ISOLASI DAN PENGKLONAN FRAGMEN cdna GEN PENYANDI MAJOR FACILITATOR SUPERFAMILY (MFS) DARI Melastoma affine L. WIDYARTINI

ISOLASI DAN PENGKLONAN FRAGMEN cDNA GEN PENYANDI MAJOR FACILITATOR SUPERFAMILY (MFS) DARI Melastoma affine L.

WIDYARTINI

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2007

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Isolasi dan Pengklonan Fragmen cDNA Gen Penyandi Major Facilitator Superfamily (MFS) dari Melastoma affine L. adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Januari 2007 Widyartini NRP. P055030071

ABSTRAK WIDYARTINI. Isolasi dan Pengklonan Fragmen cDNA Gen Penyandi Major Facilitator Superfamily (MFS) dari Melastoma affine L. Di bimbing oleh SUHARSONO DAN MUHAMMAD JUSUF. Beberapa sistem transpor pada membran terbukti berperan penting bagi sifat ketahanan terhadap senyawa toksik alami dan xenobiotik pada bakteri maupun eukariot. Salah satu sistem transpor adalah Major Facilitator Superfamily (MFS) yang memiliki kisaran substrat luas yang meliputi antibiotik, obat, polisakarida, gula, asam amino, logam berat dan molekul-molekul lainnya. MFS merupakan sistem transpor sekunder aktif berupa polipeptida tunggal dan berfungsi untuk mentranspor molekul-molekul atau solut berukuran kecil dengan menggunakan gradien ion kemiosmosis. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, mengklon dan melakukan karakterisasi gen penyandi MFS dari Melastoma affine L. yang diduga memiliki kontribusi dalam ketahanan terhadap cekaman asam dan aluminium. Penelitian dilakukan melalui beberapa tahap yaitu isolasi RNA total, sintesis cDNA total melalui transkripsi balik, isolasi fragmen cDNA Mfs dari M. affine dengan PCR, pengklonan fragmen cDNA Mfs M. Affine (MaMfs) ke dalam plasmid pGEM®–T Easy, transformasi genetik Escherichia coli DH5α dengan vektor rekombinan, analisis cDNA sisipan dan analisis urutan nukleotida MaMfs. Dalam penelitian ini kami berhasil mendapatkan fragmen cDNA Mfs M. affine berukuran 511 pb yang menyandikan 168 asam amino. Analisis situs enzim restriksi pada fragmen MaMfs menunjukkan bahwa fragmen MaMfs mempunyai beberapa situs restriksi tetapi tidak mempunyai situs restriksi EcoR1. Analisis kesejajaran lokal berdasarkan urutan nukleotida menggunakan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) menunjukkan bahwa fragmen MaMfs mempunyai kesamaan 74% dengan bagian coding sequence (cds) Arabidopsis thaliana (AY056374), 73% dengan klon mth2-61c11 Medicago truncantula (AC148655) pada bagian cds 29835-35720 yang menyandi Major Facilitator Superfamily (MFS_1) dan 71% dengan bagian mRNA (complete cds) yang menyandi tetracycline resistance efflux protein like protein (MFS_1) dari A. thaliana (AK230262). Analisis kesejajaran berdasarkan urutan asam amino yang dideduksi dari cDNA Mfs menunjukkan bahwa fragmen MaMFS mempunyai kesamaan 80% dengan bagian MFS_1 dari M. truncantula (Q1S1V4), 77% dengan bagian hypotetical protein A. thaliana (O82747), 73% dengan OsMFS_1 dari padi (Q7XTZ1), 73% dengan bagian MFS_1 M. truncantula (Q2HV19), 73% dengan bagian tetracycline resistance efflux protein like protein (MFS_1) A. thaliana (Q9LQ03), 30% dengan bagian putative MFS multidrug efflux pump (MFS_1) dari bakteri Yersinia pseudotuberculosis (Q66DU6) dan 30% dengan bagian multidrug efflux transporter (MFS_1) dari bakteri Wollinela succinogenes (Q1Q9B7). Hasil analisis kesejajaran asam amino fragmen MaMFS yang terdiri dari 168 asam amino dengan MtMFS menunjukkan bahwa fragmen MaMFS sejajar dengan MtMFS pada asam amino ke-209 sampai asam amino ke-375. Fragmen MaMFS memiliki 4 domain putatif transmembran yaitu TM6, TM7, TM8 dan TM9 dimana domain TM6 dan TM7 menentukan fungsi protein dan domain TM8 dan TM9 menentukan spesifisitas substrat.

