ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS ENZIM AMILASE KASAR TERMOFILIK DARI SUMBER AIR PANAS SEMANGAT GUNUNG KABUPATEN KARO, SUMATERA UTARA TESIS

8

ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS ENZIM AMILASE KASAR TERMOFILIK DARI SUMBER AIR PANAS SEMANGAT GUNUNG KABUPATEN KARO, SUMATERA UTARA

TESIS

Oleh

JUSUF GINTING 067030012/BIO

SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2009 Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8


TESIS

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains dalam Program Studi Magister Biologi pada Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara

Oleh

JUSUF GINTING 067030012/BIO

SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2009 Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

Judul Tesis

:


Nama Mahasiswa :

Jusuf Ginting

Nomor Pokok

:

067030012

Program Studi

:

Biologi

Menyetujui, Komisi Pembimbing :

(Prof. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc.) Ketua

Ketua Program Studi

(Prof. Dr. Dwi Suryanto, M. Sc.)

(Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc.) Anggota

Direktur

(Prof. Dr. Ir. T. Chairun Nisa B., M.Sc)

Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

Tanggal lulus : 27 September 2008 Telah diuji pada Tanggal 27 September 2008

PANITIA PENGUJI TESIS Ketua

:

Anggota :

Prof. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc. 1. Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc. 2. Dr. Herla Rusmarilin, M.S. 3. Dr. Delvian, MP.


8

ABSTRAK

Isolasi bakteri dan uji aktivitas enzim amilase kasar termofilik dari sumber air panas Desa Semangat Gunung, Kabupaten Karo telah dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara, dari bulan Pebruari sampai dengan Agustus 2008. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan dan karakterisasi bakteri termofil yang berpotensi amilolitik serta mengetahui aktivitas enzim amilase. Kemampuan isolat bakteri dalam menghidrolisis pati ditunjukkan dengan adanya zona bening di sekitar koloni setelah ditambahkan larutan iodin 0,1%. Tiga isolat yang dipilih menghasilkan zona bening terbesar yaitu SG.3 dengan diameter zona bening 52,56 mm, diikuti SG.2 sebesar 48,75 mm dan SG.1 sebesar 26,15 mm. Konsentrasi glukosa terbesar hasil hidrolisis pati pada penelitian ini adalah 1074,07 μg/ml setelah diinkubasi selama 48 jam pada suhu 65oC dan pH 7,0. Suhu dan pH optimum aktivitas enzim amilase pada penelitian ini adalah 60 oC dan 5,0-7,0. Kata kunci: Amilase, termofilik, amilolitik, hidrolisis pati.


8

ABSTRACT

A study on bacterial isolation and activity assay of crude amylase of thermophilic bacteria from Desa Semangat Gunung hot spring has been carried out in Microbiology Laboratory, Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, University of Sumatera Utara from February to August 2008. This study was aimed to obtain and to characterize the thermophilic bacteria that had an amylolytic potentional and to know the activity of crude amylase enzyme. The ability of isolates to hydrolize starch was indicated by clearing zone around bacterial colonies after addition of 1% iodine solution. Three isolates with wider clearing zone were chosen for further work. The result showed that SG.3 produced clearing zone with diameter of 52.26 mm, followed by SG.2 (48.75 mm) and SG.1 (26.15 mm). The highest concentration of glucose released was 1074.07 μg/ml after incubated for 48 hours at temperature of 65oC and pH of 7.0. The optimum temperature and pH for the enzyme activity in this study was 60oC and 5.0-7.0 respectively. Key words: Amylase, thermophilic, amylolytic, starch hydrolysis.


8

KATA PENGANTAR

Dengan rendah hati, penulis mengucapkan puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas anugerah dan berkat-Nya yang telah diberikan, sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan tesis dengan judul, “Isolasi Bakteri dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara”. Tesis ini merupakan salah satu persyaratan penyelesaian studi pada Program Studi Magister Biologi, Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara. Pada kesempatan ini penulis menyampaikan terima kasih kepada: Prof. dr. Chairuddin P. Lubis, DTM&H, Sp. A(K) selaku Rektor Universitas Sumatera Utara. Prof. Dr. Ir. T. Chairun Nisa B, M.Sc. selaku Direktur Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk mengikut i Program Studi Magister Biologi di Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara Medan. Kepala Bappeda Pemerintah Propinsi Sumatera Utara yang telah memberikan beasiswa kepada penulis dan Kepala Dinas Pendidikan Kota Medan yang telah memberikan izin untuk mengikut i Program Studi Magister Biologi di Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara Medan. Prof. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc. selaku Dosen Pembimbing I dan Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc. selaku Dosen Pembimbing II yang telah membimbing penulis sehingga dapat menyelesaikan penelitian dan menyempurnakan tesis ini. Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

Seluruh Staf Pengajar pada Program Studi Magister Biologi Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara, yang telah memberikan ilmunya selama masa perkuliahan. Rekan-rekan Mahasiswa Program Studi Magister Biologi Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara yang telah memberikan bantuan moril dan materil serta dorongan kepada penulis dalam penulisan tesis ini. Keluarga Besar Ginting di Tanjung Morawa dan Keluarga Besar Pasaribu di Medan yang tetap mendorong dan mendoakan penulis dalam penyelesaian studi. Terakhir penulis mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada Istri tercinta Dra. Roslina Pasaribu yang tidak kenal lelah memberi semangat dan tetap mendukung dalam doa selama masa studi. Akhir kata penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak/Ibu/Saudara/i dan rekan sekalian yang telah membantu penulis baik secara langsung maupun tidak langsung. Semoga Tuhan Yang Maha Esa memberkati kita semua.

Medan, 3 Juni 2009 Penulis,

Jusuf Ginting


8

DAFTAR ISI

Halaman ABSTRAK ...................................................................................................... ABSTRACT ...................................................................................................... KATA PENGANTAR ...................................................................................... DAFTAR ISI ................................................................................................... DAFTAR TABEL ............................................................................................ DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... BAB 1 PENDAHULUAN................................................................................ 1.1. Latar Belakang............................................................................ 1.2. Perumusan Masalah .................................................................... 1.3. Tujuan Penelitian ........................................................................ 1.4. Hipotesis ..................................................................................... 1.5. Manfaat Penelitian ...................................................................... BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................... 2.1. Enzim ......................................................................................... 2.2. Enzim Amilase ........................................................................... 2.3. Bakteri Termofilik ...................................................................... 2.4. Enzim Termostabil...................................................................... 2.5. Potensi Enzim α-amilase dalam Industri...................................... BAB 3 METODE PENELITIAN ..................................................................... 3.1. Waktu dan Tempat ...................................................................... 3.2. Bahan dan Alat ........................................................................... 3.3. Sumber Isolat .............................................................................. 3.4. Pengambilan Sampel Air Panas................................................... 3.5. Isolasi Bakteri ............................................................................. 3.6. Pembuatan Suspensi Isolat Bakteri 108 CFU/ml Untuk Pengujian ........................................................................ 3.7. Pengujian Produksi Enzim α-amilase .......................................... 3.8. Uji Biokimia Metabolisme Bakteri.............................................. 3.9. Pembuatan Media Produksi Enzim Amilase ................................ 3.10. Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase Kasar ............................... 3.11. Pembuatan Kurva Baku Glukosa ................................................. 3.12. Analisis Data .............................................................................. BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................ 4.1. Isolasi, Seleksi dan Karakter Bakteri Penghasil Amilase ............. 4.2. Aktivitas Enzim Amilase Isolat Termofil Semangat Gunung ......

i ii iii v vii viii ix 1 1 3 4 5 5 6 6 7 9 10 13 15 15 15 15 16 16 17 18 18 20 20 21 22 23 23 25


8

4.3. Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim Amilase ................... 4.4. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase ....................... BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................ 5.1. Kesimpulan................................................................................. 5.2. Saran .......................................................................................... DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................

27 31 35 35 35 36


8

DAFTAR TABEL

Nomor 1.

Judul

Halaman

Enzim Termostabil yang Menghidrolisis Pati dan Mikroorganisme Sebagai Sumbernya ...............................................................................

11

2.

Reaksi Biokonversi dan Penggunaan Enzim Termostabil .......................

12

3.

Penggunaan α-amilase Dalam Beberapa Sektor Industri ........................

14

4.

Sidik Ragam ..........................................................................................

22

5.

Karakter Isolat Bakteri Termofilik Penghasil Enzim Amilase Dari Sumber Air Panas Desa Semangat Gunung, Kabupaten Karo ..........

24

Diameter Zona Bening Pada Berbagai Isolat Bakteri Termofilik Penghasil Enzim Amilase Setelah Inkubasi Selama 72 Jam ....................

26

Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Amilase Yang Diukur Sebagai Konsentrasi Glukosa Isolat Semangat Gunung ........................

28

Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Amilase Yang Diukur Sebagai Konsentrasi Glukosa Isolat Semangat Gunung ..........................

32

6.

7.

8.


8

DAFTAR GAMBAR

Nomor 1.

2.

3.

Judul

Halaman

Pembentukan Zona Bening oleh Isolat Bakteri Termofilik Penghasil Amilase Isolat Semangat Gunung ..........................................

26

Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Amilase Yang Diukur Sebagai Konsentrasi Glukosa Isolat Semangat Gunung ..........................

30

Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Amilase Yang Diukur Sebagai Konsentrasi Glukosa Isolat Semangat Gunung ..........................

33


8

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor

Judul

Halaman

1.

Isolasi Bakteri Dari Sampel Air Panas ...................................................

40

2.

Karakterisasi Isolat Bakteri Penghasil Enzim Amilase ...........................

41

3.

Pembuatan Suspensi Isolat Bakteri 108 CFU/ml ....................................

42

4.

Pengujian Produksi Enzim Amilase oleh Isolat Bakteri .........................

43

5.

Pembuatan Kultur Untuk Produksi Enzim Amilase ................................

44

6.

Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase Kasar .........................................

45

7.

