KERAGAMAN GENETIK ISOLAT Escherichia coli DARI RONGGA MULUT BIAWAK (Varalllls) DAN KLONING GEN PENYANDI RESISTENSI AMPISILIN
YOGIARA
Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarj ana Sains . pada Program Studi Biologi
." "" JURUSAN BIOLOGI ... " FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 1998
Judul : Keragaman Genetik Isolat Escherichia coli dari Rongga Mulut Biawak (Varanus) dan Kloning Gen Penyandi Resistensi Ampisilin Nanla : Yogiara NIM :G31.1556
Menyetujui,
Df. If. Antonius Suwanto. M.Sc. Pembimbing I
Tanggal Lulus: 28 Desember 1998
-
Dra. Amarila Malik. M.Si. Pembimbing II
RINGKASAN YOGIARA. Keragaman Genetik Isolat Escherichia coli dari Rongga Mulut Biawak (Varanus) dan Kloning Gen Penyandi Resistensi Ampisilin (Genetic Diversity Analyses a/Escherichia coli isolatedfrom Oral 0/ Biawak Monilor [Varanus]) and Clonning 0/ Ampicillin Resistance Gene. Dibimbing oleh ANTONWS SUWANTO dan AMARILA MALIK. Biawak merupakan reptilia yang tidak memiliki kelenjar bisa. Namun ternyata gigitannya dapat menyebabkan infeksi (bakteremia). Diduga infeksi ini disebabkan oleh mikrobe yang hidup pada oral biawak tersebut. Infonnasi mengenai gen penyandi resistensi terhadap antibiotika yang diperoleh dari mikrobe yang hidup di alam masih sedikit. Pada penelitian ini diperoleh 12 bakteri Escherichia coli yang resisten terhadap antibiotika ampisilin dari 13 isolat E. coli yang berhasil diisolasi. Analisa keragaman genetik terhadap 12 isolat E. coli yang resisten menghasilkan 9 profil schizotyping Spel yang beragam. Tiga isolat lainnya tidak dapat menghasilkan pola pita DNA yang diskrit kemungkinan dikarenakan endonuklease yang dihasilkan oleh bakteri tersebut tidak berhasil diinaktivasi saat penyiapan DNA genom utuh. Selanjutuya pada penelitian ini juga diperoleh transfonnan E. coli TOPIO yang mengandung plasmid rekombinan pAS901 berukuran 15 kb, dan transforman E. coli TOPIO yang mengandung plasmid endogenous pVar2.2 berukuran 5,8 kb. Hal ini juga menginformasikan ballWa sifat resistensi terhadap ampisilin, yang dimiliki oleh isolat E. coli yang diisolasi dari oral biawak, dikodekan ole11 gen yang terdapat di dalam plasmid.
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bandung pada tanggal19 Januari 1975 sebagai anak kedua dari empat bersaudara, anak dari pasangan H. Sarjo Nitiatmaja dan Ratih Sugiarti. Tahun 1993 penulis lulus dari SMU Negeri 78 Jakarta Barat dan pada tahun yang sarna lulus Ujian Masuk Perguruan Tinggi Negeri (UMPTN) diterima di Program Studi Pemuliaan Tanaman, Fakultas Pertanian, Universitas Padjadjaran, BandlIng. Pada tahun 1994 penulis mengikuti kembali UMPTN dan diterima di Institut Pertanian Bogar, Pada tahun 1995 penulis memilih Program Studi Biologi, junlsan
Biologi, Fakultas Matematika dan I1mu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan penuHs pemah menjadi asisten program Humaniora untuk cabang o1ah
raga bela diri pencak silat Persaudaraan Setia Hati pada tahun ajaran 199411995, 199511996, dan 199611997, pelatih olah raga bela diri pencak silat Persaudaraan Setia Hati pada mata kuliah Olah Raga dan Seni untuk tahun ajaran 199711998 dan 199811999, asisten luar biasa mata kuliah Biologi Dasar I pada tahun ajaran 199611997 dan 199711998, mata kuliah Rekayasa Genetika pada tahun ajaran 199711998, se11a mata kuliah Biologi Molekuler Keragaman Bakteri pada tahun ajaran 1998/1999. Pada tahun 1998 penulis
bekerja sebagai pengajar Biologi di Lembaga Pendidikan TEKNOS cabang Bogor.