ABSTRACT WIDYARTINI. Isolation and Cloning of cDNA Fragment of Gene Encoding for Major Facilitator Superfamily (MFS) from Melastoma affine L. Under the direction of SUHARSONO and MUHAMMAD JUSUF. Many membrane transport systems have been demonstrated to play an important role in both bacteria and eucaryotes by confering resistance to a wide range of natural toxic compounds and xenobiotic. One of them is Major Facilitator Superfamily transporters (MFS) that have a broad substrate range including unrelated chemicals such as sugars, inorganic ions, heavy metals, peptides, amino acids, oligopeptides, polysaccharides, proteins and drugs. MFS transporters are single-polypeptide secondary carriers active capable of transporting small solutes in response to chemiosmotic ion gradien. The objective of this experiment is to isolate, clone and characterize the gene encoding MFS from Melastoma affine L. This protein is supposed to have contribution in Al and acid stress resistance in M. affine. M. affine grows well in acid soil with high level of soluble aluminum. We started our study by total RNA isolation. Total cDNA had been generated from the total RNA as template by reverse transcription. By PCR technique, the cDNA fragment of MFS from M. affine (MaMfs) had been succesfully isolated by using total RNA as template and specific primer of Mfs that designed from ZmMfs from Zea mays and Mfs from Medicago truncantula. The MaMfs fragment was inserted into pGEM®–T Easy plasmid, then the recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli DH5α. Sequencing of the fragment MaMfs by using ABI Prism 310 automated DNA sequencer showed that the MaMfs fragment is about 511 bp in size that encoding 168 amino acids. Enzym restriction sites analysis of the MaMfs fragment showed that the fragment MaMfs contains some restriction sites but it does not contain EcoR1 restriction site. Nucleotide allignment analysis using BLASTn program showed that MaMfs fragment is 74% identical to complete coding sequence (cds) Arabidopsis thaliana (AY056374), 73% to part of MtMfs from Medicago truncantula (AC148655) and 71% to part of tetracycline resistance efflux protein like protein (MFS_1) from A. thaliana (AK230262). Amino acids allignment analysis using BLASTp program shows that MaMFS fragment is 80% identical to MFS_1 from M. truncantula (Q1S1V4), 77% to hypotetical protein A. thaliana (O82747), 73% to OsMFS_1 from rice (Q7XTZ1), 73% to tetracycline resistance efflux protein like protein (MFS_1) A. thaliana (Q9LQ03), 30% to putative MFS multidrug efflux pump (MFS_1) from Yersinia pseudotuberculosis bactery (Q66DU6) and 30% to multidrug efflux transporer (MFS_1) from Wollinela succinogenes bactery (Q1Q9B7). Allignment with MtMFS showed that the fragment MaMFS has four transmembrane-domain: TM6,TM7,TM8 and TM9. TM6 and TM7 domains are necessary for protein function and TM8 and TM9 domains are participate in substrate determination.

ISOLASI DAN PENGKLONAN FRAGMEN cDNA GEN PENYANDI MAJOR FACILITATOR SUPERFAMILY (MFS) DARI Melastoma affine L.

WIDYARTINI

Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2007

Judul Tesis

:

Isolasi dan Pengklonan Fragmen cDNA Gen Penyandi Major Facilitator Superfamily (MFS) dari Melastoma affine L.

Nama

:

Widyartini

NRP

:

P055030071

Disetujui Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Suharsono, DEA

Dr. Ir. Muhammad Jusuf

Ketua

Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Bioteknologi

Dr. Ir. Muhammad Jusuf

Tanggal Lulus:

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS

KATA PENGANTAR Bismillaahirrahmaanirrahiim Segala puji saya panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah yang berjudul ” Isolasi dan Pengklonan Fragmen cDNA Gen Penyandi Major Facilitator Superfamily (MFS) dari Melastoma affine L” dapat diselesaikan. Penelitian ini dibiayai oleh Proyek Hibah Penelitian Tim Pascasarjana Angkatan III dengan judul ”Isolasi dan karakterisasi gen-gen yang berhubungan dengan toleransi tanaman terhadap pH rendah dan aluminium tinggi atas nama Dr. Suharsono sebagai peneliti utama. Selama proses penulisan karya ilmiah ini penulis mendapat bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak baik secara langsung maupun tidak langsung. Untuk itu penulis bermaksud menyampaikan rasa terima kasih kepada : 1. Bapak Dr. Ir. Suharsono, DEA selaku Komisi Pembimbing atas bimbingan dan arahannya. 2. Bapak Dr. M. Jusuf selaku Komisi Pembimbing atas bimbingan dan arahannya 3. Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti Suharsono atas bimbingan dan arahannya. 4. Ibu Dr. Ir. Trikoesoemaningtyas yang telah memberi masukan yang sangat berarti dalam perbaikan tulisan ini 5. Papa, mama, adik-adik serta seluruh keluarga atas semua do’a, pengorbanan dan kasih sayangnya. 6. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB yang telah menyediakan sarana dan prasarana untuk penelitian 7. Terakhir dan tak terlupakan terima kasih kepada Eve, Firdaus, Agt, Zendi, Pak Mul, Mbak Pepy, Huda, Bahrelvi, Didi, Pak dan Bu Elfian, Pak Muzuni, Bu Sri Lis, Budi Hebat, Poppi, Ammay serta semua pihak yang telah banyak membantu dan tidak dapat disebutkan satu per satu. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi kita semua. Bogor, Januari 2007 Widyartini