Uji Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar ...............

46

8.

Uji Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar ..................

47

9.

Pembuatan Larutan Kontrol Penguji Aktivitas Enzim Amilase ..............

48

10.

Pembuatan Kurva Standar Glukosa .......................................................

49

11.

Sidik Ragam Pengaruh Suhu Terhadap Konsentrasi Glukosa Hasil Hidrolisis Pati Isolat Semangat Gunung .......................................

50

Sidik Ragam Pengaruh pH Terhadap Konsentrasi Glukosa Hasil Hidrolisis Pati Isolat Semangat Gunung .......................................

51

13.

Gambar Pewarnaan Gram ......................................................................

52

14.

Gambar Uji Biokimia ............................................................................

52

15.

Gambar Sumber Air Panas Desa Semangat Gunung ..............................

53

12.


8

BAB 1 PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Penggunaan enzim secara tidak langsung dalam berbagai proses telah dilakukan sejak awal peradaban manusia. Sekarang ini, hampir 4000 macam enzim telah diketahui, dan 200 diantaranya digunakan secara komersial. Mayoritas enzim yang digunakan dalam industri adalah bersumber dari mikroorganisme. Hingga tahun 1960-an, total penjualan enzim hanya beberapa juta dollar per tahun, tetapi mulai saat itu pasar enzim bertumbuh secara spektakuler (Godfrey and West, 1996). Enzim adalah protein yang mengkatalis reaksi kimia. Pada reaksi enzimatis, molekul pada awal proses disebut substrat, dan enzim merubahnya menjadi molekul yang berbeda. Hampir semua proses dalam sel hidup membutuhkan enzim untuk mempercepat reaksi. Enzim sangat spesifik terhadap substrat dan dapat menghasilkan produk utama hampir tanpa produk sampingan. Keunggulan-keunggulan ini menyebabkan enzim menjadi katalis hayati yang jauh lebih unggul daripada katalis kimiawi. Prospeknya sebagai biokatalis yang ramah lingkungan karena proses yang efisien, spesifik, dan tidak menghasilkan limbah yang merepotkan sehingga sangat dinantikan oleh kalangan industri manufaktur dan masyarakat yang mencintai lingkungan. Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

Industri pati adalah salah satu pengguna enzim terbesar untuk hidrolisis dan modifikasi bahan mentahnya. Polimer pati, seperti polimer-polimer lainnya memerlukan kombinasi enzim-enzim untuk melengkapi hidrolisisnya. Kombinasi ini meliputi α-amilase, glukoamilase atau β-amilase dan isoamilase atau pullulanase 1 (Poonam and Dalel, 1995). Dari seluruh konsumsi enzim di dunia, enzim penghidrolisis pati digunakan sebanyak 30% (Van der Maarel et al., 2002). Pati didegradasi oleh enzim amilolitik dari sejumlah mikroorganisme (Lin et al., 1997). Amilase dari tumbuhan, hewan dan mikroorganisme telah dipelajari sejak pertama sekali enzim ditemukan (Boyer et al., 1972). α-amilase adalah salah satu enzim yang paling penting dan banyak digunakan dalam bioteknologi sekarang ini. Enzim yang bersumber dari mikroorganisme secara umum banyak diminati oleh industri. Spektrum pemakaian enzim amilase secara luas digunakan di berbagai bidang seperti medis, kimia analisis, industri tekstil, industri makanan dan industri penyulingan (Pandey et al., 2000). Amilase

merupakan enzim

yang

menghidrolisis

molekul pati untuk

memberikan produk yang bervariasi termasuk dekstrin dan polimer-polimer kecil yang tersusun dari unit-unit glukosa (Windish and Mhatre, 1965). Enzim-enzim ini memiliki jumlah yang besar digunakan dalam bioteknologi dalam pembuatan roti, makanan, tekstil dan industri kertas. α-milase memiliki kira-kira 25% dari seluruh pasar enzim, hampir menggantikan hidrolisis kimia pati pada industri pengolahan pati (Pandey et al., 2000). Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

Penggunaan enzim termostabil secara luas telah diterapkan dalam bidang industri, yaitu: α-amilase dalam industri pati (Poonam and Dalel, 1995), sejumlah 3 pemakaian yang lain yaitu pada tahapan perkembangan yang bervariasi. Dalam industri makanan, enzim ini telah digunakan dalam sintesis asam amino (Satosi et al., 2001). Dalam bidang perminyakan, kimia dan industri pulp dan kertas, enzim termostabil telah digunakan untuk melenyapkan sulfur yang mengandung polutan pada biodegradasi senyawa kimia seperti dibenzitiofen (Bahrami et al., 2001), pada produksi 1,3-propandiol dari gliserol dan pada penggantian reagen kimia pencemar yang menyebabkan terbentuknya produk yang beracun (Peter et al., 2001). Enzim termostabil adalah enzim yang stabil dan aktif pada suhu yang lebih tinggi dari pada suhu optimum untuk pertumbuhan mikroorganisme (Saboto et al., 1999). Enzim termostabil adalah enzim yang paling diinginkan oleh kebanyakan industri. Enzim α-amilase termostabil telah digunakan secara luas dalam proses pembuatan bir, produksi gula, industri tekstil dan dalam industri pembuatan deterjen (Hewitt and Solomons, 1996). Setiap penggunaan enzim α-amilase memerlukan kekhususan spesifitas, stabilitas, suhu dan pH. Seleksi mikroorganisme dengan aktifitas α-amilase yang tinggi dapat memfasilitasi penemuan amilase yang baru yang sesuai untuk digunakan dalam industri (Gupta et al., 2003). Fermentasi termofilik juga dianggap sangat baik digunakan dalam bidang teknik dan pemeliharaan lingkungan (Kristjanson, 1989).


8

1.2. Perumusan Masalah Banyak industri yang dalam proses produksinya memerlukan bantuan enzim. Pada umumnya enzim yang diperlukan adalah enzim yang tahan terhadap suhu tinggi 4 karena proses kimia dalam industri banyak yang berlangsung pada suhu tinggi yaitu di atas 40oC. Oleh karena itu, kebutuhan akan enzim yang bersifat termostabil sangat tinggi. Salah satu enzim yang berperan sangat penting dalam industri dan bioteknologi adalah enzim amilase. Dilaporkan bahwa kebutuhan akan enzim amilase termostabil bagi industri adalah yang terbesar dibandingkan dengan enzim-enzim lainnya. Indonesia merupakan salah satu wilayah yang memiliki aktifitas vulkanologi yang relatif tinggi dan banyak memiliki sumber geotermal sehingga memiliki peluang yang cukup besar sebagai sumber mikroorganisme penghasil enzim amilase termostabil. Salah satu sumbernya adalah kolam sumber air panas yang cukup banyak tersebar di Indonesia termasuk di Sumatera Utara, diantaranya adalah sumber air panas yang terletak di Desa Semangat Gunung, Merdeka, Karo, Sumatera Utara. Melalui penelitian ini akan diselidiki apakah terdapat bakteri termofilik penghasil amilase dalam sumber air panas di Desa Semangat Gunung, Merdeka, Karo, Sumatera Utara.

1.3. Tujuan Penelitian


8

a.

Untuk mendapatkan isolat bakteri yang memiliki potensi amilolitik dari kolam sumber air panas di Desa Semangat Gunung, Merdeka, Karo, Sumatera Utara.

b.

Untuk mengetahui karakter bakteri termofil yang bersifat amilolitik dari kolam sumber air panas.

c.

5 Untuk mengetahui aktivitas enzim amilase kasar dari isolat bakteri termofil.

1.4. Hipotesis a.

Terdapat beberapa isolat bakteri termofilik yang mampu menghasilkan enzim amilase dari sumber air panas di Desa Semangat Gunung, Merdeka, Karo, Sumatera Utara.

b.

Terdapat perbedaan karakter diantara isolat bakteri termofilik penghasil enzim amilase.

c.

Terdapat perbedaan aktivitas enzim amilase kasar dari isolat-isolat bakteri termofilik tersebut.

1.5. Manfaat Penelitian a.

Sebagai informasi bahwa terdapat bakteri termofilik penghasil enzim amilase di kolam sumber air panas Desa Semangat Gunung, Merdeka, Karo, Sumatera Utara.


8

b.

Sebagai sumber informasi untuk penelitian lebih lanjut terhadap usaha eksplorasi enzim amilase yang bersifat termostabil.


8

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Enzim Enzim adalah suatu atau beberapa gugus polipeptida (protein) yang berfungsi sebagai katalis (senyawa yang mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi) dalam suatu reaksi kimia. Enzim bekerja dengan cara menempel pada permukaan molekul zat-zat yang bereaksi dan dengan demikian mempercepat proses reaksi. Sebagian besar enzim bekerja secara khas, yang artinya setiap jenis enzim hanya dapat bekerja pada satu macam senyawa atau reaksi kimia. Hal ini disebabkan perbedaan struktur kimia tiap enzim yang bersifat tetap. Sebagai contoh, enzim αamilase hanya dapat digunakan pada proses perombakan pati menjadi glukosa (Maton et al., 1993). Kerja enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, terutama adalah substrat, suhu, keasaman, kofaktor dan inhibitor. Tiap enzim memerlukan suhu dan pH optimum yang berbeda-beda karena enzim adalah protein, yang dapat mengalami perubahan bentuk jika suhu dan pH berubah. Di luar suhu atau pH yang sesuai, enzim tidak dapat bekerja secara optimal atau strukturnya akan mengalami kerusakan. Hal ini akan menyebabkan enzim akan kehilangan fungsinya sama sekali. Kerja enzim juga dipengaruhi oleh kofaktor dan inhibitor (Maton et al., 1993).


8 7

2.2. Enzim Amilase 6 Amilase adalah nama yang diberikan kepada enzim glikosida hidrolase yang memecah pati menjadi molekul maltosa. Enzim ini ditemukan terutama pada air liur. α-amilase bekerja dalam ikatan α-1,4-glikosida. α-amilase adalah enzim yang pertama

ditemukan

dan

diisolasi.

