ISOLASI DAN KLONING GEN PENYANDI FITASE DARI Bacillus subtilis AQ1 DENGAN TEKNOLOGI GATEWAY
RACHMAWATI NUR FITRIANA
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Isolasi dan Kloning Gen Penyandi Fitase dari Bacillus subtilis AQ1 dengan Teknologi Gateway adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Skripsi ini disusun berdasarkan hasil penelitian di Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT) Serpong tahun 2014. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Januari 2015 Rachmawati Nur Fitriana NIM G84100041
ABSTRAK RACHMAWATI NUR FITRIANA. Isolasi dan Kloning Gen Penyandi Fitase dari Bacillus subtilis AQ1 dengan Teknologi Gateway. Dibimbing oleh EDY DJAUHARI PURWAKUSUMAH dan SISWA SETYAHADI. Fitase merupakan enzim yang dapat mengkatalisis reaksi pemecahan asam fitat untuk membebaskan fosfor dan nutrien yang terdapat dalam kompleks fitat sehingga dapat mengurangi efek antinutrisi dari asam fitat. Enzim ini sangat penting sebagai bahan tambahan pakan ternak monogastrik. Teknik rekayasa genetika diperlukan untuk menghasilkan DNA rekombinan penyandi gen fitase yang lebih stabil dengan produktivitas yang tinggi. Gen phy diisolasi dari bakteri Bacillus subtilis AQ1 yang telah terbukti menghasilkan fitase. Penelitian ini bertujuan menyisipkan gen penyandi fitase pada vektor donor dan vektor ekspresi dengan teknik kloning Gateway. Gen phy hasil kloning ditransformasikan ke dalam E.coli BL21-Star. Ekspresi fitase rekombinan dalam E.coli BL21-Star dapat terlihat dari hasil uji aktivitas fitase pada jam ke-6, ke-12, dan ke-24 yang masing-masing memiliki aktivitas sebesar 1.989 U/mL, 2.988 U/mL, dan 3.331 U/mL. Hasil aktivitas ini menunjukkan bahwa gen fitase yang dikloning dengan metode Gateway dapat terekspresi dalam E.coli BL21-Star. Kata kunci: Fitase, asam fitat, Bacillus subtilis AQ1, kloning Gateway
ABSTRACT RACHMAWATI NUR FITRIANA. Isolation and Cloning of Phytase Gene from Bacillus subtilis AQ1 by Gateway Technology. Supervised by EDY DJAUHARI PURWAKUSUMAH and SISWA SETYAHADI. Phytase was an enzyme that could catalyze the breakdown of phytic acid to release phosphorus and nutrients contained in the phytate complex, so it could reduce the antinutritional effect of phytate. This enzyme was very important as an feed additive in monogastric animals. The genetic engineering technique is required to produce a recombinant DNA gene encoding phytase which more stable with high productivity. Phy gene was isolated from Bacillus subtilis AQ1 that had been proven to produce phytase. The objectives of this research was to insert the phytase encoding gene inside donor and expression vectors with Gateway cloning technique. Phy gene then tansformed into E.coli BL21-Star. The expression of phytase recombinant in E.coli BL21-Star could be seen from the result of phytase activity after 6, 12, and 24 hours that each had activity of 1.989 U/mL, 2.988 U/mL, and 3.331 U/mL. The result of this activity indicated that the phytase gene cloned by using Gateway method could be expressed in E.coli BL21-Star. Keywords: Phytase, phytic acid, Bacillus subtilis AQ1, Gateway cloning
ISOLASI DAN KLONING GEN PENYANDI FITASE DARI Bacillus subtilis AQ1 DENGAN TEKNOLOGI GATEWAY
RACHMAWATI NUR FITRIANA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
Judul Skripsi : Isolasi dan Kloning Gen Penyandi Fitase dari Bacillus subtilis AQ1 dengan Teknologi Gateway Nama : Rachmawati Nur Fitriana NIM : G84100041
Disetujui oleh
Drs Edy Djauhari PK, MS Pembimbing I
Dr Ir Siswa Setyahadi, MSc Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika MAppSc Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat, hidayah, dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan karya ilmiah ini. Tak lupa shalawat serta salam semoga tetap tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW. Penelitian yang berjudul Isolasi dan Kloning Gen Penyandi Fitase dari Bacillus subtilis AQ1 dengan Teknologi Gateway ini dilaksanakan sejak bulan Maret sampai dengan Oktober 2014 di Laboratorium Teknologi Bioindustri, Laboratorium Pengembangan Teknologi Agroindustri dan Biomedika (LAPTIAB), Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT), Serpong. Ucapan terima kasih terutama penulis sampaikan kepada Drs Edy Djauhari PK, MS dan Dr Ir Siswa Setyahadi, MSc atas bimbingan, arahan, kritik, saran, dan motivasi yang telah diberikan selama penelitian, serta Kak Ruby Setiawan yang telah banyak memberikan saran dan bantuan selama penelitian. Secara khusus juga penulis ucapkan terima kasih kepada kedua orang tua penulis Alm. Bapak Sugiyo dan Ibu Siti Asiyah atas doa dan dorongan semangat untuk kesuksesan, kelancaran dan kemudahan jalan hidup bagi penulis. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada kakak dan kedua adik penulis serta kepada keluarga besar Pinus merkusii dan teman-teman Biokimia 47 yang selalu memberikan semangat dan motivasi sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini. Penulis berharap karya ilmiah ini bermanfaat bagi perkembangan dan kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi. Bogor, Januari 2015 Rachmawati Nur Fitriana
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL
x
DAFTAR GAMBAR
x
DAFTAR LAMPIRAN
x
PENDAHULUAN
1
METODE PENELITIAN
2
Bahan
2
Alat
2
Metode
3
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Pembahasan SIMPULAN DAN SARAN
7 7 10 15
Simpulan
15
Saran
15
DAFTAR PUSTAKA
15
LAMPIRAN
18
RIWAYAT HIDUP
23
DAFTAR TABEL 1 Urutan primer gen phy 2 Hasil pengukuran aktivitas fitase
7 10
DAFTAR GAMBAR 1 Elektroforegram DNA genom Bacillus subtilis AQ1 2 Elektroforegram produk PCR attB-phyaq1 3 Produk entry clone pENTR-phyaq1 (A) Hasil transformasi pENTR phyaq1, (B) Hasil konfirmasi pENTR-phyaq1 pada media yang mengandung kloramfenikol 4 Elektroforegram hasil ekstraksi plasmid pENTR-phyaq1 5 Hasil transformasi pEXP-phyaq1 6 Elektroforegram hasil ekstraksi plasmid pEXP-phyaq1
7 8 8 9 9 10
DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4 5 6 7
