ISOLASI DAN IDENTIFIKASI PROTEIN PARASPORIN DARI Bacillus thuringiensis
WINAHYU HAPSARI
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi Berjudul Isolasi dan Identifikasi Protein Parasporin dari Bacillus Thuringiensis adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2015
Winahyu Hapsari NIM G84080021
ABSTRAK WINAHYU HAPSARI. Isolasi Dan Identifikasi Protein Parasporin dari Bacillus thuringiensis. Dibimbing oleh AKHMAD ENDANG ZAINAL HASAN dan EDDY JUSUF. Protein kristal dari Bacillus Thuringiensis telah dikenal sebagai insektisida yang aman terhadap kesehatan dan ramah lingkungan. Beberapa tipe protein dari B. thuringiensis juga memiliki kemampuan untuk menghambat sel kanker pada manusia. Tipe protein anti kanker dari galur B. thuringiensis disebut sebagai parasporin. Parasporin yang sampai saat ini telah ditemukan diklasifikasi ke dalam empat famili yaitu parasporin-1, parasporin-2, parasporin-3, dan parasporin-4. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan identifikasi protein parasporin dari B. thuringiensis. Identifikasi tipe protein yang didapatkan beradasarkan bobot molekul menggunakan metode elektroforesis SDS PAGE. Penyebaran bakteri B. thuringiensis terbanyak didapatkan di tanah, batang, dan daun pepohonan. Pada penelitian ini sampel yang digunakan berasal dari tanah dari daerah Ciamis, Sukabumi, Cianjur, Tangerang, dan Purwokerto. Hasil dari isolasi tanah didapatkan 48 nomor isolat yang menghasilkan protein kristal. Dari kelima daerah tersebut, sampel tanah yang berasal dari Ciamis paling banyak menghasilkan isolat protein kristal sedangkan Sukabumi memiliki isolat paling sedikit sebagai penghasil protein berkristal. Hasil elektroforesis SDS PAGE menunjukkan hanya ada dua sampel yang merupakan protein parasporin. Sampel yang berasal dari Ciamis (C3) termasuk kedalam protein parasporin-1, sedangkan sampel yang berasal dari Ciamis (C5) merupakan protein parasporin-3. Kata kunci : Bacilus thuringiensis, protein, parasporin, SDS PAGE WINAHYU HAPSARI. Isolation and Identification of Proteins from Bacillus thuringiensis Parasporin. Supervised by AKHMAD ENDANG ZAINAL HASAN and EDDY JUSUF. Crystal protein from Bacillus thuringiensis has been known as a safe insecticide to health and environmentally friendly. Several types of B. thuringiensis proteins also have the ability to inhibit cancer cells in humans. Type of anti- cancer proteins from B. thuringiensis strain referred to as parasporin. Parasporin which to date have been found classified into four families , namely parasporin - 1 , parasporin - 2 , parasporin - 3 , and parasporin - 4. This study aimed to isolate and identify proteins from B. thuringiensis parasporin. Identify the type of protein molecular weight obtained using SDS PAGE electrophoresis method. The spread of B. thuringiensis bacteria found in most soil, stems , and leaves of trees. In this study, samples were taken from the soil of the area Ciamis, Sukabumi, Cianjur, Tangerang, and Purwokerto. The results of the ground isolation numbers obtained 48 isolates that produce protein crystals. Of the five regions, soil samples from Ciamis most isolates produce crystal protein isolates while Sukabumi have at least as a producer of crystalline proteins. SDS PAGE electrophoresis results showed only two protein samples are parasporin. Samples derived from ciamis ( C3 ) included in parasporin protein - 1 , whereas samples originating from Ciamis ( C5 ) is parasporin protein - 3. Kata kunci : Bacilus thuringiensis, protein, parasporin, SDS PAGE
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI PROTEIN PARASPORIN DARI Bacillus thuringiensis
WINAHYU HAPSARI
Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
