2
ISOLASI, KARAKTERISASI, DAN ENUMERASI MIKROBA
Bab ini menguraikan teknik dasar pengambilan contoh tanah, isolasi dan perbanyakan mikroba, prosedur enumerasi (penghitungan) populasi mikroba pada contoh tanah atau kepadatan sel dalam biakan murni, dan pengujian karakter fenotip yang terkait dengan fungsi mikroba bagi tanah, tanaman, dan lingkungan. Salah satu tantangan yang dihadapi dalam analisis mikroba umumnya masih terkait dengan enumerasi populasi. Tantangan yang dihadapi tidak hanya terkait pada pemilihan media yang cocok, tetapi juga berkenaan dengan interpretasi terhadap data hasil analisis yang kadangkadang tidak menggambarkan kondisi yang sebenarnya di lapangan. Hal ini bisa terjadi karena kekeliruan dalam pengambilan contoh ataupun terkontaminasinya media yang digunakan. Prosedur kerja yang ketat dengan mengedepankan higienisitas merupakan syarat utama dalam analisis mikrobiologi. Teknik pengenceran bertingkat dalam enumerasi mikroba pada media cawan agar (plate count) merupakan teknik enumerasi mikroba tertua yang sampai saat ini masih digunakan. Penemuan agar (polisakarida dari ganggang laut) sebagai media padat sangat bermanfaat dalam mempelajari mikroorganisme karena sifat-sifatnya yang unik, yakni mencair pada suhu 100oC dan membeku pada suhu sekitar 40oC serta tahan perombakan oleh kebanyakan mikroorganisme. Selain teknik enumerasi dengan cawan agar, penghitungan populasi mikroba dengan teknik MPN (most probable number), khususnya untuk mikroba yang memiliki karakteristik pertumbuhan tertentu diuraikan secara lebih rinci pada bab ini dengan berbagai variasi cara perhitungan sesuai dengan jenis mikroba yang dianalisis. Secara keseluruhan bab ini bertujuan untuk menyajikan informasi yang cukup tentang langkah-langkah pengambilan contoh tanah dan analisis mikroba yang terkait dengan isolasi, karakterisasi, dan penghitungan populasi. Beberapa jenis analisis disajikan agak lebih detail, seperti analisis cendawan mikoriza, sehingga pengguna dapat dengan mudah menerapkan dan mengikutinya. Selain itu, disertakan dalam bab ini beberapa jenis analisis yang jarang dijumpai dalam buku metode analisis, seperti mikroba pendegradasi polutan, pengakumulasi logam berat, penghasil asam indol asetat (AIA), dan bakteri penghasil siderofor yang sekarang ini mulai banyak dipelajari dan dikomersialkan.
2.1
PENGAMBILAN CONTOH TANAH UNTUK ANALISIS MIKROBA Edi Husen Tanah, dengan kandungan C-organik terbesar di alam, yakni 1,2 – 1,6 x 1015 kg C (Wagner & Wolf, 1997), menyokong kehidupan berbagai jenis mikroba dari beragam tipe morfologi dan fisiologi, baik yang menguntungkan maupun yang merugikan. Banyak diantaranya yang sudah dikomersialkan seperti mikroba penambat N2 dari udara, pelarut P, pemacu tumbuh tanaman, dan pengendali patogen. Berbagai atribut mikroba seperti keragaman jenis, kepadatan populasi, dan laju respirasi menjadi indikator yang potensial untuk menilai kualitas dan kesehatan tanah. Di dalam tanah, keberadaan mikroba sangat dipengaruhi oleh kondisi fisik, kimia, dan biologi tanah. Ungkapan Beijerinck (the Father of Microbial Ecology) “Every-thing is everywhere and the milieu selects” menjelaskan besarnya peran faktor lingkungan dalam seleksi mikroba; lingkunganlah yang memilih, jenis mikroba mana saja yang dapat hidup dan berkembangbiak dalam suatu