Diagram alir penelitian Kurva standar fosfat Pengukuran aktivitas fitase Peta marka seleksi vektor donor (pDONR221) Peta marka seleksi vektor ekspresi (pDEST14) Prediksi reaksi rekombinasi BP Prediksi reaksi rekombinasi LR
18 19 19 20 20 21 22
PENDAHULUAN Fitase merupakan enzim yang mampu mengkatalisis hidrolisis asam fitat menjadi mio-inositol mono-, di-, tri-, tetra-, dan pentafosfat, serta fosfat organik (Baruah et al. 2004). Asam fitat (mio-inositol heksakisfosfat) merupakan bentuk penyimpanan fosfor pada tanaman dan merupakan salah satu faktor tumbuh bagi tanaman. Asam fitat mampu membentuk kompleks dengan mineral-mineral bervalensi 2 atau 3, protein, karbohidrat, dan lipid, sehingga dapat mengurangi penyerapan dari mineral dan makromolekul tersebut. Oleh karena itu, asam fitat dianggap sebagai zat antinutrisi pada bahan pangan (Correa et al. 2014). Selain membebaskan fosfor, fitase juga akan membebaskan nutrien lain yang mungkin terikat dalam kompleks fitat (Ravindran 2000), sehingga dapat mengurangi efek antinutrisi dari asam fitat. Fitase merupakan enzim yang penting sebagai bahan pakan aditif pada hewan monogastrik dan agastrik seperti unggas, babi, dan ikan. Selain meningkatkan pemanfaatan fosfor, penambahan fitase pada pakan hewan monogastrik dan agastrik juga dapat mengurangi penambahan unsur fosfat anorganik ke dalam pakan. Hal ini tidak hanya akan mengurangi biaya pembuatan pakan, namun juga akan mengurangi dampak negatif dari penambahan fosfat anorganik yang dapat menyebabkan eutrofikasi akibat konsentrasi fosfat berlebih yang diekskresikan ternak ke lingkungan (Siregar 2010; Khemakhem et al. 2012). Eutrofikasi adalah pencemaran air yang diakibatkan adanya nutrien yang berlebihan di dalam ekosistem air yang biasanya ditandai dengan fenomena alga bloom. Fitase terdistribusi secara luas dalam jaringan tanaman dan hewan, serta ditemukan pula dalam mikroorganisme seperti fungi, ragi, dan bakteri. Berbagai jenis fungi, ragi, dan bakteri telah dikarakterisasi untuk produksi fitase. Fitase dapat diklasifikasikan menjadi empat macam berdasarkan struktur dan mekanisme katalitiknya, yaitu histidine acid phosphatases (HAPs), cysteine phytases, purple acid phosphatases (PAPs), dan β-propeller phytases (BPPs) yang dikenal juga sebagai alkalin fitase. Sebagian besar fitase yang digunakan dalam suplementasi pakan komersial adalah HAPs yang merupakan turunan utama dari Aspergillus niger, Peniophora lycii, dan Escherichia coli. Ketiganya memiliki aktivitas katalitik yang tinggi pada pH 2.5-6, namun kelompok tersebut memiliki termostabilitas yang rendah dan spesifisitas substrat yang rendah. Di sisi lain, fitase jenis BPPs dikarakterisasi terutama dari genus Bacillus yang saat ini dianggap sebagai alternatif terbaik karena karakteristiknya, antara lain memiliki termostabilitas yang tinggi, spesifisitas substrat yang tinggi, optimum pada pH netral, dan memiliki ketahanan terhadap proteolisis (Khemakhem et al. 2012). Bakteri Bacillus subtilis AQ1 merupakan bakteri isolat lokal koleksi BPPT yang berasal dari endapan di dasar akuarium. Bakteri ini sebelumnya telah diteliti dan dikarakterisasi mengenai aktivitas fitasenya oleh Satriaji (2010) dan Hasriani (2011). Hasil keduanya menunjukkan aktivitas fitase yang masih rendah. Produksi enzim dengan cara fermentasi dari bakteri asli memiliki banyak kelemahan, antara lain sulit diperoleh enzim yang bersifat stabil, aktivitasnya tinggi, dan dihasilkan dalam jumlah banyak. Solusi yang dapat dilakukan untuk mengatasi permasalahan tersebut adalah perlu dilakukannya perekayasaan secara genetik terhadap bakteri tersebut untuk mendapatkan DNA rekombinan sehingga dapat dihasilkan strain
2 bakteri yang dapat menyandikan gen penghasil enzim yang diinginkan dengan produktivitas yang tinggi. Penelitian ini bertujuan melakukan isolasi dan menyisipkan gen penyandi fitase pada vektor donor dan vektor ekspresi dengan teknik kloning Gateway. Hipotesis pada penelitian ini adalah gen penyandi fitase yang terdapat pada bakteri B. subtilis AQ1 dapat diisolasi dan disisipkan dalam vektor donor dan vektor ekspresi sehingga dapat diperbanyak dengan teknik kloning Gateway. Kloning Gateway memberikan cara yang cepat dengan efisiensi tinggi untuk memindahkan sekuen DNA ke dalam berbagai sistem vektor untuk analisis dan ekspresi protein (Hartley et al. 2000). Cara ini diharapkan mampu menghasilkan konstruk gen penyandi fitase dengan produktivitas yang tinggi.
METODE PENELITIAN Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat Bacillus subtilis AQ1, pepton, NaCl, ekstrak khamir, agar, akuades, NaOH 1M, alkohol 70 %, bufer TE pH 8, larutan lisozim, larutan Tris-HCl pH 8, larutan STEP (0.5 % SDS + 50 mM Tris-HCl pH 7.5 + 0.4 M EDTA + Proteinase K), tris bufer fenol, sodium asetat, etanol (100 %, 70 %), ddH2O steril, bubuk agarosa, bufer TAE 1X, loading buffer, parafilm, etidium bromide (EtBr), 10X bufer DNA polimerase, 2 mM dNTPs, primer phyaq1F dan phyaq1R, primer adapter attB1 dan attB2, DNA polimerase, marker 1 kb plus DNA ladder, vektor donor pDONR221, BP Clonase, vektor ekspesi pDEST14, LR Clonase, kontrol positif pEXP7-tet, kontrol positif pENTR-gus, proteinase K, sel kompeten E. coli DH5α, sel kompeten E.coli BL21-Star, media SOC (Super Optimal broth with Catabolite repression), kanamisin, ampisilin, kloramfenikol, GeneJET Plasmid Extraction Kit, amonium heptamolibdat, amonium monovanadat, asam nitrat pekat, amonium hidroksida, bufer asetat, bufer fosfat, natrium fitat, mercaptoethanol, IPTG, dan KH2PO4. Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pH meter, neraca analitik (RAD WAG WAS 220/C/2), autoklaf (Iwaki), laminar air flow (ESCO Class II BSC), shaker incubator (Kuhner), cold sentrifuse (Hitachi CR-21G), micro sentrifuse (Eppendorf Mini Spin), pipet mikro, tips, stopwatch, thermomixer (Eppendorf), vortex, konsentrator (Eppendorf Consentrator 5301), microwave (Sharp), perangkat elektroforesis (BioMetra), gel documentation, thermal cycler PCR (Bio-Rad T100 Thermal Cycler), nanodrop (BioDrop), lemari asam, hot plate, sonikator dan peralatan gelas.