PRAKATA Puji dan syukur dipanjatkan atas kehadirat Allah SWT untuk segala rahmat dan karunia-Nya serta salawat dan salam tercurahkan pada Rasulallah SAW sehingga penulisan hasil penelitian ini dapat diselesaikan. Hasil penelitian yang berjudul Isolasi dan Identifikasi Protein Parasporin 2 dari Bacillus thuringiensis. ini ditujukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia. Rasa terima kasih diberikan kepada semua pihak yang telah membantu dalam penyusunan hasil penelitian ini, baik secara langsung maupun tidak langsung. Ucapan terima kasih disampaikan kepada Dr. Ir. Akhmad Endang Zainal Hasan, M.Si sebagai pembimbing skripsi dan Drs. Eddy Jusuf ,DES sebagai pembimbing penelitian yang dilaksanakan di Laboratorium Rekayasa Genetika Bioteknologi, Pusat Penelitian Biologi, LIPI, Cibinong-Bogor. Terima kasih pula kepada Mbak Rere dan Kak Ogi yang telah mendampingi selama penelitian. Tidak lupa pula rasa terima kasih pun diucapkan kepada kedua orang tua, adik, dan seluruh keluarga besar atas segala doa dan dukungan yang sangat berarti bagi penulis. Adapula rasa terima kasih kepada para sahabat Ana, Septhia, Iqbal, Wahyu, Bambang, Tika, Utty, Oji, Arini, Rahma, Ima, Riris, Yudith, Azizah, Tati, Deffy, Deni, dan Fitri atas segala dukungan dan bantuannya selama penulisan hasil penelitian ini. Penulisan hasil penelitian ini masih banyak kekurangannya. Oleh karena itu, diharapkan saran dan kritik membangun yang dapat berguna dalam memperbaiki penulisan hasil penelitian ini. Besar harapan agar hasil penelitian ini bermanfaat bagi semua pihak yang membutuhkan.
Bogor, Mei 2015
Winahyu Hapsari
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan dan Alat
2
Prosedur Penelitian
2
HASIL
4
Isolat B. thuringiensis dari Tanah di Pulau Jawa
4
Hasil Uji Kuantitatif Protein
4
Hasil Elektroforesis SDS PAGE
5
PEMBAHASAN
6
Isolat B. thuringiensis dari Tanah di Pulau Jawa
6
Hasil Uji Kuantitatif Protein
6
Hasil Elektroforesis SDS PAGE
7
SIMPULAN DAN SARAN
7
DAFTAR PUSTAKA
8
LAMPIRAN
10
RIWAYAT HIDUP
13
DAFTAR TABEL 1 Isolat penghasil protein kristal 2 Konsentrasi protein Toksin 3 Bobot molekul
4 4 5
DAFTAR LAMPIRAN 1 2
Alur Penelitian Hasil Analisis Photo-CapMw
10 11
PENDAHULUAN Penyakit kanker merupakan salah satu penyakit penyebab utama kematian di dunia. Menurut data World Health Organization (WHO) tahun 2008, sekitar 7,6 juta kematian disebabkan oleh penyakit tersebut. Jenis kanker yang paling banyak diderita adalah kanker paru-paru, kanker kolon, kanker hati, kanker payudara, dan kanker serviks. Hasil Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas) tahun 2007 menunjukkan prevalensi tumor/kanker adalah 4,3 per 1000 penduduk, artinya dari setiap 1000 orang Indonesia sekitar 4 orang di antaranya menderita kanker. Data dari Sistim Informasi Rumah Sakit (SIRS) 2008 menunjukkan, kanker payudara (18,4%) dan kanker leher rahim atau kanker serviks (10,3%) menduduki urutan pertama dan kedua terbanyak. Beberapa macam bahan kimia telah dikenal sebagai senyawa anti-kanker seperti mytomycin C, doxorubicin HCl, 5-lourouracil, vincristine sulfate, vinblastine sulfate, dan lainnya telah dikomersilkan dalam terapi penyakit kanker. Penggunaan sinar X, sinar gamma, dan pengangkatan jaringan kanker sudah lama diperkenalkan, namun dari semua cara ini masih belum diperoleh adanya penyembuhan total. Dari penelitian sebelumnya diketahui bahwa beberapa tipe protein yang disintesis oleh bakteri Bacillus thuringiensis memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan sel kanker pada manusia. Protein kristal dari B. thuringiensis telah dikenal sebagai racun pada beberapa serangga sehingga banyak digunakan sebagai insektisida dalam bidang pertanian dan kehutanan. B. thuringiensis dikenal sebagai bahan baku pestisida yang baik dalam pertanian dan aman terhadap kesehatan serta ramah lingkungan. Sifat ramah lingkungan tersebut karena protein kristal yang diisolasi dari B. thuringiensis mempunyai target yang spesifik sehingga tidak mematikan serangga yang bukan sasaran serta tidak mencemari lingkungan. Awal abad ke 21 telah diketahui beberapa tipe protein dari B. thuringiensis yang memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan sel kanker pada manusia. Dari beberapa penelitian terdahulu telah diidentifikasi protein cristal dari Bacillus thuringiensis yang merupakan protein non-insektisidal (Ito et al 2005). Protein dengan