ii

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Palembang pada tanggal 6 Juni 1979 dari ayah I. Made Sudania, SH dan ibu Patmini A Ma Pd.

Penulis merupakan putri

pertama dari empat bersaudara. Pendidikan sarjana ditempuh di Program Studi Pemuliaan Tanaman, Jurusan Budi Daya Pertanian, Fakultas Pertanian IPB, lulus pada tahun 2001. Pada tahun 2003, penulis diterima di Program Studi Bioteknologi pada Program Pascasarjana IPB. Penulis pernah bekerja di Perkebunan Kelapa Sawit Cipta Futura pada tahun 2002 dan ditempatkan di Desa Muara Enim, Sumatera Selatan.

iii

DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL............................................................................................. iv DAFTAR GAMBAR ........................................................................................

v

DAFTAR LAMPIRAN..................................................................................... vii PENDAHULUAN Latar Belakang.......................................................................................... Tujuan Penelitian ...................................................................................... Hipotesis ...................................................................................................

1 4 4

TINJAUAN PUSTAKA Toksisitas dan Toleransi Aluminium pada Tanaman.............................. 5 Toksisitas Al ................................................................................... 5 Toleransi Al..................................................................................... 6 Major Facilitator Superfamily (MFS)..................................................... 9 Karakteristik Melastoma dan Toleransinya terhadap Aluminium .......... 13 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ................................................................. Bahan ..................................................................................................... Metode Penelitian ................................................................................... Isolasi RNA total............................................................................. Sintesis cDNA total melalui transkripsi balik................................. Isolasi Fragmen cDNA MaMfs melalui PCR ................................ Pengklonan cDNA ke dalam vektor pGEM®-T Easy ..................... Transformasi genetik bakteri E. coli DH5α dengan vektor rekombinan...................................................................................... Analisis cDNA sisipan .................................................................... Analisis urutan nukleotida MaMfs ..................................................

19 21 22

HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi RNA Total ................................................................................... Sintesis cDNA Total ............................................................................... Isolasi Fragmen cDNA MaMfs Melalui PCR ......................................... Pengklonan Fragmen MaMfs ke dalam Plasmid pGEM®-T Easy .......... Analisis Fragmen MaMfs ........................................................................ Analisis Domain Fragmen MaMFS ........................................................ Analisis Hidrofobisitas Fragmen MaMFS ..............................................

23 24 25 26 28 36 40

15 15 16 17 18 19 19

SIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan ............................................................................................. 42 Saran........................................................................................................ 42 DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................... 42 LAMPIRAN

iv

DAFTAR TABEL Halaman 1.

Rendemen Isolasi RNA Total ................................................................. 23

2.

Matriks kesamaan urutan nukleotida fragmen MaMfs dan Mfs dari organisme lainnya ................................................................................... 32

3.

Matriks kesamaan asam amino fragmen MaMFS dan MFS dari organisme lainnya ................................................................................... 34

4.

Analisis domain transmembran menggunakan program Tmpred versi 2.0 ..................................................................................... 37

5.

Kemiripan TM6, TM7, TM8 dan TM9 MaMFS dengan MtMFS, AtMFS dan OsMFS ................................................................................ 38

v

DAFTAR GAMBAR Halaman 1.

Topologi MFS transporter dengan 12 dan 14 domain transmembran .... 10

2.

MFS multidrug efflux transporter menggunakan gradien elektrokimia transmembran dari proton atau ion sodium untuk mensekresi senyawa toksik dan xenobiotik dari dalam sel....................................................... 11

3.

Melastoma affine L. ................................................................................ 13

4.

Vektor pengklonan pGEM® –T Easy...................................................... 15

5.

Tahapan isolasi dan pengklonan fragmen cDNA Mfs dari Melastoma affine L .................................................................................................... 16

6.

RNA total yang terdapat pada ketiga sampel yaitu akar (1), daun tua(2) dan daun pucuk (3) ....................................................................... 24

7.

Pita cDNA ekson1- ekson2 dari aktin yang dihasilkan dari PCR aktin menggunakan cetakan cDNA dari sampel daun (1), daun pucuk (2) dan akar (3) ............................................................................................. 24

8.

