KLONING DAN EKSPRESI GEN pdc PENYANDI PYRUVATE DECARBOXYLASE DARI Zymobacter palmae
Skripsi
Untuk memenuhi sebagian persyaratan guna memperoleh gelar Sarjana Sains
Oleh: Agitya Putra Kusuma M0404018
JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA 2008
i
PENGESAHAN
SKRIPSI KLONING DAN EKSPRESI GEN pdc PENYANDI PYRUVATE DECARBOXYLASE DARI Zymobacter palmae Oleh: Agitya Putra Kusuma NIM M0404018 Telah dipertahankan di depan Tim Penguji pada tanggal 28 Juli 2008 dan dinyatakan telah memenuhi syarat
Surakarta,
Agustus 2008
Penguji I
Penguji II
Dr. Okid Parama Astirin, MS NIP. 131 569270
Dr. Prabang Setyono, M.Si NIP. 132 240 171
Penguji III
Penguji IV
Prof. Drs. Suranto, M.Sc., Ph.D NIP. 131 472 192
Budi Saksono, M.Sc NIP. 320 006 024
Mengesahkan Dekan FMIPA
Ketua Jurusan Biologi
Prof. Drs. Sutarno, M.Sc, Ph.D NIP.131 649 948
Dra. Endang Anggarwulan, M.Si NIP. 130 676 864
ii
PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi ini adalah hasil penelitian saya sendiri dan tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, serta tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka. Apabila di kemudian hari ditemukan adanya unsur penjiplakan maka gelar kesarjanaan yang telah diperoleh dapat ditinjau dan/atau dicabut.
Surakarta,
Agustus 2008
Agitya Putra Kusuma NIM M0404018
iii
KLONING DAN EKSPRESI GEN pdc PENYANDI PYRUVATE DECARBOXYLASE DARI Zymobacter palmae Agitya Putra Kusuma Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret, Surakarta ABSTRAK Gen pdc merupakan penyandi enzim pyruvate decarboxylase (PDC) yang berperan dalam proses produksi asetaldehida secara homofermentatif. Asetaldehida berperan penting dalam sintesis asam asetat, anhidrid asam asetat, butanol, etil asetat dan piridin. Kebutuhan asetaldehida terus mengalami peningkatan setiap tahun, sehingga memerlukan teknologi produksi yang efektif, efisien dan ramah lingkungan. Rekayasa genetika dengan penerapan teknologi DNA rekombinan diharapkan dapat dikembangkan sebagai teknologi alternatif produksi asetaldehida dengan memanfaatkan metabolisme bakteri dan limbah biomassa pertanian. Untuk mengembangkan teknologi tersebut, pada penelitian ini telah dilakukan kloning dan ekspresi gen pdc penyandi pyruvate decarboxylase dari Zymobacter palmae. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk (1) mengisolasi gen pdc dari genom bakteri Z. palmae, (2) mendapatkan klon gen pdc pada vektor plasmid pGEM-T easy, (3) menguji ekspresi gen pdc pada vektor plasmid pET21b. Penelitian ini dimulai dengan studi bioinformatika yang bertujuan untuk mencari sekuen gen pdc pada GenBank NCBI dan mendesain pasangan primer PCR dengan memanfaatkan beberapa perangkat lunak seperti Genamics Expression, BioEdit, FastPCR dan DNA Calculator Online. Gen pdc didapatkan dengan metode PCR menggunakan genom Z. palmae digunakan sebagai DNA cetakannya. Kloning dilakukan dengan membuat DNA rekombinan antara gen pdc dan plasmid pGEM-T easy yang ditransformasikan ke dalam E. coli DH5α untuk selanjutnya dilakukan konfirmasi tingkat keberhasilan dengan isolasi plasmid. Uji ekspresi gen pdc dilakukan dengan menggunakan plasmid pET21b dan ditransformasikan ke dalam E. coli BL21 DE3pLys. Hasil dari penelitian ini adalah DNA rekombinan antara gen pdc hasil amplifikasi dengan metode PCR dan pGEM-T easy telah berhasil diklon ke dalam E. coli DH5α. Analisis restriksi dengan NdeI dan BamHI terhadap plasmid rekombinan pGEM-T easy + pdc menghasilkan dua pita yang masing-masing berukuran ± 3018 bp (identik dengan ukuran pGEM-T easy) dan ± 1671 bp (identik dengan ukuran pdc Z. palmae). Uji ekspresi gen pdc pada pET21b melalui E. coli BL21 DE3pLys belum berhasil dilakukan, sehingga memerlukan kajian lebih mendalam mengenai metode yang digunakan dalam penelitian tersebut. Kata Kunci : Kloning, Ekspresi, Gen pdc, Pyruvate Decarboxylase, Zymobacter palmae.
