ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN TAKSONOMI MIKROBA
ISOLASI MIKROBA
Medium dan Biakan
Habitat alami
Medium di Lab.
•Medium: Nutrien yang digunakan organisme untuk tumbuh di luar habitat alaminya •Biakan: Perbanyakan mikroorganisme menggunakan berbagai media
Komponen Media Makronutrien (C, N, P, K) Mikronutrien (Fe, Mg, Ca, Na) Vitamin
Macam Media Mikrobiologis Media
Kimia Tertentu (defined)
Komposisi
kimia penyusun media diketahui dengan pasti
Media
Kompleks (undefined)
Komposisi
kimia penyusun media tidak diketahui dengan pasti Sering tersusun dari ekstrak tanaman atau hewan seperti ekstrak kedelai, ekstrak kecambah, protein susu, dll.
Macam Media Mikrobiologis
Media Padat Media
yang tersusun dari bahan padat
Media Cair Media
yang bahan-bahan penyusunnya dilarutkan dalam air
Media Semipadat Media
yang telah diberi bahan pembuat gel
Agar (paling sering digunakan) Gelatin Silika gel (digunakan bila membutuhkan pembuat gel non-organik)
Tujuan Penggunaan Media Umum Nutrien
Selektif
Broth/Agar, Luria Bertani
& Pembeda
Medium
bebas N
Pengayaan Medium
plus senyawa tertentu
Pengujian Pati
agar, medium nitrat
Media Seletif & Pembeda
Media Selektif Mengandung
bahan yang menghambat pertumbuhan mikroba tertentu tetapi tidak yang lain Seringkali digunakan untuk mengisolasi mikroorganisme tertentu dari populasi mikroorganisme lainnya
Media Pembeda Mengandung
indikator yang menghasilkan reaksi berbeda antar mikroorganisme (contoh, warna koloni berbeda) Digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme
Media Pertumbuhan Selektif
Dimaksudkan untuk memacu pertumbuhan mikrobia yang dikehendaki dan menghambat mikrobia yang tidak dikehendaki Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol (DRBC): antibiotik yang menghambat pertumbuhan bakteri. Cocok untuk isolasi Fungi Brilliant Green Agar: Senyawa kimia cat Green menghambat bakteri Gram (+). Cocok untuk isolasi bakteri Gram (-) Bismut Sulfite Agar: Cocok untuk isolasi Salmonella typhi, menghambat bakteri lain
Differential Media
Coliform pada media Lauryl Tryptone Broth pada suhu 30oC mampu menghasilkan gas, sedangkan non-Coliform tidak tumbuh atau tumbuh tapi tidak menghasilkan gas
Baird Parker Agar: untuk membedakan Staphylococcus aureus
Egg Yolk: S. aureus mampu memecah egg yolk dan menberikan zona bening sekitar koloni
Media Padat (Agar)
Media Cair (Broth)
Media Pengayaan
Memungkinkan pertumbuhan mikroba yang diinginkan Contoh:
Di dalam tanah hanya terdapat sejumlah kecil mikroba pendegradasi fenol di antara berjutajuta mikroba lainnya
Medium yang mengandung fenol diinokulasi tanah tersebut dan diinkubasi Biakan yang mulai tumbuh dipindahkan/reinokulasi ke medium baru (diulang beberapa kali) Hanya mikroba yang mampu memetabolisme fenol yang tumbuh dalam medium tersebut
Pengayaan Azotobacter
Inokulasi media mengandung agar untuk memperoleh koloni tunggal
Biakan campuran
Biakan tunggal
Goresan di permukaan media yang mengandung agar
IDENTIFIKASI MIKROBA YANG TELAH DIISOLASI
Taksonomi Konvensional vs. Molekular
Karakter Fenotipik Termasuk
di dalamnya karakter fisik dan
biokimia Dua mikroba yang tak berhubungan bisa memiliki fenotipe yang sama
Filogeni 70%
DNA terhibridisasi? 97% kesamaan pada 16S rRNA? Mikroba dengan fenotipe berbeda dapat memiliki 16S rRNA yang identik
Karakter Fenotipik yang Digunakan dalam Taksonomi Konventional Morfologi, reaksi pengecatan Gram, dinding sel, lipida, organela inklusi dan penyimpan produk, pigment, penggunaan sumber karbon, penggunaan sumber nitrogen, penggunaan sumber sulfur, produk fermentasi, kebutuhan gas, kisaran suhu, kisaran pH, patogenisitas, hubungan simbiotik, habitat.