ekosistem tanah tertentu. Perbedaan berbagai atribut mikroba pada berbagai kondisi tanah disebabkan antara lain oleh perbedaan jenis dan kandungan bahan organik, kadar air, jenis penggunaan tanah dan cara pengelolaannya. Dengan memperhatikan keberagaman ini, teknik pengambilan contoh tanah yang tepat perlu dipahami agar waktu, tenaga, dan biaya yang dicurahkan untuk pengambilan contoh tanah menjadi lebih efisien. Jumlah contoh yang terlalu banyak merupakan pemborosan, namun apabila jumlah contoh terlalu sedikit interpretasi data bisa keliru sehingga informasi yang diperoleh bisa menjadi kurang bermanfaat. 2.1.1 Prinsip Pada prinsipnya pengambilan contoh tanah adalah suatu aktivitas pengumpulan sebagian volume tanah yang mewakili suatu wilayah tertentu secara tepat untuk menghasilkan suatu data atau nilai yang bisa memberi gambaran kondisi tanah di wilayah tersebut secara keseluruhan. Pengambilan contoh harus didahului dengan perencanaan sesuai dengan tujuan pengambilan contoh dan tingkat ketelitian data yang diinginkan. Untuk mendapatkan data tentang suatu atribut mikroba, misalnya kepadatan populasi bakteri Gram negatif pada tanah lapisan atas atau laju respirasi tanah yang dipupuk dengan pupuk hijau (sisa-sisa
2
tanaman segar), maka perlu dirancang cara atau strategi pengambilan contoh tanah, jumlah contoh yang diperlukan, kedalaman pengambilan contoh, dan ukuran contoh yang diperlukan. Strategi pengambilan contoh tanah Pengambilan contoh tanah dapat dilakukan dengan cara: (i) sistematis; (ii) random/acak; (iii) komposit; dan (iv) bebas, tergantung pada tujuan dan sasaran yang ingin dicapai (Wollum, 1994). Beberapa cara lain yang tidak dibahas di sini biasanya dilakukan untuk tujuan khusus seperti evaluasi tingkat pencemaran dengan cara polar sampling atau algorithmorientated sampling oleh Totsche (1995). Pengambilan contoh tanah cara sistematis ataupun cara radom/acak ditujukan untuk mendapatkan nilai maksimum, minimum, dan rata-rata berbagai atribut mikroba pada suatu areal tertentu berdasarkan analisis statistik. Areal dibagi secara proporsional ke dalam beberapa areal kecil untuk pengambilan contoh individu (sampling unit) dimana tiap contoh individu memberikan data sendiri-sendiri. Pada pengambilan contoh cara sistematis, contoh tanah individu diambil di tiap areal kecil, sedangkan pada cara random hanya dilakukan di beberapa areal kecil yang dipilih secara acak (Gambar 1). Cara random lebih menghemat waktu dan biaya asalkan banyaknya contoh individu yang diambil memperhatikan heterogenitas areal lahan (lihat uraian perhitungan jumlah contoh).
A
B = Titik pengambilan contoh
Gambar 1. Pengambilan contoh tanah cara sistematis (A) dan cara random/ acak (B)
3
Pengambilan contoh tanah komposit ditujukan untuk mendapatkan gambaran umum (unbiased estimation) berbagai atribut mikroba di suatu areal atau petak tanah yang relatif homogen. Contoh tanah komposit merupakan campuran dari anak-anak contoh yang diambil dari beberapa tempat pada areal atau petak tanah yg sama secara acak, zigzak, atau diagonal. Tiap areal atau petak tanah diwakili oleh satu contoh tanah komposit. Banyaknya jumlah anak contoh disesuaikan dengan luas areal atau petak tanah. Aturan umum adalah semakin banyak jumlah anak contoh, semakin baik contoh komposit yang dihasilkan (Gambar 2).