iv
CLONING AND EXPRESSION pdc GENE ENCODING PYRUVATE DECARBOXYLASE FROM Zymobacter palmae Agitya Putra Kusuma Biology Department, Mathematics and Natural Sciences Faculty, Sebelas Maret University, Surakarta
ABSTRACT The pdc gene is encode of Pyruvate Decarboxylase (PDC) enzyme that play a part in production process acetaldehyde according to homofermentatif. Acetaldehyde play important role in synthesis acetic acid, anhidrid acetic acid, butanol, etil acetic and pyridine. The requirement of acetaldehyde always increase in every year, so that need effective production technology, efficient and friendly environment. Genetics engineering with adjustment of DNA recombinant technology supposed can be developed as production alternative technology of acetaldehyde with make use bacteria metabolism and waste biomassa agriculture. To develop of this technology, in this experiment have been done cloning and expression of pdc gene from Zymobacter palmae. The aims of this experiment were (1) to isolate pdc gene from genom Z. palmae, (2) to get positive clon of pdc gene in vector plasmid pGEM-T easy pass E. coli DH5α, (3) to examine expression of pdc gene in vector plasmid pET21b pass E. coli BL21 DE3pLys. This experiment was begun with bioinformatical studies in order to seek sequence pdc gene in GenBank NCBI and design a pair of PCR primers using several softwares such as Genamics Expression, BioEdit, FastPCR and DNA Calculator Online. The results showed that pdc gene from Z. palmae has succesfully cloned into pGEM-T easy. Restriction analysis with NdeI and BamHI towards plasmid recombinant pGEM-T easy + pdc are produce two bands which else have a size about 3018 bp (pGEM-T easy) and about 1671 bp (pdc Z. palmae). Expression of pdc gene in pET21b not yet success done, so that need study more detail to hit method that used in experiment. Keyword: Cloning, Expression, pdc gene, Pyruvate Decarboxylase, Zymobacter palmae
v
MOTTO
“Sesungguhnya, seseorang hanya akan meraih pengetahuan bila dalam dirinya terdapat enam hal: kecerdasan, semangat, kesabaran, bekal, guru, dan proses yang tiada henti”
“Setiap kegagalan adalah suatu pelajaran yang membawa seseorang untuk mencoba suatu pendekatan baru yang tidak pernah dicoba sebelumnya”
“Berbahagialah manusia yang diberi berbagai masalah, karena dengan itu manusia sadar akan kelemahannya dan bisa menjadi pandai karena pengertian”
Janganlah kamu bersikap lemah dan janganlah pula kamu bersedih hati, padahal kamulah orang yang paling tinggi derajatnya, jika kamu orang-orang yang beriman (Q.S. Ali Imron: 139)
Aku mengagumi seorang mukmin. Bila memperoleh kebaikan dia memuji Allah dan bersyukur. Bila ditimpa musibah dia memuji Allah dan bersabar (H.R. Ahmad dan Abu Daud)
vi
PERSEMBAHAN
Karya ini aku persembahkan kepada ibu dan bapak (alm) tercinta, yang senantiasa memberikan dukungan, kasih sayang dan doanya. Terima kasih.