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan.
Judul yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan
Januari 1998 ini ialah Keragaman Genetik Isolat Escherichia coli dari Rongga Mulut Biawak (Varanus) dan Kloning Gen Penyandi Resistensi Ampisilin. Penulis mengucapkan terima kasih kepada berbagai pihak yang telah membantn penyelesaian karya ilmiah ini, antara lain Bapak Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc. selaku pembimbing I atas bimbingannya yang luar biasa serta kesempatan yang diberikan sebagai asisten praktikum pada beberapa mata kuliah yang beliau asuh, Ibu Dra. Amarila Malik, M.Si. selaku pembimbing II atas saran dan pengarahan selama penelitian dan penulisan karya ihniah ini. Di samping itn penghargaan diberikan kepada Bapak Husen Samhari yang telah membantn pelaksanaan penelitian, Bapak Dr. Drs. Yaya Rukayadi, M.Si., Bapak Drs.Samsul A. Yani kasih
atas saran dan pengarahan selama penelitian ini. Terima
penulis ucapkan pula kepada ayah, ibu, Ang Dida, Nola, Neli, ternan-ternan sepeIjuangan:
Triwidodo, Ronald, Sari, lin, dan lain-lain yang tidak mungkin disebutkan satn persatn, atas segala doa dan dukungan yang diberikan. Sernoga karya ilmiah ini dapat bennanfaat.
Bogor, Desember 1998
Yogiara
DAFTARISI DAFTAR GAMBAR ... ... ... ... ... ...... ... ...... ... ...... ... ... ...... ... ... ... ... ... ... ...... ... ... .....
Halaman v
DAFTAR TABEL ...... .................. ... ......... ..................... ... ... ... ...... ......... ... .....
v
DAFTARLAMPIRAN ....................................................................................
vi
PENDAHULUA.!'I ...... ......... ........................ .................. ... ... ... ...... ............ .....
1
BAHAN DAN METODE Galur bakteri, plasmid dan spesimen asa! sampel .......................................... . Pengambilan sampel ............................................................................ . Isolasi dan Seleksi Bakteri Resisten Ampisilin ............................................. . Identifikasi Bakteri ............................................................................. . Analisis Keragaman Genetik .................................................................. . Kloning dan Transformasi DNA Genom .................................................... .
2 2
4 4 4 4
HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi dan Penapisan E. coli Resisten Ampisilin ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. . ... ... .. ... Analisis Keragaman Genetik ... .. . ... ... ... .. . ... ... ... .. . ... ... .. . .. . ... . .. ... ... ... .. . ... .... Kloning dan Transformasi Gen Penyandi Resistensi Ampisilin ..................... ... ...
6
KESIlvIPULAN ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...... ... ... ...... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .....
9
DAFTAR PUSTAKA
9
LAMPIRAN
4 6
II
DAFTAR GAMBAR Halaman 1.
Pengambilan sampel cairan dari rongga mulu! biawak ..................... ... ... . . . . . . ... ...
2
2.
A. Profil schizo typing beberapa isola! E. coli yang diisolasi dari oral biawak. Lajur M: DNA genom Rhodobacter sphaeroides yang dipotong dengan enzim restriksi AseI sebagai penanda molekuIer. Lajur 1: isolat 5-1, lajur 2: isolat 7-1, lajur 3: isolat 30-1, lajur 4: isolat 31-2, lajur 5: isolat 30-2, lajur 6: isolat 23-2, lajur 7: isolat 31-4, lajur 8: isolat 4-1, lajur 9: isolat 6-1. Kondisi pemisahan (running) DNA: 0.9% high melting point agarose (HMA), 0.5 x lamtan penyangga Tris-Borat EDTA (TEE), subu lamtan penyangga 14°C, waktu pulsa ramping/ramping pulse lime 2-40 detik, waktu pemisahan 20 jam, tegangan 5.4 volt (28-30 mAl. B. Diagram profil schizotyping SpeI isolat E. coli hasil interpretasi PFGE ............ ...