A
B
= Titik pengambilan anak contoh
C = Jalur pengambilan
Gambar 2. Titik pengambilan anak contoh untuk contoh komposit dengan pola acak (A), zigzag (B), dan diagonal (C) Pengambilan contoh tanah cara bebas hanya ditujukan untuk keperluan isolasi mikroba (contoh tanah sebagai sumber mikroba). Lokasi atau titik pengambilan contoh dipilih secara bebas sesuai keinginan dan pertimbangan pengguna. Data yang dihasilkan tidak bisa dipakai untuk menggambarkan kondisi umum wilayah di sekitarnya. Jumlah contoh Secara ilmiah tujuan pengambilan contoh adalah untuk mendapatkan beberapa unit contoh dari suatu populasi pada tempat dimana pengamatan dilakukan guna memperoleh perkiraan nilai rata-rata populasi tanpa harus mengambil semua unit contoh dalam populasi tersebut. Dua pertanyaan penting yang perlu diperhatikan adalah apakah populasi terdistribusi secara normal dan seberapa dekat nilai rata-rata yang ditetapkan dengan nilai
4
populasi rata-rata (25%, 10%, atau 5%). Besar kecilnya nilai ini sangat berpengaruh terhadap banyaknya jumlah contoh yang perlu diambil. Sebagai contoh, diasumsikan bahwa populasi terdistribusi normal dan nilai rata-rata contoh yang diinginkan berada dalam 10% dari nilai ratarata populasi yang sebenarnya. Nilai rata-rata dan varian (simpangan baku) dari contoh diperoleh dari hasil pengambilan contoh pendahuluan (presampling). Dengan demikian banyaknya jumlah contoh yang diperlukan untuk selang kepercayaan 95% (tα 0,05) dapat dihitung dengan persamaan berikut: (nilai-t)2 (nilai varian contoh) Jumlah contoh =
(nilai rata-rata contoh) (0,1)2
Penjelasan secara lebih rinci tentang perhitungan banyaknya jumlah contoh dapat dilihat pada Wollum (1994). Kedalaman pengambilan dan ukuran contoh Kedalaman pengambilan contoh tanah disesuaikan dengan jenis penggunaan tanah. Pengambilan contoh pada tanah-tanah pertanian dilakukan pada lapisan olah atau pada kedalaman 20 cm. Untuk tanahtanah padang rumput dan semak/belukar contoh tanah diambil pada lapisan tanah padat akar atau pada kedalaman 10 cm. Pengambilan contoh dari suatu penampang tanah (profil tanah) dilakukan di setiap lapisan horizon tanah. Ukuran (berat) tiap contoh tanah yang diperlukan tergantung pada banyaknya jenis analisis. Secara umum, 100 g tanah per contoh sudah cukup untuk analisis mikroba. 2.1.2 Prosedur Pengambilan Contoh Tanah Alat dan bahan -
Sekop atau sendok tanah Bor tanah Kantong plastik contoh Pisau/gunting Ember atau baskom plastik Kotak es Alkohol 90-95% Kertas/karton label
5
-
Botol selai bertutup atau botol lain yang sejenis (untuk contoh tanah anaerobik) Parafilm atau selotip
Bahan dan peralatan yang akan digunakan harus dalam kondisi bersih dan steril. Sterilisasi alat dapat dilakukan dengan mencuci peralatan menggunakan air bersih, kemudian dibilas atau diusap dengan kapas beralkohol dan dievaporasi dengan nyala api. Cara kerja -
-
Catat keadaan umum fisik lingkungan di lokasi pengambilan contoh, antara lain: jenis penggunaan tanah, vegetasi atau tanaman yang diusahakan, riwayat penggunaan tanah (bila tersedia), lereng, ketinggian tempat, dan keadaan permukaan tanah (berbatu, dan lainlain). Khusus contoh tanah untuk trapping mikroba simbiosis seperti rhizobia, catat tanaman inang (legum) yang tumbuh di lokasi pengambilan contoh dan ambil contohnya untuk diidentifikasi.
1) Pengambilan contoh tanah non-rizosfir - Tanah non-rizosfir merupakan bagian tanah tanpa akar dan tanah yang melekat pada akar. Gambar 3 menyajikan pengambilan contoh tanah komposit non-rhizosfir. - Bersihkan permukaan tanah di lokasi/titik pengambilan contoh dari tanaman dan serasah (litter). Kemudian tetapkan volume penggalian tanah, misalnya 20 x 20 x 20 cm atau 10 x 10 x 20 cm (panjang, lebar dan kedalaman), yang penting ukuran volume pengambilan contoh ini konsisten di tiap titik pengambilan contoh. - Gali tanah dengan sendok tanah atau spatula (kape). Gunakan bor tanah untuk pengambilan contoh tanah pada kedalaman tertentu. - Bersihkan tanah galian dari sisa tanaman dan potongan akar. - Dengan sendok tanah, masukkan sejumlah tanah dengan volume atau berat tertentu (sesuai kebutuhan) ke dalam kantong plastik dan diberi label. Gunakan botol selai bertutup atau yang sejenis untuk contoh tanah anaerobik. Untuk contoh komposit, contoh tanah ini dimasukkan ke dalam ember atau baskom plastik untuk digabung dengan anak contoh tanah lain. Setelah diaduk rata dengan sendok tanah, sejumlah tanah dengan volume atau berat tertentu (sesuai kebutuhan) dimasukkan ke dalam kantong plastik dan diberi label. - Masukkan segera contoh tanah ke dalam kotak es agar terhindar dari suhu tinggi. Pemberian es batu dalam kotak es dilakukan bila perjalanan contoh tanah ke laborato-rium memerlukan waktu lama.