3 Metode Perancangan Primer Kloning penyandi gen fitase dilakukan dengan amplifikasi PCR menggunakan dua pasang primer. Primer pertama didesain secara manual menggunakan tiga nukleotida penyandi gen fitase dari B. subtilis subsp. subtilis strain 168 (AL009126.3), B. subtilis phyC (AJ584664.1), dan B. subtilis strain E20 (FJ541287.1). Koleksi sekuen terpilih disejajarkan, dilihat konsensusnya pada situs http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de. Sebanyak 24 basa dari kodon awal (start codon) diambil sebagai primer forward dan 20 basa sampai kodon akhir (stop codon) diambil sebagai primer reverse yang sebelumnya dilakukan reverse complement ke situs http://basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html. Kualitas hasil rancangan diuji dengan program oligoanalyzer pada situs http://sg.idtdna.com. Kedua rancangan primer ditambahkan sebagian adaptor pada masing-masing ujung 5’. Peremajaan Bakteri Stok bakteri B. subtilis AQ1 diambil sebanyak 0.5 mL, ditumbuhkan dalam 10 mL media LB (Luria Bertani) cair dan diinkubasi semalam pada suhu 37 oC dan agitasi 150 rpm. Satu ose bakteri yang sudah ditumbuhkan sebelumnya, digores ke dalam media LB agar untuk mendapatkan koloni tunggal. Sebanyak satu koloni bakteri yang sudah ditumbuhkan sebelumnya, dimasukkan ke dalam 50 mL media LB cair, diinkubasi semalam pada suhu 37 oC dan agitasi 150 rpm untuk diisolasi genomnya. Isolasi DNA Genom Bakteri (Sambrook & Russel 2001) Isolasi DNA genom bakteri dilakukan dengan metode modifikasi dari metode Sambrook & Russel (2001). Sebanyak 50 mL kultur bakteri yang telah ditumbuhkan selama semalam dalam media LB cair dipindahkan ke tabung falcon 50 mL dan disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit. Setelah itu supernatan dibuang, lalu pelet diresuspensi dengan 2.5 mL TE kemudian dibekukan pada suhu -80 ºC. Sebanyak 0.25 mL larutan lisozim segar 10 mg/mL yang dibuat dalam 0.25 M Tris-HCl pH 8.0 ditambahkan pada sel yang beku dan dicairkan pada suhu ruang dengan diaduk. Setelah mencair, kemudian diinkubasi dalam es selama 45 menit. Sebanyak 0.5 mL larutan STEP (0.5 % SDS + 50 mM Tris HCl pH 7.5 + 0.4 M EDTA + Proteinase K) ditambahkan ke dalam sampel dan dihomogenkan, kemudian dipanaskan pada suhu 50 ºC selama 1 jam dengan sesekali dikocok perlahan. Sampel ditambahkan 3 mL bufer Tris fenol, dicampur perlahan selama 5 menit tanpa divortex. Sampel disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit sehingga membentuk tiga lapisan. Lapisan yang paling atas dipindahkan ke dalam tabung baru yang steril, kemudian ditambahkan 3 M Na-asetat sebanyak 0.1 dari volume, dan dicampur perlahan tanpa divortex. Larutan kemudian ditambahkan etanol 2 kali dari volume dan dibolak balik, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 20 menit. Supernatan dibuang, pelet dicuci dengan etanol 70 %, dikocok perlahan, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang, DNA dikeringkan menggunakan konsentrator selama 15 menit, kemudian diresuspensi dengan ddH2O steril. DNA disimpan pada suhu -20 ºC.
4 Elektroforesis Gel Agarose (Sambrook & Russel 2001) Pembuatan Gel Agarose 1 %. Sebanyak 0.25 gram agarose ditambah dengan 25 mL TAE 1X, lalu dipanaskan hingga larut. Setelah larut dengan sempurna, larutan tersebut dibiarkan sampai hangat, kemudian dituang ke dalam cetakan yang telah dilengkapi dengan sisir. Campuran tersebut didiamkan sampai gel tersebut benar-benar mengeras. Gel yang telah mengeras kemudian dimasukkan dalam alat elektroforesis dan direndam dengan bufer TAE 1X. Elektroforesis Gel Agarose. Sebanyak 1 μL sampel DNA dicampurkan dengan 1 μL loading dye di atas parafilm dengan menggunakan mikropipet kemudian dimasukkan ke dalam sumur elektroforesis. Setelah elektroforesis selesai, gel dicuci dengan ddH2O kemudian direndam dengan EtBr selama 10 menit, gel dicuci lagi dengan ddH2O, kemudian dilihat pita DNAnya dengan bantuan sinar ultraviolet (UV). Profil DNA yang terlihat kemudian disimpan dalam perangkat dokumentasi gel (gel-documentation). Perangkat dokumentasi gel adalah alat yang terdiri atas kotak berbahan metal tempat penyinaran sinar UV yang dihubungkan dengan kamera digital. Kamera digital tersebut terpasang pada komputer atau laptop yang sudah terdapat software yang dapat menyimpan fotografi dari hasil elektroforeis. Amplifikasi Gen Penyandi Fitase (Savitri et al. 2013) Amplifikasi gen penyandi fitase dilakukan dengan PCR menggunakan dua set primer. Primer pertama adalah pasangan primer phyaq1F dan phyaq1R dan primer kedua adalah pasangan primer adapter attB1 dan attB2. Komposisi reaksi PCR pertama adalah 1 μL 10x bufer KOD polimerase, 0.64 μL MgSO4 25 mM, 1 μL dNTP 2 mM, 1 μL campuran primer phyaq1F dan phyaq1R 2 mM, 1 μL genom B. subtilis AQ1, 5.16 μL ddH2O, 0.2 μL KOD polimerase. Program PCR diatur dengan kondisi denaturasi awal 94 ºC selama 2 menit, denaturasi 94 ºC selama 15 detik, annealing 65 ºC selama 30 detik dan extension 68 ºC selama 1 menit 40 detik sebanyak 3 siklus, kemudian 3 siklus berikutnya dengan kondisi 94 ºC selama 15 detik dan 68 ºC selama 1 menit 40 detik. Komposisi reaksi PCR kedua adalah 1 μL 10x bufer KOD polimerase, 0.56 μL MgSO4 25 mM, 1 μL dNTP 2 mM, 1 μL campuran primer attB1 dan attB2 4 mM, 1 μL hasil PCR pertama, 4.24 μL ddH2O, 0.2 KOD polimerase. Program PCR diatur dengan kondisi denaturasi awal 94 ºC selama 2 menit, denaturasi 94 ºC selama 15 detik, annealing 58 ºC selama 30 detik dan extension 68 ºC selama 1 menit 40 detik sebanyak 5 siklus, kemudian 25 siklus berikutnya dengan kondisi 94 ºC selama 15 detik dan 68 ºC selama 1 menit 40 detik. Hasil PCR kemudian dielektroforesis menggunakan gel agarose 1 %. Produk yang didapat diberi kode attB-phyaq1. Pengklonan Fragmen DNA pada Vektor Donor pDONR221 (Reaksi BP) (Invitrogen 2003) Reaksi rekombinasi BP dilakukan dengan membuat campuran reaksi yang terdiri atas 1 μL attB-phyaq1, 0.5 μL vektor donor pDONR221, 3 μL bufer TE, dan 1 μL campuran BP Clonase. Setelah itu campuran divortex dan diinkubasi pada suhu 25 ºC selama 1 jam. Sebanyak 0.5 μL larutan proteinase K dimasukkan ke dalam campuran kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 10 menit. Hasil rekombinasi diberi kode pENTR-phyaq1 dan kemudian ditransformasikan ke
