ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS AMILASE KASAR TERMOFILIK DARI SUMBER AIR PANAS GURUKINAYAN KARO SUMATERA UTARA

ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS AMILASE KASAR TERMOFILIK DARI SUMBER AIR PANAS GURUKINAYAN KARO SUMATERA UTARA

TESIS

Oleh NURHALIJAH SUTIAMIHARJA 067030014/BIO

S

C

N

PA

A

S

K O L A

H

E

A S A R JA

SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2008

Nurhalijah Sutiamiharja : Isolasi Bakteri Dan UJi Aktivitas Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Gurukinayan Karo Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008

ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS AMILASE KASAR TERMOFILIK DARI SUMBER AIR PANAS GURUKINAYAN KARO SUMATERA UTARA

TESIS Untuk Memperoleh Gelar Magister Sains (M.Si) dalam Program Studi Biologi pada Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara

Oleh NURHALIJAH SUTIAMIHARJA 067030014/BIO

SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2008


Judul tesis Nama Mahasiswa Nomor Pokok Program Studi

: ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS AMILASE KASAR TERMOFILIK DARI SUMBER AIR PANAS GURUKINAYAN KARO SUMATERA UTARA : Nurhalijah Sutiamiharja : 067030014 : Biologi

Menyetujui Komisi Pembimbing

(Dr. Dwi Suryanto, M.Sc.)

(Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc.)

Ketua

Anggota

Ketua Program Studi,

Direktur,

(Dr. Dwi Suryanto, M.Sc.)

(Prof. Dr. Ir. T.Chairun Nisa B, M.Sc)

Tanggal lulus : 27 September 2008


Telah diuji pada Tanggal 27 September 2008

PANITIA PENGUJI TESIS Ketua

:

Anggota :

Dr. Dwi Suryanto, M.Sc. 1. Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc. 2. Dr. Herla Rusmarilin, M.Si. 3. Dr. Delvian, SP, MP.


ABSTRAK

Isolasi bakteri dan uji aktifitas enzim amilase kasar termofilik dari sumber air panas Gurukinayan Kecamatan Payung, Kabupaten Karo telah dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, FMIPA USU Medan dari bulan Pebruari sampai dengan Juli 2008 Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan dan mengkarakterisasi bakteri termofil yang berpotensi amilolitik serta mengetahui aktifitas enzim amilase kasar. Hasil isolasi mendapatkan 25 isolat penghasil amilase melalui uji iodine, dipilih tiga isolat yang paling besar zona beningnya yaitu GK 4 (35,20 mm) diikuti GK13 (32,18 mm) dan GK14 (30,15 mm). Isolat GK13 menghasilkan amilase yang bekerja optimum pada suhu 60oC dengan menghasilkan glukosa lebih banyak, sebesar 633,65 μg/ml dan pada pH 6,0 sebesar 639,59 μg/ml. Kata kunci: Amilase, termofilik, amilolitik, hidrolisis pati.


ABSTRACT

A study on isolation and activity assay of crude amylase thermophilic bacteria from hot spring Gurukinayan Kabupaten Karo had been carried out in Laboratory of Microbiology Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences. University of Sumatera Utara from February to July 2008. This study was aimed to obtain and to characterize the amylolytic thermophilic bacteria and to know the activity of crude amylase. Twenty isolates showed amilolytic activity based on iodine test. Three out of twenty were choosen for examination of their crude amylolityc potential based on diameter of clearing zone GK4 (35,20 mm), GK13 (32,18 mm), and GK14 (30,15 mm). GK 13 showed optimum enzyme activity at 60oC by releasing 633,65 μg/ml glucosa and pH 6,0 by product 639,59 μg/ml Key word : Amylase, thermophilic, amylolytic, starch hydrolytic


UCAPAN TERIMA KASIH

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT, karena berkat rahmatNya penulis dapat menyelesaikan tesis ini, dan akhirnya perkenankanlah penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada : 1. Pemerintah Provinsi Sumatera Utara yang telah memberikan Beasiswa kepada penulis untuk menyelesaikan studi di Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara. 2. Prof. Chairuddin P. Lubis, DTM&H, Sp.A.(K)., selaku Rektor Universitas Sumatera Utara. 3. Prof. Dr. Ir. T. Chairun Nisa B, M.Sc., selaku Direktur Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara yang telah memberikan kesempatan dan fasilitas kepada penulis untuk mengikuti pendidikan program Magister. 4. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc., dan Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc., sebagai dosen pembimbing, penulis mengucapkan terima kasih yang tulus atas segala perhatian dan kesabaran dalam memberikan bimbingan, pengarahan serta saran kepada penulis mulai dari penyusunan usulan penelitian, pelaksanaan penelitian di laboratorium sampai dengan penyelesaian tesis ini. 5. Dr. Herla Rusmarilin, M.Si. dan Dr. Delvian, SP.MP. sebagai dosen penguji yang telah banyak memberikan saran-saran kepada penulis dalam menyusun tesis ini.


6. Seluruh dosen dan staf pada Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara yang telah memberikan ilmu bagi penulis melalui materi-materi kuliah yang bermanfaat dalam penyelesaian tesis ini. 7. Kepala Sekolah SMA Negeri 2 Medan Drs. Muhammad Daud, MM., yang telah memberikan kesempatan dan dorongan kepada penulis untuk mengikuti pendidikan pada Sekolah Pascasarjana USU hingga selesai. 8. Laboran Mikrobiologi FMIPA USU yang telah banyak membantu dalam pelaksanaan penelitian di laboratorium. 9. Teman-teman Mikrobiologi 2006, terima kasih atas dorongan dan saran-saran yang diberikan kepada penulis. 10. Kepada suami tercinta Basrianto serta buah hati kami Widya, Faisal dan Astri penulis menyampaikan penghargaan dan rasa terima kasih yang tulus atas segala doa, pengorbanan dan pengertiannya selama penulis mengikuti pendidikan hingga penyelesaian tesis ini. 11. Penghargaan yang tulus juga penulis sampaikan kepada ayahanda Sudjud dan Ibu Nurlela Siregar, kedua Mertua Bapak Baktiar dan Ibu Desmaniar serta seluruh adik-adik dan keluarga atas segala dorongan dan doa yang dipanjatkan kehadirat Allah SWT demi keberhasilan studi penulis. 12. Akhirnya kepada semua yang terlibat yang namanya tidak tersebutkan, penulis haturkan hormat dan semoga apa yang di dapat dalam studi ini dapat bermanfaat untuk banyak orang dan membuat kerendahan hati bahwa banyak hal yang harus dipelajari dengan bantuan orang lain. Nurhalijah Sutiamiharja : Isolasi Bakteri Dan UJi Aktivitas Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Gurukinayan Karo Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008

Dengan iringan do’a semoga Allah SWT memberikan pahala yang berlimpah atas segala kebaikan dan ketulusan yang telah diberikan. Amin.

Medan, 27 September 2008 Penulis

Nurhalijah Sutiamiharja


KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan tesis dengan judul “Isolasi dan Uji Aktivitas Amilase Termofilik Kasar dari Sumber Air Panas Gurukinayan Karo Sumatera Utara”. Selama pelaksanaan penelitian sampai tersusunnya tesis ini penulis banyak mendapatkan bantuan secara moril, bimbingan dan motivasi dari berbagai pihak sehingga tesis ini dapat terselesaikan. Penulis menyadari bahwa dalam penulisan tesis ini masih terdapat berbagai kekurangan, oleh sebab itu dengan keikhlasan hati penulis menerima semua kritik dan saran yang membangun untuk masa yang akan datang, semoga Allah SWT memberikan taufik dan hidayah-Nya kepada kita semua, Amin. Medan, 27 September 2008 Penulis

Nurhalijah Sutiamiharja


RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan pada tanggal 15 Maret 1969 di Sibolga. Anak pertama dari 6 bersaudara, putri sulung dari Ayahanda Sudjud dan Ibunda Nurlela Siregar, tamat SD Negeri Nomor 081234 tahun 1982 di Sibolga, kemudian melanjutkan sekolah di SMP Negeri 1 Sibolga, lulus pada tahun 1985. Pada tahun 1988 penulis menamatkan SMA di SMA Negeri 1 Sibolga Jurusan Biologi, pada tahun yang sama penulis melanjutkan studi pada Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Program Studi Biologi Universitas Islam Sumatera Utara dan Lulus pada tahun 1993. Pada tahun 2006 penulis mendapat kesempatan mengikuti pendidikan Magister pada Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara jurusan Mikrobiologi dengan beasiswa dari Pemerintah Propinsi Sumatera Utara. Pada bulan September 1995 penulis menikah dengan Basrianto dan telah dikarunia 2 putri dan 1 putra yaitu Widya Wulandari, Faisal Reza Pahlevi dan Amalia Astri.


DAFTAR ISI Halaman ABSTRAK ABSTRACT

..……………………………………………………………

i

.........………………………………………………….....

ii

UCAPAN TERIMA KASIH KATA PENGANTAR RIWAYAT HIDUP

…………………………………………

iii

…………………………………………………

vi

…………… ………………………………………..

DAFTAR ISI …………………………………………………………… DAFTAR TABEL

xi

………………………………………………….

xii

………………………………………………

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang

…………………………………………

1

………………………………………

1

1.2. Perumusan Masalah

………………………………….

3

…………..……………………………………

4

1.4. Hipotesis …………..………………………………….

4

1.5. Kegunaan

4

1.3. Tujuan

BAB II

viii

……………………………………………………..

DAFTAR GAMBAR

BAB I

vii

………….…………………………………

TINJAUAN PUSTAKA

…………………………………..

5

2.1. Bakteri Termofilik

…………………………………..

5

2.2. Amilum ………………………………………………..

6

2.3. Enzim Amilase ………………………………………..

7

2.4. Mikroba Penghasil Amilase

…………………………


11

2.5. Manfaat Enzim Amilase dan Bakteri Termofilik

BAB III

……

12

2.6. Faktor-faktor Yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim …

13

2.7. Sumber Air Panas Gurukinayan

……………………

14

…………………………………..

15

METODE PENELITIAN

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian

……………………….

15

3.2. Bahan dan Alat ………………………………………..

15

3.3. Sumber Isolat

…….…………………………………..

15

3.4. Penapisan Bakteri Penghasil Enzim Amilase …………

16

3.5. Pengujian Aktivitas Amilase Isolat Bakteri

………….

17

3.6. Karakterisasi Morfologi dan Uji Biokimia Bakteri Termofilik Penghasil Enzim Amilase …….……...........…….............

17

3.7. Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Amilase Kasar ……

18

3.8. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Amilase Kasar ……..

20

3.9. Pembuatan Larutan Kontrol Penguji Aktivitas Enzim Amilase Kasar ....………………………………………..

20

3.10. Pembuatan Kurva Standar Glukosa

…………………

21

………………………………………………

21

3.11. Analisis BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN …………………………….. 4.1. Hasil Isolasi dan Seleksi Bakteri Termofilik Penghasil Amilase dari Kolam Air Panas Gurukinayan ………......….

