006), fold purification yang semakin tinggi mengindikasi protein yang dimurnikan sudah terpisah baik dengan protein lainnya. Penentuan Bobot Molekul Invertase Ragi (yeast) dengan SDS-PAGE Elektroforesis adalah metode yang digunakan untuk memisahkan makromolekul dari kompleks campuran dengan menggunakan aliran listrik. Makromolekul ditempatkan pada ujung matriks (gel) kemudian dialirkan oleh listrik, maka makromolekul berbeda dalam campuran akan bergerak dengan kecepatan yang berbeda tergantung sifat gel dan karakteristik makromolekul (Corley 2005). SDS-PAGE merupakan metode yang umum digunakan dalam teknik biomolekular khususnya handling protein. SDS-PAGE dapat menentukan bobot molekul dengan membandingkan protein standar (log Mr vs pergerakan). Natrium deodesil sulfat-gel poliakrilamida (SDS-PAGE) terdiri dari interaksi protein dengan SDS. Protein akan terdenaturasi karena adanya SDS. SDS akan berinteraksi dengan protein membentuk kompleks rod-like yang setara dengan 14 mg SDS/mg protein dan akan mengubah muatan protein menjadi negatif sehingga semua protein dalam kompleks campuran mempunyai muatan yang sama dan migrasi yang bersamaan (Dennison 2003). Bobot molekul sampel ditentukan secara duplo pada Gambar 3 menunjukkan pita elektroforesis invertase ragi komersial berdasarkan data sekunder Sivakumar et al. (2013). Visualisisasi marker digunakan untuk standarisasi dan menentukan bobot molekul sampel berdasarkan persamaan garis liner antara logaritma bobot molekul dan Rf.
13
Nilai Rf merupakan perbandingan jarak tempuh sampel per jarak total running gel. Sampel 1 menghasilkan 8 pita sedangkan sampel 2 menghasilkan 5 pita. Pita pada gel elektroforesis mengindikasikan bobot molekul protein dalam campuran sampel. Protein dengan bobot molekul rendah akan bergerak cepat sehingga memiliki nilai Rf tinggi sedangan protein berbobot molekul tinggi akan bergerak perlahan melewati gel poliakrilamida sehingga nilai Rf akan rendah. Bobot molekul tertinggi pada sampel 1 adalah 142.233 kDa dan terendah 24.391 kDa, sedangkan pada sampel 2 bobot molekul tertinggi adalah 134.598 kDa dan terendah 24.390 kDa. Menurut Timerman (2012), bobot molekul invertase terdiri atas subunit protein besar dengan massa 270 kDa yang terdiri dari dua subunit dan subunit terglikosilasi dengan massa 135 kDa. Menurut Sivakumar et al.(2013), analisis berat molekul invertase maksimum dengan pita 130 kDa terdapat pada mutan dan tipe liar S. cerevisiae dan 110 kDa terdapat juga pada tipe mutan dan 102.5 kDa terdapat di tipe liar. Struktur invertase dengan bobot 270 kDa terdiri atas beberapa dimer yang membentuk oktamer dan pada situs aktif enzim terdapat rantai polisakarida (Polo et al. 2012) Menurut Timerman (2012), bahwa bobot molekul invertase sekitar 270 kDa. Pita elektroforesis yang menunjukkan bobot molekul invertase pada pita nomor 1 dengan bobot molekul 142.233 kDa dan 134.598 kDa bila pita elektroforesis diambil maka dapat digunakan untuk analisis sekuensing. Beberapa faktor kesalahan yang mendasari penggunaan data sekunder pada percobaan penentuan bobot molekul invertase adalah permukaan running gel yang tidak rata menyebabkan protein dalam sampel bergerak pada titik yang tidak bersamaan, kontaminasi buffer, jumlah protein dalam sampel termasuk diantaranya nilai yield enzim dan fold purification dari berbagai fraksinasi, dan termasuk konsentrasi poliakrilamida yang terlalu tinggi untuk protein dalam sampel sehingga protein dalam sampel bergerak tidak bebas dalam gel poliakrilamida. Beberapa faktor kesalahan menyebabkan pita protein pada gel poliakrilamida hasil percobaa tidak terpisah dengan baik
Gambar 5 Struktur kristallografi invertase yang disandi oleh gen SUC2 (Polo et al. 2012)
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Isolasi invertase dari ragi komersial digunakan dengan metode pengendapan amonium sulfat. Fraksi 0-20% diperoleh nilai unit aktivitas, aktivitas spesifik, yield enzim dan fold purification tertinggi. Fraksi 0-20% merupakan fraksi dengan jumlah protein invertase yang termurnikan dalam
jumlah tinggi serta penentuan bobot molekul invertase menggunakan SDS-Page adalah 142.233 kDa dan 134.598 kDa. Saran Perlunya optimasi isolasi maksimum invertase pada penggenapan fraksi amonium sulfat tertentu untuk memperoleh isolate protein invertase murni dalam jumlah tinggi. Adanya berbagai kontaminan baik itu pada sampel dan reagen dapat memengaruhi parameter pemurnian enzim atau protein seperti unit aktivitas dan aktivitas spesifik.