7
A.Hasii elektroforesis pemotongan p Var2.2 dengan enzim restriksi XhoI+HindIll(I); EcoRl(2); EcoRl+XhoI(3); EcoRl+HindIII(4); penanda molekuler I kb DNA ladder (M). B. Hasil pemotongan plasmid pVar30.2. Plasmid pVar30.2 utub (1 dan 3); pVar30.2 dipotong enzim restriksi EcoRl (2 dan 4); penanda lkb DNA ladder (M). C.Hasii pemotongan pAS901. Penanda molekuler I kb DNA ladder (M), plasmid rekombinan pAS901 dipotong dengan enzim restriksi EcoRl (1), HindIII(2), EcoRl+HindIII (3),XhoI (4), danXhoI+HindIII (5) ... ...... ... ... ... ... ... .....
8
Peta restriksi plasmid pAS90 1 dan P Var2.2 .......................... ......................................
9
3.
4.
DAFTAR TABEL Halaman 1.
Bakteri dan plasmid ...............................................; .............; ............................................. .
2
2.
Daftar spesimen biawak (Varanus) yang digunakan sebagai sampel .............................. .
3
3.
Hubungan antara isolat,spesies spesimen, daerah asal spesimen, pakan, dan karakter fisiologi .............................................................................. .
5
Pengamatan basil transformasi DNA genom secara langsung .......................................... .
6
4.
DAFTAR LAMPIRAN Halaman Tabel pengamatan morfologi koloni isolat E. coli pada media Cawan agar EMB ...................................................................................... .
12
2.
Tabel isolat Escherichia coli hasil seleksi antibiotika ampisilin (100 flglml) ............ .
13
3.
Tabel identifikasi isolat E. coli resisten ampisilin (l00 flglml) melalui uji fisiologis sederhana ............................................................................... .
13
Tabel hasil identifrkasi dengan menggunakan Microbact® 24E (l2E/12A+ 12B) .............................................................................. .
14
S.
Hasil pemotongan pAS90 1 dengan sejumlah enzim restriksi ............................... .
IS
6.
Hasil pemotongan pVar2.2 dengan sejumlah enzim restriksi ................................
IS
7.
Stnrktur kimia beberapa antibiotika keluarga penisilin, tanda panall menunjukkan situs aktivitas enzim ~-laktamase ............................................................. .
IS
Vektor kloning plasmid pAS900 ................................................................ .
16
1.
4.
8.