23

4.2. Karakter Morfologi dan Biokimia Isolat Termofilik Amilase ………….……………....………………………

25

4.3. Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Amilase Kasar

.....…..

27

4.4. Pengaruh pH terhadap Aktifitas Amilase Kasar

………

30


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

……………………………

34

5.1. Kesimpulan …………….……………………………..

34

5.2. Saran-saran ………......................................………......

34

DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………

35


DAFTAR TABEL

Nomor 1.

Judul

Halaman

Enzim hidrolitik yang berasal dari mikroorganisme dan aplikasinya pada bidang industri (Brock & Brock, 1978) …..

13

2..

Analisis sidik ragam rancangan acak lengkap non faktorial ...

22

3.

Diameter zona bening isolat bakteri amilase termofilik dalam uji nisbi ...............………….....................................................

24

4.

Karakter morfologi bakteri termofil

….…….........................

25

5.

Karakter sifat biokimia isolat amilolitik termofilik Gurukinayan .........................................................................

26

Pengaruh suhu inkubasi terhadap aktifitas enzim amilase kasar isolat bakteri termofil Gurukinayan …………………..

27

Pengaruh pH terhadap aktifitas enzim amilase kasar isolat bakteri termofil Gurukinayan …………………………........

30

6. 7.


DAFTAR GAMBAR

Nomor

1.

2. 3.

4. 5.

Judul

Halaman

(A) Amilosa yang memperlihatkan struktur gulungan heliks, (B) Amilopektin yang memperlihatkan titik cabang 1-6 ……………………………………………………........

7

Jenis reaksi hidrolisis yang dikatalis oleh enzim amilase (Nickerson & Brown) …………………………………......

10

Tiga isolat terpilih berdasarkan diameter zona bening uji iodin setelah inkubasi 72 jam (A) Isolat GK4, (B) Isolat GK13, (C) Isolat GK14 ......................................................

24

Pengaruh suhu inkubasi terhadap aktivitas enzim amilase kasar isolat bakteri termofil sumber air panas Gurukinayan

28

Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim amilase kasar isolat bakteri termofil sumber air panas Gurukinayan ………….

32


DAFTAR LAMPIRAN

Nomor

Judul

Halaman

1.

Penapisan bakteri dari sampel air panas

………………..

39

2.

Pengujian produksi enzim amilase oleh isolat bakteri ……..

40

3.

Karakterisasi isolat bakteri penghasil enzim amilase …..…..

41

4.

Pembuatan kultur untuk produksi enzim amilase

……....

42

5

Pengukuran aktivitas enzim amilase kasar dari isolat terpilih .

43

6.

Pengukuran aktivitas enzim amilase kasar pada suhu yang bervariasi ..…….....................................................................

44

Pengukuran aktivitas enzim amilase kasar pada pH yang bervariasi .......…....................................................................

45

Pembuatan larutan kontrol penguji aktivitas enzim amilase kasar ……………...................................................................

46

9.

Alur kerja pembuatan kurva standard glukosa

…..…………

47

10.

Daftar sidik ragam dan uji Duncan isolat bakteri amilase kasar Gurukinayan ……..........................................................

48

Daftar sidik ragam dan uji Duncan isolat bakteri amilase kasar Gurukinayan ……..........................................................

49

12.

Kurva Standar Glukosa …….…………….………………….

50

13.

Photo Mikroskop Pewarnaan Bakteri ……………………….

51

7. 8.

11.


BAB I PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang Enzim adalah suatu katalisator protein yang dapat mempercepat reaksi kimia yang terjadi pada makhluk hidup dalam sistem biologi. Dalam mengkatalisis reaksi tersebut enzim bersifat sangat spesifik, sehingga meskipun jumlah enzim ribuan dalam sel dan subtratpun sangat banyak tidak akan terjadi kekeliruan (Shahib, 1992). Kemampuan enzim yang unik dalam melaksanakan transformasi kimianya yang khas ketika diisolasi telah meningkatkan penggunaan enzim dalam berbagai proses industri (Smith, 1995). Menurut Jenni (2003), enzim merupakan larutan koloid atau katalis organik yang dihasilkan organisme. Enzim meningkatkan kecepatan reaksi dan sangat spesifik untuk reaksi yang dikatalisnya, artinya setiap jenis enzim hanya dapat bekerja pada satu macam senyawa atau reaksi kimia. Hal ini disebabkan perbedaan struktur kimia tiap enzim bersifat tetap. Enzim memegang peranan penting dalam dunia industri seperti industri tekstil, deterjen, bahan pangan dan minuman, bahan kimia, obat-obatan dan industri kulit. Salah satu diantaranya adalah enzim amilase (Muctadi. et al., 1992). Pada tahun 1996 Indonesia mengimpor enzim sebesar 2.490.396 kg dengan nilai US $ 12.181.608 (Richana. et al., 1999). Enzim amilase secara konstitusi merupakan kelompok enzim yang sangat dibutuhkan dalam bidang industri dengan penguasaan pasar mencapai hampir 25% Nurhalijah Sutiamiharja : Isolasi Bakteri Dan UJi Aktivitas Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Gurukinayan Karo Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008

dari pasaran enzim di dunia. Oleh karena enzim ini bernilai komersil maka perlu ditemukan sumber-sumber yang cukup luas sebagai penghasil enzim amilase sesuai dengan karakteristik enzim amilase yang dibutuhkan (Carvalho, 2008). Amilase merupakan kelompok enzim yang memiliki kemampuan untuk memutuskan ikatan glikosida yang terdapat pada molekul amilum. Hasil hidrolisisnya berupa molekulmolekul yang lebih kecil seperti glukosa, maltosa, dan dekstrin (Reddy et al., 2003). Amilase merupakan salah satu enzim yang dapat dihasilkan oleh bakteri termofil dari berbagai sumber air panas di daratan maupun lautan. Jatuhan daun-daun, ranting, batang dan bangkai hewan yang terdapat pada sumber air panas tersebut merupakan sumber bahan organik yang dapat dimanfaatkan bakteri termofil penghasil amilase untuk tumbuh (Dirnawan et al., 2000). Mikroorganisme termofil menghasilkan enzim termostabil yang sangat penting dalam proses industri. Mikroorganisme ini mampu hidup pada suhu di atas 45oC, bahkan beberapa diantaranya tumbuh di atas 80oC (Lestari, 2000). Pada saat ini lebih 70 genus dari 140 spesies termofil telah diisolasi dari berbagai lingkungan termus (George, 2001). Menurut Poernomo (2003), pemilihan mikroba sebagai sumber enzim mempunyai beberapa keuntungan bila dibandingkan enzim yang diisolasi dari tanaman ataupun hewan, sebab sel mikroba relatif lebih mudah ditumbuhkan, kecepatan pertumbuhan relatif lebih cepat, skala produksi sel lebih mudah ditingkatkan bila dikehendaki, produksi yang lebih besar, biaya produksi relatif rendah, kondisi selama produksi tidak tergantung oleh adanya pergantian musim, dan waktu yang dibutuhkan dalam proses produksi lebih pendek. Nurhalijah Sutiamiharja : Isolasi Bakteri Dan UJi Aktivitas Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Gurukinayan Karo Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008

Mikroorganisme termofil telah diisolasi dari sumber air panas Sileri Dieng Jateng. Menurut Indrajaya et al., (2003), Mikroorganisme ini mampu hidup sampai suhu 85oC. Bora & Kalita (2007) berhasil mengisolasi bakteri termofil yang mampu menghasilkan enzim amilase dari sumber air panas Arunachal Pradesh India. Aiyer (2004) menemukan bakteri termofilik penghasil amilase dari tanah di Gujarat India yang berasal dari species Bacillus sp. Dirnawan et al., (2000) berhasil mengisolasi bakteri termofil yang mampu menghasilkan enzim hidrolitik dari sumber air panas Gunung Pancar. Diantara bakteri tersebut ada yang mampu menghasilkan enzim amilase. Fu-Saw et al., (1995) berhasil mengisolasi bakteri Thermus sp., penghasil amilase dari sumber air panas di bagian utara Taiwan. Mengingat bahwa bakteri termofil penghasil enzim amilase ini sangat berpotensi dalam bidang industri, perlu dilakukan penelitian dalam upaya mencari sumber daya alam yang potensial bagi kesejahteraan manusia, dengan cara mengisolasi bakteri termofil penghasil enzim amilase dari sumber air panas yang banyak dijumpai di berbagai daerah di Sumatera Utara. 1.2. Perumusan Masalah Mikroorganisme termofil menghasilkan enzim termostabil yang sangat penting dalam bidang industri karena sebagian besar prosesnya berjalan pada suhu tinggi (50–100oC). Enzim ini umumnya dihasilkan oleh bakteri termofil yang dapat hidup pada suhu yang tinggi, sehingga di duga pada sumber air panas di Gurukinayan Kecamatan Karo terdapat bakteri termofil penghasil enzim amilolitik.


1.3. Tujuan a. Untuk memperoleh isolat bakteri termofil yang dapat menghasilkan enzim amilase. b. Untuk mengetahui karakter isolat bakteri yang mampu menghasilkan enzim amilase dari sumber air panas Gurukinayan Kabupaten Karo. c. Untuk mengetahui aktivitas enzim amilase kasar yang berasal dari sumber air panas Gurukinayan Kabupaten Karo. 1.4. Hipotesis a. Terdapat keanekaragaman bakteri termofil penghasil amilase dari sumber air panas Gurukinayan, Kabupaten Karo. b. Terdapat perbedaan aktivitas enzim amilase kasar dari bakteri termofil. 1.5. Kegunaan Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan : a. Untuk memperoleh data isolat tentang bakteri termofil yang dapat menghasilkan amilase. b. Untuk memperoleh data tentang kemampuan aktivitas enzim amilase kasar dari bakteri termofilik. c. Sebagai informasi bagi pihak yang tertarik dalam pemanfaatan mikroba khususnya bakteri termofil yang dapat menghasilkan enzim amilase.


BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Bakteri Termofilik Indonesia sebagai negara tropik mempunyai banyak daerah dengan aktivitas geotermal seperti daerah pegunungan berapi, sumber air panas dan cadangan minyak bumi dan batubara. Beberapa kondisi lingkungan yang berbeda dalam setiap lokasi memungkinkan untuk mengisolasi heterogenitas bakteri termofil yang tinggi (Indrajaya et al., 2003). Bakteri termofil menghasilkan enzim termostabil yang sangat penting dalam proses industri dan bioteknologi seperti dalam teknik-teknik biologi molekuler untuk kegunaan penelitian dan diagnostik (enzim yang memproses DNA dan RNA) dan kemampuan enzim untuk mengubah tepung, makanan, pengelolaan sampah, pembuatan kertas dan sintesis zat-zat organik (Vielle and Zeikus, 2001). Bakteri termofilik tumbuh optimal pada suhu 45oC–80oC, bahkan ada yang mampu hidup pada suhu 100oC atau lebih (Lestari, 2000). Mikroorganisme termofil telah berhasil diisolasi dari berbagai sumber air panas di Indonesia antara lain sumber air panas Cimanggu, Kawah Domas Tangkuban Perahu serta Kawah Papandayan yang terdapat di sekitar Jawa Barat (Akhmaloka et al., 2000). Indrajaya et al., (2003) telah berhasil mengisolasi dan mengindentifikasi bakteri dari sumber air panas kawah Wayang Pangalengan dengan metode analisis gen 16S rRNA. Hasil penelitian menunjukkan homologi tertinggi ditunjukkan oleh bakteri Geobacillus thermoleovourans yang tumbuh pada kisaran Nurhalijah Sutiamiharja : Isolasi Bakteri Dan UJi Aktivitas Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Gurukinayan Karo Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008

suhu 42oC sampai 70oC. Thomas D Brock pada tahun 1978 menemukan bakteri Thermus aquaticus suatu bakteri yang mampu tumbuh di atas suhu 70oC. Bakteri ini menghasilkan enzim termostabil. Bacillus umumnya merupakan mikroorganisme yang dominan dalam suatu lingkungan termasuk pada lingkungan yang kurang cocok membentuk endospora, sementara bakteri lain yang tidak memiliki endospora menuntut kondisi yang spesifik untuk dapat bertahan hidup (Indrajaya et al., 2003). 2.2. Amilum Amilum

merupakan

bagian

dari

homopolisakarida

yang

monomer

monosakaridanya ialah D-4-glukosa dengan submonomer maltosa. Pada umumnya amilum terdapat sebagai butiran yang dapat berwujud bola, lensa atau telur dan mempunyai struktur berlapis yang jelas (Schlegel & Schmidt, 1994). Berbagai macam amilum ditemukan di alam karena dapat disintesis oleh ribuan macam tumbuhan. Setiap macam pati memiliki bentuk partikel atau granula yang berbeda, dan secara mikroskopis dipakai untuk membedakan berbagai pati alamiah. Pati terbagi menjadi dua golongan yaitu pertama adalah amilosa (15-20%) yang merupakan rantai panjang tidak bercabang yang terdiri dari molekul-molekul α-Dglukopiranosa yang bersambungan dengan ikatan α1,4. Kedua adalah amilopektin (80–85%) yang merupakan rantai bercabang sebanyak 24–30 molekul alfa-Dglukopiranosa yang bersambungan dengan ikatan α1,4 dan α1,6 (Poedjadi, 1994). Kedua tipe pati ini dapat dipisahkan dengan melarutkannya ke dalam air mendidih. Amilosa mengendap sedangkan amilopektin membentuk koloid yang jika dibiarkan


akan menarik air dan terbentuk pasta (Hawab, 2004). Struktur amilum dan amilo pektin dapat dilihat pada gambar di bawah ini.

Gambar 1 (A) Amilosa yang memperlihatkan struktur gulungan heliks (B) Amilopektin yang memperlihatkan titik cabang 1-6 Secara kimia hidrolisis pati terjadi pada pemanasan dengan asam encer yang secara berturut-turut terbentuk amilodekstrin. Amilodekstrin memberi warna biru dengan penambahan iodium, sedang akrodekstrin, maltosa, dan glukosa tidak memberi warna dengan penambahan iodium. Secara enzimatis hidrolisis dikatalis oleh kelompok enzim amilase (Poedjadi, 1994). 2.3.Enzim Amilase Enzim merupakan penyusun sebagian besar protein total di dalam sel. Mikroorganisme seperti bakteri, kapang maupun khamir dapat menghasilkan berbagai macam enzim diantaranya amilase. Amilase merupakan salah satu enzim yang mampu mengkatalisis proses hidrolisis ikatan (α1,4) glikosida pada senyawa polimer karbohidrat dengan rumus umum (C6H10O5)n. Amilase dapat digunakan untuk Nurhalijah Sutiamiharja : Isolasi Bakteri Dan UJi Aktivitas Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Gurukinayan Karo Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008

mengkonversi bahan-bahan berpati menjadi monomer yang lebih sederhana dalam bentuk glukosa, dekstrosa, fruktosa atau maltosa. Penggunaan enzim amilase sangat besar dalam bidang industri pangan, farmasi dan tekstil namun enzim tersebut masih banyak di impor (Richana et al., 1999). Pemanfaatan enzim dalam bidang industri harus memperhatikan faktor penting yang sangat mempengaruhi efisiensi dan efektivitas dari enzim yang digunakan. Faktor yang mempengaruhi reaksi enzim antara lain konsentrasi enzim, suhu, pH, dan spesifitas enzim (Hartati et al., 2002). Amilase merupakan enzim yang paling penting dalam bidang bioteknologi. Amilase dapat dikelompokkan menjadi 3 golongan enzim (Poejiadi 1994) yaitu: a. α-amilase (1,4–α–D-glukan–glukanohidrolase) α-amilase merupakan enzim ekstraseluler yang menghidrolisis ikatan 1,4-αglikosida. α-amilase dibentuk oleh berbagai bakteri dan fungi. Pada umumnya αamilase diproduksi oleh mikroorganisme aerob yang membutuhkan oksigen untuk pertumbuhannya. Beberapa mikroorganisme anaerob mampu memproduksi enzim α-amilase seperti Clostridium thermosulfuregenes dan B. stearpthermophillus (Brock, 1986). Kapang penghasil α-amilase adalah Aspergillus oryzae, A. niger, Paecilomyces subglobosum dan Mucor pusilus (Fogarty, 1983). Golongan αamilase yang tahan pada suhu tinggi umumnya digunakan pada proses likuifikasi, sedang α-amilase yang bersifat labil digunakan dalam proses sakarafikasi pada pembuatan gula cair. Kegunaan α-amilase dalam berbagai kondisi sangat Nurhalijah Sutiamiharja : Isolasi Bakteri Dan UJi Aktivitas Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Gurukinayan Karo Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008

dipengaruhi stabilitas enzim tersebut. α-amilase yang tidak stabil akan tidak efektif memecah subtrat karena aktivitasnya menurun. Hal ini dapat dipertahankan dengan teknik imobilisasi dan modifikasi kimia (Rosmimik et al., 2001). Aktivitas α-amilase ditentukan dengan mengukur hasil degradasi pati, biasanya dari penurunan kadar pati yang larut atau dari kadar dekstrinnya dengan menggunakan subtrat jenuh. Hilangnya subtrat dapat diukur dengan pengurangan derajat pewarnaan iodium terhadap subtrat. Pati yang mengandung amilosa bereaksi dengan yodium menghasilkan warna biru, sedangkan dekstrin bila bereaksi dengan yodium berwarna coklat. Keaktifan α-amilase juga dapat dinyatakan dengan pengukuran viskositas dan jumlah produksi yang terbentuk. Laju hidrolisis akan meningkat bila tingkat polimerisasi menurun dan laju hidrolisis akan lebih cepat pada rantai lurus (Winarno, 1986) b. β-amilase (1,4-α-D-glukan maltohidrolase) β-amilase ditemukan pada tanaman tingkat tinggi dan mikroorganisme. Enzim βamilase memecah ikatan glukosida α-1,4 pada pati dan glikogen yang terjadi secara bertahap dari arah luar atau ujung rantai gula yang bukan pereduksi, karena pemotongannya dari arah luar maka enzim ini disebut eksoamilase (Winarno, 1986). Beberapa mikroorganisme yang mampu menghasilkan enzim β-amilase yaitu B. polymyxa, B. cerens, B, megaterium, Streptomyces sp, Psudomonas sp, dan R. japanicus (Cruger & Anneliese, 1984). Bakteri C. thermosulforogenes memiliki aktivitas ekstra kasar β-amilase (Dirnawan et al., 2000).


c. γ-amilase (Glukoamilase) Glukoamilase jarang ditemukan pada bakteri, glukoamilase dihasilkan oleh beberapa fungi seperti A. niger, A. oryzae, A. awamori dan R. javanicus (Cruger & Anneliese, 1984). Glukoamilase memecah pati dari luar dengan mengeluarkan unit-unit glukosa ujung bukan pereduksi polimer pati. Hasil reaksinya hanya glukosa, sehingga dapat dibedakan dengan α dan β amilase. Dengan pengaruh enzim glukoamilase posisi glukosa α dapat diubah menjadi β, pH optimal 4 – 5 dan suhu optimal 50 – 60 oC (Winarno, 1986). Bakteri penghasil enzim amilase dapat menghidrolisis pati menjadi molekul-molekul maltosa, glukosa dan dektrin. (Gambar 2).

Gambar 2. Jenis reaksi hidrolisis yang dikatalis oleh enzim amilase (Nickerson & Brown) amylo (1-4) dextrinase, α-amylase amylo (1-4) maltosidase, β-amylase • amylo (1-4, 1-6) glucosidase, amyloglusocidase ¾ amylo (1-6) dextrinase, isoamylase amylo (1-6) glucosidase