Pengecatan Gram
Prosentasi G+C
“Komposisi basa DNA merupakan salah satu karakter yang perlu diketahui untuk melakukan deskripsi minimal dari suatu genera dan spesies” (Lévy-Frébault & Portaels, 1992; Goodfellow& O’Donnell,1993). Seringkali, nisbah GC juga digunakan. Jika
dua mikroba yang diduga berkerabat dekat berdasarkan kriteria fenotipiknya tidak memiliki kemiripan nilai GC, maka pada kenyataannya mereka tidaklah berkerabat dekat.
Kandungan GC Struktur duplek DNA : G-C dan A-T Kandungan G+C (mol% GC) beragam dalam mikroorganisme Titik denaturasi oleh panas meningkat OD260 meningkat.
Kesimpulan:
1. Beda kandungan G+C<5% dalam spesies yang sama 2. Perbedaan %GC hubungan kekerabatan jauh 3. Komposisi basa DNA bermanfaat untuk melihat/mengukur keberagaman genetik
Peranan 16S rRNA
23S rRNA 5S rRNA 34 protein 50S subunit
70S ribosom
16S rRNA 30S subunit
21 protein
Operon Ribosomal RNA (rRNA) 16S-23S ITS
23S-5S ITS
16S rDNA
23S rDNA
1500 bp
3000 bp
5S
Inti
120 bp
Pemrosesan
Sitoplasma 16S rRNA
23S rRNA
5S rRNA
Filogenetik dalam Mikrobiologi 1.
Memahami hubungan evolusioner (= filogenik) antar organisme
2.
Cukup berbeda daripada yang semula dipahami
Ekologi Mikroba
Kemampuan untuk membuktikan struktur komunitas tanpa memerlukan pembiakan
Skema Penentuan Urutan Basa (sequencing) Gen 16S rRNA DNA extraction
16S rRNA gene PCR
DNA Cloning or single-strand prep
Database search
Sequencing Vector + 16S rRNA
Phylogenetic tree
Amplifikasi Gen 16S rRNA menggunakan PCR DNA Genom atau lisat sel elektroforesis Primer PCR dNTP Taq DNA polymerase
95 C, 1 min 60 C, 1 min 35 daur 72 C, 2 mins 1636 bp
Primer 9F (5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)
16S rRNA gene
Primer 1542R (5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’)
Gambar hasil elektroforesis pada gel agarosa dari gen 16S rRNA yang diamplifikasi menggunakan PCR
Urutan basa (sequence) gen 16S rRNA dari galur Chj707T 1 gtttgatcct ggctcaggat gaacgctagc ggnaggccta acacatgcaa gccgagcggt 61 atggatagct tgctatccag agagcggcgt acgggtgcgt aacacgtgtg caacctgcct 121 ttatctgggg gatagccttt cgaaaggaag attaataccc cataatatgg tgtccggcat 181 cggtcgcatt gaaagcctcg gcggatagag atgggcacgc gcaagattag atagttggcg 241 gggtaacggc ccaccaagtc gatgatcttt aggggtcctg agagggagat cccccacact 301 ggtactgaga cacggaccag actcctacgg gaggcagcag tgaggaatat tggacaatgg 361 gtggaagcct gatccagcca tcccgcgtga aggatgacgg tcctatggat tgtaaacttc 421 ttttgtacag ggataaacct gccctcgtga gggcagctga aggtactgta cgaataagca 481 ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg tgcgagcgtt atccggattt 541 attgggttta aagggtccgt aggcgggcct gtaagtcagt ggtgaaatct catagcttaa 601 ctatgaaact gccattgata ctgcaggcct tgagtaaatt tgaagtggct ggaataagta 661 gtgtagcggt gaaatgcata gatattactt agaacaccga ttgcgaaggc aggtcactaa 721 gatttaactg acgctgatgg acgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta 781 gtccacgccg taaacgatgc taactcgttt ttggacttcg ggttcagaga ccaagcgaaa 841 gtgataagtt agccacctgg ggagtacgtc cgcaaggatg aaactcaaag gaattgacgg 901 gggcccgcac aagcggtgga ttatgtggtt taattcgatg atacgcgagg aaccttacca 961 agacttaaat gggaattgac