5 dalam sel kompeten E.coli DH5α. Beberapa koloni hasil transformasi yang telah tumbuh diduplikasi dan ditumbuhkan ke dalam media LB agar yang telah mengandung 15 μg/mL kloramfenikol. Hal ini dilakukan untuk mengkonfirmasi keberadaan gen yang disisipkan (insert) di dalam plasmid. Transformasi ke E.coli DH5α (Sambrook & Russel 2001) Transformasi diawali dengan penambahan hasil reaksi BP (pENTR-phyaq1) sebanyak 1 μL ke dalam tabung yang berisi 50 μL sel kompeten E. coli DH5α, kemudian dihomogenkan dan diinkubasi di es selama 30 menit. Selanjutnya dilakukan perlakuan kejut panas (heat shock) pada suhu 42 ºC selama 1 menit, dan diinkubasi kembali di dalam es selama 2 menit. Sebanyak 250 μL media SOC ditambahkan ke dalam tabung kemudian diinkubasi dalam shaker incubator pada suhu 37 ºC selama 1 jam dengan agitasi 150 rpm. Sebanyak 100 μL dari biakan hasil inkubasi disebarkan pada media LB agar yang mengandung 50 μg/mL kanamisin dan diinkubasi semalam pada suhu 37 ºC. Kemudian dipilih satu koloni tunggal hasil transformasi dan ditumbuhkan pada media LB cair yang mengandung 50 μg/mL kanamisin selama semalam untuk diekstrak plasmidnya. Ekstraksi Plasmid Rekombinan (Kit Thermo Scientific) Ekstraksi plasmid dilakukan dengan menggunakan GeneJET Plasmid Extraction Kit. Koloni transforman yang diduga positif mengandung gen penyandi fitase ditumbuhkan dalam 5 mL media cair LB-kanamisin. Sebanyak 5 mL kultur E. coli tersebut disentrifugasi pada 6000 rpm selama 5 menit pada suhu kamar. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensi dengan 250 μL resuspension solution yang sudah ditambah dengan RNAse A dan dimasukkan ke dalam tabung mikro. Sebanyak 250 μL lysis solution ditambahkan ke dalam campuran dan tabung dibolak-balikkan sebanyak 4 - 6 kali diikuti dengan penambahan 350 μL neutralization solution dan tabung dibolak-balikkan sebanyak 4 - 6 kali. Setelah itu campuran disentrifugasi pada kecepatan 14000 rpm selama 5 menit, kemudian supernatan dipindahkan ke dalam kolom GeneJET dan disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 14000 rpm lalu supernatannya dibuang. Sebanyak 500 μL wash solution ditambahkan ke dalam kolom dan disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 14000 rpm lalu supernatan dibuang. Kolom dicuci kembali dengan 500 μL wash solution, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 14000 rpm selama 1 menit dan supernatan dibuang diikuti dengan sentrifugasi lebih lanjut selama 1 menit untuk memisahkan sisa wash solution. Setelah itu kolom GeneJET dipindahkan ke dalam tabung mikro baru dan ditambahkan 50 μL elution buffer kemudian diinkubasi selama 2 menit pada suhu kamar dan diikuti dengan sentrifugasi selama 2 menit pada kecepatan 14000 rpm. Supernatan yang didapat merupakan plasmid yang dimurnikan. Pengklonan Fragmen DNA pada Vektor Ekspresi pDEST14 (Reaksi LR) (Invitrogen 2003) Reaksi rekombinasi LR dilakukan dengan membuat campuran reaksi yang terdiri atas 1 μL entry clone pENTR-phyaq1, 0.5 μL vektor ekspresi pDEST14, 3 μL bufer TE, dan 1 μL campuran LR Clonase. Setelah itu campuran divortex dan diinkubasi pada suhu 25 ºC selama 1 jam. Sebanyak 0.5 μL larutan proteinase K dimasukkan ke dalam campuran kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 10
6 menit. Hasil rekombinasi kemudian ditransformasikan ke dalam sel kompeten E. coli DH5α. Satu koloni yang yang tumbuh kemudian diambil dan ditumbuhkan ke dalam media LB cair yang mengandung 100 μg/mL ampisilin selama semalam untuk diekstrak plasmidnya. Ekstraksi plasmid dilakukan menggunakan GeneJET Plasmid Extraction Kit. Plasmid murni yang telah diekstrak diberi kode pEXPphyaq1. Plasmid ini kemudian ditansformasikan ke dalam sel kompeten E.coli BL21-Star dengan metode kejut panas (heat shock). Koloni yang tumbuh akan dijadikan isolat untuk produksi enzim fitase rekombinan. Produksi dan Pemanenan Enzim (Setiawan 2014) Satu koloni E. coli BL21-Star rekombinan diinokulasikan ke dalam 5 mL media LB cair yang mengandung 100 μg/mL ampisilin, kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC hingga nilai OD600 mencapai 0.8. Sebanyak 2.5 mL kultur dimasukkan ke dalam 25 mL media produksi yang mengandung 100 μg/mL ampisilin dan 1 mM IPTG. Media kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC dengan agitasi 150 rpm dan diambil sampel pada jam ke-6, ke-12, dan ke-24. Kultur yang sudah diambil kemudian disentrifugasi dalam keadaan dingin pada kecepatan 6000 rpm selama 15 menit. Supernatan dipisahkan dari pelet secara steril, dan peletnya dipakai untuk uji aktivitas fitase. Pelet yang sudah didapat, ditambahkan campuran bufer natrium fosfat 20 mM pH 7 dan 2-mercaptoethanol 1 mM sebanyak 1/10 dari volume kultur. Pelet yang telah diresuspen dengan bufer kemudian disonikasi selama 5 menit dalam keadaan dingin. Sonikasi ini bertujuan memecah dinding sel dan mengeluarkan protein rekombinan yang terdapat di dalam sel. Pelet hasil sonikasi kemudian disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 ºC. Supernatan yang didapatkan kemudian diukur aktivitas fitasenya. Uji Aktivitas Fitase (Sajidan 2002) Pengujian aktivitas fitase dilakukan berdasarkan metode Sajidan (2002) yang telah dimodifikasi. Sebanyak 50 μL enzim rekombinan ditambahkan 150 μL larutan substrat natrium fitat, kemudian diinkubasi dalam thermomixer pada suhu 37 ºC selama 30 menit. Setelah itu ditambahkan larutan STOP untuk menghentikan reaksinya. Larutan STOP terdiri atas campuran amonium heptamolibdat, amonium monovanadat, HNO3 70 %, dan H2O dengan perbandingan 1.5:1.5:1:2. Campuran kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 ºC. Larutan kemudian diencerkan 10 kali dan diukur serapannya pada panjang gelombang (λ) 415 nm. Satu unit fitase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk melepaskan 1 μmol fosfat dari asam fitat per menit. Aktivitas enzim dinyatakan dalam U/mL, yang merupakan μmol fosfat yang dilepaskan per menit per mL enzim (Widowati et al. 2001).
7
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Primer Spesifik Gen Phy Primer spesifik gen phy didesain secara manual untuk mengisolasi gen fitase dari DNA genom hasil isolasi dari B. subtilis AQ1. Primer forward terdiri atas 24 basa dengan Tm 70.3 ºC dan primer reverse terdiri atas 20 basa dengan Tm 71.5 ºC. Masing-masing ujung 5’ dari primer tersebut ditambahkan adaptor (diberi garis bawah). Primer yang berhasil didesain ditampilkan dalam Tabel 1. Tabel 1 Urutan primer gen phy Phyaq1-F Phyaq1-R
Sekuen Tm 5’-AAA AAG CAG GCT CGA TGA AKS WTY CAA 70.3 ºC AAA CAM TKY TG-3’ 5’-AGA AAG CTG GGT ATC AGY TTY CTC GGR 71.5 ºC TYW ACC-3’
Simbol K, S, W, Y, M, R dalam primer tersebut adalah simbol untuk primer degenerate. DNA Genom Bacillus subtilis AQ1 Hasil Isolasi Hasil elektroforesis gel agarose 1 % menunjukkan fragmen DNA hasil isolasi dari B. subtilis AQ1 berada di bagian atas dan berukuran lebih dari 10000 pb (Gambar 1). Fragmen DNA yang dihasilkan menunjukkan bahwa DNA yang diisolasi merupakan DNA genom yang berukuran besar dan tidak terfragmentasi.
M 1 10000 pb
>10000 pb DNA genom
Gambar 1 Elektroforegram DNA genom B. subtilis AQ1. (M) marker 1 kb DNA ladder, (1) DNA genom Gen Penyandi Fitase Hasil Amplifikasi Gen penyandi fitase diisolasi dan diamplifikasi dari DNA genom B. subtilis AQ1. Amplifikasi dilakukan dengan primer phyaq1 yang telah didesain sebelumnya dan primer adapter attB. Berdasarkan hasil elektroforesis gel agarose
8 1 %, pita DNA yang diduga merupakan produk PCR attB-phyaq1 yang berhasil teramplifikasi memiliki ukuran sekitar 1200 pb (Gambar 2).