2.4. Mikroba penghasil amilase Bakteri merupakan salah satu kelompok mikroorganisme yang menghasilkan enzim amilase. Diantara jenis bakteri tersebut ada yang bersifat termofilik (Indrajaya et al., 2003). Bakteri termofilik yang mampu menghasilkan enzim amilase biasanya tumbuh maksimal pada pH 5–6. Produksi amilase dengan menggunakan bakteri termofil memiliki keunggulan yang salah satunya dapat menurunkan resiko kontaminasi (Santos & Meire, 2003). Pada tahap awal untuk mendapatkan mikroba yang berpotensi sebagai penghasil enzim ialah dengan mengisolasi dan seleksi mikroba tersebut dari habitat alaminya. Mikroba yang diperoleh dari hasil isolasi harus memiliki kemampuan untuk melangsungkan reaksi atau menghasilkan produk yang diinginkan (Handayani et al., 2002). Mamo & Gessesse (1999) membuktikan bahwa bakteri termofilik menghasilkan enzim amilase pada medium dengan pH 4 dan pH 9. Haki & Rakehit (2003) telah berhasil mengisolasi bakteri termofilik ekstrim dan hipertermofil yaitu Thermus sp. yang menghasilkan enzim amilase dan Thermococcus litoralis menghasilkan enzim pullulanase. B. stearothermophilus merupakan bakteri termofil yang mampu hidup pada suhu 60–70 oC berhasil di isolasi dari kawah pegunungan Dieng (Lestari 2000). Damardjati et al., (1997) berhasil mengisolasi enzim amilase yaitu dari bakteri mesofil Bacillus sp. dengan bakteri termofil B. licheniformis yang mempunyai aktivitas optimum pada pH 6,0–7,0. Shih & Labbe (1995) menumbuhkan α-amilase dari bakteri Clostridium perfringens dapat menghasilkan maltosa, maltotriosa dan Nurhalijah Sutiamiharja : Isolasi Bakteri Dan UJi Aktivitas Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Gurukinayan Karo Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008

maltotetrosa sebagai produk utama. Al-Qodah et al. (2007) berhasil mendeterminasi parameter kinetik dari enzim amilase yang dihasilkan oleh Bacillus sphaericus yang berasal dari sumber air panas di Jordania, aktifitasnya optimum pada suhu 50oC. 2.5. Manfaat enzim amilase dari bakteri termofilik Bakteri termofilik dapat menghasilkan enzim termostabil seperti enzim amilase. Penggunaan enzim termostabil dapat menghemat biaya karena enzim ini memiliki waktu simpan yang lebih lama dan aktivitas yang lebih tinggi pada suhu tinggi. Dengan aktivitas yang tinggi (produktivitas juga tinggi) keuntungan yang diperoleh juga tinggi karena alokasi dana untuk investasi dapat diperkecil. Enzim amilase termostabil digunakan dalam industri tekstil, hidrolisis pati, bir, roti, sirup, pemanis, pembuatan etanol, dan deterjen (Lestari, 2000). Dalam industri hidrolisis pati enzim digunakan untuk mencairkan pati. Enzim tersebut berfungsi untuk menurunkan viskositas pati dan menghidrolisisnya menjadi maltodekstrin (Lestari, 2000). Penggunaan enzim amilase yang dihasilkan oleh bakteri termofilik memiliki beberapa keuntungan yaitu dapat menekan biaya produksi, mengurangi resiko terjadinya kontaminasi, meningkatkan difusi masa, meningkatkan produktivitas dan mempengaruhi daya larut saat pencampuran senyawa organik (Igarashi et al., 1998). Diantara sekian banyak enzim yang digunakan dalam industri, enzim untuk industri pangan merupakan enzim yang menguasai pasar dunia. Pada saat ini enzim yang sangat besar penggunaannya untuk biokonversi bahan berpati ialah amilase (Rosmimik et al, 2001).


Enzim termostabil yang dihasilkan mikroorganisme bermanfaat dan aplikasinya dalam bidang industri dapat dilihat pada Tabel 1 berikut ini: Tabel 1. Enzim hidrolitik yang berasal dari mikroorganisme dan aplikasinya pada bidang industri (Brock & Brock, 1978) Enzim Amilase

Protease

Sumber Jamur Bakteri Jamur Bakteri Jamur Bakteri Jamur Bakteri Bakteri Bakteri Bakteri Bakteri

Aplikasi Roti Pelapis kertas Sirup dan gula Bahan pencuci Obat Pencernaan Pembersih warna kain Roti Penghilang noda Aroma daging Pembersih luka Pembersih kain Deterjen

Industri Roti Kertas Makanan dan minuman Pati Farmasi Kain Roti Pencuci pakaian Daging Kesehatan Kain Rumah tangga

2.6. Faktor-faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim Dalam proses biokimia yang terjadi di dalam sel maupun di luar sel, enzim berfungsi sebagai katalis. Suatu enzim dapat mempercepat reaksi 108–1011 kali lebih cepat daripada reaksi tersebut dilakukan tanpa katalis. Aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh berbagai faktor beberapa diantaranya adalah suhu, pH, jumlah enzim, jumlah subtrat dan keberadaan aktivator serta inhibitor enzim (Poedjadi, 1994). Suhu sangat berpengaruh terhadap kerja enzim, karena enzim terdiri atas protein. Enzim dapat menjalankan aktivitasnya pada kisaran suhu tertentu. Semakin tinggi suhu reaksi kimia akan semakin cepat, akan tetapi enzim akan mengalami denaturasi jika suhu terlalu tinggi. Apabila enzim terdenaturasi maka terjadi


perubahan susunan molekul enzim sehingga enzim menjadi tidak aktif. Suhu optimum untuk setiap organisme berbeda-beda. Enzim membutuhkan pH tertentu untuk menjalankan aktivitasnya. Setiap enzim membutuhkan pH yang berbeda-beda. Ada enzim yang dapat bekerja optimal pada pH tinggi dan ada pula yang bekerja optimal pada pH yang rendah. Jika pH terlalu tinggi atau terlalu rendah enzim akan mengalami denaturasi dan ini akan mengakibatkan menurunnya aktivitas enzim. Kecepatan enzim bereaksi dipengaruhi oleh konsentrasi enzim yang berfungsi sebagai katalisator. Jika konsentrasi enzim dengan subtrat sudah seimbang maka kecepatan reaksi kimia akan relatif konstan. Demikian juga dengan adanya aktivator yang berfungsi mengaktifkan enzim dan pada umumnya berasal dari bahan yang tahan panas dan berberat molekul yang relatif rendah. 2.7. Sumber Air Panas Gurukinayan Indonesia merupakan negara yang kaya sumber air panas yang memiliki suhu cukup tinggi dan dapat dijadikan sebagai lingkungan tempat kehidupan bagi mikroorganisme yang tahan terhadap suhu air yang panas, seperti bakteri, fungi maupun alga yang bersifat termofil yang dapat memproduksi enzim yang bernilai ekonomis. Bakteri termofilik dapat diisolasi dari sedimen geotermal dan sumber air panas yang salah satunya terdapat di kolam air panas Gurukinayan. Sumber air panas Gurukinayan terletak di desa Gurukinayan Kecamatan Payung Kabupaten Karo Propinsi Sumatera Utara, tepatnya berada di posisi geografis 03o,07’7,10” LU dan 98o23’9,70”BT, memiliki suhu sekitar 46oC–55oC dan pH 6,5. Nurhalijah Sutiamiharja : Isolasi Bakteri Dan UJi Aktivitas Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Gurukinayan Karo Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008

BAB III METODE PENELITIAN 3.1. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan sejak bulan Februari-Juli 2008 bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara. 3.2. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah sumber isolat yaitu air panas dari desa Gurukinayan, media selektif termofil, media selektif amilase, larutan iodine, hidrogen peroksida 3%, kristal violet, safranin, etanol 95 %, NaCl, media SIM, SCA, TSIA, gelatin dan H2O2 untuk uji katalase. Alat yang digunakan adalah timbangan, pinset, batang pengaduk, botol sampel, termometer, pH universal, gelas ukur, Erlenmeyer, tabung reaksi, spatula, jarum ose, beaker glass, lampu bunsen, cawan petri, pipet tetes, magnetic strirer, autoclave, incubator, open, shaker, waterbath, vortex, mikroskop, pipet ukur 5 ml, pipetman dan mikro pipet, gelas benda, jangka sorong, spektrofotometer. 3.3. Sumber Isolat Sampel air sebagai sumber isolat diambil dari kolam air panas Gurukinayan yang masing-masing berada pada tiga tempat yang berbeda. Sebelum sampel diambil lebih dahulu dilakukan pengamatan pengukuran lingkungan terhadap kondisi fisik


dan kimia di lingkungan. Suhu air dan suhu lingkungan diukur dengan termometer, pH air diukur dengan menggunakan pH universal. Masing-masing parameter diukur dengan mencelupkan alat pengukur ke dalam air panas selama 3 menit. Sampel diambil pada bagian dasar dan permukaan aliran air panas dengan kedalaman 50 cm sebanyak 250 ml dari 3 tempat yang berbeda. Sampel air dimasukkan dalam botol wingkler dan diberi label. 3.4. Penapisan Bakteri Penghasil Enzim Amilase Media yang digunakan adalah luria agar yang terdiri dari 5 g yeast ekstrak, 5 g pepton, 3 g NaCl, 5 g tepung agar, dilarutkan dalam 1 liter aquades dan disterilkan. Selanjutnya media dituang pada petri steril dan dibiarkan padat. Sebanyak 0,1 ml sampel air panas disebar dengan hoki stik pada permukaan agar, kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 65oC (Hartuti, 2006). Koloni bakteri yang tumbuh pada kultur yang sama diambil 1 ose dan digores pada setiap cawan petri yang berisi media agar selektif amilolitik yang terdiri dari 0,2% yeast ekstrak, 0,5% pepton, 0,05% NaCl, 0,05% MgSO4, 0,015% CaCl2, 2% tepung agar, dan 1% soluble starch (Santos & Martin, 2003). Kultur diinkubasi selama 24 jam pada suhu 65oC. Hal ini dilakukan untuk mendapatkan biakan tunggal tiap jenis bakteri termofil yang hidup pada sumber air panas. Koloni bakteri yang tumbuh ditetesi dengan iodium, bila terdapat zona bening di sekeliling koloni bakteri itu menandakan enzim amilase diproduksi oleh bakteri dan di daerah tersebut amilum sudah dihidrolisis dapat dilihat pada lampiran 1.


3.5. Pengujian Aktivitas Amilase Isolat Bakteri Sebanyak 1–2 ose isolat bakteri termofil yang telah dimurnikan dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril yang telah berisi NaCl fisiologis 0,9%. Campuran kemudian dihomogenkan dengan vortex kekeruhan campuran dibandingkan dengan kekeruhan Mac Farland 0,5 standar yang setara dengan 108 CFU/ml. Sebanyak 5 μl suspensi dengan menggunakan mikropipet lalu diteteskan dengan tepat pada bagian tengah petridis yang sudah berisi media agar pati. Kultur diinkubasi selama 72 jam pada suhu 65oC. Isolat bakteri yang tumbuh ditetesi dengan iodium untuk melihat kemampuan amilolitik pada media. Uji positif ditandai dengan tampaknya zona lingkaran jernih di sekitar isolat bakteri dan area medium menjadi warna biru tua. Untuk mengamati aktivitas enzim amilase secara semikuantitatif dilakukan pengukuran diameter zona bening yang dihasilkan. Diameter zona bening yang terbentuk diukur dengan menggunakan jangka sorong dapat dilihat pada lampiran 2 (Dirnawan et al., 2000). 3.6. Karakterisasi Morfologi dan Uji Biokimia Bakteri Termofilik Penghasil Enzim Amilase Karakterisasi sifat morfologi mencakup bentuk koloni, permukaan koloni dilihat dari samping, tepi koloni, warna koloni, motilitas, dan sifat gram (Hadioetomo, 1985). Motilitas bakteri diamati dengan menggunakan medium semi padat sulfide indolmotility (SIM). Pewarnaan gram menggunakan pewarnaan kristal violet dan safranin untuk menentukan sifat gram (Volk & Wheeler, 1988).