agatttagaa atagatcctc cttcgggcaa ttttcaaggt 1021 gctgcatggt tgtcgtcagc tcgtgccgtg aggtgttagg ttaagtcctg caacgagcgc 1081 aacccctgcc aacagttgcc atcattcagt tggggactct gttgggactg cctacgcaag 1141 tagagaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcacggccc ttacgtcttg ggccacacac 1201 gtaatacaat ggccggtaca gagggcagct acctggtgac aggatgcgaa tctcgaaagc 1261 cggtctcagt tcggattgga gtctgcaact cgactctatg aagctggaat cgctagtaat 1321 cgcgcatcag ccatggcgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaag 1381 ccatggaagt ctggggtacc tgaagtcggt gaccgtaata ggagctgcct agggtaaaac 1441 aggtaactag ggctaagtcg taacaagggg gg
Panjang Total: 1472bp
Hasil Pembandingan terhadap Database NCBI menggunakan program BLAST
Hasil Pembandingan terhadap Database NCBI menggunakan program BLAST
100
59
Chryseobacterium gleum ATCC35910T (M58772) 98 Chryseobacterium indologenes ATCC29897T (M58773) 46 Chryseobacterium joostei LMG18212 (AJ271010) 27 Chryseobacterium proteolyticum 9670 (AB039830) 59 Chryseobacterium defluvii B2T (AJ309324) Chryseobacterium indoltheticum ATCC27950T (M58774) Chryseobacterium balustinum ATCC33487T (M58771) 98 75 95 Chryseobacterium scophthalmum LMG13028T (AJ271009) Chj707T 89 Ko2 100 Ko10 Bergeyella zoohelcum ATCC43767T (M93153) Riemerella anatipestifer ATCC11845T (U10877) 75 62 Riemerella columbina LMG11607T (AF181448) Chryseobacterium meningosepticum ATCC13253T (M58776) Empedobacter brevis ATCC14234T (M59052) 100 Weeksella virosa ATCC43766T (M93152) Ornithobacterium rhinotracheal LMG9086T (U87101) Coenonia anatina LMG14382T (Y17612) Cellulophaga lytica ATCC23178T (M62796) 100 82 Flavobacterium aquatile ATCC11947T (M62797) 98
Pohon filogenetik (cabang ChryseobacteriumBergeyellaRiemerella)
0.02
Resolusi Taksonomik (yang saat ini digunakan)
PEMONITORAN DAN PENGHITUNGAN
Pengukuran Pertumbuhan Mikroba menggunakan Pembiakan
Plate Counts: Dengan membuat pengenceran berseri dari cuplikan
Plate Count/ Pour Plate Media agar dalam cawan Petri diinokulasi (dicampurkan dengan agar pada pour plate atau diratakan di permukaan agar pada plate count) dengan pengenceran berseri
Plate Count/ Pour Plate
Setelah masa inkubasi, jumlah koloni yang muncul di media agar dihitung. Hanya berlaku untuk agar yang memiliki 30-300 koloni (CFUs)
Metoda Most Probable Number (MPN) Menggunakan banyak tabung Yang dihitung adalah tabung yang menunjukkan positif dan dibandingkan dengan tabel statistik MPN
Pengukuran Pertumbuhan Mikroba
Senyawa Organik (CH2O) + O2
CO2 + H2O + senyawa antara metabolisme + materi sel + energi (ATP)
Pengukuran Pertumbuhan Mikroba dengan Pembiakan CO2 + 2 NaOH
Na2CO3 + H2O
Pengukuran Pertumbuhan Mikroba tanpa Pembiakan ATP + D-lusiferin + O2
lusiferase
oksilusiferin + AMP + pirofosfat + CO2 + sinar (562 nm)
DETEKSI MIKROBA TANPA PEMBIAKAN
Metoda Molekular untuk Mendeteksi Mikroba Komponen dinding sel, Protein, Lipopolisakarida
Asam Nukleat
RNA LMW RNA
DNA Teknik menggunakan PCR
LMW (Low Molecular Weight) RNA Molekul RNA yang berberat molekul rendah, memiliki nilai yang tinggi untuk mempelajari keragaman dalam populasi karena karakter khususnya.