DAFTAR PUSTAKA
Ajay K, Awasthi A. 2009. Bioseparation Engineering. New Delhi (IND): Krishan Makhijani Pr. Bintang M. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta (ID): Erlangga. Bonner PLR. 2007. Protein Purification. New York (US): Taylor. Chauhan. 2008. Principles of Biochemistry and Biophysics. New Delhi (IN): Uni Sci Pr. Corley RB. 2005. A Guide to Methods in The Biomedical Sciences. Boston (US): Springer. Day RA, Underwood AL. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Sopyan I, penerjemah; Wibi H, editor. Jakarta (ID): Erlangga. Terjemahan dari: Quantitative Analysis Sixth Edition. Dennison C. 2003. A Guide to Protein Isolation. New York (US): Kluwer Pr. Elevri PA, Putra SR. 2006. Produksi etanol menggunakan Saccharomyces cerevisiae yang diamobilisasi dengan agar batang. Akt. Kimindo 1(2): 105114. Farrell S, Taylor L. 2006. Experiment in Biochemistry: A Hands on Approach. Belmont (US): Thomson Learning Pr. Gandjar I. 2006. Mikologi Dasar dan Terapan. Jakarta (ID): Obor. Gascon S, Lampen JO. 1967. Purification of the internal invertase of yeast. J. Bio. Chem. 243(7):1567-1572. Ghosal M, Srivastava. 2009. Fundamentals of Bioanalytical Techniques and Instrumentation. New Delhi (IN) : Raj Pr. Grodzki AC, Berenstein E. 2010. Antibody purification: ammonium sulfate fractionation or gel filtration. Methods Mol. Bio. 588:15-26. Hasanah ENI, Putra SR. 2010. Karakterisasi ekstrak kasar enzim invertase yang diamobilisasi dengan Na-alginat. Prosiding Skripsi Institut Teknologi Sepuluh November:1-10.