α-amilase

dari

tumbuhan,

hewan

dan

mikroorganisme telah dipelajari sejak enzim ditemukan untuk pertama kalinya (Boyer and Ingle, 1972). α-amilase merupakan salah satu enzim yang sangat penting dalam bidang bioteknologi sekarang ini. Enzim yang bersumber dari mikroorganisme secara umum banyak diminati oleh industri. Spektrum pemakaian enzim amilase secara luas digunakan di berbagai bidang seperti medis, kimia analisis, industri tekstil, industri makanan dan industri penyulingan (Pandey et al., 2000). Enzim amilase dapat diklasifikasikan ke dalam 3 (tiga) kelompok, yaitu: 1. Alfa amilase (α-amilase) α-amilase (EC 3.2.1.1) memiliki nama lain yaitu 1,4-α-D-glukan glukano hidrolase; glikogenase. Enzim ini menghidrolisis pati, glikogen, dan polisakarida lainnya

melalui

pemutusan

ikatan

α-1,4-glikosida

secara

acak.

Karena

kemampuannya bekerja di bagian manapun dari substrat, α-amilase bekerja lebih cepat daripada β-amilase. Enzim α-amilase terdapat pada bermacam-macam bakteri, jamur, tumbuhan, dan hewan dan memiliki peranan yang besar dalam penggunaan polisakarida. α-amilase merupakan enzim penting dalam industri. Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

Pada umumnya α-amilase adalah metaloenzim, yang membutuhkan ion kalsium (Ca2+) untuk aktifitas, integritas struktural dan untuk stabilitasnya (Bordbar and Omidiyan, 2005). α-amilase dapat dibagi ke dalam 4 kelompok, yaitu endoamilase, eksoamilase, enzim pemutus cabang dan transferase (Van der Mareel et al, 2002). Endoamilase memutus ikatan α-1,4, eksoamilase memutus ikatan α-1,4 atau α-1,6 dari residu glukosa eksternal, enzim pemutus cabang menghidrolisis ikatan α-1,6 rantai panjang polisakarida, dan transferase memutus ikatan α-1,4 glikosida molekul donor dan mentransfer bagian dari donor kepada akseptor glikosida membentuk ikatan glikosida baru. 2. Beta amilase (β-amilase) β-amilase (EC 3.2.1.2) memiliki nama lain 1,4-α-D-glukan maltohidrolase; glikogenase; sakarogen amilase. β-amilase juga disintesis oleh bakteri, jamur, dan tumbuhan. β-amilase mengkatalis hidrolisis ikatan kedua dari α-1,4 glikosida, memutuskan dua unit glukosa pada saat yang sama. Selama proses pematangan buah, β-amilase memecah pati menjadi gula, menghasilkan rasa manis pada buah yang matang. β-amilase juga ada pada perkecambahan, dimana α-amilase dan protease memperlihatkan bahwa perkecambahan telah dimulai. Sejumlah mikroorganisme juga menghasilkan amilase untuk mendegradasi pati ekstraseluler. Jaringan hewan tidak memiliki

β-amilase,

kecuali

bila

mikroorganisme

terdapat

dalam

saluran

pencernaannya. pH optimum β-amilase adalah 12. 3. Gamma amilase ( γ-amilase ) Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

γ-amilase (EC 3.2.1.3) memiliki nama lain glukan 1,4-α-glukosidase; 1,4-α-D9 glukan glukohidrolase; exo-1,4-α-glukosidase; glukoamilase; lisosomal α-glukosidase Pemutusan ikatan akhir α(1-4) glikosida pada ujung non reduksi dari amilose dan amilopektin, menghasilkan glukosa, γ-amilase juga memutuskan ikatan α(1-6) glikosida. γ-amilase sangat efisien pada lingkungan yang bersifat asam dan bekerja pada pH optimum 3.

2.3. Bakteri Termofilik Organisme termofilik diartikan sebagai organisme yang mampu hidup pada suhu tinggi. Organisme ini tidak hanya mampu bertahan hidup tetapi bahkan tumbuh subur dalam air mendidih (Brock, 1985). Bakteri dibagi menjadi beberapa kelas berdasarkan suhu dimana mereka dapat tumbuh dengan baik. Bakteri dengan suhu yang rendah adalah psikrofil, yang dapat tumbuh baik hingga suhu -10oC dan suhu optimum 15 oC atau lebih rendah. Mesofil dapat tumbuh pada suhu 20–45oC. Termofil tumbuh dengan subur pada suhu di atas 45oC, dan beberapa hidup pada suhu atau bahkan diatas titik didih air. Strain bakteri termofilik telah diidentifikasi dengan rentang suhu optimum dari 55oC hingga 105oC Kemampuan bakteri termofilik tumbuh pada suhu tinggi dan menghasilkan enzim ekstraseluler yang stabil merupakan pertanda adanya kemungkinan peningkatan produksi dan aktifitas enzim mereka melalui rekayasa genetika. Oleh


8

karena itu, mikroorganisme ini merupakan kandidat pertama untuk menghasilkan enzim yang digunakan dalam industri (Hisotsuyanagi, 1979). Mikroorganisme, sebagaimana halnya makhluk hidup lainnya, menyesuaikan 10 diri dengan lingkungan tempat mereka hidup. Organisme termofilik mengandung protein yang bersifat termostabil dan tahan terhadap denaturasi dan proteolisis (Kumar et al., 2001). Membran sel termofilik dibentuk oleh asam lemak jenuh. Asam lemak melengkapi suatu lingkungan hidrofobik untuk sel dan menjaga kekakuan sel untuk hidup pada suhu yang meningkat (Herbert et al., 1992).

2.4.

Enzim Termostabil Mikroorganisme termofilik dipercaya berpotensi menjadi pilihan yang baik

sebagai sumber enzim termostabil. Bakteri termofilik dapat diisolasi dari lingkungan alam yang bersuhu tinggi yang tersebar di seluruh dunia dan ditemukan di daerah yang memiliki gunung berapi aktif (Brock, 1985). Enzim termostabil memungkinkan terjadinya proses pada suhu tinggi, yang jelas menguntungkan sebab memiliki reaktifitas yang tinggi, stabilitas yang lebih tinggi, hasil yang lebih tinggi, viskositas yang rendah dan masalah kontaminasi yang lebih rendah (Moszhaev, 1993). Enzim termostabil dapat diperoleh dari organisme mesofilik dan termofilik, bahkan psikrofil memiliki beberapa enzim termostabil (Adams et al., 1995). Enzim termostabil yang diisolasi dari organisme termofilik memiliki sejumlah pemakaian secara komersil oleh karena stabilitasnya (Demirijan et Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

al., 2001). Keuntungan dari bioproses yang berlangsung pada suhu tinggi adalah kecepatan difusi yang lebih tinggi, menurunkan viskositas substrat, kecepatan reaksi lebih tinggi (Milo et al., 1999), meningkatkan kelarutan reaktan, dan mengurangi risiko terjadinya kontaminasi dengan mikroba patogen (Műtzel et al., 1997). 11 Polimer pati memerlukan suatu kombinasi enzim untuk melengkapi hidrolisisnya. Kombinasi enzim ini meliputi γ-amilase, glukoamilase atau β-amilase dan isoamilase atau pullunase (Poonam and Dalel, 1995). Tabel 1 berikut ini menunjukkan enzim termostabil yang menghidrolisis pati yang diperoleh dari mikroorganisme. Tabel 1. Enzim termostabil yang menghidrolisis pati dan mikroorganisme sebagai sumbernya (Underkofler, 1976) Enzim α-amilase

β-amilase

Mikroorganisme Bacillus amyloliquefaciens Bacillus licheniformis Bacillus stearothermophilus Bacillus subtilis Lactobacillus manihotivorans Myceliophtora thermophila Pyrococcus furiosus Pyrococcus woesei Staphylothermus marinus Thermococcus aggreganes Thermococcus celer Thermococcus fumicolans Thermococcus hydrothermalis Thermococcus profoundus Bacillus circulans Bacillus cereus var. mycoides Bacillus sp. Clostridium thermosulphurogenes

Suhu optimal ( oC )

pH optimal

70 100 70 – 80 70 55 100 100 100 65 100 90 95 85 80 60 50 50 75

7,0 6,0 – 6,5 5,0 – 6,0 7,0 5,5 5,6 5,5 6,5 – 7,5 5,0 5,5 5,5 4,0 – 6,3 4,8 – 7,8 4,0 – 5,0 7,5 5,5


8

Pullulanase

Bacillus sp. Pyrococcus furiosus Pyrococcus woesei Thermococus aggregans Thermus caldophilus GK 24 Thermococus celer Thermococcus hydrothermalis Thermococcus litoralis Thermotoga maritima MSB8

60 98 100 100 75 90 95 98 90

5,5 5,5 – 6,0 6,5 5,5 5,5 5,5 12 5,5 6,0

Beberapa konversi biokatalitik enzim termostabil dan penggunaannya dalam industri dapat dilihat dalam Tabel 2. Tabel 2. Reaksi biokonversi dan penggunaan enzim termostabil (Haki and Rakshit, 2003)

Enzim α-amilase ( bakteri ) α-amilase ( jamur ) Pullulanase Xylanase Kitinase

Rentang suhu (oC ) 90 – 100

Pati → dekstrosa

50 – 60

Pati → dekstrosa

50 – 60 45 – 65, 105 65 – 75

Pati → dekstrosa Bubur kayu → xylan + lignin Kitin → kitobiose Kitin → N-asetil glukosamin N-asetil glukosamin → glukosamin Kitin → kitosan Selulosa → glukosa

Biokonversi

Aplikasi Hidrolisis pati, pembuatan bir, pembuatan roti dan deterjen Produks i maltosa Produksi sirup glukosa Industri kertas Industri makanan, kosmetik, farmasi, agro kimia