Karakter LMW RNA
Stabil selama masa pertumbuhan sel, dan tidak tergantung komposisi media pertumbuhan.
Dimiliki oleh semua jenis sel hidup: prokaryot maupun eukaryot.
Memiliki fungsi yang sama di semua sel hidup: Untuk sintesis protein.
Diduga ada sejak awal evolusi.
LMW RNA Molekul yang mana saja?
5S rRNA 5.8S rRNA tRNA class 1 tRNA class 2
LMW RNA PROFILING: Elektroforesis menggunakan polyacrylamide gels
PROFIL LMW RNA Kenapa bisa disebut sidik jari molekular mikroba? Spesies prokaryot dari genus yang sama menunjukkan 5S rRNA yang identik.
Spesies eukaryot dari genus yang sama menunjukkan kombinasi zona 5S-5.8S rRNA yang identik.
Galur-galur dari spesies prokaryot maupun
eukaryot
menunjukkan identik
profil
yang tRNA
sama yang
METODA ANALISIS DNA Ukuran dan struktur suatu molekul DNA
DNA Plasmid
DNA Kromosom
Derajat kekerabatan antar molekul menggunakan prosedur hibridisasi Kelemahan: i. Kurang stabil di beberapa galur ii. Beberapa galur tak memiliki plasmid iii. Dapat terjadi transfer plasmid antar galur
Teknik terkait PCR
Penentuan urutan basa DNA (sequencing) suatu gen Profiling dari produk PCR yang dielektroforesis
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba PROFILING DNA PLASMID Plasmid adalah molekul asam nukleat
yang paling mudah diuji. Molekul-molekul tersebut berperan penting
karena
membedakan
kemampuan galur mikroba. Kemampuan galur mikroba untuk menjadi
simbion
ditentukan
oleh
atau
patogen
plasmid
yang
dimilikinya. DNA plasmid mudah diekstrak dan dielektroforesis
menggunakan
agarosa sederhana.
gel
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba PROFILING DNA KROMOSOM
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Thermal Gradient Gel Electrophoresis (TGGE)
Prinsip: Berdasarkan amplifikasi zona GC berkeragaman tinggi (hypervariable) dari 16S rDNA, dan pemisahan fragmen DNA yang dihasilkannya menggunakan elektroforesis gel poliakrilamida dengan keberadaan senyawa denaturan atau suhu bergradien linier
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Thermal Gradient Gel Electrophoresis (TGGE)
Keunggulan: dapat dipercaya, reproducible, cepat dan relatif murah Pembatas: Baru dimanfaatkan untuk prokaryot. Sidik jari tidak terkait langsung dengan informasi taksonomi Analisis perbandingan urutan DNA dengan database 16S rDNA Analisis pola hibridisasi dengan probe oligonukleotida spesifik taxon terhadap 16SrRNA
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)
Prinsip: Berdasarkan pembentukan struktur melipat dari benang DNA untai tunggal yang tergantung urutan DNA penyusunnya. Biasanya terdapat di daerah berkeragaman tinggi dari gen 16S rRNA.