vii
KATA PENGANTAR
Segala puja dan puji syukur dipanjatkan ke hadirat Allah SWT, yang telah melimpahkan segala rahmat dah hidayah-Nya yang tak terhingga sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul: “Kloning dan Ekspresi Gen pdc Penyandi Pyruvate Decarboxylase dari Zymobacter palmae”. Penyusunan skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar kesarjanaan strata (S1) pada Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret Surakarta. Gen pdc merupakan penyandi enzim pyruvate decarboxylase (PDC) yang berperan dalam proses produksi asetaldehida secara homofermentatif dengan memanfaatkan metabolisme mikroorganisme. Terkait dengan hal tersebut, sekam dan jerami sebagai limbah biomassa diketahui mengandung karbohidrat seperti silosa, arabinosa, dan selulosa. Proses sakarifikasi terhadap karbohidrat dalam biomassa mampu menghasilkan monosakarida yang melalui proses fermentasi dengan memanfaatkan metabolisme mikroorganisme bakteri dapat menghasilkan asetaldehida. Kloning dan ekspresi gen pdc penyandi enzim PDC dari bakteri Z. palmae diharapkan mampu menjadi teknologi alternatif dalam memproduksi asetaldehida dengan memanfaatkan limbah biomassa dan metabolisme mikroorganisme. Kloning gen pdc dilakukan dengan menggunakan vektor plasmid pGEM-T easy dan Escherichia coli DH5α sebagai bakteri inang, sedangkan ekspresi gen pdc
viii
dilakukan dengan menggunakan vektor plasmid pET21b dan E. coli BL21 DE3pLys sebagai bakteri inang. Dalam melakukan penelitian maupun penyusunan skripsi ini penulis telah mendapatkan banyak masukan, bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak yang sangat berguna dan bermanfaat baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu pada kesempatan yang baik ini dengan besar hati penulis ingin mengucapkan terima kasih yang setulus-tulusnya dan sebesar-besarnya kepada: Sri Wahyuningsih dan (Alm) Agus Salim, selaku ibu dan bapak yang selalu memberikan perhatian dan kasih sayang dengan tulus. Prof. Drs. Sutarno, M.Sc., Ph.D., selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret Surakarta yang telah memberikan ijin penelitian untuk keperluan skripsi. Dra. Endang Anggarwulan, M.Si., selaku Ketua Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret Surakarta yang telah memberikan ijin penelitian untuk keperluan skripsi. Prof. Drs. Suranto, M.Sc., Ph.D., selaku dosen pembimbing I yang telah memberikan bimbingan dan petunjuknya selama penelitian sampai selesainya penyusunan skripsi. Budi Saksono, M.Sc., selaku dosen pembimbing II yang telah memberikan bimbingan dan petunjuknya selama penelitian sampai terselesainya penyusunan skripsi.
ix
Dr. Okid Parama Astririn, M.S., selaku dosen penelaah I yang telah memberikan bimbingan dan petunjuknya selama penelitian sampai terselesainya penyusunan skripsi. Dr. Prabang Setyono, M.Si., selaku dosen penelaah II yang telah memberikan bimbingan dan petunjuknya selama penelitian sampai terselesainya penyusunan skripsi. Valentino Arya Kusuma dan Pramudita Putri Kusuma, terima kasih atas jalinan persaudaraan yang begitu hebat di antara kita serta Mariana Indrastuti, terima kasih atas cinta, kasih sayang, perhatian, semangat, dan motivasi yang telah diberikan dengan tulus selama ini. Elvi Yetti, Lita Triratna, Dewi Fitriani, Puspita Suci Wulandari, Gunawan Ari Wibowo, Fitria Kumala Arum, Sri Nurul Aini, Ifah Munifah, Dwi Setyo Rini, dan Gintung Patantis terima kasih atas bimbingan, saran dan kritik selama proses penelitian dan penyusunan skripsi di CBRG LIPI. Dhimas Sagietha, Dhita Kurniawan, Tri Warseno, Eki Sulistyowati, Leny Rahayuningsih, Maryati Rahayu, Susanti Wahyuningsih, Ari Rusmiyati, dan Andriyani Puspitaningrum, terima kasih atas kebersamaan dalam perjalanan mengarungi hidup di Cibinong. Usman Setiawan, Topan Cahyono, Anugrah Adi Santoso, Rindyana Arifatus Solikah, dan Galih Septia Amiati terima kasih atas persahabatan dan kesabaran kalian dalam mendidik dan memberikan pemahaman tentang hidup, serta Nina Astreani, terima kasih atas dukungan dan motivasi yang diberikan selama menuntut ilmu di jurusan biologi.
x
Semua pihak yang telah membantu proses penelitian dan penyusunan skripsi. Dengan kerendahan hati penulis menyadari bahwa dalam melakukan penelitian dan penyusunan skripsi ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu masukan yang berupa saran dan kritik yang membangun dari para pembaca akan sangat membantu. Semoga skripsi ini bisa bermanfaat bagi kita semua dan pihakpihak yang terkait.