Selulase

45 – 55, 95

Protease

65 – 85

Protein → asam amino dan peptida

Hidrolisis selulosa, degradasi polimer dalam deterjen Pembuatan roti, pembuatan bir, deterjen, industri kulit

Lipase

30 – 70

Pelepasan lemak,

Industri susu, deterjen,


8

DNA polimerase

90 - 95

hidrolisis, inesterifikasi, alkoholisis, aminolisis DNA amplifikasi

bubur kertas, farmasi, kosmetik dan industri kulit Teknik genetika / PCR

13

2.5. Potensi Enzim α-amilase Dalam Industri Amilase merupakan enzim yang paling penting dan keberadaannya paling besar. Pada bidang bioteknologi, enzim ini diperjual belikan sebanyak 25% dari total enzim yang lainnya. Amilase didapatkan dari berbagai macam sumber, seperti tumbuhan, hewan dan mikroorganisme. Amilase yang berasal dari mikroorganisme banyak digunakan dalam industri. Hal ini dikarenakan mikroorganisme periode pertumbuhannya pendek. Amilase pertama kali yang diproduksi adalah amilase yang berasal dari fungi pada tahun 1894 (Burhan et al, 2003). Enzim α-amilase merupakan enzim yang banyak digunakan pada berbagai macam makanan, minuman dan industri tekstil. α-amilase ekstra seluler dihasilkan dari beberapa bakteri, diantaranya adalah Bacillus coagulans, B. stearothermophilus dan B. licheniformis (Pandey et al, 2000). α-amilase termostabil memiliki nilai komersial yang luas dalam penggunaannya dalam memproses pati, pembuatan bir dan produksi gula (Leveque et al, 2000), industri tekstil dan dalam proses pembuatan deterjen (Hewitt and Solomons, 1996). Sifat termostabil yang dimiliki oleh enzim Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

merupakan karakter yang diinginkan oleh banyak industri yang menggunakan enzim (Morgan and Priest, 1981). Penggunaan enzim α-amilase dalam beberapa sektor industri ditunjukkan pada Tabel 3 di bawah ini.

14

Tabel 3. Penggunaan α-amilase dalam beberapa sektor industri (Van der Mareel et al, 2002) Sektor Industri makanan

Industri deterjen Industri kertas Industri tekstil Industri farmasi

Penggunaan Produksi sirup glukosa, kristalin glukosa Produksi sirup fruktosa jagung Produksi sirup maltosa Pengurangan viskositas sirup gula Pengurangan pembentukan uap pada jus Pelarutan dan pembentukan gula pati untuk fermentasi alkohol dalam industri bir Penghambat pembusukan pada industri roti Digunakan sebagai bahan tambahan untuk menghilangkan kotoran dari pati Pengurangan viskositas pati pada kertas Pencegahan pembesaran pada serat tekstil Digunakan sebagai bantuan pencernaan


8

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian dilakukan pada bulan Pebruari sampai Agustus 2008 bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara.

3.2. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah yeast ekstrak, bacto pepton, MgSO4.7H2O, NaCl, CaCl2.2H2O, KCl, pati, hidrogen peroksida 3%, iodium, kristal violet, aquadest, gram iodin, alkohol, safranin, reagen dinitrosalicilyc acid (DNS), sitrat buffer fosfat. Alat yang digunakan adalah botol sampel steril, termometer, indikator pH universal, shaker, forteks, water bath, bunsen, pipet ukur, propipet, jarum ose, petri dish, tabung reaksi, autoklaf, inkubator, gelas objek, erlenmeyer, hot plate, magnetic stirer, oven, test tube, mikroskop, kamera foto, spectrofotometer, sentrifuge, jangka sorong.

3.3. Sumber Isolat


8

16 Sumber isolat dalam penelitian ini adalah air dari sumber air panas Desa Semangat Gunung, Kabupaten Karo, Sumatera Utara. 3.4. Pengambilan Sampel Air Panas 15 Sampel air panas diambil dari sumber air panas Desa Semangat Gunung, Kabupaten Karo, Propinsi Sumatera Utara, dari 3 tempat yang berbeda. Sebelum sampel air diambil, terlebih dahulu dilakukan pengukuran parameter fisik dan kimia di lapangan. Parameter pertama yang diukur adalah suhu air di tiap titik pengambilan sampel dengan menggunakan termometer yang dicelupkan selama 3 menit ke dalam tiap sumber pengambilan sampel. Parameter ke dua adalah pH air pada setiap titik pengambilan sampel yang diukur dengan indikator pH universal dengan cara dicelupkan ke permukaan air, lalu warna yang diperoleh dicocokkan dengan tabel pH yang tertera pada kotak pH universal. Sampel air diambil dari kolam sumber air panas dengan kedalaman 40 cm dari permukaan air sebanyak 200 ml dari setiap titik pengambilan, kemudian dimasukkan ke dalam botol steril dan diberi label dan selanjutnya dimasukkan ke dalam termos agar suhu air dapat dipertahankan. Sampel air kemudian dibawa ke Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA, Universitas Sumatera Utara, untuk dilakukan isolasi.

3.5. Isolasi Bakteri Isolasi bakteri dilakukan dengan menggunakan media padat yang mengandung pati 10 g, yeast ekstrak 2 g, bacto pepton 5 g, MgSO4.7H2O 0,5 g, NaCl 0,5 g, Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

CaCl2.2H2O 0,15 g, agar 20 g yang dilarutkan dalam 1000 ml aquadest (pH diatur 17 sampai pH 7). Larutan dipanaskan dan disterilisasi dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121oC, kemudian dituang ke dalam cawan petri steril sebanyak 15 ml. Sampel diambil sebanyak 0,1 ml dan disebarkan di atas lempeng agar dengan menggunakan hockey stick untuk menumbuhkan bakteri. Hal ini dilakukan sebanyak dua kali ulangan untuk setiap sampel yang berbeda. Isolat diinkubasi selama 24 jam pada suhu 60oC. Setiap koloni yang berbeda dimurnikan kembali pada medium segar dengan metode cawan gores. Isolat murni bakteri yang diperoleh kemudian dikarakterisasi melalui pengamatan morfologi koloni yang meliputi bentuk koloni, tepi koloni, elevasi koloni, warna koloni, uji bakteri gram positif dan negatif, dan sejumlah uji biokimia yang meliputi uji katalase, uji hidrolisis pati, uji hidrolisis gelatin, uji sitrat, uji TSIA dan uji motilitas. Alur kerja dapat dilihat pada Lampiran 1 dan 2.

3.6. Pembuatan Suspensi Isolat Bakteri 108 CFU/ml Untuk Pengujian Bakteri yang digunakan dalam pengujian dibuat dalam bentuk suspensi. Dengan menggunakan jarum ose diambil 1-2 ose biakan bakteri lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril yang telah berisi larutan NaCl fisiologis 0,85%. Campuran kemudian dihomogenkan dengan vortex, kekeruhan campuran dibandingkan dengan kekeruhan McFarland 0,5 standard yang setara dengan 108 CFU/ml. Alur kerja dapat dilihat pada Lampiran 3. Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

Bahan untuk pembuatan larutan McFarland adalah BaCl2 (1,175% 10/v BaCl2) dan H2SO4 (1% v/v). 0,05 ml dari 0,048 M BaCl2 ditambahkan pada 99,5 ml 0,35 N 18 H2SO4.

3.7. Pengujian Produksi Enzim Amilase Sebanyak 0,1 ml suspensi bakteri diteteskan ke dalam cawan petri yang berisi media produksi amilase, lalu diinkubasi selama 72 jam pada suhu 65oC. Tiap koloni yang tumbuh pada media pati tersebut ditetesi dengan reagen iodium untuk menyeleksi bakteri penghasil enzim amilase. Isolat yang menghasilkan enzim amilase ditunjukkan oleh adanya zona bening di sekitar koloni bakteri. Diameter zona bening diukur dengan menggunakan jangka sorong. Tiap isolat yang positif menghasilkan enzim amilase melalui uji iodin ini digunakan untuk pengujian selanjutnya. Alur kerja dapat dilihat pada Lampiran 4.

3.8. Uji Biokimia Metabolisme Bakteri 3.8.1. Uji Katalase Sebanyak 2 tetes hidrogen peroksida diteteskan pada kaca objek, kemudian satu ose isolat bakteri termofil amilase diletakkan di atasnya. Uji katalase positif ditandai dengan dihasilkannya gelembung udara. Adanya gelembung udara menunjukkan banyaknya gas oksigen yang dihasilkan (Lay, 1994). 3.8.2. Uji hidrolisis pati Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

Satu ose isolat bakteri dari suspensi biakan diambil lalu digoreskan pada media pati dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 65oC. Permukaan koloni ditetesi dengan iodin. Uji positif ditunjukkan dengan adanya zona bening disekeliling koloni (Lay, 19 1994).

3.8.3. Uji hidrolisis gelatin Satu ose inokulum ditusukkan ke bagian tengah media gelatin semi padat lalu diinkubasi selama 5 hari pada suhu 65oC dan didinginkan dalam lemari pendingin selama 15 menit. Uji positif bila terdapat cairan pada permukaan media (Lay, 1994). 3.8.4. Uji Sitrat Satu ose isolat bakteri digoreskan ke dalam tabung yang berisi media miring Simone Citrat Agar (SCA) dan dengan ose lurus isolat bakteri ditusukkan di bagian tengah media sampai ke dasar tabung reaksi, lalu diinkubasikan selama 48 jam pada suhu 65oC. Uji positif ditandai dengan perubahan warna media dari hijau menjadi biru (Lay, 1994). 3.8.5. Uji Triple Sugar Iron Agar (TSIA) Satu ose isolat bakteri digoreskan pada media miring TSIA, kemudian bagian tengah media ditusuk dengan lurus. Diinkubasi selama 48 jam pada suhu 65oC. Uji positif ditandai dengan keretakan atau naiknya media dan adanya endapan hitam (Lay, 1994). 3.8.6. Uji Motilitas Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

Satu ose isolat bakteri diinokulasikan pada media Sulfit Indol Motility (SIM) dengan cara menusukkannya hingga setengah media pada tabung reaksi lalu diinkubasi selama 48 jam pada suhu 65oC. Uji positif ditunjukkan dengan adanya jejak pergerakan bakteri (Lay, 1994). 20

3.9.