fungsi unik tersebut saat ini dikategorikan ke dalam suatu kelompok parasporin. Protein kristal anti kanker dari galur B. thuringiensis disebut sebagai parasporin. Istilah parasporin didefinisikan sebagai protein-protein δ-endotoksin yang non-hemolitik tetapi memiliki kemampuan preferensial membunuh sel kanker (Mizuki et al. 2000). Parasporin yang sampai saat ini telah ditemukan diklasifikasi ke dalam empat famili yaitu parasporin -1, -2, -3, dan -4. Keempat parasporin tersebut diisolasi dari B. thuringiensis yang berasal dari lingkungan alamiah di Jepang. Beberapa peneliti sebelumnya melaporkan bahwa lingkungan alam tropis dan sub-tropis di Asia Tenggara merupakan lingkungan yang baik bagi populasi B. thuringiensis. Vietnam merupakan salah satu negara yang telah mengeksplorasi tanahnya. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa protein B.thuringiensis yang diisolasi dari tanah di Vietnam termasuk kedalam famili parasporin-1. Protein tersebut memiliki aktivitas pembunuh sel kanker yang telah diuji secara in vitro dan secara immunologi memiliki kesamaan yang dekat dengan parasporin-1(cry 31Aa) yang telah ditemukan di Jepang. Penemuan ini memperkuat pendapat bahwa parasporin dapat diproduksi tidak hanya di Jepang tetapi di daerah Asia lainnya (Yasutake et al. 2005).
memperkuat pendapat bahwa parasporin dapat diproduksi tidak hanya di Jepang tetapi di daerah Asia lainnya (Yasutake et al. 2005). Indonesia merupakan negara ke-2 setelah Brazil yang sangat kaya dengan keanekaragaman sumber daya hayati.Besar kemungkinan galur bakteri tersebut dapat diperoleh. Penelitian ini difokuskan untuk mengeksplorasi sumber daya hayati Indonesia, khususnya tanah yang mengandung protein parasporin dari B. thuringiensis yang memiliki aktivitas sitosidal paling besar dan sel kanker sasaran yang lebih banyak (Ohba et al 2009). B.thuringiensispenghasil protein toksin yang berpotensi tidak hanya sebagai anti serangga tetapi juga sebagai anti kanker, kemudian mengidentifikasi tipe protein yang didapatkan berdasarkan bobot molekulnya.
METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan yaitu tanah yang diambil secara acak dari Ciamis, Sukabumi, Cianjur, Tangerang, dan Purwokerto, buffer fosfat, bacto agar, tripton, triptos, yeast ekstrak, glukosa, MnCl2, NaCl, MgSO4. 7H2O, FeSO4.7H2O, CaCl. 4H2O, ZnSO4, K2HPO4, malachit green, commasie blue, safranin, aquadest, aquabidest, SDS 1%, beta merkapto etanol 0.01%, bovine serum albumin, alkohol, acrylamide/bis acrylamide 30/0.8, tris 3M pH 8,8, tris 1M pH 6,8, SDS 10%, amonium persullfat 10%, TEMED, buffer SDS, SDS commasie blue. Peralatan yang diperlukan di antaranya pipet Mohr, pipet tetes, pipet volumetrik, labu Erlenmeyer, neraca analitik, tabung reaksi, cawan petri, vortex, penangas air, laminar air flow, pipet mikro, mikroskop, kaca preparat, tusuk gigi, bunsen, sentrifus, microtube, microwave, peralatan elektroforesis, dan Spektrofotometer UV-Vis. Prosedur Penelitian Pembuatan Media Media yang digunakan pada penelitian ini yaitu media modifikasi sporulasi (HCO) dan media LA. Media modifikasi HCO dibuat dari campuran 4 g bacto agar, 3 g tripton, 2 g triptos, 1.5 g yeast ekstrak, dan garam-garam mineral yaitu 0.005 M MnCl2, 0.05% NaCl, 0.02% MgSO4.7H2O, 0.00005% FeSO4.7H2O, 0.018 g CaCl2. 4H2O, 3 g glukosa, 0.0005 g ZnSO4, dan 0.5 K2HPO4. Sedangkan media LA dibuat dari campuran 4 g bacto agar, 10 g tripton, 5 g yeast ekstrak, dan 10 g NaCl. Isolasi Bakteri Bacillus thuringiensis yang berasal dari tanah (Travera1987) Sampel tanah sebanyak 1 gram dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril, kemudian dicampurkan dengan 10 mL bufer fosfat lalu diaduk kuat sampai homogen. Campuran tersebut dipanaskan pada suhu 70oC selama 30 menit sambil terus diaduk.Sebanyak 5 µL, 10 µL, dan 20 µL disebarkan ke cawan petri yang telah berisi media HCO.Kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama kurang lebih 72 jam. Dari semua sampel dipilih 24 koloni tunggal yang memiliki kesamaan morfologi, bentuk, dan aroma yang sama dengan B.