Sifat biokimia yang diamati mencakup uji sitrat dengan media Simon Sitrat Agar. Uji TSIA dengan media triple sugar iron agar. Inokulasikan satu ose bakteri dengan cara menggores dan menusuk pada permukaan hingga bagian tengah media amati perubahan warna. Uji gelatin dengan media nutrien gelatin, dengan menggunakan ose yang berisi inokulum tusuk dengan lurus pada bagian tengah media dan amati kemampuan bakteri dalam mencairkan gelatin. Uji katalase dilakukan dengan menggunakan 3% H2O2 diteteskan pada gelas objek yang berisi isolat bakteri, uji positif bila terlihat pembentukan gelembung udara. Uji TSIA, sitrat, motilitas dan uji gelatin diinkubasi pada suhu 65oC selama 48 jam dapat dilihat pada lampiran 3 (Capucino & Sherman, 1983; Lay, 1994).

3.7. Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Amilase Kasar Aktivitas enzim amilase ditentukan dengan metode Bernfeld (1955) dengan menggunakan DNS (3.5-dinitro salicylic acid) dan pati sebagai substrat. Perlakuan ini menggunakan 3 kali ulangan. Filtrat dari kultur enzim amilase kasar digunakan sebagai sample enzim. Satu unit aktivitas enzim amilase didefenisikan sebagai banyaknya pati yang terhidrolisis menjadi glukosa selama masa inkubasi 20 menit. Satu ose kultur bakteri amilolitik dari stok kultur yang berumur 1 hari dimasukkan ke dalam media cair steril untuk perangsang pembentukan amilase. Media cair terbuat dari (per liter larutan) 2% peptone, 0,03% K2HPO4, 0,1% MgSO4 7H2O,

dan 0,5 larutan pati disterilkan dalam Erlenmeyer 250 ml dengan otoklaf.

Media yang mengandung kultur bakteri diinkubasi pada suhu 65oC selama 48 jam Nurhalijah Sutiamiharja : Isolasi Bakteri Dan UJi Aktivitas Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Gurukinayan Karo Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008

diguncang dengan menggunakan shaker pada kecepatan 150 rpm Lampiran 4 (Ajayi et al., 2007). Setelah diinkubasi selama 48 jam, kultur cair bakteri dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge dan diputar selama 20 menit dengan kecepatan putaran 5000 rpm, bagian yang merupakan supernatan merupakan ekstrak dari amilase kasar yang dihasilkan oleh kultur bakteri tersebut. Enzim ini adalah enzim ekstraseluler, yang diproduksi ke lingkungan media pertumbuhan bakteri tersebut. Supernatan diambil dengan menggunakan mikropipet (Lampiran 5). Sebanyak 1 ml ekstrak amilase kasar hasil sentrifugasi dimasukkan ke dalam tabung uji, lalu ditambahkan ke tiap tabung uji 1 ml larutan pati 1% dalam sitrat buffer fosfat pH 6,5 kemudian divorteks. Larutan pati dan enzim tersebut diinkubasi pada waterbath dengan suhu yang bervariasi mulai suhu 40oC, 50oC, 60oC, 65oC, 70oC, dan 80oC selama 20 menit. Untuk menghentikan reaksi setelah 30 menit, ke dalam tiap tabung uji ditambahkan 2 ml reagen DNS. Tabung uji dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit, didinginkan dan ditambahkan 20 ml akuades, selanjutnya tiap larutan dalam tabung uji dideterminasi intensitas warnanya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Nilai absorbansinya diplotkan dengan kurva standart glukosa yang terbuat dari larutan glukosa mono hidrat dengan konsentrasi larutan 80-260 μl dapat dilihat pada Lampiran 6.


3.8. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Amilase Kasar Pekerjaan yang sama dilakukan pada pH yaitu dengan cara mengukur aktivitas enzim dengan menggunakan pH yang bervariasi yaitu 4,0–9,0 pada suhu 65oC, buffer yang digunakan untuk penentuan pH optimum adalah bufer sitrat fosfat 0,05 M. (lampiran 7) Aktivitas amilase dihitung berdasarkan data kadar glukosa relatif sebagai mg glukosa yang dihasilkan per ml, filtrat enzim dengan menggunakan rumus : MG x 100 AE =

……………… (Kombong, 2004) BMg x MI

Dimana : AE = MG = BMg = MI =

Aktivitas Enzim (Unit/ml filtrat enzim) Miligram Glukosa Berat molekul glukosa Masa Inkubasi

3.9. Pembuatan Larutan Kontrol Penguji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Sebanyak 2 ml enzim amilase kasar dimasukkan dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan dalam tiap tabung uji 1 ml larutan pati 1 % dalam sitrat buffer fosfat pH 6,5. Larutan pati dan enzim tersebut diinkubasi pada suhu yang bervariasi selama 20 menit. Untuk menghentikan reaksi setelah 20 menit dalam tiap tabung uji tambahkan 2 ml reagen DNS. Tabung uji dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit, didinginkan dan ditambahkan 20 ml air yang didestilasi, selanjutnya larutan dalam

tabung

uji

dideterminasi

intensitas

warna

dengan

menggunakan

spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm (Lampiran 8).


3.10. Pembuatan Kurva Standar Glukosa Pembuatan kurva standar glukosa menurut metode Bernfeld (1955) dengan cara menyiapkan larutan glukosa standar. Larutan glukosa standar disiapkan dalam beberapa tabung reaksi pada berbagai konsentrasi yang bertingkat (80 sampai dengan 260 μl), dengan melalui pengenceran kemudian diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke tabung reaksi, ditambah DNS 1,5 ml, dipanaskan selama 5 menit, didinginkan dengan air mengalir selama 15 menit, dan ditambahkan 20 ml aquades steril. Selanjutnya adsorbansinya diukur pada panjang gelombang 540 nm (Lampiran 9). 3.11. Analisis Hasil pengamatan morfologi dan biokimia dipaparkan secara deskriptif, sedangkan hasil berupa data kuantitatif pengaruh suhu dan pH dianalisis varian. Bila didapatkan pengaruh nyata atau sangat nyata dilanjutkan dengan Uji Duncan Multiple Range Test (DMRT) (Sujana, 2002). Mengingat semua media dan kondisi lingkungan serta perlakuan terhadap amilase kasar dikondisikan sama kecuali perlakuan suhu dan pH untuk mengukur aktivitas enzim, dilakukan rancangan sesuai dengan rancangan acak lengkap non faktorial. Perlakuan suhu yang dilakukan pada rentang 40–80 oC sebanyak 3 kali ulangan demikian juga dengan pH pada rentang 4,0–9,0 sebanyak 3 kali ulangan. Dalam penelitian ini variabel yang diukur adalah konsentrasi amilase kasar (μg/ml) terhadap berbagai kondisi suhu dan pH. Data hasil penelitian dihitung dalam struktur tabel sidik ragam yang disajikan sebagai berikut :


Tabel 2. Analisis Sidik Ragam Rancangan Acak Lengkap Non Faktorial Sumber kereagaman

Derajat bebas

Jumlah kuadrat

Perlakuan Galat

p-1 (P(n-1)

Σ (Σ Yij)2/n- FK JKt – JKp

Total

P(n-1)

JKtotal

Kuadrat tengah

Fhitung

JKperl/dbperl JKG/dbG

KTP/KTG

Ftabel 0,05 Tabel F α (0.05)

0,01 Tabel F Α (0.01)

Pengujian hipotesis dilanjutkan bila nilai Fhitung > Ftabel maka hipotesis nol ditolak yang berimplikasi bahwa perlakuan suhu memberikan pengaruh nyata terhadap konsentrasi glukosa (μg/ml). Dengan demikian dilakukan uji Duncan Multiple Range Test (DMRT) untuk melihat jarak antar perlakuan suhu dan pH.


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil Isolasi dan Seleksi Bakteri Termofilik Penghasil Amilase dari Kolam Air Panas Gurukinayan Dari hasil isolasi yang telah dilakukan, diperoleh 25 isolat bakteri termofil. Isolasi dilakukan untuk mendapatkan biakan murni dengan menggunakan media selektif amilase. Dari percobaan ini diperoleh 20 isolat amilolitik. Dari 20 isolat tersebut, 9 isolat berasal dari kolam 1, 6 isolat berasal dari kolam 2, dan 5 berasal isolat dari kolam 3. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada setiap air panas terdapat berbagai jenis bakteri termofilik penghasil amilase. Santos dan Martin (2003) berhasil mengisolasi 16 bakteri termofilik penghasil amilase dengan suhu pertumbuhan optimal 50oC dan pH pertumbuhan optimal 6,5, sedangkan Mammo dan Gesesse (1999) berhasil mengisolasi 12 bakteri termofilik penghasil amilase dengan suhu pertumbuhan optimal 55oC dan pH pertumbuhan optimal 6,0. Koloni bakteri yang tumbuh ditetesi dengan jodium dengan tujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri menggunakan pati. Deteksi dilakukan dengan melihat terbentuknya zona bening di sekitar koloni bakteri yang tumbuh. Inchem (2008) menyatakan bahwa degradasi yang terjadi pada pati diketahui dengan hilangnya material yang terwarnai oleh iodine. Menurut Melliawati & Sukara (1989) kemampuan atau daya amilolitik suatu mikroba ditandainya dengan terbentuknya zona jernih dalam medium yang mengandung pati. Zona menjadi senyawa yang lebih


sederhana (glukosa). Produksi amilase dapat dilihat pada pembentukan zona bening di sekitar koloni bakteri seperti pada Gambar 3 di bawah ini.