M
1
1500 pb 1000 pb
±1200 pb Amplikon gen phy
Gambar 2 Elektroforegram produk PCR attB-phyaq1. (M) marker 1 kb DNA ladder, (1) amplikon gen phy Produk Entry Clone pENTR-phyaq1 dengan Reaksi Rekombinasi BP Produk PCR attB-phyaq1 direkombinasi dengan vektor donor pDONR221 dengan bantuan campuran BP Clonase untuk menghasilkan entry clone pENTRphyaq1. Hasil transformasi entry clone pENTR-phyaq1 ke dalam sel E. coli DH5α tumbuh pada media LB agar yang mengandung kanamisin (Gambar 3A). Semua koloni yang ditumbuhkan pada media yang mengandung kloramfenikol tidak tumbuh (Gambar 3B), hal tersebut menyatakan bahwa telah terjadi rekombinasi antara situs attB pada produk PCR dengan situs attP pada vektor donor pDONR221. A
B
Gambar 3 Produk entry clone pENTR-phyaq1 (A) Hasil transformasi pENTRphyaq1, (B) Hasil konfirmasi pENTR-phyaq1 pada media yang mengandung kloramfenikol Hasil Ekstraksi Plasmid pENTR-phyaq1 Koloni yang diduga positif mengandung entry clone pENTR-phyaq1 kemudian ditumbuhkan pada media cair yang telah mengandung ampisilin untuk diekstrak plasmidnya, dan didapatkan plasmid dengan ukuran sekitar 3700 pb (Gambar 4).
9
M 4000 pb 3500 pb
1
±3700 pb Plasmid pENTR-phyaq1
Gambar 4 Elektroforegram hasil ekstraksi plasmid pENTR-phyaq1. (M) marker 1 kb DNA ladder, (1) DNA plasmid yang mengandung gen phy Produk Expression Clone pEXP-phyaq1 dengan Reaksi Rekombinasi LR Expression clone dibuat dengan cara merekombinasikan entry clone pENTR-phyaq1 ke dalam vektor ekspresi pDEST14. Hasil transformasi expression clone pEXP-phyaq1 ke dalam sel E. coli DH5α tumbuh pada media LB agar yang mengandung ampisilin (Gambar 5). Koloni yang tumbuh merupakan koloni yang diduga membawa ekspresi gen penyandi fitase.
Gambar 5 Hasil transformasi pEXP-phyaq1 Hasil Ekstraksi Plasmid pEXP-phyaq1 Koloni yang diduga positif membawa ekspresi gen penyandi fitase kemudian ditumbuhkan ke dalam media LB yang mengandung 100 μg/mL ampisilin untuk diekstrak plasmidnya, dan didapatkan plasmid dengan ukuran sekitar 5800 pb (Gambar 6).
10
M 1
2
6000 pb
±5800 pb Plasmid pEXP-phyaq1
5000 pb
Gambar 6 Elektroforegram hasil ekstraksi plasmid pEXP-phyaq1. (M) marker 1 kb DNA ladder, (1-2) DNA plasmid yang mengandung gen phy Aktivitas Fitase Ekspresi plasmid pEXP-phyaq1 dibuktikan dengan pengukuran uji aktivitas. Satu unit fitase dapat didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk melepaskan 1 μmol fosfat dari asam fitat per menit. Hasil uji aktivitas fitase ditampilkan dalam Tabel 2. Tabel 2 Hasil pengukuran aktivitas fitase Sampel Jam ke-6 Jam ke-12 Jam ke-24
Aktivitas (U/mL) 1.989 2.988 3.331
Pembahasan Primer Spesifik Gen Phy Primer merupakan oligonukleotida yang umumnya berukuran 20-30 basa yang berfungsi mengawali proses pembentukan utas DNA. Desain primer yang tepat merupakan salah satu faktor terpenting yang menentukan keberhasilan amplifikasi DNA. Desain primer dilakukan sebelum isolasi dan amplifikasi. Primer spesifik gen phy dirancang secara manual. Primer forward terdiri atas 24 basa dan primer reverse terdiri atas 20 basa yang sudah dilakukan reverse complement terlebih dahulu yang masing-masing ujung 5’ nya telah ditambahkan sebagian adaptor (Tabel 1) agar dapat melekat pada primer adapter attB1 dan attB2 saat proses amplifikasi. Simbol K, S, W, Y, M, R dalam primer spesifik gen phy (Tabel 1) adalah simbol untuk primer degenerate. Sekuen attB1 dengan arah sekuen dari 5’ ke 3’ adalah G GGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T, sedangkan sekuen attB2 dari arah sekuen 5’ ke 3’ adalah GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT. Situs attB ini akan mengarahkan gen pada saat amplifikasi sehingga arah penempelan primer akan benar. Sekuen GGGG pada situs attB berfungsi untuk efisiensi saat
11 amplifikasi gen agar primer dapat melekat kuat pada gen target. Kedua pasang primer juga berfungsi untuk membatasi daerah DNA yang akan diamplifikasi. Segmen yang diamplifikasi dalam PCR adalah daerah yang berada di antara kedua primer termasuk daerah tempat primer tersebut menempel (Saraswati 2010). DNA Genom Bacillus subtilis AQ1 Hasil Isolasi Isolasi DNA genom dilakukan untuk mendapatkan genom bakteri Bacillus subtilis AQ1 yang akan dijadikan sebagai DNA cetakan dalam proses amplifikasi gen fitase. Isolasi DNA genom dari B. subtilis AQ1 diawali dengan menumbuhkan satu koloni tunggal ke dalam media LB cair selama 14 jam pada suhu 37 ºC dan agitasi 120 rpm. Media LB adalah media kompleks yang terdiri atas pepton, ekstrak khamir, dan NaCl. Pepton menyediakan sumber asam amino dan peptida, sedangkan ekstrak khamir menyediakan kebutuhan nitrogen, gula, dan nutrien organik serta anorganik bagi bakteri. Agitasi berfungsi untuk meratakan nutrisi dan oksigen yang diperlukan dalam pertumbuhan bakteri. Pemanenan kultur bakteri dilakukan dengan teknik sentrifugasi untuk memisahkan sel bakteri dari media pertumbuhannya (Brown 2010). Isolasi DNA genom dilakukan secara kimiawi dengan senyawa yang dapat merusak dinding sel dan membran sel karena sel bakteri tertutup dalam membran sitoplasma dan dinding sel yang kuat. Penambahan larutan lisozim pada tahapan isolasi berfungsi memotong peptidoglikan yang merupakan komponen utama dari dinding sel. Selain lisozim, ditambahkan juga larutan STEP yang merupakan campuran dari SDS, Tris-HCl, EDTA, dan Proteinase K. Molekul lipid penyusun dinding sel dihilangkan dengan penambahan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). EDTA berfungsi sebagai agen pengkelat ion magnesium yang penting untuk mempertahankan struktur selubung sel dan menghambat enzim-enzim selular yang dapat merusak DNA (Clark & Pazdernik 2009; Brown 2010). Selain DNA, ekstrak sel juga mengandung protein dan RNA yang merupakan kontaminan yang harus dihilangkan untuk mendapatkan DNA yang murni. Protein dihilangkan dengan penambahan fenol. Sebelum diendapkan dengan fenol, terlebih dahulu ditambahkan proteinase K untuk memecah polipeptida menjadi unit yang lebih kecil sehingga lebih mudah dihilangkan dengan fenol. Setelah disentrifugasi, larutan akan membentuk tiga lapisan. DNA akan berada pada lapisan paling atas yang berwarna bening, lapisan tengah adalah protein, dan lapisan paling bawah adalah fenol, karena fenol tidak larut air. Beberapa molekul RNA akan hilang dengan pemberian fenol (Brown 2010). Uji kuantitas DNA murni yang dihasilkan dilakukan dengan spektrofotometer nanodrop, sedangkan uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa 1 %. Hasil elektroforesis gel agarose memperlihatkan ukuran DNA genom hasil isolasi diatas 10.000 pb (Gambar 1). Gen Penyandi Fitase Hasil Amplifikasi Amplifikasi gen penyandi fitase dengan teknik PCR (Polimerase Chain Reaction) dilakukan untuk menggandakan gen tersebut secara in vitro. Amplifikasi ini dilakukan dengan menggunakan dua pasang primer, yaitu primer spesifik gen phy (phyaq1) yang telah ditambahkan sebagian adaptor pada masingmasing ujung 5’ dan primer adapter Gateway. Reaksi PCR dilakukan sebanyak dua kali. Reaksi PCR pertama menggunakan pasangan primer phyaq1 sebanyak