Pembuatan Media Produksi Enzim Amilase Bahan untuk membuat media produksi enzim amilase terdiri dari (per liter

larutan) 2% pepton, 0,03% K2HPO4, 0,1% MgSO4.7H2O dan 0,5% pati. Semua bahan dicampur lalu sebanyak 40 ml dipindahkan ke dalam tabung erlenmeyer 100 ml dan disterilisasi di dalam autoklaf. Satu ose isolat bakteri yang dipilih dicampurkan dengan media produksi amilase yang telah steril kemudian digoyang dalam shaker water bath selama 48 jam dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 65oC. Alur kerja dapat dilihat pada Lampiran 5. 3.10. Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase Kasar Kultur bakteri penghasil enzim amilase yang berumur 72 jam disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit. Supernatan yang dihasilkan diambil. Satu ml supernatan dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan dengan 1 ml larutan pati 1% dalam sitrat buffer fosfat, kemudian diinkubasi dalam water bath selama 20 menit untuk setiap perlakuan suhu (40oC, 50oC, 60oC, 65oC, 70oC, 80oC). Variasi suhu yang digunakan dalam penelitian ini sesuai dengan pendapat Brock Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

(1985) yang mengemukakan bahwa kecepatan tumbuh maksimal dari beberapa bakteri termofilik berkisar pada suhu 55oC-70oC. Satu unit aktivitas enzim amilase didefenisikan sebagai banyaknya pati yang terhidrolisis menjadi glukosa selama masa inkubasi 20 menit. Setelah dikeluarkan dari water bath, ditambahkan 2 ml dinitrosalicilyc acid (DNS) untuk menghentikan reaksi. Campuran didinginkan pada 21 air mengalir selama 15 menit. Selanjutnya absorbansi diuji dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm. Nilai absorbansinya diplotkan dengan kurva standard glukosa yang terbuat dari larutan glukosa monohidrat dengan konsentrasi mulai 0,01–0,20 ppm (Kombong, 2004). Alur kerja dapat dilihat pada lampiran 6. Pekerjaan yang sama dilakukan pada perlakuan pH dengan cara mengukur aktivitas enzim dengan menggunakan pH yang bervariasi yaitu 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 dan 9,0 pada suhu 65oC. Buffer yang digunakan untuk penentuan pH optimum adalah buffer sitrat fosfat 0,05 M. Alur kerja dapat dilihat pada Lampiran 7. Aktivitas enzim amilase dihitung berdasarkan data kadar glukosa relatif sebagai mg glukosa yang dihasilkan per ml filtrat enzim dengan menggunakan rumus: AE =

MG x 1000 BMg x MI

Dimana : AE = Aktivitas Enzim (unit/ml filtrat enzim) MG = Miligram Glukosa BMg

= Berat Molekul glukosa


8

MI = Masa Inkubasi 3.11. Pembuatan Kurva Baku Glukosa Bahan yang digunakan adalah glukosa monohidrat (C6H12O6. H2O) 1000 μg/ml (1000 ppm), diencerkan pada berbagai konsentrasi yaitu 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, dan 260 μg/ml (10 variasi konsentrasi). Sebanyak 1 ml dari tiap 22 konsentrasi glukosa dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1,5 ml reagen DNS, dipanaskan selama 5 menit lalu didinginkan dengan air mengalir selama 15 menit, kemudian ditambahkan 20 ml aquadest steril dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. Alur kerja dapat dilihat pada Lampiran 10. 3.12. Analisis Data Hasil pengamatan morfologi dipaparkan secara deskriptif, sedangkan hasil berupa data kuantitatif dianalisis varian, bila didapatkan perbedaan nyata atau sangat nyata dilanjutkan dengan uji Duncan Multiple Range Test (Sujana, 1989). Rancangan yang dilakukan adalah rancangan acak lengkap non faktorial karena media dan kondisi lingkungan serta perlakuan terhadap amilase kasar dikondisikan sama kecuali perlakuan suhu dan pH untuk mengukur aktivitas enzim. Perlakuan suhu dan pH dilakukan dengan 3 kali ulangan. Dalam penelitian ini diukur konsentrasi amilase kasar (μg/ml) pada berbagai kondisi suhu dan pH. Data hasil penelitian dihitung dalam struktur Tabel sidik ragam yang disajikan sebagai berikut. Tabel 4. Sidik Ragam Sumber keragaman

Derajat bebas

Jumlah kuadrat

Kuadrat tengah

Fhitung

Ftabel 0,05

0,01


8

Perlakuan Galat

p-1 p(n-1)

Σ(Σ Yij)2/n.FK JKt-JKp

Total

p(n-1)

JKtotal

JKperl/dbperl JKG/dbG

KTP/KTG

Tabel F α(0,05)

Tabel F α(0,01)

Pengujian hipotesis dilanjutkan bila nilai Fhitung > Ftabel maka hipotesis nol ditolak, yang berimplikasi bahwa perlakuan suhu memberikan pengaruh nyata terhadap konsentrasi glukosa (μg/ml). Dengan demikian dilakukan uji Duncan Multiple Range Test (DMRT) untuk melihat jarak antar perlakuan suhu dan pH. BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Isolasi, Seleksi dan Karakter Bakteri Penghasil Amilase Dari hasil isolasi yang telah dilakukan, diperoleh 8 isolat bakteri penghasil enzim amilase yang berbeda berdasarkan pengamatan warna, bentuk, tepi dan elevasi koloni, bentuk dan penataan sel, serta sejumlah uji biokimia sederhana yang meliputi uji motilitas dengan menggunakan media SIM, uji sitrat dengan menggunakan media SCA, uji TSIA, uji hidrolisis gelatin dengan menggunakan media gelatin dan uji katalase dengan menggunakan H2O2 3% serta pewarnaan gram dengan menggunakan mikroskop cahaya. Hasil dari pengujian ini digunakan untuk pencirian dan identifikasi mikroorganisme. Dari 8 isolat tersebut, diperoleh 3 isolat bakteri penghidrolisis pati terbaik yang ditentukan berdasarkan besarnya zona bening di sekitar koloni bakteri tersebut. Tiga Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

isolat tersebut adalah SG.1, SG.2, dan SG.3. SG.1 diperoleh dari kolam I dengan suhu air 55 oC dan pH 7. SG.2 diperoleh dari kolam II dengan suhu air 59oC dan pH 6. SG.3 diperoleh dari kolam III dengan suhu air 62oC dan pH 6. Hasil pengamatan morfologi, uji biokimia sederhana dan pewarnaan gram dari masing-masing koloni isolat bakteri penghasil enzim amilase dapat dilihat pada Tabel 5 berikut ini.

24

Tabel 5. Karakter isolat bakteri termofilik penghasil enzim amilase dari sumber air panas Desa Semangat Gunung, Kabupaten Karo 23

Isolat

Bentuk Koloni

Tepi Koloni

Elevasi Koloni

Warna Koloni

Bentuk Sel

Uji Biokimia Pewarnaan M S T G K Gram

SG.1

bulat

rata

timbul

krem

batang

+ - - + +

-

SG.2

tidak beraturan tidak beraturan

rata

rata

krem

batang

+ + + + +

-

berlekuk

timbul

krem

batang

+ + + + +

+

SG.3

Keterangan : M = Motilitas G = Gelatin S = Sitrat K = Katalase T = TSIA Dari bentuk koloni, ke-3 isolat memiliki bentuk, tepi dan elevasi koloni yang bervariasi, sedang warna koloni umumnya krem dan bentuk sel batang. Pewarnaan Gram menunjukkan 2 isolat yaitu SG.1 dan SG.2 bersifat Gram negatif, sedang isolat SG.3 bersifat Gram positif. Uji motilitas terhadap ketiga isolat menunjukkan bahwa Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

ketiganya bersifat motil ditandai dengan adanya jejak pergerakan bakteri di dalam media. Hasil uji sitrat menunjukkan bahwa SG.1 tidak mampu menggunakan sitrat sebagai sumber karbon, sedangkan SG.2 dan SG.3 mampu menggunakan sitrat sebagai sumber karbon. Keadaan positif pada uji sitrat ditandai dengan berubahnya medium dari hijau menjadi biru karena terjadi penghilangan asam dan peningkatan pH dalam media (Cappuccino and Sherman, 1983). Dari uji TSIA diperoleh bahwa SG.1 tidak mampu memfermentasikan glukosa dan laktosa atau sukrosa. Keadaan positif pada uji TSIA ditandai dengan adanya perubahan warna dan endapan hitam pada media. TSIA digunakan terutama untuk mengidentifikasi bakteri Gram negatif. Media ini mengandung 3 macam gula yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa, serta indikator merah fenol dan FeSO4 untuk memperlihatkan pembentukan H2S yang ditunjukkan dengan adanya endapan hitam (Lay, 1994). Dari uji hidrolisis gelatin diperoleh bahwa SG.1, SG.2 dan SG.3 mampu menghidrolisis gelatin. Uji positif gelatin ditandai dengan medium gelatin yang tetap cair setelah dimasukkan ke dalam lemari pendingin selama 30 menit (Cappuccino and Sherman, 1983). Hasil uji katalase menunjukkan bahwa ketiga isolat memiliki enzim katalase yang ditandai dengan terbentuknya gelembung udara di sekitar koloni ketika ditambahkan dengan larutan 3% H2O2. Katalase adalah enzim yang mengkatalis penguraian hidrogen peroksida (H2O2) menjadi air (H2O) dan oksigen (O2). Hidrogen peroksida bersifat toksik terhadap sel karena bahan ini menginaktivasikan enzim dalam sel. Hidrogen


8

peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga mikroorganisme yang tumbuh dalam lingkaran aerob harus menguraikan bahan toksik tersebut (Lay, 1994).