1
PENDAHULUAN Mikroorganisme, khususnya bakteri memiliki habitat alami yang sangat beragam. Bakteri dapat ditemukan mulai dari dasar laut sampai PWlCak gWlWlg. Beberapa di antaranya hidup pada organisme lain, baik sebagai patogen maupWl mikrobiota normal. Bahkan ada bakteri yang mampu hidup pada kondisi lingkungan yang ekstrem, misalnya pada temperatur atau kadar garam yang tinggi (Brock dan Madigan, 1991). Berkaitan dengan habitat alami tersebut, Auffenberg (1981) telah mengidentifikasi beberapa spesies bakteri yang hidup pada komodo (Varanus komodoensis), yaitu Proteus morganii, Proteus vulgaris, Providencia sp., dan Staphylococcus sp .. Setelah pemeliharaan komodo selama tujuh tahWl maka keempat spesies ini tidak dapat ditemukan, yang ada hanya Pseudomonas sp. Ketiadaan keempat spesies tersebut mWlgkin disebabkan oleh pakan dan lingkWlgan penangkaran yang berbeda dengan habitat aslinya. Oleh karena Varanus tidak memiliki kelenjar bisa (Zug, 1993) maka Auffenberg (1981) menduga bahwa keberadaan bakteri inilah yang menyebabkan teIjadinya infeksi yang dapat menimbulkan kematian pada luka gigitan komodo. Untuk mengetahui lebih jauh tentang mikroorganisme yang berasosiasi dengan biawak perlu dilakukan serangkaian penelitian tentang jenis dan karakteristik mikroorganisme yang hidup pada biawak. Habitat biawak merupakan habitat alam yang relatif jauh dari campur tangan manusia. Informasi tentang bakteri yang hidup di lingkWlgan alarniah, seperti yang ·hidup pada biawak sangat penting terutama yang berhubWlgan dengan sifat Menurut resistensi t"rhadap antibiotika. Desselberger (1998) data mengenai keberadaan gen penyandi resistensi antibiotika pada bakteri yang hidup di lingkWlgan alami masih langka. Sementara itu peningkatan isolat bakteri (termasuk E. coli ) sekarang ini mendapat perhatian yang cukup serius. Neu (1992) melaporkan bahwa 40%75% isolat E. coli yang diisolasi dari rumah sakit memiliki sifat resistensi terhadap berbagai antibiotika dari keluarga Penisilin. Desselberger (1998) juga melaporkan adanya peningkatan yang nyata dari mikrobe yang resistensi terhadap sejumlall bahan antimikrobe. Ampisilin merupakan antibiotik keluarga fllaktam yang menghambat pembentukan dinding sel bakteri. Penghambatan pembentukan dinding sel teIjadi pada saat bakteri memasuki fase log pertumbuharmya. Pada fase ini sel bakteri
membelah dengan laju yang konstan, massa sel menjadi dua kali lipat dengan laju yang sama, dengan aktivitas metabolisme yang konstan. Penambahan ampisilin setelah 20 menit pada kultur bakteri menyebabkan penonjolan pada bagian dinding sel bakteri. Penonjolan ini menyebabkan dinding sel menjadi rentan terhadap tekanan internal sebingga mudah rusakJpecah. Selain itu juga dinding sel dapat langsung mengalami kerusakanlpecah (Gale et al., 1981, dan Alcamo, 1997). Resistensi terhadap ampisilin antara lain disebabkan oleh fungsi katalitik enzim fllaktamase. Enzim ini diekspresikah oleh gen bla yang dapat memutus cincin fl-Iaktam pada ampisilin. Akibat putusnya atau rusalmya cincin fllaktam, ampisilin tidak dapat lagi menjadi penghambat sintesis dinding sel bakteri (Gale et al., 1981). Pada penelitian ini, keragaman bakteri dilillat melalui analisis keragaman genetik secara schizo typing atau Macrorestriction Fragment Length Polymorphisms (MFLP) dengan menggWlakan Pulsed Field Gel Electrophoresis (pFGE). Schizotyping merupakan analisis total DNA genom dengan cara melihat pola pita DNA yang telall dipotong oleh enzim restriksi yang memotong jarang (Suwanto dan Kaplan, 1992). PFGE merupakan teknologi pemisahan DNA berukuran besar. Teknik ini dapat memisahkan DNA berukuran lebih dati 50 kilo pasang basa (kb).