12 tiga siklus dengan DNA genom hasil ekstraksi sebagai DNA cetakan. Hasil reaksi PCR pertama ini dijadikan DNA cetakan untuk reaksi PCR kedua menggunakan pasangan primer attB untuk mendapatkan produk attB-phyaq1. Etidium bromide (EtBr) yang digunakan untuk merendam gel agarosa setelah elektroforesis akan membentuk kompleks dengan utas DNA sehingga DNA akan berfluoresensi dan dapat dilihat di bawah sinar UV dengan panjang gelombang 254 nm atau 366 nm (Sambrook & Russel 2001). Pita DNA yang diduga merupakan amplikon dari gen penyandi fitase berukuran sekitar 1200 pb (Gambar 2). Hasil ini menunjukkan bahwa perancangan primer yang dilakukan sudah benar karena terdapat hasil amplifikasinya dan ukuran ampikon juga sesuai dengan prediksi. Selanjutnya produk PCR ini diberikan kode attB-phyaq1. Produk Entry Clone pENTR-phyaq1 dengan Reaksi Rekombinasi BP Produk PCR attB-phyaq1 selanjutnya disisipkan ke dalam vektor donor pDONR221 dengan reaksi BP. Proses rekombinasi gen fitase dengan vektor donor ini dikatalisis oleh campuran BP Clonase yang terdiri atas lamda bakteriofage Integrase (Int) dan protein IHF (integration host factor) (Karimi et al. 2007). Gen fitase memiliki situs attB1 dan attB2 yang ditambahkan pada saat proses amplifikasi, sedangkan vektor donor pDONR221 memiliki situs attP1 dan attP2 yang merupakan tempat untuk rekombinasi dengan situs attB1 dan attB2. Adanya situs rekombinasi ini menyebabkan tidak adanya kemungkinan kesalahan orientasi gen saat proses rekombinasi berlangsung. BP Clonase bekerja optimum pada suhu 25 ºC selama satu jam, kemudian reaksi dihentikan dengan penambahan proteinase K. Enzim ini akan memecah enzim dan protein yang ada dalam campuran BP Clonase. Setelah proses rekombinasi yang mempertemukan dua situs attB dan attP, gen fitase akan menyisip ke ke dalam vektor donor, yang menghasilkan entry clone pENTR-phyaq1 yang mengandung situs attL. Entry clone pENTR-phyaq1 hasil reaksi rekombinasi BP kemudian ditransformasikan ke dalam sel kompeten E. coli DH5α dengan metode kejut panas (heat shock). Prinsip utama metode ini adalah adanya lonjakan suhu dari 0 ºC menjadi 42 ºC yang menyebabkan membran sel kompeten menjadi tidak selektif terhadap molekul asing sehingga memudahkan plasmid rekombinan masuk ke dalam sel inang (Tarigan 2008). Sel kemudian dikultur ke dalam media SOC selama satu jam dengan agitasi 150 rpm dan suhu 37 ºC untuk memperbanyak jumlah sel. Setelah itu sel disebar pada media LB agar yang telah mengandung antibiotik kanamisin 50 μg/mL. Hasil rekombinasi terseleksi dengan adanya gen resisten kanamisin dan gen ccdB (seleksi negatif) yang terdapat dalam vektor donor pDONR221, yang akan menghambat pertumbuhan sel inang (Magnani et al. 2006). Gen ccdB adalah sebuah gen yang mengkode protein yang bertanggungjawab atas kematian sel E. coli sehingga menghambat pertumbuhan sel inang E. coli DH5α. Target dari gen ccdB adalah DNA girase. DNA girase dikenal juga sebagai topoisomerase II yang dapat menyebabkan terbentuknya konformasi pilinan negatif. Enzim ini menghilangkan pilinan positif di depan garpu replikasi dan memastikan keberlangsungan proses repliksi (Jonge et al. 2009). Saat proses rekombinasi berlangsung, gen ccdB akan bertukar dengan gen target, sehingga sel inang yang dimasuki vektor yang tidak tersisipi gen target akan mati karena terekspresinya protein ccdB. Sel inang yang tidak dimasuki vektor juga akan mati karena adanya antibiotik pada media tumbuh, sedangkan sel
13 inang yang dimasuki entry clone akan tumbuh karena memiliki gen resisten antibiotik kanamisin dan tersisipi gen target. Beberapa koloni hasil transformasi yang tumbuh kemudian diambil dan ditumbuhkan ke dalam media LB agar yang telah mengandung 15 μg/mL kloramfenikol untuk memastikan gen target telah masuk ke dalam vektor. Selain memiliki gen ccdB, daerah rekombinasi vektor donor pDONR221 juga memiliki gen resisten terhadap kloramfenikol. Jika telah terjadi rekombinasi, gen resisten kloramfenikol ini akan bertukar tempat dengan gen target, sehingga sel inang yang telah dimasuki entry clone tidak akan tumbuh jika ditumbuhkan dalam media yang mengandung antibiotik kloramfenikol. Koloni pENTR-phyaq1 kemudian diambil dan ditumbuhkan dalam media LB cair yang telah mengandung 50 μg/mL kanamisin untuk ekstraksi plasmid dan didapatkan plasmid dengan ukuran sekitar 3700 pb (Gambar 4) sesuai dengan prediksi (Lampiran 6). Plasmid pENTR-phyaq1 ini yang akan direkombinasikan dengan vektor ekspresi pDEST14 untuk menghasilkan expression clone. Produk Expression Clone pEXP-phyaq1 dengan Reaksi Rekombinasi LR Entry clone pENTR-phyaq1 hasil reaksi BP merupakan substrat kunci reaksi LR untuk menghasilkan expression clone. Reaksi rekombinasi LR dikatalisis oleh campuran LR Clonase yang terdiri atas lamda bakteriofage Integrase (Int), protein Excisionase (Xis), dan protein IHF (integration host factor) (Karimi et al. 2007). Enzim ini akan membantu proses rekombinasi antara situs attL1 dan attL2 pada entry clone dengan situs attR1 dan attR2 yang terdapat pada vektor ekspresi pDEST14. Proses rekombinasi ini menghasilkan expression clone pEXP-phyaq1 yang membawa gen resisten ampisilin dan produk samping pDONR221 yang membawa gen resisten kanamisin dan gen ccdB (Invitrogen 2003). Hasil rekombinasi ditransformasikan ke dalam E. coli DH5α dengan metode heat shock (kejut panas). Seleksi transforman pada tahap ini juga dilakukan dengan gen ccdB dan antibiotik. Transforman ditumbuhkan pada media LB padat yang mengandung 100 μg/mL ampisilin. Koloni yang tumbuh merupakan E. coli pEXP-phyaq1. Satu koloni E. coli pEXP-phyaq1 diambil dan ditumbuhkan pada media LB cair yang telah mengandung 100 μg/mL ampisilin untuk ekstraksi plasmid. Plasmid yang berhasil diekstrak berukuran sekitar 5800 pb (Gambar 6) sesuai dengan prediksi (Lampiran 7). Plasmid pEXP-phyaq1 kemudian ditransformasi lagi ke dalam sel kompeten E. coli BL21-Star. Transformasi ke dalam E. coli BL21-Star ini ditujukan melihat ekspresi gen penyandi fitase yang telah dikloning. Sel E. coli BL21-Star diketahui tidak mengandung lon protease dan mengalami defisiensi pada bagian outer membrane protease (ompT). Defisiensi tersebut dapat mengurangi terjadinya degradasi protein rekombinan yang diekspresikan di dalam sel inang sehingga dapat menghasilkan protein rekombinan dalam jumlah banyak. Ekspresi Fitase Rekombinan Produksi enzim dilakukan dalam media produksi yang mengandung pepton, ekstrak khamir, dan NaCl. Bahan-bahan tersebut menyediakan nutrisi bagi pertumbuhan bakteri seperti sumber karbon dan sumber nitrogen. Sumber karbon diperlukan untuk menyediakan kebutuhan energi bagi pertumbuhan bakteri, sedangkan sumber nitrogen berfungsi untuk menyediakan protein dan asam amino