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)
Keunggulan: Cepat dan dapat membedakan di tingkat spesies Pembatas: Sidik jari tidak dapat digunakan untuk analisis filogenetik
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Metoda terkait PCR
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
Prinsip: Berdasarkan pola pemotongan menggunakan enzim endonuklease restriksi terhadap produk PCR. Produk PCR dihasilkan menggunakan oligonukleotida primer yang didesain untuk menempel di urutan basa DNA konsensus di berbagai gen (yang paling sering digunakan adalah gen 16S rRNA)
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Metoda terkait PCR
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
Keunggulan: Telah digunakan baik pada prokaryot maupun eukaryot. Pembatas: Kadang-kadang tidak diperoleh pembedaan pada tingkatan taksonomik, tergantung pada zona diterapkannnya enzim endonuklease restriksi.
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Metoda terkait PCR
Length heterogeneity-PCR (LH-PCR)
Prinsip: Berdasarkan keragaman alami dari panjang gen 16SrRNA (atau gen lain). Oligonukleotida berfluoresen digunakan sebagai primer forward, bersama primer reverse yang tidak Pembatas: Tingkat berlabel, untuk mengamplifikasi pembedaan lebih rendah daerah berkeragaman tinggi dari daripada teknik T-RFLP, gen 16 rRNA. Fragmen yang karena kelompok dihasilkan dideteksi berdasarkan taksonomi yang berbeda fluoresensi yang diinduksi laser dapat menghasilkan produk dengan panjang dengan deteksi menggunakan yang sama sequencer otomatis.
Operon Ribosomal RNA (rRNA) 16S-23S ITS
23S-5S ITS
16S rDNA
23S rDNA
1500 bp
3000 bp
5S
Inti
120 bp
Pemrosesan
Sitoplasma 16S rRNA
23S rRNA
5S rRNA
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Metoda terkait PCR
Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA)
Prinsip: Berdasarkan kespesifikan DNA ribosom pada spesies bakteri. Fragmen yang teramplifikasi pada PCR kemudian dielektroforesis. Pola yang diperoleh dianalisis secara matematis.
Tingkat pembedaan pada aras spesies berguna untuk dimanfaatkan pada studi filogenetik dan ekologis
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Metoda terkait PCR
rDNA Internal Spacer Analysis (RISA)
Prinsip: Berdasarkan perbedaan panjang daerah antara (spacer) gen 16S dan 23S rRNA yang teramplifikasi. Spacer ini sangat beragam dalam ukuran dan urutan basanya. Keunggulan: Teknik yang sangat baik untuk mempelajari keragaman populasi, dan dapat membedakan hingga aras spesies. Dapat digunakan untuk karakterisasi galur karena ada perbedaan sangat besar antar galur
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Metoda terkait PCR
Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
Prinsip: Berdasarkan pola yang terbentuk dari elektroforesis langsung hasil PCR menggunakan satu primer pendek dan suhu annealing rendah, yang menghasilkan amplifikasi acak.
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Metoda terkait PCR
Two-primers RAPD (TP-RAPD)
Prinsip: Berdasarkan hasil amplifikasi 16S rDNA menggunakan dua primer universal pada konsentrasi tinggi (10 kali) dengan suhu annealing 50-55ºC
Teknik ini sangat bermanfaat untuk mempelajari taksonomi dan keragaman dengan pembedaan hingga aras spesies pada bakteri dan jamur
Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Metoda terkait PCR
Repetitive element sequence-based PCR (rep-PCR)
Prinsip: Berdasarkan pola elektroforesisi langsung hasil PCR menggunakan primer untuk mengamplifikasi urutan DNA pendek berulang (short repetitive sequence) yang banyak ditemukan di jasad prokaryot. Keunggulan: These techniques show intraspecific variations among microorganisms, and have resolution at species level, so their usefulness is very similar to that of RAPD
DNA Fingerprinting of Microorganism Populations PCR-based methods
Repetitive element sequence-based PCR
Principle: Depending on the number of primers used, there are different techniques based on repetitive sequences: 1 primer:
BOX-PCR
2 primers:
REP-PCR
ERIC-PCR