thuringiensispembanding. Koloni tersebut dipindahkan ke cawan petri yang berisi media LA kemudian diinkubasi selama kurang lebih 72 jam. Setelah itu dipindahkan ke media HCO baru diinkubasi pada suhu ruang selama kurang lebih 72 jam sampai terjadi sporulasi. Untuk mengetahui adanya sporulasi dilakukan observasi menggunakan mikroskop dengan perbesaran 40x. Koloni yang telah bersporulasi diambil sedikit untuk dibuat preparatkemudian diobservasi kembai dengan mikroskop untuk dilihat protein kristalnya. Koloni yang dipastikan membentuk protein kristal dipanen dan dikoleksi sebagai isolat baru dalam media LA miring. Isolasi Protein Bakteri Bacillus thuringiensis(Bel 1997) Koloni yang telah dipanen dimasukkan ke dalam mikrotube yang telah berisi NaCl 0.5 M dingin sebanyak 0,5 mL diaduk rata sampai homogen menggunakan vorteks. Campuran tersebut selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 13.000 g selama 10 menit. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang, sedangkan pelet diresuspensi dengan NaCl 0.5 M dingin sebanyak 0,5 mL lalu disentrifugasi dengan kecepatan dan lama waktu yang sama. Kemudian supernatan dibuang, pelet disuspensi dengan 140 µL campuran antara SDS 1% dengan 0.01% β-merkaptoetanol dan dipanaskan pada suhu 100oC selama 10 menit. Selanjutnya disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13.000 g selama 20 menit.Supernatan dikumpulkan untuk digunakan pada uji kuantitatif protein dan elektroforesis SDS PAGE. Uji Kuantitatif Protein (Kresze 1983) Sebanyak 50 µL sampel dicampur dengan akuades sampai volumenya tepat 2 mL.Campuran tersebut kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Selanjutnya dihitung dengan rumus : Konsentrasi Protein (mg/ml) = 1.55 A280 – 0.76 A260 Elektroforesis Gel Poliakrilamida Sodium Dodesil Sulfat (SDS PAGE) (Laemli 1970) Preparasi Sampel. Supernatan hasil isolasi protein diambil sebanyak 20 µL dan ditambahkan dengan 20 µL bufer sampel. Bufer sampel terdiri dari campuran 0.15 M tris/HCl pH 8.8, 3.75 M EDTA, 0.75 M sukrosa, 0.075% bromphenol blue, 2.5% SDS dan 7.4 mM dithiotreitol. Campuran supernatan dan bufer sampel dihomogenkan dan dipanaskan pada suhu 100oC selama 10 menit. Preparasi Gel Elektroforesis.Running Gel 13%Sebanyak 4.33 mL Acrylamide/bisacrylamide (30/08)dicampurkan dengan 4.22 mL aquabidest, 1.25 mL tris 3M pH 8.8, 100 µL SDS 10 %, 100 µL amonium persulfat, dan ditambahkan TEMED sebanyak 8 µL. Campuran tersebut selanjutnya dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam kaca elektroforesis. Jika ada gelembung ditambahkan aquabidest diatas permukaan gel tersebut. Stacking Gel.Sebanyak 0.8 mL Acrylamide/bisacrylamide (30/08)dicampurkan dengan 3.40 mL aquabidest, 0.625 mL tris 1M pH 6.8, 50 µL SDS 10 %, 50 µL amonium persulfat, dan ditambahkan TEMED sebanyak 6 µL. Selanjutnya campuran segera dimasukkan sedikit demi sedikit diatas running gel yang telah dibuat kemudian sisir dipasang di dalam gel tersebut.