14 bagi pertumbuhan bakteri (Riadi 2007). Produksi enzim dilakukan pada suhu 37 ºC dengan agitasi 150 rpm selama 24 jam. Agitasi ini diperlukan untuk meratakan nutrisi dan oksigen dalam media produksi sehingga membentuk suspensi enzim yang seragam. Selain itu, dalam media produksi juga ditambahkan ampisilin dan isopropil tiogalaktosida (IPTG). Penambahan ampisilin dilakukan karena vektor ekspresi yang digunakan (pDEST14) memiliki marka seleksi resisten terhadap antibiotik tersebut, sedangkan IPTG yang ditambahkan ke dalam media produksi berfungsi sebagai penginduksi ekspresi gen. Ekspresi gen merupakan proses transkripsi DNA menjadi RNA yang selanjutnya menjadi polipeptida spesifik (Madigan et al. 2009). Pengaturan ekspresi gen pada sel prokariot dinamakan konsep operon. Sistem ekspresi yang dibawa plasmid pDEST14 menggunakan regulasi T7 promotor. Promotor adalah sekuen DNA spesifik yang dapat dikenali oleh RNA polimerase sehingga proses transkripsi dapat berjalan. Salah satu konsep operon yang digunakan untuk mengekspresikan gen asing sehingga dapat mengekspresikan suatu protein rekombinan adalah sistem operon lac (operon laktosa). Ekspresi gen phy dalam E.coli BL21-Star dilakukan melalui induksi isopropil tiogalaktosida (IPTG) yang merupakan senyawa dengan struktur mirip laktosa dan berfungsi sebagai penginduksi ekspresi gen di bawah kontrol promotor lac. Proses yang terjadi ketika IPTG ditambahkan ke dalam media adalah terjadinya ikatan antara IPTG dengan lac represor. Ikatan tersebut mencegah lac represor menekan transkripsi T7 RNA polimerase. Keberadaan T7 RNA polimerase ini menyebabkan gen target dapat ditranskripsikan yang selanjutnya akan ditranslasi menjadi protein yang diinginkan. Apabila tidak terdapat IPTG, lacI promoter akan menghasilkan lac represor yang dihasilkan oleh gen lacI yang akan menekan sintesis T7 RNA polimerase. Tidak adanya T7 RNA polimerase ini menyebabkan ekspresi gen target yang transkripsinya di bawah kontrol promotor T7 tidak akan terbentuk (Fairbanks & Andersen 1999; Glick et al. 2010). Pemanenan enzim dilakukan dengan cara sentrifugasi. Supernatan dipisahkan dari peletnya, kemudian pelet diresuspensi dengan campuran bufer fosfat dan mercaptoethanol. Pengeluaran enzim rekombinan dilakukan dengan cara memecahkan dinding sel bakteri secara mekanik dengan sonikator selama 5 menit. Sonikasi merupakan metode pemecahan sel dengan menggunakan gelombang suara frekuensi tinggi untuk menghancurkan sel. Di dalam sonikator terdapat vibrating probe yang dapat menghasilkan gelombang suara. Gelombang suara dihantarkan melalui vibrating probe yang dapat dibenamkan ke dalam suspensi sel. Energi mekanik dari probe tersebut akan menginisiasi terbentuknya gelembung uap air mikroskopik sementara dan kemudian pecah. Hal tersebut menyebabkan terjadinya kejutan gelombang (waves shocks) yang memancar melewati sel pada seluruh sampel sehingga menyebabkan sel lisis. Selama proses sonikasi, suspensi sel harus diletakkan dalam wadah berisi es untuk mencegah kelebihan panas, karena suhu tinggi dapat mendenaturasi sebagian besar enzim (Thermo scientific 2009; Bintang 2010). Pengukuran aktivitas fitase dilakukan berdasarkan metode Sajidan (2002) yang telah dimodifikasi. Reaksi berlangsung selama 30 menit pada suhu 37 ºC. Reaksi dihentikan dengan penambahan larutan STOP yang terdiri atas campuran amonium heptamolibdat, amonium monovanadat, asam nitrat, dan akuades. Produk fosfat yang terbentuk dari hasil reaksi antara fitase dan substrat natrium
15 fitat akan berikatan dengan asam molibdat dan asam vanadat sehingga terbentuk kompleks asam vanadimolibdifosfat yang berwarna kuning orange. Warna yang terbentuk diukur serapannya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 415 nm. Absorban tersebut selanjutnya harus dikonversi ke dalam kurva standar fosfat untuk mengetahui konsentrasi produk hasil reaksi enzim. Ekspresi fitase rekombinan pada E. coli BL21-Star dapat dilihat dari hasil uji aktivitas yang dilakukan pada jam ke-6, ke-12, dan ke-24 selama masa produksi. Aktivitas fitase yang terukur pada jam tersebut masing-masing adalah 1.989 U/mL, 2.988 U/mL, dan 3.331 U/mL. Hasil tersebut menunjukkan bahwa gen penyandi fitase yang diisolasi dari B. subtilis AQ1 dan dikloning dengan teknik kloning Gateway sudah dapat terekspresi pada E. coli BL21-Star.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Gen penyandi fitase yang diisolasi dari bakteri Bacillus subtilis AQ1 berukuran 1200 pb dan telah berhasil disisipkan ke dalam vektor donor dan vektor ekspresi dengan teknologi Gateway. Hal tersebut dibuktikan dengan terekspresinya gen fitase dalam E. coli BL21-Star yang ditandai dengan adanya aktivitas fitase dalam mendegradasi substrat natrium fitat pada jam ke-6, ke-12, dan ke-24 yang masing-masing memiliki aktivitas sebesar 1.989 U/mL, 2.988 U/mL, dan 3.331 U/mL. Saran Diperlukan analisis lanjutan seperti karakterisasi dan purifikasi enzim rekombinan yang telah dihasilkan serta optimasi agar dapat menghasilkan enzim dengan produktivitas yang maksimal.
DAFTAR PUSTAKA Baruah K, Sahu NP, Pal AK, Debnath D. 2004. Dietary phytase: an ideal approach for a cost effective and low-polluting aqua feed. NAGA. 27 (3&4): 15-19. Bintang M. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta: Erlangga. Brown T A. 2010. Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction. 6th ed. John West Sussex: Wiley & Sons Ltd. Clark DP, Pazdernik NJ. 2009. Biotechnology: Applying the Genetic Revolution. Elsevier Academic Pr.