6
-
Untuk penggambilan contoh tanah di tempat lain, cuci semua peralatan dengan air dan sterilkan seperti dijelaskan pada bagian Alat dan Bahan di atas.
Wadah pencampur
Titik sampling
Gambar 3. Titik pengambilan (titik sampling) contoh individu (kiri), baskom (tengah) atau kantong/karung plastik (kanan) sebagai wadah pencampur contoh individu dari berbagai titik sampling untuk mendapatkan satu contoh komposit tanah non-rizosfir 2) Pengambilan contoh tanah rizosfir/rizoplan - Rizosfir merupakan porsi tanah yang langsung dipengaruhi oleh akar tanaman, sedangkan rizoplan adalah permukaan akar dengan tanah yang melekat kuat pada permukaannya. Batas rizosfir dimulai dari permukaan akar sampai ke batas dimana akar tidak lagi berpengaruh langsung terhadap kehidupan mikroba (bisa mencapai 5 mm). - Tetapkan tanaman yang akan digali dan bersihkan permukaan tanah di bawah tajuk dari daun atau serasah. - Gali tanah di bawah tajuk di sekitar perakaran secara perlahanlahan dengan sendok tanah atau spatula. Kemudian pisahkan akar dari bongkahan tanah besar dan membiarkan sebanyak mungkin tanah yang melekat pada akar. - Potong bagian tajuk tanaman di dekat pangkal akar (Gambar 4), kemudian masukkan akar beserta tanah yang melekat ke dalam plastik, beri label, dan selanjutnya masukkan ke dalam kotak es. - Pengambilan contoh rizosfir/rizoplan kedua dari jenis tanaman yang berbeda dilakukan setelah semua peralatan bersih dan steril dengan cara seperti dijelaskan pada bagian alat dan bahan di atas. 2.1.3 Penyimpanan Contoh Tanah Pada dasarnya, penyimpanan contoh tanah untuk analisis mikroba tidak dianjurkan. Namun apabila jumlah contoh terlalu banyak dan tidak memungkinkan untuk segera memproses dan menganalisisnya, maka
7
sebagian contoh dapat disimpan pada kondisi yang sesedikit mungkin terjadinya perubahan. Beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa tekstur tanah, kandungan air awal, dan suhu penyimpanan berpengaruh terhadap parameter biomassa dan aktivitas mikroba (Foster, 1995). Suhu terbaik penyimpanan contoh tanah adalah 2 - 4oC, yakni untuk penyimpanan sampai 4 minggu. Suhu -20oC biasanya digunakan untuk penyimpanan contoh tanah dalam jangka panjang.
Potong
CR
Gambar 4. Akar beserta tanah yang melekat kuat diambil sebagai contoh tanah rizosfir/rizoplan (CR) DAFTAR PUSTAKA Foster, J.C. 1995. Soil sampling and storage. p 49-51. In K. Alef & P. Nannipieri (Eds.) Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press. London. Totsche, K. 1995. Quality – project – design –spatial sampling. p 5-24. In K. Alef & P. Nannipieri (Eds.) Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press. London. Wagner, G. H. & D.C. Wolf. 1997. Carbon transformation and soil organic matter formation. p 218-258. In D.M. Silvia, J.J. Fuhrmann, P.G. Hartel, & D.A Zuberer (Eds.) Principles and Applications of Soil Microbiology. Prentice Hall. New Jersey. Wollum, A.G. 1994. Soil sampling for microbial analysis. p 1-14. In R.W. Weaver, S. Angle, P. Bottomley, D. Bezdicek, S. Smith, A. Tabatabai,
8
& A. Wollum (Eds.) Methods of Soil Analysis (Microbiological and Biochemical Properties). SSSA. Wisconsin, USA.
9