15
Heslot H, Gaillardin C. 1991. Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts. Florida (US): CRC Pr. Javmen A, Grigiskis S, Gliebute R.2012. B-glukan extraction from Saccharomyces cerevisiae yeast using Actinomyces rutgernsis 88 yeast lyzing enzymatic complex. Biologija 58(2):51-59. Marks D, Marks A, Smith C. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar : Sebuah pendekatan klinis. Vivi S, penerjemah; Joko S, editor. Jakarta (ID): EGC. Terjemahan dari : Basic medical biochemistry: a clinical appoarch. Otles S. 2010. Methods of Analysis of Food Components and Additives. New York (US): CRC Pr. Polo MS, Escudero MR, Lafraya A, Gonzalez B, Navarro JM, Polaina J, Aparicio J. 2012. Three dimensional structure of Saccharomyces cerevisiae Invertase: roles of noncatalytic domain in oligomerization and substrate specifity. J. Biol. Chem. 288(12):9755-9766. Rastall RA. 2009. Prebiotics and Probiotics Science and Technology. Charalompoulus D, editor. London (UK): Springer Sci. Siegrist J. 2009. Enzymatic Food Analysis [terhubung berkala] http://www.sigmaaldrich.com/technicaldocuments/articles/analytix/enzymati c-food-analysis.html (Diakses Senin, 13 April 2015) Septiani Y, Purwoko T, Pangastuti A. 2004. Kadar karbohidrat, lemak, dan protein pada kecap tempe. J Biotek 1(2): 48-53. Sivakumar T, Ravikumar M, Prakash M, Shanmugaraju V. 2013. Production of extracellular invertase from Saccharomyces cerevisiae strain isolated from grapes. Int.J.Curr.Res.Aca.Rev. 1(2):71-83. Soeharsono. 2006. Biokimia 1. Yogyakarta (ID): UGM Pr. Stansfield WD, Colome J, Cano R. 2003. Biologi Molekuler dan Sel. Fahmi V, penerjemah; Safitri A, editor. Jakarta (ID): Erlangga. Terjemahan dari : Schaums Easy Outlines: Molecular and Cell Biology. Stewart GG. 2014. Encylopedia of Food Microbiology. Batt CA, editor. Oxford (UK): Elsivier. Timerman AP. 2012. The isolation of invertase from baker yeast-an introduction to protein purification strategies. http://cdn.intechopen.com/pdfs-wm/26595.pdf (Diakses Sabtu, 12 April 2015). Wilson K, Walker J. 2010. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology. Cambridge (UK): Cambridge Pr. Yuwono T.2008. Biologi Molekular. Jakarta (ID): Erlangga.
LAMPIRAN LAMPIRAN L
17
Lampiran 1 Diagram alur percobaan\
RAGI
Pemecahan sel
Pemurnian parsial dengan pengendapan amonim sulfat
Fraksi kasar Fraksi 020%
Fraksi 20-40%
Fraksi 40-60% Fraksi 60-80%
Pengujian aktivitas invertase Pengujian kadar protein Pengujian aktivitas spesifik Pengujian yield enzim Pengujian fold purification Pengujian bobot molekul
Lampiran 2 Volume fraksinasi invertase Sampel
Ekstrak kasar 1 2 7.5 9.5
Supernatan (mL) (NH4)2SO4 (g) 0.855 Contoh perhitungan :
0-20% 1 7.5
2 24
20-40%
40-60%
1 7.85
1 7.4
0.97 0.9425 2.9520 1.04
2 24
3.1678 1.06
2 25
6080% 1 2 -
3.575 -
-