16 Correa TLR, Queiroz MV, Araujo EF. 2014. Cloning, recombinant expressio, and characterization of a new phytase from Penicillium chrysogenum. Microbiological Research. doi: 10.1016/j.micres.2014.06.005. Fairbanks DJ, Andersen WR. 1999. Genetics: The continuity of life. Toronto: Cole Publishing Company. Glick BR, Pasternak JJ, Patten CL. 2010. Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. Washington DC: ASM Pr. Hartley JL, Temple GF, and Brasch MA. 2000. DNA Cloning Using in vitro SiteSpecific Recombination. Genome Research 10: 1788-1795. Hasriani F. 2011. Pemurnian dan karakterisasi fitase dari Bacillus subtilis AQ1 [skripsi]. Jakarta (ID): Universitas Negeri Jakarta. Invitrogen. 2003. Gateway® Technology: a universal technology to clone DNA sequences for functional analysis and expression in multiple system. California: Life Technologies. Jonge ND, Pino AG, Buts L, Haesaerts S, Charlier D, Zangger K, Wyns L, Greve HD, Loris R. 2009. Rejuvenation of CcdB-Poisined Gyrase by an Intrinsically Disordered Protein Domain. J.Molecular Cell 35: 154-163. Karimi et al. 2007. Recombinational cloning with plant Gateway vectors. Plant Physiology. 145: 1144-1154. Khemakhem AF, Ali MB, Boukhris I, Khemakhem B, Maguin E, Bejar S, Chouayekh H. 2012. Crucial role of pro 257 in the thermostability of Bacillus phytases: Biochemical and srtuctural investigation. International Journal of Biological Macromolecules. 54: 9-15. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2012.11.020. Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV, Clark DP. 2009. Brock: Biology of microorganism. San Francisco: Pearson Benjamin Cummungs publishing Inc. Ravindran V. 2000. Effect of Natuphos Phytase on the bioavailability of protein and amino acids. Palmerston: Massey University. Riadi, L. 2007. Teknologi Fermentasi. Yogyakarta : Graha Ilmu. Sajidan. 2002. Molekulare Characterisierung einer Phytase (Myo-inositol Hexakifosfate Hydrolase) und von Fosfatasen aus Bakterieisolaten Indoneschicher Reisfelder (Klebsiella pneumoniae) [Dissertation]. Deutschland (GE): Humboldt Universitat zu Berlin. Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual 3rd ed. New York, United State of America: Cold Spring Harbor Laboratory Pr. Saraswati O. 2010. Kloning dan karakterisasi gen penyandi α-amilase (amyA) Aspergillus niger serta konstruksi ekspresi dengan teknologi Gateway [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Satriaji KP. 2010. Optimasi produksi fitase oleh Bacillus subtilis AQ1 menggunakan Response Surface Methodology [skripsi]. Jakarta (ID): Universitas Negeri Jakarta. Savitri SM, AA Prasetyo, C Onuma, S Ishikawa, A Malik, N Ogasawara. 2013. Efficient Expression of Recombinant Soluble Apoptin in Escherichia coli and Bacillus subtilis. IJCEBS 1(1): 207-210. Setiawan R. 2014. Kloning dan ekspresi Endo-β-1,4-Glukanase dari isolat lokal BPPTCC-RK2 [tesis]. Depok (ID): Universitas Indonesia. Siregar RY. 2010. Isolasi dan karakterisasi bakteri penghasil enzim fitase dari sumber air panas Rimbo Panti Pasaman [skripsi]. Padang (ID): Universitas Andalas.
17 Tarigan D. 2008. Isolasi dan kloning fragmen gen penyandi aminocyclopropane carboxylic synthase (ACS) dari daun tanaman karet (Hevea brasiliensis) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Thermo scientific. 2009. Cell lysis technical handbook. United States: Thermo Fisher Scientific Inc. Widowati S, Andriani D, Riyanti EI, Raharto P, Sukarno L. 2001. Karakterisasi Fitase dari Bacillus coagulans. Bogor: Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan.
18 Lampiran 1 Diagram alir penelitian
Perancangan Primer
Pembuatan media dan peremajaan bakteri
Isolasi DNA genom Bacillus subtilis AQ1
Amplifikasi gen penyandi fitase
Pengklonan Fragmen DNA pada Vektor Donor pDONR 221
Ekstraksi plasmid rekombinan
Pengklonan Fragmen DNA pada Vektor Ekspresi pDEST 14
Ekstraksi plasmid dan transformasi ke sel kompeten E.coli BL21‐Star
Produksi dan panen enzim rekombinan
Uji aktivitas fitase
19 Lampiran 2 Kurva standar fosfat
Lampiran 3 Pengukuran aktivitas fitase Sampel Kontrol 6 jam 12 jam 24 jam
1 0.330 0.448 0.463 0.507
Absorbansi 2 0.317 0.435 0.515 0.519
3 0.311 0.438 0.519 0.530
Absorbansi rata-rata
Absorbansi terkoreksi
Aktivitas (U/mL)
0.319 0.440 0.499 0.519
0 0.121 0.180 0.200
0 1.989 2.988 3.331
Aktivitas fitase dihitung dengan rumus sebagai berikut: Aktivitas (U/mL) = [Fosfat] x 1000 x Vt x Faktor Pengenceran BM KH2PO4 x Vs x t Keterangan: Vt = volume total (mL) Vs = volume enzim (mL) t = waktu inkubasi (menit)
20
Lampiran 4 Peta marka seleksi vektor donor (pDONR221)
Lampiran 5 Peta marka seleksi vektor ekspresi (pDEST14)
21
Lampiran 6 Prediksi reaksi rekombinasi BP
22
Lampiran 7 Prediksi reaksi rekombinasi LR
23
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Boyolali pada tanggal 12 April 1992. Penulis merupakan anak kedua dari empat bersaudara dari pasangan Bapak Sugiyo (Alm) dan Ibu Siti Asiyah. Penulis menyelesaikan pendidikan menengah atas di SMA Negeri 1 Surakarta tahun 2010. Pada tahun yang sama penulis diterima di Departemen Biokimia, Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Selama menjadi mahasiswa penulis aktif dalam mengikuti berbagai kegiatan. Penulis pernah mengikuti UKM Agriaswara (2010) dan UKM Panahan (2010-2011). Penulis aktif dalam Himpunan Profesi Community of Research and Education in Biochemistry (CREBs) sebagai sekertaris divisi HRD (2011-2012) dan staff divisi HRD (2012-2013). Penulis juga aktif mengikuti berbagai kepanitiaan antara lain Seminar dan Workshop K3 (2011), Seminar Kesehatan Nasional (2012), IPB Dedeication For Education (IDEA) (2012), Seminar dan Kajian Ilmiah Kehalalan (2012), Pesta Sains Nasional (2012), International Scholarship Education Expo (2013), dan IPB Innovation Fair (2013). Tahun 2012 penulis pernah mendapatkan dana penelitian dari DIKTI dalam Program Kreativitas Mahasiswa bidang Penelitian (PKMP) dengan judul proposal Uji Aktivitas Daya Serap Kulit Pisang (Musaceaea sp.) terhadap Logam Berat dalam Air Tercemar sebagai Upaya Mengatasi Krisis Air Bersih. Tahun 2013 penulis kembali mendapatkan dana penelitian dalam bidang yang sama untuk empat judul proposal penelitian. Pada tahun yang sama penulis juga tercatat sebagai finalis Tanoto Student Research Awards tingkat IPB. Penulis merupakan penerima beasiswa PPA pada tahun 2011-2013, dan beasiswa karya salemba empat (KSE) pada tahun 2013-2014. Penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah biokimia umum (2013) dan biologi dasar (2013-2014). Penulis juga aktif menjadi pengajar privat di tahun 2013. Penulis pernah mendapatkan kesempatan magang di Laboratorium Biokimia, BB Biogen pada tahun 2013 dan menyelesaikan Praktik Lapang di tempat yang sama dengan judul Deteksi Tujuh Strain Chilli Veinal Mottle Virus (ChiVMV) pada Tanaman Cabai (Capsicum annuum L.) Menggunakan Metode Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Sebagai tugas akhir, penulis melakukan penelitian di Laboratorium Teknologi Bioindustri, LAPTIAB, BPPT Serpong, Tangerang Selatan dengan judul Isolasi dan Kloning gen Penyandi Fitase dari Bacillus subtilis AQ1 dengan Teknologi Gateway.