4.2.

Aktivitas Enzim Amilase Isolat Termofil Semangat Gunung Isolat bakteri termofilik yang mengindikasikan penghasil enzim amilase

dilihat aktivitasnya dengan mengukur diameter zona bening di sekitar isolat bakteri termofilik. Zona bening yang terbentuk di sekitar isolat bakteri termofilik menunjukkan bahwa isolat bakteri tersebut mampu menghidrolisis pati (Dirnawan et 26 al., 2000). Diameter zona bening terbentuk setelah isolat bakteri diinkubasi selama 72 jam pada suhu 65oC. Besar kecilnya diameter zona bening yang terbentuk dari masing-masing isolat berbeda-beda. Hal ini disebabkan kemampuan menghidrolisis pati dari setiap isolat juga berbeda-beda. Diameter zona bening bakteri termofilik penghasil enzim amilase dari masing-masing isolat dapat dilihat pada Tabel 6 dan pembentukan zona bening oleh isolat bakteri termofilik penghasil amilase pada isolat Semangat Gunung dapat dilihat pada Gambar 1. Tabel 6. Diameter zona bening pada berbagai isolat bakteri termofilik penghasil enzim amilase setelah inkubasi selama 72 jam Isolat SG.1 SG.2 SG.3

Diameter Zona Bening (mm) 26,15 48,75 52,56


8

Gambar 1. Pembentukan zona bening oleh isolat bakteri termofilik penghasil amilase isolat Semangat Gunung


8 27

Pada Tabel 6 dan Gambar 1 dapat dilihat bahwa zona bening terbesar dihasilkan oleh isolat SG.3 (52,56 mm) diikuti oleh SG.2 (48,75 mm) dan SG.1 (26,15 mm). Hasil ini menunjukkan bahwa isolat SG.3 merupakan penghasil enzim amilase dengan kriteria memiliki potensi tinggi, diikuti oleh isolat SG.2 dengan kriteria memiliki potensi sedang dan isolat SG.1 dengan kriteria memiliki potensi rendah. Pereira et al. (1999) berhasil mengisolasi bakteri termofilik penghasil enzim amilase dengan aktivitas hidrolitik yang termasuk kriteria memiliki potensi tinggi dengan diameter zona bening > 30 mm, sedang kriteria yang memiliki potensi sedang adalah diameter zona bening 20-30 mm dan kriteria memiliki potensi rendah adalah diameter zona bening < 20 mm. Igarashi et al. (1998) berhasil mengisolasi bakteri termofilik penghasil enzim amilase dengan aktivitas hidrolitik termasuk kriteria memiliki potensi tinggi dengan diameter zona bening > 26 mm, sedang kriteria yang memiliki potensi sedang adalah diameter zona bening 14-26 mm dan kriteria yang memiliki potensi rendah adalah diameter zona bening < 14 mm.

4.3.

Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Aktivitas amilolitik supernatan dalam menghidrolisis pati diuji pada rentang

suhu 40–80oC pada pH konstan 7,0 ditunjukkan pada Tabel 7 berikut ini.


8 28

Tabel 7. Pengaruh suhu terhadap aktivitas amilase konsentrasi glukosa isolat Semangat Gunung Isolat

SG.1

SG.2

SG.3

Suhu (oC) 40 50 60 65 70 80 40 50 60 65 70 80 40 50 60 65 70 80

Konsentrasi glukosa (µg/ml) 141,08 319,68 463,74 422,58 411,38 341,40 772,00 908,97 969,11 856,15 715,28 626,79 362,67 532,57 1074,07 876,73 597,74 489,81

yang

diukur

Aktivitas enzim (U/ml) 0,04 0,09 0,13 0,12 0,11 0,09 0,21 0,25 0,27 0,24 0,20 0,17 0,10 0,15 0,30 0,24 0,17 0,14

sebagai

Notasi 5% c bc a ab abc abc c ab a ab cd d e abcd a ab abc abcd

Keterangan: angka-angka yang diikuti huruf yang sama pada masing-masing isolat, tidak berbeda nyata pada taraf 5%

Pada Tabel 7 di atas dapat dilihat bahwa aktivitas enzim amilase isolat SG.1 pada suhu 40oC menunjukkan hasil berbeda nyata pada taraf 5% dibanding dengan perlakuan pada suhu 60oC dan 65oC. Perlakuan pada suhu 50oC berbeda nyata dengan perlakuan pada suhu 60oC. Perlakuan pada suhu 50oC, 65oC, 70oC dan 80oC tidak berbeda nyata pada taraf 5%. Pada SG.2 perlakuan suhu 40oC berbeda nyata dengan suhu 60oC dan 80oC pada taraf 5%. Perlakuan suhu 50oC dan 65oC tidak berbeda nyata pada taraf 5%. Pada SG.3 perlakuan suhu 40oC dan 60 oC berbeda nyata pada taraf 5%, sedang suhu 50oC, 70oC dan 80oC tidak berbeda nyata pada taraf 5%. Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8 29

Dari hasil pengujian diperoleh nilai konsentrasi glukosa tertinggi hasil hidrolisis pati oleh isolat SG.1 terdapat pada suhu inkubasi 60oC yaitu sebesar 463,74 μg/ml dan aktivitas enzim 0,13 U/ml, isolat SG.2 pada suhu 60oC sebesar 969,11 μg/ml dan aktivitas enzim 0,27 U/ml, dan isolat SG.3 pada suhu 60oC sebesar 1074,07 μg/ml dan aktivitas enzim 0,30 U/ml. Pada Tabel 7 dapat dilihat bahwa aktivitas enzim meningkat pada rentang suhu 50oC-70oC. Aktivitas enzim berkurang pada suhu diatas 70oC. Bacillus subtilis dilaporkan memiliki suhu optimum aktivitas enzim α-amilase 70oC (Burhan et al, 2003). Strain Bacillus stearothermophillus yang diisolasi dari sampel industri pemrosesan kentang memiliki suhu optimum aktivitas enzim αamilase 70 oC dengan pH optimum 5,5-6,0 (Wind et al, 1994). α-amilase dari genus Bacillus stabil pada suhu tinggi dan memiliki potensi yang diharapkan dalam industri yang menggunakan pati sebagai bahan baku. Untuk lebih jelasnya, berikut ini adalah grafik pengaruh suhu terhadap konsentrasi glukosa hasil hidrolisis pati pada isolat Semangat Gunung (Gambar 2).


8 30

1200

Konsentrasi glukosa (μg/ml)

1000 800 600 400 200 0 40

50

60 SG.1

65 Suhu (oC) SG.2

70

80

SG.3

Gambar 2. Pengaruh suhu terhadap aktivitas amilase yang diukur sebagai konsentrasi glukosa isolat Semangat Gunung

Dari Tabel 7 dan Gambar 2 dapat dilihat bahwa aktivitas enzim dalam menghidrolisis pati meningkat mulai dari suhu 50oC sampai 60 oC. Suhu optimum aktivitas enzim amilase pada penelitian ini adalah 60oC. Hasil ini sesuai dengan yang ditunjukkan oleh isolat SG.3 yang memiliki aktifitas enzim tertinggi yang diisolasi dari sumber air panas dengan suhu 62oC. Sohail et al. (2005) melaporkan bahwa Bacillus sp. memiliki suhu optimum aktivitas enzim α-amilase 60oC. Anto et al. (2006) melaporkan bahwa Bacillus cereus MTCC 1305 memiliki suhu optimum Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8 31

aktivitas enzim α-amilase 55 oC. Enzim α-amilase dari genus Bacillus stabil pada suhu tinggi dan sangat diminati oleh industri yang menggunakan larutan pati. Menurut Burhan et al. (2003), pengaruh suhu terhadap aktivitas produksi amilase berhubungan dengan pertumbuhan organisme. Rentang suhu yang besar (35-80oC) merupakan suhu optimum untuk pertumbuhan dan produksi enzim α-amilase pada bakteri. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim secara umum ditunjukkan melalui mekanisme kompleks yang melibatkan fenomena berlawanan dari stimulasi dan inaktifasi. Aktivitas mula-mula meningkat dengan makin tingginya suhu, namun pada suatu titik tertentu terjadi inaktifasi enzim yang ditandai dengan menurunnya aktivitas enzim. Pengaruh suhu sesungguhnya agak kompleks, yaitu suhu yang terlalu tinggi akan mempercepat pemecahan atau perusakan enzim, sebalikya semakin tinggi suhu semakin aktif pula enzim tersebut.

4.4. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Aktivitas amilolitik supernatan pada pH yang berbeda diuji pada rentang pH 4,0–9,0 pada suhu inkubasi 65oC. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim disebabkan oleh terjadinya perubahan tingkat ionisasi pada enzim atau substrat sebagai akibat dari perubahan pH. Analisis data pengaruh pH terhadap konsentrasi glukosa hasil hidrolisis pati isolat Semangat Gunung dapat dilihat pada Tabel 8. pH optimum pada SG.1 adalah 7,0 dengan konsentrasi glukosa 345,29 μg/ml dan aktivitas enzim 0,10 U/ml. pH optimum SG.2 adalah 5,0 dengan konsentrasi glukosa 798,75 μg/ml dan Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

832

aktivitas enzim 0,22 U/ml. pH optimum SG.3 adalah 5,0 dengan konsentrasi glukosa 822,99 μg/ml dan aktivitas enzim 0,23 U/ml. Tabel 8.