Jumlah amonium sulfat = Jumlah amonium sulfat = Jumlah amonium sulfat = 2.9520 gram
Lampiran 3 Pembacaan absorbansi deret standar aktivitas invertase No Standar (mM) Absorbansi terbaca (A) Absorbansi terkoreksi (A) 1 Blanko 0.2720 0 2 Standar 0.10 0.4430 0.1710 3 Standar 0.15 0.6750 0.4030 4 Standar 0.20 0.7920 0.5200 5 Standar 0.25 0.9510 0.6850 6 Standar 0.30 1.1025 0.8300 7 Standar 0.35 1.2435 1.9710 8 Standar 0.40 1.4650 1.1930 Contoh perhitungan (Standar 1) Absorbansi terkoreksi = Absorbansi terbaca – Absorbansi blanko = 0.4430 A – 0.2720 A = 0.1710 A
Absorbansi Terkoreksi (A)
V1 N1 = V2 N2 50ul 1 mM = 500 ul N2 0.1 mM= N2
2.5 2 1.5 1 0.5 0
y = -0.124 + 3.22x R= 99.67%
0
0.1
0.2
0.3
0.4
Konsentrasi (mM)
Gambar 1 Kurva standar glukosa aktivitas protein invertase
0.5
19
Lampiran 4 Pembacaan absorbansi sampel metode Folin Wu Sampel
Absorbansi Terbaca
Absorbansi [glukosa] (mM) Terkoreksi Blanko spektro 0.272 0 Blanko kasar 0.533 0.261 0.119 Blanko fraksi 0-20 0.304 0.032 0.048 Blanko fraksi 20-40 0.327 0.055 0.055 Blanko fraksi 40-60 0.550 0.278 0.124 Blanko fraksi 60-80 0.352 0.080 0.063 Fraksi kasar 1 5.547 5.014 1.595 Fraksi kasar 2 5.547 5.014 1.595 Fraksi 0-20 % 1 5.547 5.243 1.665 Fraksi 0-20% 2 0.528 0.224 0.108 Fraksi 20-40% 1 0.586 0.259 0.118 Fraksi 20-40% 2 0.474 0.147 0.026 Fraksi 40-60% 1 0.468 -0.082 0.013 Fraksi 40-60% 2 0.354 -0.196 -0.022 Fraksi 60-80% 1 0.304 -0.048 0.023 Fraksi 60-80% 2 0.491 0.139 0.081 Contoh perhitungan (Fraksi ekstrak kasar ulangan 1) Absorbansi = Absorbansi terbaca sampel – Absorbansi blanko spektroAbsorbansi blanko aktivitas terkoreksi = 5.547 A – 0.272 A – 0.261 A = 5.014 A y = -0.124 3.222 [produk] = [produk] 1.595 mM = [produk]
Lampiran 5 Pembacaan absorbansi deret standar aktivitas spesifik invertase No. Sampel (ug/mL) Absorbansi Terukur 1 Blanko 0.300 2 Standar 100 0.440 3 Standar 300 0.264 4 Standar 400 0.265 5 Standar 500 0.259 6 Standar 600 0.302 Contoh Perhitungan: Absorbansi terkoreksi = Absorbansi terbaca – Absorbansi blanko = 0.440 A – 0.300 A = 0.140 A V1 N1 1000 ug/mL 100 ug/mL
= V2 N2 25 ul = 250 ul N2 = N2 = -N2
Absorbansi Koreksi 0 0.140 -0.036 -0.035 -0.041 0.002
Absorbansi Terkoreksi (A)
0.15 y = -0.284.10-4x + 0.112 R² = 0.492
0.1 0.05
0 -0.05 0 -0.1
100
200
300
400
500
600
700
Konsentrasi (ug/mL)
Gambar 2 Kurva standar BSA
Lampiran 6 Pembacaan absorbansi sampel konsentrasi protein Lowry Sampel
Absorbansi Terbaca
Absorbansi Terkoreksi 0 -0.056 -0.050 -0.126 -0.105 -0.102 0.010 -0.094 -0.032 -0.038 0.062
Blanko spektro 0.300 Fraksi kasar 1 0.244 Fraksi kasar 2 0.250 Fraksi 0-20 % 1 0.174 Fraksi 0-20% 2 0.195 Fraksi 20-40% 1 0.198 Fraksi 20-40% 2 0.310 Fraksi 40-60% 1 0.206 Fraksi 40-60% 2 0.268 Fraksi 60-80% 1 0.262 Fraksi 60-80% 2 0.362 Contoh Perhitungan: Absorbansi terkoreksi = Absorbansi terbaca – Absorbansi blanko = 0.362 A – 0.300 A = 0.062 A y = 0.112- 2.84.10-4x [protein] -0.056 = 0.112- 2.84.10-4x [protein] = [protein] 599.144 ug/mL = [protein]