Loading Sampel.Hasil gel yang telah dibuat dipasang pada perangkat elektroforesis kemudian larutan bufer SDS dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis. Sampel dimasukkan ke dalam sumur sebanyak 30 µL. Elektroforesis dilakukan selama kurang lebih 3 jam dengan tegangan listrik sebesar 75 volt. Pewarnaan.Gel hasil elektroforesis diangkat kemudian diwarnai dengan pewarna coomassie briliant blue stanning gel selama kurang lebih 24 jam. Selanjutnya gel diangkat dan dimasukkan ke dalam aquadest lalu dipanaskan hingga pita terlihat jelas. Penentuan Bobot Molekul Bobot molekul ditentukan memakai program Photocap MW. Photo-capMw merupakan program yang dapat digunakan untuk mengkuantifikasi gel hasil elektroforesis dan imuno elektrofokusing (Gibas dan Jambeck 2001).
HASIL Isolat B. thuringiensis dari Tanah di Pulau Jawa Berdasarkan hasil isolasi yang dilakukan terhadap beberapa sampel tanah diperoleh 5 sampel yang memiliki kemiripan dengan koloni B. thuringiensis.Lima daerah tersebut adalah Ciamis, Sukabumi, Cianjur, Tangerang, dan Purwokerto. Hasil dari isolasi terpilih 48 nomor isolat yang menghasilkan protein kristal. Isolat penghail protein kristal dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1 Isolat Penghasil Protein Kristal Sampel tanah
Isolat Penghasil Protein Kristal
Ciamis 1
C1, C3, C5, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C14, C17, C18, C20, C22, C23
Sukabumi
S2, S3, S5, S7
Ciamis 2
M1, M3, M4, M6, M8, M9, M13
Cianjur 2
J’1, J’12
Tangerang
T2, T3, T4, T7
Cianjur 1
J2, J5, J7, J11
Unsud
U1, U2, U4, U5, U6, U7, U11, U12, U13, U14, U15, U16
Uji Kuantitatif Protein Kuantifikasi protein dilakukan untuk mengetahui kadar protein kristal yang telah diisolasi. Konsentrasi protein didapatkan melalui pengukuran absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.Konsentrasi yang paling tinggi sebesar 1.08741 mgml-1 berasal dari tanah di Ciamis sedangkan konsentrasi protein paling rendah sebesar 0.06135mgml-1 berasal dari tanah di Sukabumi.Konsentrasi protein toksin dari sampel dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2 Konsentrasi Protein Toksin Sampel Konsentrasi Protein (mg/mL)
C1
C3
C5
C7
C8
C9
0.75374
0.74397
1.0841
0.91406
0.63845
0.49103
Lanjutan C10 0.54005
C11 0.83708
C12 0.86812
C14 0.5115
C17 0.61294
C18 0.95413
C20 0.88843
C22 1.16942
C23 103.578
S2
S3
S5
S7
M1
M3
M4
M6
M8
0.09983
0.06153
0.31775
0.16463
0.24876
0.20597
0.13628
0.13889
0.21864
M9
M13
J'1
J'12
T2
T3
T4
T7
J2
0.20016
0.20216
0.18448
0.13544
0.21685
0.32755
0.14246
0.13754
0.47037
J5
J7
J11
U1
U2
U4
U5
U6
U7
0.44289
0.17542
0.24909
0.034
0.010
0.049
0.030
0.051
0.052
U11
U12
U13
U14
U15
U16
0.022
0.052
0.085
0.020
0.009
0.025
Elektroforesis SDS PAGE Penentuan bobot molekul protein menggunakan metode Laemli.Dapat diketahui dari 48 sampel, hanya ada dua sampel yang merupakan protein parasporin. Hasil elektroforesis dapat dilihat pada gambar 1. Sampel yang berasal dari ciamis (C3) termasuk kedalam protein parasporin-1, sedangkan sampel yang berasal dari Ciamis (C5) merupakan protein parasporin-3. Bobot molekul dan tipe parasporin dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3 Bobot Molekul sampel
Bobot Molekul (kDa)
C3 C5
81.1 64.8
Tipe Parasporin PS 1 PS 3
200 150 100 75 50
81 64
37
25 Gambar 1 Hasil elektroforesis