Gambar 3. Tiga isolat terpilih berdasarkan diameter zona bening uji iodin setelah inkubasi 72 jam (A) Isolat GK4, (B) Isolat GK13, (C) Isolat GK14 Dari 20 isolat amilolitik Gurukinayan dipilih 3 isolat yang memiliki zona bening terbesar. GK4 menghasilkan diameter bening sebesar 35,20 mm, GK13 sebesar 32,18 mm dan GK 14 sebesar 30,15 mm. Proses isolasi dan seleksi dilakukan pada suhu 65oC. Isolat GK4 diperoleh dari titik 2 yang memiliki suhu 48oC, pH 6,0 Isolat GK13 dan GK14 berasal dari titik 3 yang memiliki suhu 51oC dan pH 6,0. Perbandingan diameter zona bening isolat dapat dilihat pada Tabel 3 di bawah ini. Tabel 3. Diameter zona bening isolat bakteri amilase termofilik dalam uji nisbi Isolat GK4 GK13 GK14

Zona bening (mm) 35,20 32,18 30,15


4.2. Karakter Morfologi dan Biokimia Isolat Termofilik Amilase Menurut Hadioetomo (1985), karakterisasi yang dilakukan terhadap koloni yang tumbuh meliputi pengamatan makroskopis yaitu pengamatan morfologi koloni (bentuk, warna, tepian, elevasi dan konsistensi), pengamatan mikroskopis yang pewarnaan gram serta pengamatan fisiologi dan biokimia (uji katalase). Hasil karakterisasi bentuk morfologi koloni bakteri dapat dilihat pada Tabel 4 berikut. Tabel 4. Karakter morfologi bakteri termofil Kode Isolat GK13 Krem Kream Menyebar Menyebar Berombak Berlekuk Timbul Datar

Morfologi Koloni GK4

Warna Bentu Tepi Elevasi

GK14 Kream Menyebar Berombak Bukit

Kode Isolat GK13 GK14 Batang Batang Batang Diplo Strepto Diplo Ungu Ungu Ungu + + +

Morfologi Bakteri GK4

Bentuk Penataan Warna Gram

Koloni bakteri hasil isolasi berwarna krem, dan bentuk morfologi koloni yang umumnya menyebar dengan tepi koloni GK4 dan GK14 berbentuk berombak, sedangkan GK13 berbentuk berlekuk. Permukaan GK4 timbul, GK13 datar dan GK14 seperti bukit. Pewarnaan gram dan pengamatan mikroskopis menunjukkan GK4 berbentuk batang dan sifat gram positif, GK13 berbentuk batang dan bersifat gram positif, dan GK14 berbentuk batang dan bersifat gram positif (Tabel 4). Eisenberg et al. (1997) berhasil mengisolasi bakteri termofilik penghasil amilase, sebagian bersifat gram negatif dan sebagian lagi bersifat gram positif. Fu Shaw et al. (1995) berhasil mengisolasi bakteri termofilik penghasil amilase jenis Thermus sp. yang bersifat gram positif.


Uji biokimia sederhana menunjukkan ketiga isolat memiliki sifat yang bervariasi, seperti terlihat pada Tabel 5 berikut. Tabel 5. Karakter sifat biokimia isolat amilolitik termofilik Gurukinayan Isolat GK4 GK13 GK14 Keterangan :

TSIA SA Gelatin SIM SCA Katalase M–M + + + M–K + + + + M–M + + + + Merah (M) Starch agar (SA) Kuning (K) Triple sugar ion agar (TSIA) Simon citrate agar (SCA) Sulfide Indol Motility (SIM)

Pada uji TSIA GK4 dan GK14 membentuk basa dan asam berwarna merah. Hal ini menunjukkan tidak terjadi fermentasi karbohidrat, sedang pada GK13 basa berwarna merah dan asam berwarna kuning, menunjukkan bakteri mampu memfermentasikan glukosa. Uji sitrat ditandai dengan perubahan media dari hijau menjadi biru, ternyata hanya isolat GK14 yang mampu menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. Pada uji gelatin GK4 dan GK13 menunjukkan hasil yang positif. Menurut Cappucino & Sherman (1983) uji positif ditandai dengan medium gelatin tetap cair setelah dimasukkan kedalam lemari es selama 30 menit. Uji motilitas dengan menggunakan media Sulfide Indol Motility menunjukkan bahwa GK13 dan GK14 bersifat motil ditandai dengan adanya jejak pergerakan bakteri dalam media, sedangkan GK4 bersifat immotil. Hasil uji katalase dengan penambahan larutan 3% H2O2 mengindikasikan bahwa ketiga isolat yaitu GK4, GK13, dan GK14 memiliki enzim katalase ditandai dengan terbentuknya gelembung


udara di sekitar koloni. Menurut Lay (1994) uji katalase membuktikan adanya enzim katalase dari isolat yang mampu menguraikan H2O2 menjadi H2O dan O2. 4.3. Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Amilase Kasar Setelah dilakukan isolasi dan seleksi serta pengamatan karakteristik morfologi maupun uji biokimia pada tiga isolat, dilakukan pengujian dan pengukuran aktifitas amilase berdasarkan suhu. Hasil pengujian menunjukkan adanya variasi aktifitas amilolitik enzim kasar (Tabel 6). Tabel 6. Pengaruh suhu inkubasi terhadap aktifitas enzim amilase kasar isolat bakteri termofil Gurukinayan Suhu (oC)

Konsentrasi Aktifitas enzim Notasi 0,05 glukosa (µg/ml) (unit/ml)/menit GK4 40 329,05 0,091 e 50 421,44 0,117 c 60 558,87 0,155 a 65 464,89 0,129 b 70 373,42 0,104 d 80 288,58 0,080 f GK13 40 444,53 0,123 e 50 546,75 0,152 c 60 633,65 0,176 a 65 584,71 0,162 b 70 461,22 0,128 d 80 373,42 0,103 e GK14 40 270,05 0,075 bc 50 461,23 0,128 ab 60 564,59 0,157 a 65 348,03 0,097 ab 70 309,39 0,086 bc 80 280,12 0,078 bc Keterangan : Huruf yang sama pada notasi pada masing-masing isolat menunjukkan pengaruh yang tidak berbeda nyata pada tingkat kepercayaan α 5% (Lampiran 10)

Kode Isolat


Dari Tabel 6 di atas terlihat bahwa suhu sangat berpengaruh terhadap aktivitas enzim amilase kasar yang dihasilkan oleh ketiga isolat bakteri yang terpilih. Aktivitasnya terlihat semakin meningkat mulai dari suhu 40oC sampai dengan suhu 60oC. Menurut Kristjanson (1999) suhu optimum pertumbuhan bakteri termofilik penghasil amilase terletak antara 40–70oC dan pada pH 6,0–9,0. Aktivitas amilase menurun karena enzim mengalami denaturasi sehingga kehilangan sebagian aktivitasnya. Hasil pengukuran aktivitas amilase kasar bakteri termofilik asal Gurukinayan masing-masing menunjukkan suhu optimalnya. Aktivitas amilase kasar

Konsentrasi glukosa (ug/ml)

termofilik terlihat pada Gambar 4.

700 600 500 400 300 200 100 0 40

50 60 65 70 Suhu inkubasi (0 C) GK4

80

GK13

Gambar 4. Pengaruh suhu inkubasi terhadap aktifitas enzim amilase kasar isolat bakteri termofil sumber air panas Gurukinayan Suhu optimum aktivitas amilase pada GK4, GK13 dan GK14 adalah sama yakni 60oC, tetapi nilai konsentrasi glukosa (µg/ml) dan aktivitas enzim (unit/ml) yang dihasilkan masing-masing isolat berbeda. Aktivitas enzim mulai


menurun pada suhu 80oC. Dari hasil perlakuan suhu ternyata setiap isolat memiliki aktifitas berbeda yang erat kaitannya dengan kemampuan bakteri dalam mensekresikan enzim ke dalam media pertumbuhannya. Variasi ini terlihat dari jumlah total aktivitas amilase yang diproduksi oleh setiap species dalam tabel konsentrasi glukosa yang dihasilkan. Rentang suhu optimum bakteri termofil yang dapat menghasilkan enzim amilase yang berasal dari sumber air panas Gurukinayan berkisar 40–80oC dan menunjukkan konsentrasi glukosa yang sangat berbeda-beda pada masing-masing isolat berdasarkan hasil uji spektrofotometer. Perbedaan ini terjadi karena suhu mempengaruhi

kemampuan

jenis

bakteri

penghasil

enzim

amilase

untuk

menghidrolisis amilum menjadi glukosa. Hasil pengukuran enzim pada berbagai suhu memperlihatkan aktivitas enzim yang cukup tinggi terutama pada GK13 pada suhu 60oC jika dibandingkan dengan GK4 dan GK14 pada perlakuan suhu sama. Hal ini menunjukkan bahwa GK13 memiliki kemampuan hidup yang lebih tahan panas jika dibandingkan dengan GK4 dan GK14. Sifat tahan panas pada bakteri dan enzim termofil ini terjadi akibat 3 faktor yang dimilikinya yaitu :protein Chaperonins yang tahan denaturasi oleh panas dan proteolisis, struktur lipid membran sel isolat termofil tahan suhu tinggi, struktur DNA isolat Reverse DNA Gyrase yang supercoil bermuatan positif sehingga DNA memiliki titik leleh yang lebih tinggi dari pada titik leleh DNA pada mikroorganisma non termofil (Everly and Alberto, 2000).


4.4. Pengaruh pH terhadap Aktifitas Amilase Kasar Aktivitas amilase kasar diukur mulai dari pH 4,0 sampai dengan pH 9,0 pada suhu 65oC. Nilai pH sangat mempengaruhi jumlah amilase yang dihasilkan. Pengaruh pH terhadap aktivitas bakteri aminolitik termofil berdasarkan hasil data spektrofotometer terdapat pada Tabel 7. Tabel 7. Pengaruh pH terhadap aktifitas enzim amilase kasar isolat bakteri termofil Gurukinayan Kode Isolat

pH

GK4

4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0

GK13

GK14

Konsentrasi glukosa (µg/ml) 276,46 329,05 477,92 555,90 461,91 344,60 249,70 349,86 639,59 584,71 461,45 297,27 265,02 346,89 488,67 520,68 437,22 340,72

Aktifitas enzim Notasi 0,05 (unit/ml)/menit 0,077 f 0,091 e 0,133 b 0,154 a 0,128 c 0,096 d 0,069 f 0,097 d 0,178 a 0,162 b 0,128 c 0,083 e 0,074 b 0,096 ab 0,136 ab 0,145 a 0,121 ab 0,095 b

Keterangan : Huruf yang sama pada notasi pada masing-masing isolat menunjukkan pengaruh yang tidak berbeda nyata pada tingkat kepercayaan α 5% (Lampiran 11)

Menurut Sadikin (2002) ada dua alasan untuk menyelidiki tingkat keasaman atau pH terhadap aktivitas enzim. Pertama sebagai produk makhluk hidup secara teori pH sangat berpengaruh terhadap aktifitas biologis dari enzim. Hal ini terlihat pada


perlakuan pH yang bervariasi mengakibatkan terjadinya perbedaan aktivitas enzim dalam menghasilkan glukosa. Kedua sebagai suatu protein enzim tidak berbeda dengan protein lain yang berarti mekanisme kerjanya sangat dipengaruhi oleh pH. Jika pH terlalu rendah maka enzim menjadi tidak aktif demikian juga jika pHnya terlalu tinggi kemungkinan akan menyebabkan denaturasi pada enzim. Aktivitas amilase kasar berdasarkan pengaruh pH dapat dilihat pada Gambar 5. Dari gambar terlihat adanya nilai pH tertentu yang memungkinkan enzim bekerja secara maksimal. Dalam lingkungan tersebut protein enzim membentuk struktur yang sangat tepat sehingga enzim dapat mengikat dan mengolah substrat dengan kecepatan yang tinggi. Di bawah maupun di atas pH optimum struktur enzim mulai berubah sehingga substrat tidak berada pada bagian molekul enzim yang mengolah substrat akibatnya proses katalisis berjalan tidak optimum. Jika nilai pH dikembalikan secara lambat laun kenilai pH optimum, misalnya dengan cara mendialisis campuran tersebut maka beberapa enzim akan kembali aktivitasnya. Menurut Winarno (1986) pada umumnya enzim bersifat amfolitik yang berarti enzim mempunyai konstanta disosiasi pada gugus asam maupun gugus basanya, terutama pada gugus terminal karboksil dan gugus terminal aminonya. Diperkirakan perubahan keaktifan enzim akibat perubahan pH lingkungan disebabkan terjadinya perubahan ionisasi enzim, substrat atau komplek enzim substrat. Enzim menunjukkan aktifitas maksimum pada suatu kisaran yang disebut pH optimum yang umumnya antara pH 4,5 – 8,0.