Lampiran 7 Karakterisasi enzim invertase hasil percobaaan
[protein] (ug/mL) 599.144 577.746 848.787 773.894 763.195 363.766 734.667 513.555 534.950 178.316
21
Lampiran 8 Bobot molekul marker dengan metode SDS-PAGE Bobot molekul Log Bobot molekul No (KDa) (KDa) 116,0 2,064 1 97,4 1,988 2 66,2 1,82 3 42,7 1,63 4 31,0 1,491 5 20,0 1,301 6 14,4 1,158 7 9,5 0,977 8
RF marker (cm) 0,035 0,088 0,14 0,509 0,667 0,737 0,802 0,982
Log berat molekul marker (KDa)
2.5 2
1.5 y = -1.410x + 2.178 R² = 0.982
1
0.5 0 0
0.2
0.4 0.6 Rf marker (cm)
0.8
1
Gambar 3 Kurva standar bobot molekul marker Lampiran 9 Bobot molekul sampel T1 menggunakan SDS-PAGE No Rf T1 (cm) Log BM (kDa) 1 0,018 2,153 2 0,105 2,03 3 0,175 1,932 4 0,281 1,782 5 0,333 1,709 6 0,406 1,606 7 0,474 1,509 8 0,561 1,387 Lampiran 10 Bobot molekul sampel T2 menggunakan SDS-PAGE No Rf T2 (cm) Log BM (kDa) 1 0,035 2,129 2 0,105 2,03 3 0,316 1,733 4 0,491 1,486 5 0,561 1,387
BM 142,233 107,152 85,427 60,549 51,141 40,348 32,353 24,391
BM 134,598 107,152 54,044 30,616 24,390
23
Lampiran 11 Parameter isolasi protein invertase ragi komersial No
Sampel
Absorbansi Ukur Aktivitas
Absorbansi [produk] Aktivitas (mM) Koreksi
Unit Aktivitas (unit/mL)
1 2 3 4
Blanko aktivitas Blanko protein Blanko kasar Blanko fraksi 020 Blanko fraksi 20-40 Blanko fraksi 40-60 Blanko fraksi 60-80 Fraksi kasar 1 Fraksi kasar 2 Fraksi 0-20 % 1 Fraksi 0-20% 2 Fraksi 20-40% 1 Fraksi 20-40% 2 Fraksi 40-60% 1 Fraksi 40-60% 2 Fraksi 60-80% 1 Fraksi 60-80% 2
0.272 0.533 0.304
0.261 0.032
0.119 0.048
0.327
0.055
0.550
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
[protein] (ug/mL)
[protein] (mg/mL)
Aktivitas Spesifik (unit/mg)
Yield Enzim (%)
Fold Purification (unit/mg)
-
Absorbansi Koreksi Kadar Protein 0.300 -
-
-
-
-
-
0.055
-
-
-
-
-
-
-
0.278
0.124
-
-
-
-
-
-
-
0.352
0.080
0.063
-
-
-
-
-
-
-
5.547 5.547 5.547 0.528 0.586 0.474 0.468 0.354 0.304 0.491
5.014 5.014 5.243 0.224 0.259 0.147 -0.082 -0.196 -0.048 0.139
1.595 1.595 1.665 0.108 0.118 0.026 0.013 -0.022 0.023 0.081
0.922 0.922 10.106 0.375 0.393 -0.181 -0.693 0.913 -0.250 0.112
-0.056 -0.050 -0.126 -0.105 -0.102 0.010 -0.094 -0.032 -0.038 0.062
599.144 577.746 848.787 773.894 763.195 363.766 734.667 513.555 534.950 178.316
0.599 0.578 0.848 0.744 0.763 0.364 0.735 0.514 0.535 0.178
1.539 1.595 11.917 0.484 0.515 -0.497 -0.942 1.776 -0.467 0.630
-
-
Unit aktivitas
=
Aktivitas spesifik =
Yield Enzim =
Unit aktivitas Unit aktivitas
= = 10.106 unit/mL
Aktivitas spesifik =
Yield Enzim = Yield Enzim = 40.67%
Fold Purification = Fold Purification = Fold Purification = 7.604 unit/mg
Aktivitas spesifik = 11.917 unit/mg
1096 40.67 42.62 -19.63 -75.16 99.02 -27.11 12.14
7.604 0.308 0.328 -0.317 -0.601 1.133 -0.298 0.402
1