PEMBAHASAN Isolat B. thuringiensis dari Tanah di Pulau Jawa Bacillus thuringiensis merupakan bakteri Gram positif, berspora, bersifat aerob, berbentuk batang memiliki ukuran lebar 1,0 - 1,2 µm dan panjang 3 - 5 µm. Penyebaran bakteri ini terbanyak didapatkan di tanah, makanan ternak, batang dan daun pepohonan serta lingkungan perairan (Thanabalu et al. 1992). Sampel tanah diambil dari beberapa daerah yang berbeda, yaitu Ciamis, Sukabumi, Cianjur, Tangerang, dan purwokerto. Sampel tanah dari masing-masing daerah diambil sebanyak 1gram, dicampur dengan 10 mL bufer fosfat kemudian diaduk sampai homogen. Campuran tersebut disebarkan ke cawan petri yang berisi media. Kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 72 jam. Berdasarkan hasil isolasi beberapa sampel tanah di daerah Ciamis, Sukabumi, Cianjur, Tangerang, dan purwokerto diperoleh 48 isolat yang menghasilkan protein kristal. Dari kelima daerah tersebut, sampel tanah yang berasal dari Ciamis paling banyak menghasilkan isolat protein kristal sedangkan Sukabumi memiliki isolat paling sedikit sebagai penghasil protein berkristal. Hal tersebut menunujukkn bahwa kandungan sampel tanah yang diambil pada daerah itu berbeda. Sampel tanah pada daerah Ciamis lebih banyak mengandung zat-zat yang diperlukan bagi pertumbuhan B. thuringiensisyaitu mineral, karbon, dan nitrogen. Selain itu sumber air, kondisi lingkungan, kelarutan oksigen dalam tanah, pH, dan temperatur juga dapat mempengaruhi. Uji Kuantitatif Protein Penentuan konsentrasi protein rekombinan dilakukan dengan metode berdasarkan Caprrette (1995).Perhitungan tersebut dilakukan menggunakan mesin spektrofotometri UV.Konsentrasi protein di ukur pada panjang gelombang 260 dan 280.Konsentrasi yang paling tinggi sebesar 1.08741 mgml-1 berasal dari tanah di Ciamis sedangkan konsentrasi protein paling rendah sebesar 0.06135mgml1 berasal dari tanah di Sukabumi.Perbedaan kadar protein pada masing-masing sampel dapat disebabkan dari perbedaan jumlah biomassa isolat yang didapat dan
dipengaruhi oleh proses sporulasi dari isolat pada masing-masing sampel dalam menghasilkan protein toksin (Yusuf 2009). Elektroforesis SDS PAGE Elektroforesis merupakan suatu cara untuk memisahkan fraksi-fraksi campuran berdasarkan atas pergerakan partikel-partikel koloid yang bermuatan dibawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis pada umumnya digunakan untuk menentukan berat molekul (BM), mendeteksi kemurnian dan kerusakan protein atau asam nukleat, menetapkan titik isolistrik, serta memisahkan spesies-spesies yang berbeda secara kualitatif dan kuantitatif (Bintang 2010). Salah satu metode elektroforesis yang umumnya digunakan untuk analisa protein secara kualitatif adalah SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamid Gel Elektroforesis). Prinsip dasar metode adalah pergerakan molekul protein pada media yang dialiri arus listrik. Molekul protein akan bergerak dari katoda ke anoda, pergerakan molekul protein dipengaruhi oleh ukuran, bentuk, dan muatan elektrik protein tersebut (Koolman dan Roehm 2005). Berdasarkan hasil SDS-PAGE yang dianalisis menggunakan PhotocapMwhanya ada dua sampel yang merupakan protein parasporin. Photo-capMw merupakan program yang dapat digunakan untuk mengkuantifikasi gel hasil elektroforesis dan imuno elektrofokusing (Gibas dan Jambeck 2001).Pada prinsipnya pengukurannya adalah bersifat kuantitatif dengan menunjukkan intensitas dan bobot molekul suatu molekul dari hasil elektroforesis asam nukleat atau protein. Kedua sampel yang termasuk protein parasporin berasal dari ciamis. Sampel C3 termasuk ke dalam protein parasporin-1 dengan bobot molekul 81.1 kDa sedangkan sampel C5 termasuk protein parasporin-3 dengan bobot molekul 64.8 kDa. Parasporin-1 (PS-1) merupakan protein Cry yang berukuran 81kDa yang tersusun dari 723 asam amino. Protein ini dikenal sebagai Cry31Aa2. Aktivitas sitosidal terjadi apabila protein telah didegradasi oleh protease menjadi molekul kecil yang berukuran 60kDa. Mekanisme sitosidal dari protein ini adalah meningkatkan dengan cepat kepekatan ion bebas Ca 2+ intraseluler dengan tanpa perubahan permeabilitas membran plasma dan sel-sel kanker dibunuh melalui apoptosis (Kitada et al. 2005). Parasporin-3 (PS-3) berukuran aktif pada ukuran 64 kDa setelah pemecahan protease. Mekanisme penghambatan tumbuh sel kanker belum diungkap dan reseptor yang mengenali protein ini pada membran sel-sel kanker belum diketahui (Kitada et al 2005).