Surakarta, Agustus 2008
Penyusun
xi
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN JUDUL .................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN ...................................................................... ii HALAMAN PERNYATAAN ...................................................................... iii ABSTRAK ................................................................................................... iv ABSTRACT ................................................................................................. v HALAMAN MOTTO................................................................................... vi HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................... vii KATA PENGANTAR .................................................................................. viii DAFTAR ISI ................................................................................................ xii DAFTAR TABEL ........................................................................................ xiv DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xv DAFTAR LAMPIRAN................................................................................. xvi DAFTAR SINGKATAN .............................................................................. xvii BAB I. PENDAHULUAN ............................................................................ 1 A. Latar Belakang Masalah..................................................................... 1 B. Perumusan Masalah ........................................................................... 6 C. Tujuan Penelitian ............................................................................... 6 D. Manfaat Penelitian ............................................................................. 7 BAB II. LANDASAN TEORI ...................................................................... 8 A. Tinjauan Pustaka................................................................................ 8 B. Kerangka Pemikiran........................................................................... 24 BAB III. METODE PENELITIAN ............................................................... 26 A. Waktu dan Tempat Penelitian ............................................................ 26 B. Bahan dan Alat .................................................................................. 26 C. Cara Kerja.......................................................................................... 28 D. Analisis Data ..................................................................................... 45 BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN............................... 46 A. Studi Bioinformatika.......................................................................... 46
xii
B. Desain Primer PCR ............................................................................ 47 C. Isolasi Genom .................................................................................... 49 D. Amplifikasi Gen pdc Zymobacter palmae dengan Metode PCR ......... 51 E. Kloning Gen pdc Zymobacter palmae ................................................ 55 F. Ekspresi Gen pdc Zymobacter palmae................................................ 62 BAB V. PENUTUP ...................................................................................... 67 A. Kesimpulan........................................................................................ 67 B. Saran.................................................................................................. 67 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 68 LAMPIRAN ................................................................................................. 72 RIWAYAT HIDUP PENULIS...................................................................... 77
xiii
DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1.Data Statistik Impor Asetaldehida .................................................... 3 Tabel 2.Sumber Mikroba Penghasil Gen pdc Penyandi PDC ......................... 46 Tabel 3.Komponen dan Konsentrasi Pereaksi PCR ....................................... 52
xiv
DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Rumus Molekul Asetaldehida ...................................................... 11 Gambar 2. Kerangka Pemikiran Penelitian.................................................... 25 Gambar 3. Hasil Isolasi Genom Z. palmae .................................................... 50 Gambar 4. Hasil Amplifikasi gen pdc Z. palmae ........................................... 54 Gambar 5. Circle Map pGEM-T easy............................................................ 56 Gambar 6. Hasil Transformasi Rekombinan pdc Z. palmae ........................... 58 Gambar 7. Hasil Isolasi Plasmid Rekombinan pGEM-T easy + pdc .............. 61 Gambar 8. Circle Map Plasmid pET21b........................................................ 63 Gambar 9. Hasil Digesti plasmid pET21b ..................................................... 64
xv
DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Sekuen Nukleotida Gen pdc Z. palmae...................................... 72 Lampiran 2. Hasil Uji In Silico Fast PCR ...................................................... 73 Lampiran 3. Hasil Sekuensing Gen pdc Z. palmae ........................................ 74 Lampiran 4. Daftar Riwayat Hidup Penulis ................................................... 77
xvi
DAFTAR SINGKATAN
Singkatan
Kepanjangan
µl µm Atm BLAST BPPT BPS BUMN CBRG DNA GRAS HCl IPTG kb LB LIPI mPa mRNA MYE NaCl NCBI OD PCR PDC SDS TAE TBE TE ThDP TI X-gal
mikroliter mikrometer Atmosfer Basic Local Allignment Search Tool Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi Biro Pusat Statistik Badan Usaha Milik Negara Carbohydrate and Bioengineering Research Group Deoxyribo Nucleic Acid Generally Recognized As Safe Hidroklorida Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside Kilo basepairs Luria Bertani Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia mili pascal messenger ribonucleotide Maltose Yeast Extract Natrium Klorida National Center for Biotechnology Information Optical Density Polymerase Chain Reaction Pyruvate Decarboxylase Sodium Dodesil Sulfat Tris Asetat EDTA Tris Borat EDTA Tris EDTA Thiamin Diphosphate Teknik Informasi 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside
xvii