Suwanto (1994) menjelaskan ballwa semua molekul DNA linier utas ganda yang lebih besar dari ukuran tertentu (biasanya lebih dati 50 kb) akan bergerak dalam gel agarosa pada kecepatan yang sama. Batas kemampuan pemisahan ini akan tercapai bila jari-jari girase DNA dupleks linier tersebut melampaui ukuran pori-pori gel. Molekul DNA tersebut tidak dapat disaring melalui poripori gel berdasarkan ukurarmya tetapi hams bergerak dati ujung ke ujung. Cara pemindallan moleknl DNA seperti ini disebut reptasi. Untuk dapat keluar dari kondisi reptasi, molekul DNA hams mengubah orientasi pergerakannya. Pada PFGE moleknl-molekul DNA dipisahkan berdasarkan kemampuan orientasinya dalam medan listrik, semakin besar moleknl DNA semakin lama waktu orientasinya. Moleknl DNA yang berukuran besar akan terperangkap dalam kondisi reptasinya setiap kali arah medan listrik diubah dan tidak mampu melanjutkan perpindahannya di dalam gel sampai terjadi
2
Tabel I. Bakteri dan plasmid Bakteri, plasmid KarakteIistik yang reI evan Escherichia coli TOPIO F mcrA t> (mrr-hsdIFMS-mcrBC) 080lacZ MIS MacX74 recAI deaR araD139 t> (ara-Ieu) 7697 galU ga/K rpsL (SuR) e"dAr nupG Plasmid pAS900
pAS901 pVar2.2
Turunan dari
[email protected] (Invitrogen, Co.), Situs pengldonan ganda (multiple cloning sile) satu situs EcoRl, Km' (derivat Tn5), t>Ap' dengan delesi pada situs Xillal dan Scal Km'; 11,2 kb fragmen penyandi Ap' dari E. coli 2-2EcoRl yang diklon pada pAS900 - EcoRl, 5,8 kb plasmid endogenous E. coli 2-2 yang menyandikan Ap'
orientasi kembali sepanjang sumbu yang barn pada medan listrik tersebut. Seltingga jika waktu orientasi molekul DNA kurang dari periode waktu pergantian medan listrik (waktu pulsa/ramping pulse lime) maka DNA dapat dipisahkan berdasarkan ukurarmya (Cantor el al., 1988). Menurnt Poh el al. (1992), pencirian yang berdasarkan pada analisis genom dengan menggunakan PFGE memberikan hasil yang lebih diskriminatif dibandingkan dengan analisis ribotyping. Schizotyping telall digunakan untuk analisis keragaman galur-galur Brucella (Allardet el al., 1988); Lisleria (Howard el 01., 1992); Sirepiomyces ambo/aciens (Leblond el 01., 1990); Xanlhomonas campeslris pv glycines (Rukayadi, 1995); Pseudomonas aeruginosa (poh el 01,. 1992); Escherichia coli (Bergthorsson dan Oclunan, 1995), dan Laclococcus (Tanskanen, el 01., 1990; La Bourgeois el 01., 1989). T1uuan penelitian Ill! adalah unluk melakukan penapisan Escherichia coli yang resisten ampisilin yang diisolasi dari rongga mulut berbagai jenis biawak, menganalisis keragaman genetiknya dengan Pulsed Field Gel Eleclrophoresis (PFGE), dan mengisolasi gen penyandi resistensi terhadap ampisilin.
Sumber atau referensi Invitrogen, California
A. Snwanto (tidak dipublikasi) Penelitian ini Penelitian ini
Galur balded, plasmid dan spesimen asal sampel Galur bakteri dan plasmid yang digunakan di dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel I. Daftar spesimen asal sampel terdapat pada Tabel 2. Pengambilan Sampel Spesimen biawak berasal dari koleksi Fraak Yuwono, Jakarta. Contoh oral biawak diambil dengan menggunakan ujllng tusuk sate yang sudah dibalut kapas (steril), diusapkan di anlara gigi, lalu disuspensikan dalam 2 m1 0,85% lamlan garam fisiologis steril.
BAHAN DAN METODE Penelitian ini dilakukan mulai bulan J anuari 1998 sampai dengan November 1998, di LaboratorilUn Biologi Molekuler SEAMEO BIOTROP, Tajur-Bogor, dan Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia PAU Bioteknologi IPB Bogor.
Gambar I. Pengambilan sampel cairan dari rongga mulut biawak.