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Terdapat 48 isolat B. thuringiensis yang ditemukan dari tanah di daerah Ciamis, Sukabumi, Cianjur, Tangerang, dan Purwokerto. Dari ke 48 isolat tersebut hanya dua isolat yang termasuk ke dalam protein parasporin. Sampel C3 termasuk ke dalam protein parasporin-1 dengan bobot molekul 81.1 kDa
sedangkan sampel C5 termasuk protein parasporin-3 dengan bobot molekul 64.8 kDa. Saran Berdasarkan hasil penelitian ini, disarankan agar dilakukan isolasi bakteri Bacillus thuringiensis yang berasal dari tanah di luar Pulau Jawa. Metode isolasi protein perlu diperbaiki dengan metode pemurnian protein agar didapatkan hasil yang lebih maksimal.
DAFTAR PUSTAKA Bel Y. Granero F. Alberola TA. Martinez-Sebastian MJ. Ferre J. 1997. Distribution, frequency, and Diversity of Mosquito Strains of Bacillus thuringinsisin Olive Environments in Spain. J. Biochem. Ed 20 : 52-658. Bintang. 2010. Teknik Penelitian Biokimia. Jakarta : Erlangga. CarpretteDR. 1995. Absorbance assay (280). Terhubungberkalawww.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/abs280.html. [13 Juni 2012] Collins FS and Trent JM. 2001. Cancer Genetics. Dalam: Fenton RG and Longo DL (Eds). Cell Biology of Cancer. McGraw Hill, NY. Gibas C and Jambeck P. 2001. Bioinformatics Computer Skills. United States of America : O’Reilly & Associates, Inc. Hayakawa T. Kanagawa R. Katani Y. Kimura M. Yamagiwa M. Yamane Y. Sotakebe. Sakai H. 2007. Parasporin 2Ab, a newly isolated cytotoxic crystal protein from Bacillus thuringiensis. Microbiol. 55 :278-283. Kitada S. Abe Y. Ito A. Kuge O. Akao T. Mizuki E. Ohba M. 2005. Molecular Identification and Cytocidal Action of Parasporin a Protein Group of Novel Crystal Toxins Targetting Human Cancer Cells. Conferense on the Biotechnology of Bacillus thuringiensis and its Enviromental Impact. 23-27. Koolman J, Roehm KH. 2005. Atlas of Biochemistry. Ed ke-2. New York : Thieme. Kresze G. Muensterer H. 1983. Bis(methoxycarbonyl)sulfur diimide, a convenient reagent for the allyc amination of alkenes. The Journal of Organic Chemistry. 48 : 3561-3564 Laemli UK. 1970. Nature. 227 : 680-685 Mizuki E. Park Y. Saitoh H. Yamashita S. Akao T. Higuchi K. Ohba M. 2000. Parasporin, a human leukemic cell-recognizing parasporal protein of
Bacillus thuringiensis. Clinicaland Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (4) : 625-634. Ohba M, Mizuki E, Uemori A. 2009. Parasporin, a new anticancer protein group from Bacillus thuringiensis. Anti Cancer. 29 : 427-434. Yasutake K. Binh ND. Kagoshima K. Uemori A. Ohgushi A. Maeda M. Mizuki E. Yu YM. Ohba M. 2006.Occurrence of parasporin-producingBacillus thuringiensis in Vietnam. Canadian Journal of Microbiology. 52(4): 365372. Yusuf E. 2009. Exploration of Bacillus thuringiensisδ-endotoxin protein distribution around Jabodetabek region. MicrobiologyIndonesia 3.2 : 51-55 Zakaria FR. 2001. Pangan dan Pencegahan Kanker. Teknologi dan Industri Pangan 12. 2 : 171-177 Zeigler D. 1999. Bacillus Genetic Stock Center of Strains, Part 2 ; Bacillus thuringiensis dan Bacillus cereus. USA : The Ohio State University.