Konsentrasi glukosa (ug/ml)

700 600 500 400 300 200 100 0 4,0

5,0 GK4

6,0

7,0 pH GK13

8,0

9,0

GK14

Gambar 5. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim amilase kasar isolat bakteri termofil sumber air panas Gurukinayan Perubahan konsentrasi glukosa dari tiap ulangan pada isolat terjadi mulai dari pH 4,0 kemudian disusul dengan peningkatan konsentrasi sampai dengan pH 6,0 dan pH 7,0 yang merupakan pH optimal dan konsentrasi glukosa selanjutnya akan mengalami penurunan pada pH 8,0 dan 9,0. Hal ini disebabkan dari kemampuan bakteri dalam menghasilkan enzim amilolitik dipengaruhi oleh pH. Menurut Carvalho et al. (2008) aktivitas pH optimum pertumbuhan bakteri adalah pH 4,0-8,0. pH mempengaruhi aktifitas enzim amilase kasar yang dihasilkan oleh ketiga isolat. Enzim amilase kasar isolat GK13 aktivitas optimumnya berada pada pH 6,0. Aktivitas amilase isolat GK13 terlihat meningkat mulai dari pH 4,5 – pH 6,0 dan mulai mengalami penurunan pada pH 7,0 – pH 9,0. Isolat GK4 dan GK14 menghasilkan enzim amilase kasar yang aktifitas optimumnya pada pH 7. Aktifitas optimum pada pH ini pernah ditemukan pada enzim amilase dari isolat Bacillus Nurhalijah Sutiamiharja : Isolasi Bakteri Dan UJi Aktivitas Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Gurukinayan Karo Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008

amyloliquefaciens (Syu & Chen, 1997). Dari hasil analisis sidik ragam terhadap pH GK4 dan GK14 berbeda nyata sedangkan GK13 pada pH 5,0 dan pH 8,0 berbeda nyata. Hal ini terlihat dari hasil spektrofotometer yang menunjukkan variasi jumlah konsentrasi glukosa (µg/ml) yang dihasilkan oleh setiap isolat pada setiap perlakuan pH yang berbeda. Suhu dan pH sangat mempengaruhi aktivitas enzim, karena apabila suhu tinggi dan pH terlalu tinggi maupun rendah maka enzim akan terdenaturasi, akibatnya struktur tiga dimensi enzim menjadi berubah sehingga enzim tidak lagi mengikat substrat dengan baik untuk selanjutnya diolah menjadi produk.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1. Kesimpulan Dari hasil penelitian yang dilakukan mengenai isolasi dan uji aktifitas terhadap suhu dan pH maka dapat disimpulkan sebagai berikut : a. Hasil isolasi bakteri termofilik penghasil amilase dari sumber air panas Gurukinayan ditemukan 20 isolat amilolitik dengan bentuk morfologi koloni yang bervariasi. b. Tiga isolat yang memiliki diameter zona bening tertinggi dan berpotensi untuk menghasilkan enzim amilase kasar termofil yaitu GK4 sebesar 35,20 mm, GK13 sebesar 32,18 mm, dan GK14 30,15 mm. c. Aktivitas enzim dari ketiga isolat berbeda-beda pada suhu inkubasi dan pH yang berbeda. d. Enzim amilase kasar isolat GK13 menunjukkan aktifitas tertinggi pada suhu 60oC dan pH 6,0. 5.2. Saran-saran Perlunya penelitian lebih lanjut untuk mengetahui hubungan suhu dengan pH dalam meningkatkan aktifitas enzim amilase kasar.sehingga diketahui isolat yang berpotensi dalam bidang industri. Identifikasi lanjut isolat yang berhasil diisolasi untuk melihat heterogenitas bakteri termofilik penghasil enzim amilase dari Gurukinayan. Nurhalijah Sutiamiharja : Isolasi Bakteri Dan UJi Aktivitas Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Gurukinayan Karo Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008

DAFTAR PUSTAKA

Aiyer PV. 2004.Effect of C2N on alpha amylace production by Bacillus licheminormis SPT 27. African. J. Biotechnol. 3 : 519-522. Ajayi OA., and Fagade EO. 2007. Heat activation and stability of amylase from Bacillus species. African. J. Biotechnol. 6: 1181-1184. Akhmaloka, Tika IN., Pramono H., and Sindumarta., 2000. Isolation and characterization of DNA polymerase from a local thermofilik microorganisme. JMS 4:335-343. Al-Qodah Z, Daghstani H, Geopel and Lafi W. 2007. Determination of Kinetic Parameters of α-Amylase Producing Thermophile Bacillus Sphaericus. African Journal of Biotechnol, 6: 699-706. Bernfeld Press. 1995. Amylases α-and β-, Methods in Enzymology, New York : Academic Press. 149-158. Bora L. and Kalita MC. 2007. Occurance And Extracellular Enzymatic Activity Profick of Bacterial Isolates from Hostpring of West Kamcug Districh of Arunachal Pradesh. India. J. Microbiol. 4: 685-690. Brock TD.and Brock KM. 1978. Basic Microbiology With Apllication 2nd, edition 2. Prentice Hall. Inc. New Jersey. Brock., Michael TM., Jhon MM.,and Jack P. 1986. Biology of Microorganism. Science Hill Inc. New Jersey. Cappucino JG., and Sherman N. 1983. Microbiology a laboratory Manual, 4th ed., Menlo Park. Addisson Wesley Publishing Company. Inc. Menlo Park. Carvalho RV., Correat and da silva J. (2008) Properties of an amylase from thermophilic Bacillus Sp. Brazil, J. Microbiol. 39:102-107. Crueger W., and Anneliesse C. 1984. Biotechnology : A Text book of Industrial Microbiology. Editor of the English Edition by Thomas D.Brock. Science Tech Inc. Madison. New York.


Dirnawan H.A., Suwanto., dan Purwadaria T. 2000. Eksplorasi Bakteri Termofil Penghasil Enzim Hidrolitik-Ekstraseluler dan Sumber Air Panas Gunung Pancar. Hayati 7: 52-55. Eisanberg H., and Zaeeau M. 1997. Biochemical Structural and Molecular Genetic Aspect of Bacillus sp. Adv Chem. 43: 21-62. Everly C., and Alberto J. 2000. Stressor, Stress and survival : Overview. Front Bioscience. 5: 780-786. Fogarty WM.1983. Microbial Enzymes and Biotechnology. Applied Science. London. Fu Shaw, Lin FP., Che SC., and Chen HC.1995. Purification and Properties of an Extracellular α-Amylase from Thermus sp. Bot. Bull. Acad. Sin. 36: 195-200. Hadiotomo RS. 1985. Mikrobiologi dalam Praktek. Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. PT. Gramedia. Jakarta. Haki GD., and Rakehit SK. 2003. Development in Industrially Important Thermostable Enzymes. J. Biotechnol. 89 : 17-34. Handayani D., Mubarik NR., dan Listiyawati S. 2002. Isolasi dan Karakterisasi Amilase Ekstra Seluler dari Kapang Asal Limbah Cair Tapioka. Hartati KF., Susanto, Rakhmadiono S., dan Adi L. 2002. Faktor-faktor yang berpengaruh terhadap tahap deproteinasi menggunakan enzim protease dalam pembuatan kitin dari cangkang rajungan (Portunus pelagicus) Biosains 2(1) 68-77. Hartuti MS., 2006. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Termofilik Penghasil Enzim Amilase dari Kawasan Wisata Pemandian Air Panas Pawan Rokan Hulu. Skripsi UNRI. Hawab HN. 2004. Pengantar Biokimia. Igarashi YH., Hirochi H., Katsuhisha.S., and Mikto S. 1998. Enzymatic Properties of a Novel Liquefying. Amilase from an Alkaliphilic. Bacillus Isolate and Entire Nucleotide and Amino Acid Sequences Appl Environ Microbiology. 64: 32823289


Inchem. 2008. Alpha amylase from Bacillus subtilis. http://www.inchem.org/documents/Jecfa/Jecmono/v-28je05.htm.17 Mei 2008. Indrajaya, Madayanti F., dan Akhmaloka. 2003. Isolasi Identifikasi Mikroorganisme Termofil Isolat. Kawah Wayang. Journal Mikrobiol Indones, 8: 53-56. Jenni R. 2003. Program Enzim Selulase-Hemiselulase pada Proses Drinking Kertas Koran Bekas. Jurnal Matematika dan Sain. 8 : 67-71. Kombong H. 2004. Evaluasi Daya Hidrolitik Enzim Glukoamilase dari Filtrat Kultur Aspergillus niger. Jurnal Ilmu Dasar 5: 16-20. Kristjonson JK. 1999. Thermophilic Bacteria, IRC. Press New York. Lestari P. 2000. Eksplorasi Enzim Termostabil dari Mikro Termofil. Hayati 7: 21-25. Lay BW. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT. Raja Grafindo Persada. Jakarta. Mamo M. and Gessesse R. 1999. Effect of Cultivation Condition on Growth and Amylase Production by Thermophilic. Appl. Environ Microbiol. 46: 356-369. Melliawati R. dan Sukara E. 1991. Pengaruh Sumber Pati dan Nitrogen terhadap Produksi Enzim Amilolitik oleh Khamir Saccharomycopsis sp. TJ-1. Simposium Nasional Bioteknologi. Dies Natalis ke-37 UNAIR. Surabaya. Muchtadi S., Nurleni., dan Made. 1992. Enzim dalam Industri Pangan. Pertanian Bogor. Bandung.