Isolat

SG.1

SG.2

SG.3

Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim amilase yang diukur sebagai konsentrasi glukosa isolat Semangat Gunung pH 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0

Konsentrasi glukosa (µg/ml) 225,92 264,57 268,68 345,29 265,71 241,01 318,99 798,75 644,85 610,78 496,67 364,50 786,63 822,99 610,09 576,25 568,02 534,17

Aktivitas enzim (U/ml) 0,06 0,07 0,07 0,10 0,07 0,07 0,09 0,22 0,18 0,17 0,14 0,10 0,22 0,23 0,17 0,16 0,16 0,15

Notasi 5% bcd abc ab a abc bcd d a b b c d ab a c cd cde cde

Keterangan : angka-angka yang diikuti huruf yang sama pada masing-masing isolat, tidak berbeda nyata pada taraf 5%

Dari Tabel 8 dapat dilihat bahwa pada SG.1 perlakuan pada pH 7,0 berbeda nyata dengan pH 4,0 dan 9,0 pada taraf 5%. Perlakuan pada pH 5,0, 6,0, 7,0 dan 8,0 tidak berbeda nyata pada taraf 5%. Pada SG.2 perlakuan pada pH 4,0 tidak berbeda nyata dengan perlakuan pH 9,0 dan perlakuan pH 6,0 tidak berbeda nyata dengan perlakuan pH 7,0 pada taraf 5%. Perlakuan pada pH 5,0 berbeda nyata dengan pH 4,0, 6,0, 7,0, 8,0 dan 9,0 pada taraf 5%. Pada SG.3 perlakuan pH 5,0 berbeda nyata Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8 33

dengan pH 6,0, 7,0, 8,0 dan 9,0 pada taraf 5%. Perlakuan pada pH 7,0, 8,0, dan 9,0 tidak berbeda nyata pada taraf 5%. Pada umumnya enzim hanya aktif pada kisaran pH yang terbatas. Nilai pH optimum suatu enzim ditandai dengan menurunnya aktivitas pada kedua sisi lainnya dari grafik yang disebabkan oleh turunnya afinitas atau stabilitas enzim. Grafik pengaruh pH terhadap konsentrasi glukosa hasil hidrolisis pati pada isolat Semangat Gunung dapat dilihat pada Gambar 3 di bawah ini.

900

Konsentrasi glukosa (μg/ml)

800 700 600 500 400 300 200 100 0 4,0

5,0

6,0 SG.1

7,0 pH SG.2

8,0

9,0 SG.3

Gambar 3. Pengaruh pH terhadap aktivitas amilase yang diukur sebagai konsentrasi glukosa isolat Semangat Gunung Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

348

Dari Tabel 8 dan Gambar 3 dapat dilihat bahwa aktivitas enzim amilase pada isolat SG.1 meningkat mulai dari pH 5,0-7,0 dengan pH optimum 7,0. Penurunan aktivitas enzim terjadi pada pH di atas 7,0. Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas enzim amilase dan pertumbuhan bakteri isolat SG.1 paling baik terjadi pada lingkungan dengan pH netral. Pada isolat SG.2, aktivitas optimum enzim amilase ada pada pH 5,0. Pada isolat SG.3, aktivitas enzim amilase meningkat pada pH optimum 5,0. Hasil ini menunjukkan bahwa aktivitas dan pertumbuhan bakteri isolat SG.2 dan SG.3 paling baik terjadi pada lingkungan asam. Penurunan aktivitas enzim amilase terjadi pada pH di atas 5,0. Anto et al. (2006) melaporkan bahwa Bacillus cereus MTCC 1305 memiliki pH optimum aktivitas enzim α-amilase 5,0.


8

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan Dari hasil penelitian yang telah dilakukan mengenai isolasi bakteri dan uji aktivitas enzim amilase kasar termofilik, dapat disimpulkan sebagai berikut : a.

Sebanyak 3 isolat bakteri termofilik penghasil enzim amilase kasar yang memiliki zona bening terbesar telah diisolasi dan diseleksi dari 8 isolat dengan karakteristik morfologi koloni dan sifat biokimia yang berbeda.

b.

Suhu optimum aktivitas enzim amilase ketiga isolat adalah 60oC yang ditunjukkan oleh besarnya konsentrasi glukosa hasil hidrolisis pati.

c.

Isolat SG.3 memiliki aktivitas enzim amilase tertinggi pada suhu dan pH optimum 60 oC dan 5,0.

d.

Aktivitas enzim tertinggi yaitu 0,30 unit/ml diperoleh dari isolat SG.3.

5.2. Saran Enzim yang dihasilkan pada penelitian ini masih berupa enzim kasar dan belum optimal. Disarankan untuk diadakan penelitian lebih lanjut untuk mempelajari mekanisme dan faktor-faktor yang mempengaruhi aktifitas enzim dari bakteri termofilik isolat Semangat Gunung. Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

DAFTAR PUSTAKA 35 Adams, M.W.W. and Kelly, R.M. 1998. Finding and using thermophilic enzymes. Trends in Biotechnology 16: 329-332. Anto, H., Trivedi, U. and Patel, K. 2006. Alpha amylase production by Bacillus cereus MTCC 1305 using solid-state fermentation. Food Technol. Biotechnol. 44 : 241-245. Bahrami, A., Shojaosadati, and S., Mahbeli, G. 2001. Biodegradation of dibenzothiophene by thermophilic bacteria. Biotechnol. Lett. 23: 899-901. Bordbar, K., and Omidiyan, R. H. 2005. Study on interaction of α-amilase from Bacillus subtilis with cetyl trimethylammonium bromide, Colloids Surf. B. Biointerfaces 40: 67-71. Boyer, E.W., and Ingle, M. 1972. Extracellular alkaline amylase from a Bacillus species. J. Bacteriol 110: 992-1000. Brock, T.D. 1985. Life at high temperatures. Science 230: 132-138. Burhan, A., Nisa, U., Gokhan, C., Omer, C., Ashabil, A., and Osman, G. 2003. Enzymatic properties of a nover thermophilic, alkaline and chelator resistant amylase from an alkalophilic Bacillus sp. isolate ANT-6. Process Biochemistry 38: 1397-1403. Cappuccino, J.G and Sherman, N. 1983. Microbiology a laboratory manual. 2nd ed. New York: The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. Demirijian, D.C., Morris-Varas, F., and Cassidy, C.S. 2001. Enzyme from extremophiles. Curr. Opln. Chem. Biol. 5: 144-151. Dirnawan, H., Suwanto, A., and Purwanaria, T. 2000. Eksplorasi bakteri termofil penghasil enzim hidrolitik ekstraseluler dari sumber air panas Gunung Pancar. Hayati 7: 52-55.


8

Godfrey, T. and West, S. 1996. Industrial enzymology. London, UK: Macmillan Press. 37 Gupta, R., Gigras, P., Mohapatra, H., Goswami, V. K., and Chauhan, B. 2003. Microbial α-amylase: a biotechnological perspective. Process Biochemistry 38: 1599-1616. Haki, G.D. and Rakshit, S.K. 2003. Developments in industrially important thermostable enzymes: a review. Bioresource Technology 89: 17-34. 36 Herbert, R. and Sharp, R. 1992. Molecular Biology and Biotechnology of Extremophiles. Chapman and Hall, New York. Hewitt, J.C., and Solomons, G.L. 1996. The production of α-amylase (E.C.3.2.1.1.) by Bacillus amyloliquefaciens, in a complex and a totally defined syntetic culture medium. Journal of Industrial Microbiology 17: 96-99. Hisotsuyanagi, K. 1979. Stepwise introduction of regulatory genes stimulating production of α-amylase into Bacillus subtilis: Constructions of α-amylase extrahyper producing strain. Agric. Biol. Chem. 43:2343-2349. Igarashi, K., Hatada, Y., Hagihara, K., Saeki K., Takaiwa, M., and Kobayashi, T. 1998. Enzymatic properties of a novel liquefying α-amylase from an alkaliphilic Bacillus isolate and entire nucleotide and amino acid sequences. Appl. Environ. Microbiol. 64: 3282-3289. Kombong, H. 2004. Evaluasi daya hidrolitik enzim glukoamilase dari filtrat kultur Aspergillus niger. Jurnal Ilmu Dasar 5: 16-20. Kristjansson, J.K.1989. Thermophilic organisms as sources of thermostable enzymes. Trends in Biotechnology 7: 349-353. Kumar, H.D. and Swati, S. 2001. Modern Concepts of Microbiology, second revised ed. Vikas Publishing House Pvt. Ltd., New Delhi. Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Edisi I. Cetakan I. Jakarta: Raja Grafindo Persada. Leveque, E., Janecek, S., Haye, B., and Belarbi A. 2000. Thermophilic archaeal amylolityc enzimes. Trends in biotechnology 7: 49-53.