Lampiran 1 Diagram Alir penelitian Sampel tanah
Isolasi bakteri Isolasi protein dari bakteri
Uji kualitatif protein
Elektroforesis SDS PAGE Penentuan bobot molekul
Lampiran 2 Hasil Photo-capMw
C8 66.8 kDa
C5 64.5 kDa C1 92.6 kDa
C3 81.1 kDa
C9 106.5 kDa
C7 72.4 kDa
C17 58.8 kDa C10 62.8 kDa
S2 143.9 kDa
M9 125.2 kDa
C11 65.1 kDa
S3 116.5 kDa
M13 116.8 kDa
C12 69.7 kDa
S5 127.8 kDa
C20 60.1 kDa
C14 96.8 kDa
S7 127.8 kDa
J’1 58.2k Da J’12 134 kDa
C18 80.4 kDa
M1 101.5 kDa
T2 214.9 kDa
C22 72.0 kDa
M3 105.1 kDa
M4 111.2 kDa
C23 76.7 kDa
M6 135.7 kDa
M8 98.9 kDa
J7 117.5 kDa
J2 144 kDa
U1 92.9 kDa
U11 79.1 kDa
J11 160.4 kDa
T3 92.8 kDa
T4 88.7 kDa
T7 155.1 kDa
J11 160.4 kDa
J5 148.0 kDa
U2 129 kDa
U12 84.8 kDa
U4 129 kDa
U13 80.2 kDa
U5 139.4 kDa
U14 82.5 kDa
U6 143.6 kDa
U15 84.8 kDa
U7 47.4 kDa
U16 123.5 kDa
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Kota Bogor pada tanggal 2Agustus 1990 dari ayah yang bernama Bambang Moeryantoro dan ibu yang bernama Martini. Penulis adalah anak pertama dari tiga bersaudara.Adik perempuan penulis bernama Arini Murwindarti dan Amelia Chairunnisa. Pada tahun 2008 penulis lolos seleksi masuk perguruan tinggi negeri di Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Pilihan mayor yang penulis ambil adalah Biokimia yang berada di bawah Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama penulis mengikuti perkuliahan di IPB, penulis pernah mengikuti beberapa organisasi dan kepanitian.Organisasi yang pernah diikuti penulis adalah Gentra Kaheman, dan CREBs. Kepanitian yang pernah penulis ikuti adalah Lomba Karya Ilmiah Populer(LKIP) sebagai anggota divisi publikasi dekorasi tahun 2009, Musyawarah Besar Himpunan Mahasiswa Biokimia pada tahun 2009 sebagai anggota divisi humas, Koordinator divisi konsumsi pada Biokimia Expo pada tahun 2010, fieldtrip I biokimia sebagai koordinator divisi konsumsi pada tahun 2010, Masa Perkenalan Departemen Biokimia pada tahun 2010 sebagai sekretaris, fieldtrip II biokimia pada tahun 2011 sebagai koordinator divisi konsumsi, Masa Perkenalan Departemen Biokimia pada tahun 2011 sebagai penanggung jawab kelompok, dan Siang Keakraban Biokimia pada tahun 2012 sebagai koordinator divisi konsumsi. Penulis dalam bidang karya ilmiah pernah mendapatkan dana bersaing dari Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) dalam Pekan Kreativitas Mahasiswa (PKM) pada tahun 2010 dengan judul Pembuatan Cangkang Kapsul Dari Pektin Kulit Buah Markisa Sebagai Upaya Jaminan Halal Obat-Obatan, serta pada tahun 2012 dengan judul Ameliorasi Sel Hati Akibat Sindrom Metabolik Melalui Terapi HerbalPada Tikus (RattusNovergicus) Dengan Pemanfaatan Limbah Kulit Kayu Mahoni (Swietenia Macrophylla King.). Selain itu penulis pada tahun 2012 terpilih sebagai peserta Bank Indonesia Entrepreneurship Program. Penulis melakukan Praktik Lapangan di Laboratorium Bahan Alam, Balai Penelitian South East Asian Regional for Tropical Biology (SEAMEO BIOTROP), Jalan Raya Tajur KM 6, Bogor.Judul dari Praktik Lapangan yang penulis lakukan adalah Peningkatan Kandungan Protein Tepung Onggok Melalui ProsesFermentasi Substrat PadatDengan Bantuan Aspergillus Niger.