Institut

Nickerson., WJ., and Brown RG. 1965. Advance in Applied Microbiol Academic Press. 7: 275. Poedjadi A. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Penerbit Universitas Indonesia. Poernomo AT., dan Djoko DA. 2003. Uji Aktivitas Crude Enzim Proteolitic. Bacillus subtilis. FNCC 0059 Hasil Fermentasi Curah Majalah Farmasi Erlangga. 3 : 103-107. Reddy NS., Nimmagadda. A, Rao KRS., and Sambasiva. 2003. An Overview of the Microbiology α-amylase Family. African J. Biotechnol. 2: 645-648. Richana M., Yusuf MG., Lestari P., dan Damardjati SD. 1999. Perilaku Kultivasi Isolat Bakteri Termofil Penghasil α Amilase. J. Mikrobiol Indones. 4: 35-39. Nurhalijah Sutiamiharja : Isolasi Bakteri Dan UJi Aktivitas Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Gurukinayan Karo Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008

Rosmimik., Richana N., Lestari P. dan Said J. 2001. Studi Penambahan Ion Kalsium Terhadap Aktivitas dan Stabilitas α Amilase Bacillus stearothermophilus T II12. Mikrobiol Indonesia. 6 : 12-14. Sadikin M. 2002. Biokimia Enzim. Widya Medika. Jakarta. Santos EO, and Martins ML. 2003. Effect Product of the Medium Composition on Formation of Amylase by Bacillus sp. Brazilian Arch Biol Technol. 46: 129134. Shahib MN. 1992. Pemahaman Seluk Beluk Biokimia dan Penerapan Enzim, Citra Aditya Bakti. Shih NJ. and Labbe RG. 1995. Purification and Characterization of an extracellular α amylase from Clostridium perfringens. Tipe A. App. Environ Microbiol 61: 1776-1779. Smith JE. 1995. Bioteknologi. Edisi 2. Terjemahan Andry Hartono. EGC. Jakarta. Sudjana. 2002. Metode Statistika. Penerbit Tarsito. Bandung. Syu MJ. and Chen YH. 1997. A Study on the α-Amylase Fermentation Performed by Bacillus amyloliquefaciens Chem. Eng. Journal. 65 ; 237-247. Vielle, C. and Zeikus, GJ. 2001, Hyperthermophilic Enzymes: Sources, Uses, and Molecular Mechanism, for Thermostability. Microbiol Mol Biol Rev. 65: 143. Volk WA. and Wheeler MF. 1988. Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga. Jakarta. 30-33. Winarno FG. 1986. Enzim Pangan. Gramedia. Jakarta. 57-59.


LAMPIRAN 1 : PENAPISAN BAKTERI DARI SAMPEL AIR PANAS

Sampel air panas dipipet 0,1 ml disebar pada media agar selaktif termofil diinkubasi pada suhu 65oC selama 48 jam Kultur campuran bakteri termofil isolat air panas tiap isolat berbeda diambil satu ose digores pada media agar selektif amilase (media agar + pati) diinkubasi 24 jam pada suhu 65oC Kultur murni bakteri termofil amilolitik isolat air panas ditetesi larutan iodine bila terdapat zona bening pada media berarti pati dipecah oleh enzim amilase bakteri (pati + iodine) berwarna biru kehitaman) Bakteri termofil penghasil enzim amilase isolat air panas


LAMPIRAN 2 : PENGUJIAN ADANYA PRODUKSI ENZIM AMILASE OLEH ISOLAT BAKTERI

Tiap isolat tunggal diambil satu ose masukkan dalam larutan fisiologis difortex disamakan keruhnya dengan larutan Mac Farland 108 Hasil pengenceran dipipet 0,5 μl masukkan dalam Luria Agar + pati 1 % Inkubasi 72 jam 65o C Isolat bakteri tumbuh ditetesi larutan iodium Menghasilkan zona zona bening Isolat menghasilkan enzim amilase Zona bening diukur dengan jangka sorong Seleksi 3 isolat terpilih


LAMPIRAN 3 : KARAKTERISASI ISOLAT BAKTERI PENGHASIL ENZIM AMILASE Isolate tunggal bakteri terpilih penghasil enzim amilase

Karakteristik makrokopis

Karakteristik mikrokopis sederhana

- warna koloni - uji bakteri gram +/- bentuk koloni dari permukaan - bentuk sel - bentuk koloni dilihat dari samping - penataan sel - tepi koloni dilihat dari atas

Karakteristik Fisiologi/biokimia

- uji katalase - uji sitrat - uji TSIA - uji SIM - uji gelatinase

Hasil


LAMPIRAN 4 : PEMBUATAN KULTUR UNTUK PRODUKSI ENZIM AMILASE

Isolat tunggal penghasil amilase

diambil satu ose dilarutkan dalam media produksi amilase yang sudah disterilisasi diinkubasi pada suhu 65oC selama 48 jam 150 rpm shaker waterbath Kultur bakteri dengan produksi enzim amilase


LAMPIRAN 5 : PENGUKURAN AKTIFITAS ENZIM AMILASE KASAR DARI ISOLAT TERPILIH

Media kultur produksi enzim amilase

disentrifugal selama 20 menit kecepatan 6000 rpm supernatan diambil memakai mikro pipet

uji pengaruh temperatur terhadap aktifitas enzim amilase kasar


LAMPIRAN 6 : PENGUKURAN AKTIVITAS ENZIM AMILASE KASAR PADA SUHU YANG BERVARIASI

Ekstrak enzim amilase kasar dari supernatan diambil 1 ml masukkan ke test tube tambahkan 1 % larutan pati dalam larutan sitrat buffer fosfat pada pH 6,5 (dibuat 4 test tube diinkubasi pada water bath suhu 40oC, 50oC, 60oC, 65oC, 70oC dan 80oC selama 20 menit setelah 20 menit reaksi dihentikan dengan menambah 2 ml reagen DNS ke dalam tiap test tube dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit didinginkan ditambah 20 ml air destilase determinasi intensitas warnanya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm dibandingkan dengan larutan standar glukosa Data hasil pengujian


LAMPIRAN 7 : PENGUKURAN AKTIVITAS ENZIM AMILASE KASAR PADA pH YANG BERVARIASI Ekstrak enzim amilase kasar dari supernatan diambil 2 ml dipanaskan hingga mendidih selama 20 menit ditambah larutan pati 1 % dalam sitrat buffer fosfat sampai pH 6,5 Ukur pH 4, 5, 6, 7, 8 dan 9 diinkubasi 20 menit pada suhu 65oC setelah 20 menit reaksi dihentikan dengan menambah 2 ml reagen DNS ke dalam tiap test tube dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit didinginkan ditambah 20 ml air destilasi determinasi intensitas warnanya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm dibandingkan dengan larutan standar glukosa Data hasil pengujian


LAMPIRAN 8 : PEMBUATAN LARUTAN KONTROL PENGUJI AKTIVITAS ENZIM AMILASE KASAR

Ekstrak enzim amilase kasar dari supernatan diambil 2 ml dipanaskan hingga mendidih selama 20 menit ditambah larutan pati 1 % dalam sitrat buffer fosfat sampai pH 6,5 diinkubasi 20 menit pada variasi suhu 40oC 50, 60,65, 70 dan 80oC setelah 20 menit reaksi dihentikan dengan menambah 2 ml reagen DNS ke dalam tiap test tube dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit didinginkan ditambah 20 ml air destilasi determinasi intensitas warnanya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm

Data hasil pengujian


LAMPIRAN 9: ALUR KERJA PEMBUATAN KURVA STANDAR GLUKOSA

Larutan Standar Glukosa dibuat pengenceran 80 – 280 μg/mol dipipet 1 ml kedalam tabung reaksi 1 ml larutan standar glukosa dalam tabung reaksi ditambahkan 1,5 ml Reagen DNS dipanaskan selama 5 menit didinginkan dengan air mengalir selama 15 menit ditambahkan 20 ml aquadest steril divorteks diukur absorbansi warna dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm Absorbansi Dibuat kurva standar dan persamaan regresinya Kurva standar


Lampiran 10.

Daftar Sidik Ragam dan Uji Duncan Isolat bakteri Amilase GuruKinayan

Daftar Sidik Ragam Konsentrasi Amilase GK4 SK Db JK KT Suhu 5 143542,17 28708,43 Galat Percobaan 12 1304,05 108,67 Total 17 144846,22 Kk = 2,57%. Uji Jarak Duncan GK4 Suhu P 2 329,05 LSR P (0,05) 18,29

3 373,42 19,44

4 421,44 20,05

Daftar Sidik Ragam Konsentrasi Amilase GK13 SK Db JK KT Suhu 5 142502,13 28500,43 Galat Percobaan 12 1093.79 91,15 Total 17 144846,22 Kk = 1,88%. Uji Jarak Duncan GK13 Suhu P 2 3 444,53 461,22 LSR P (0,05) 16,75 17,80

4 546,75 18,35

Daftar Sidik Ragam Konsentrasi Amilase GK14 SK Db JK KT Suhu 5 205147,43 41029,49 Galat Percobaan 12 8688,96 724,08 Total 17 213836,39 Kk = 7,23%. Uji Jarak Duncan GK14 Suhu P 2 3 280,12 309,39 LSR P (0,05) 47,27 50,23

4 348,03 51,78

Fhitung 264,18

F.tabel 0,05 3,45

5 464,89 20,23

6 558,87 20,47

Fhitung 312,68

F.tabel 0,05 3,48

5 585,71 18,52

6 633,65 18,73

Fhitung 56,66

F.tabel 0,05 3,48

5 461,23 52,24

6 564,59 52,87


Lampiran 11.

Daftar Sidik Ragam dan Uji Duncan Isolat bakteri Amilase GuruKinayan

Daftar Sidik Ragam Konsentrasi pH GK4 SK Db JK pH 5 171672,30 Galat Percobaan 12 2117,12 Total 17 173789,42 Kk = 3,26%. Uji Jarak Duncan GK4 pH P 2 329.05 LSR P (0,05) 23,32

3 344,60 24,77

KT 34334,46 176,43

Fhitung 194,61

F.tabel 0,05 3,45

4 461,91 25,54

5 477,92 25,77

6 555,9 26,08

Fhitung 482,25

F.tabel 0,05 348

5 584,71 24,16

6 639,59 24,45

Fhitung 37,83

F.tabel 0,05 3,48

5 488,67 53,73

6 520,60 54,37

Daftar Sidik Ragam Konsentrasi Amilase GK13 SK Db JK KT pH 5 376202,05 75240,41 Galat Percobaan 12 1872,24 156,02 Total 17 378074,29 Kk = 2,90%. Uji Jarak Duncan GK13 pH P 2 297,426 LSR P (0,05) 21,86

3 349,86 23,22

4 461,45 23,94

Daftar Sidik Ragam Konsentrasi Amilase GK14 SK Db JK KT pH 5 145098,15 29019,63 Galat Percobaan 12 9206,0 767,17 Total 17 154304,15 Kk = 6,93%. Uji Jarak Duncan GK14 pH P 2 340,72 LSR P (0,05) 48,61

3 346,89 51,65

4 437,22 53,25


Lampiran 12 : Kurva Standar Glukosa


Lampiran 13 : Photo Mikroskop Pewarnaan Bakteri

Gambar : Isolat GK 4 (10 x 40)





ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS AMILASE KASAR TERMOFILIK DARI SUMBER AIR PANAS GURUKINAYAN KARO SUMATERA UTARA

Recommend Documents