8

Lin L.L., Hsu W.H. and Chu W.S. 1997. A gene encoding form an α-amylase form themophilic Bacillus sp. Strain TS-23 and its expression in Escherichia coli. J. Appl. Microbiol. 82: 325-334. 38 Maton, A., Jean, H., William, L., Susan, J.and Maryanna, QW., 1993. Human Biology and Health. Englewood Cliffs, New Jersey, USA: Prentic Hall. Milo, R.E., Duffner, F.M. and Muller, R. 1999. Catechol 2, 3-dioxygenase from the thermophilic, phenol-degrading Bacillus thermoleovorans strain A2 has unexpected low thermal stability. Extremophile 3: 185-190. Morgan, F.J. and Priest, F.G. 1981. Characterization of thermostable α-amylase from Bacillus licheniformis NCTB 6346. Journal of Applied Bacteriology 50: 104114. Moszhaev, V. 1993. Mechanism-based strategies for protein thermostabilization. Trends in Biotechnology 11: 88-95. Műtzel, A., Reinscheid, U.M., Antranikian, G. and Muller, R. 1996. Isolation and characterization of thermostable Bacillus strain that degrade phenol and cresol as sole carbon source at 70oC. Appl. Microbiol. Biotechnol. 46: 593- 596. Pandey, A., Nigam P. and Soccol C.R. 2000. Advances in microbial amylases. Biotechnol. Appl. Biochem 31: 135 152. Pereira, N., Andrade, A. and Carolina, M. 1999. Thermophilic microorganism and their polymer-hydrolitic enzymes. Brazilian Arch. Bio. and Tech. 12: 112-130. Peter, W., Alexandra, T. and Klaus, D. 2001. Conversions of glycerol to 1,3propandiol by a newly isolated thermophilic strain. Biotechnol. Lett. 23: 463466. Poonam, N. and Dalel, S. 1995. Enzyme and microbial systems involved in starch processing. Enzyme Microb. Technol. 17: 770-778. Saboto, D., Nucci R., Rossi, M., Gryczynski, I., Gryczynski, Z. and Lakowicz, J. 1999. The β-glycosidase from the hyperthermophilic archaeon Sulfolobusolfataricus: enzyme activity and conformational dynamics at temperature above 100oC. Biophys. Chem. 81: 23-31. Satosi, H., Seigo, O., Kenji, T., Kazuhisa, K., Tetsuo, K., Toshiaki, K. and Hitosi, K. 2001. Chemo-enzymatic synthesis of 3-(2-naphtyl)-L-alanine by an amino Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

transfer form the extreme themophiles Thermococcus profundus. Biotechnol. Lett. 23: 589-591. Sohail, M., Ahmad, A., Shahzad, S. and Khan, S.A. 2005. A survey of amylolytic 39 bacteria and fungi from native environmental samples. Pak. J. Bot., 37: 155161. Sujana. 1989. Metode Statistika. Edisi ke-5. Bandung: Tarsito. Underkofler, L. 1976. Microbial enzymes. In: Miller, B., Litsky, W. (Eds). Industrial Microbiology. McGraw-Hill, New York. Van der Maarel, M., Van der Veen, B., Uitdehaag, H., Leemhuis, H. and Dijkhuizen, L. 2002. Properties and application of starch converting enzymes of the αamylase family. J. Biotechnol. 94: 137-155. Wind, R.D., Buitelaar, R.M., Egglink, G.,Huizing, H.J., and DijKhuized, L. 1994. Characterization of a new Bacillus stearothermophillus isolate: a highly thermostable α-amylase producing strain. Applied Microbiology and Biotechnology 41: 155-162. Windish, W.W. and Mhatre, N.S. 1965. Microbial amylases. In W.U. Wayne (Ed.). Advances in applied microbiol. 7: 273-304. New York: Academic Press. Zeikus, J., Lee, C., Lee, Y. and Saha, B. 1998. Thermostable saccharides: new sources, uses and biodesigns. J. Biotechnol. 60: 155-163.


8

Lampiran 1. Isolasi Bakteri Dari Sampel Air Panas

Sampel air panas diambil 0,1 ml disebar kedalam petri dish berisi media agar selektif termofil diinkubasi selama 48 jam pada suhu 65oC Kultur bakteri dalam media padat diambil satu ose dari tiap koloni yang tumbuh digores pada media agar selektif amilase diinkubasi selama 24 jam pada suhu 65oC Kultur murni bakteri termofil amilolitik

ditetesi larutan iodin terdapat zona bening Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

Bakteri termofil penghasil enzim amilase

2. Karakterisasi Isolat Bakteri Penghasil Enzim Amilase 40 Isolat tunggal bakteri penghasil enzim amilase

Karakteristik makroskopis

- bentuk koloni - tepi koloni - elevasi koloni - warna koloni

Karakteristik mikroskopis

- uji bakteri gram + / - bentuk sel

Karakteristik sifat fisiologi / biokimia

- uji katalase - uji hidrolisis pati - uji gelatin - uji sitrat - uji TSIA - uji motilitas

Hasil


8

3. Pembuatan Suspensi Isolat Bakteri 108 Cfu/ml 41 Isolat bakteri

diambil satu ose dimasukkan dalam larutan NaCl 0,85% dihomogenkan dengan vortex

dibandingkan dengan kekeruhan Mac Farland 0,5 standard yang setara dengan 108 CFU/ml

Suspensi isolat bakteri


8

4. Pengujian Produksi Enzim Amilase oleh Isolat Bakteri 42 Suspensi isolat bakteri tunggal

diambil 0,5 ml dimasukkan dalam cawan petri berisi media agar + pati diinkubasi selama 72 jam pada suhu 65oC Isolat bakteri

ditetesi larutan iodium Menghasilkan zona bening

Isolat menghasilkan enzim amilase

Zona bening diukur dengan jangka sorong Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

Seleksi 3 isolat terpilih

5. Pembuatan Kultur Untuk Produksi Enzim Amilase 43 Isolat tunggal penghasil amilase dengan zona bening terbesar

diambil satu ose dilarutkan dalam 40 ml media produksi amilase yang telah disterilisasi

diinkubasi selama 48 jam pada suhu 65oC dalam shaker water bath dengan kecepatan 150 rpm

Kultur bakteri dengan produksi enzim amilase


8

6. Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase Kasar 44 Kultur bakteri produksi enzim amilase disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 6000 rpm

Supernatan diambil dengan mikropipet

Supernatan yang mengandung enzim amilase kasar


8

7. Uji Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar 45

Ekstrak enzim amilase dari supernatan diambil 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi ditambahkan 1% larutan pati diinkubasi dalam water bath selama 20 menit pada suhu 40oC, 50oC, 60oC, 65oC, 70oC, 80oC ditambahkan 2 ml reagen DNS untuk menghentikan reaksi dipanaskan selama 5 menit dalam air mendidih didinginkan selama 15 menit pada air mengalir absorbansi diuji dengan spektro-fotometer dengan panjang gelombang 540 nm


8

dibandingkan dengan larutan standar glukosa

data hasil pengujian

8. Uji Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar 46 Ekstrak enzim amilase dari supernatan diambil 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi ditambahkan 1% larutan pati dalam larutan sitrat buffer fosfat pada pH 4, 5, 6, 7, 8, dan 9 diinkubasi dalam water bath selama 20 menit pada suhu 65oC ditambahkan 2 ml reagen DNS untuk menghentikan reaksi dipanaskan selama 5 menit dalam air mendidih didinginkan selama 15 menit pada air mengalir absorbansi diuji dengan spektro-fotometer dengan panjang gelombang 540 nm Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

dibandingkan dengan larutan standar glukosa data hasil pengujian

9. Pembuatan Larutan Kontrol Penguji Aktivitas Enzim Amilase 47 Ekstrak enzim amilase dari supernatan diambil 2 ml dipanaskan dalam air mendidih selama 20 menit ditambahkan 1% larutan pati dalam larutan sitrat buffer fosfat sampai pH 6,5 diinkubasi dalam water bath selama 20 menit pada suhu 40, 50, 60, 65, 70, dan 80oC ditambahkan 2 ml reagen DNS untuk menghentikan reaksi dipanaskan selama 5 menit dalam air mendidih didinginkan selama 15 menit


8

pada air mengalir dan ditambah 20 ml air suling absorbansi diuji dengan spektro-fotometer dengan panjang gelombang 540 nm dibandingkan dengan larutan standar glukosa data hasil pengujian

10. Pembuatan Kurva Standar Glukosa 48 Larutan standar glukosa

dibuat pengenceran 80-280 μg/mol dimasukkan 1ml ke dalam tabung reaksi 1 ml larutan standar glukosa dalam tabung reaksi ditambah 1,5 ml reagen DNS dipanaskan selama 5 menit didinginkan dengan air mengalir selama 15 menit ditambahkan 20 ml aquadest divortex diukur absorbansinya dengan Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm Absorbansi dibuat kurva standar dan persamanaan regresinya Kurva standar glukosa

11. Sidik ragam pengaruh suhu terhadap konsentrasi glukosa hasil hidrolisis pati isolat Semangat Gunung. 49 Sidik Ragam untuk isolat SG.1. SK Perlakuan Galat Percobaan

db 5 12 17

JK 199840,40 55712,43 255552,84

KT 39968,0807 4642,7028

F 8,608**

Tanda ** = berbeda nyata pada taraf 5% Koefisien Keragaman (KK) = 19,46%

Sidik Ragam untuk isolat SG.2. SK Perlakuan Galat Percobaan

db 5 12 17

JK 243604,27 41114,49 284718,77

KT 48720,8558 3426,2073

F 14,220**

Tanda ** = berbeda nyata pada taraf 5% Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

Koefisien Keragaman (KK) = 7,24%


db 5 12 17

JK 1067368,4 9898,64 1077267,03

KT 213473,679 824,8864

F 258,7916**


12. Sidik ragam pengaruh pH terhadap konsentrasi glukosa hasil hidrolisis pati isolat Semangat Gunung. 50


db 5 12 17

JK 25465,73 25891,13 51356,87

KT 5093,1476 2157,5945

F 2,3605**

JK 493418,34 14882,86 508301,20

KT 98683,6682 1240,2383

F 79,5683**



db 5 12 17

Tanda ** = berbeda nyata pada taraf 5% Koefisien Keragaman (KK) = 6,53% Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8


db 5 12 17

JK 227288,45 24737,30 252025,76

KT 45457,6916 2061,4414

F 22,0514**


13. Gambar Pewarnaan Gram 51

SG.1 : Gram (-)

SG.2 : Gram (-)

SG.3 : Gram (+)

14. Gambar Uji Biokimia


8

Isolat SG.1

Isolat SG.2

Isolat SG.3

15. Gambar sumber air panas desa Semangat Gunung 1. Gambar sumber air panas I ( Lokasi I )

52


8

Suhu air panas 55oC, pH air 7,0.

54

2. Gambar sumber air panas II ( Lokasi II ) 53 Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

Suhu air panas 59oC, pH 6,0.

55

3. Gambar sumber air panas III ( Lokasi III )


8

Suhu air panas 62oC, pH 6,0.


8


8


8


8


8


8


8


8


8


ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS ENZIM AMILASE KASAR TERMOFILIK DARI SUMBER AIR PANAS SEMANGAT GUNUNG KABUPATEN KARO, SUMATERA UTARA TESIS

Recommend Documents