Pita fragmen cDNA MaMFS hasil amplifikasi dengan teknik PCR menggunakan cetakan cDNA sampel daun (1) dan sampel akar (2) ...... 25

9.

Seleksi biru putih koloni E. coli DH5α hasil transformasi dengan vektor pGEMT Easy pada media seleksi yang mengandung X-gal, IPTG dan antibiotik ampisilin................................................................. 26

10.

Hasil PCR terhadap koloni E. coli DH5α (koloni putih) sebagai cetakan .................................................................................................... 27

11.

Plasmid pGEMT Easy rekombinan utuh (1) dan hasil pemotongan plasmid dengan enzim restriksi EcoR1 ................................................... 27

12.

Urutan nukleotida fragmen cDNA MaMfs dan deduksi asam aminonya ................................................................................................. 28

13.

Situs pemotongan enzim restriksi endonuklease pada fragmen MaMfs menggunakan program NEB Cutter........................................................ 29

14.

Filogenetik berdasarkan urutan nukleotida fragmen MaMfs dengan Mfs dari organisme lainnya (angka menunjukkan jarak) ........................ 33

15.

Filogenetik berdasarkan asam amino fragmen MaMFS dengan MFS dari organisme lainnya (angka menunjukkan jarak) ............................... 35

16.

Posisi fragmen MFS Melastoma (MaMFS) pada MFS Medicago (MtMFS) berdasarkan hasil analisis kesejajaran asam amino ................ 36

17.

Analisis kesejajaran transmembran TM6, TM7, TM8 dan TM9 MaMFS dengan MtMFS, AtMFS dan OsMFS....................................... 38

18.

Motif domain fragmen MaMFS .............................................................. 40

vi 19.

Profil hidrofobisitas MFS M. truncantula............................................... 41

20.

Profil hirofobisitas fragmen MaMFS dan fragmen MFS M. truncantula......................................................................................... 41

vii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman 1. Daftar asam amino dan polaritas...............................................................

49

2. Hasil sekuensing DNA sisipan (fragmen MaMfs) pada pGEM®-T Easy menggunakan primer sp6 ..........................................................................

50

3. Hasil analisis penyejajaran urutan nukleotida fragmen MaMfs dengan gen pada data GenBank menggunakan program Blast.............................

51

4. Hasil analisis kesejajaran lokal berdasarkan urutan nukleotida antara MaMfs dengan MtMfs ...............................................................................

57

5. Hasil analisis penyejajaran urutan asam amino fragmen MaMFS dengan data GenBank menggunakan program Blast ................................

58

6. Hasil analisis kesejajaran lokal berdasarkan urutan asam amino antara MaMFS dengan MtMFS ...........................................................................

64

PENDAHULUAN

Latar Belakang Salah satu usaha untuk meningkatkan produksi pertanian secara nasional adalah melalui ekstensifikasi penanaman pada lahan marjinal yang belum dimanfaatkan secara optimal di luar pulau Jawa. Salah satu lahan marjinal adalah tanah podzolik merah kuning. Jenis tanah ini mendominasi lahan kering yang ada di Sumatera, Kalimantan dan Irian Jaya dengan penyebarannya yaitu 10.04 juta ha di Kalimantan Timur, 7.62 juta ha di Irian Jaya, 5.71 juta ha di Kalimantan Barat, 4.81 juta ha di Kalimantan Tengah dan 2.27 juta ha di Riau (Puslitbang Tanah 1999). Permasalahan yang biasa ditemukan pada tanah podzolik merah kuning adalah tingginya tingkat keasaman, pencucian hara (leaching), defisiensi unsur hara Ca, Mg, K, P, N dan kelarutan aluminium tinggi yang dapat menyebabkan keracunan bagi tanaman serta mudah mengalami erosi. Keracunan aluminium merupakan faktor utama yang membatasi produktivitas tanaman pada tanah asam dan meliputi 40% lahan pertanaman di dunia (Kochian 1995). Usaha untuk mengatasi permasalahan keracunan aluminium tersebut salah satunya adalah melalui perbaikan genetik tanaman. Untuk itu perlu dilakukan isolasi gen-gen yang berperan dalam toleransi terhadap aluminium terutama dari tanaman indikator tanah asam yang diharapkan akan lebih efektif dan menambah sumberdaya genetik bagi sifat ketahanan ini. Melastoma affine merupakan tanaman gulma yang tumbuh di daerah hutan hujan tropis. Melastoma affine dapat tumbuh pada tanah asam dengan tingkat kelarutan Al yang tinggi. Tumbuhan ini merupakan indikator tanah asam yang dominan dan dapat mengakumulasi Al pada daunnya. Hasil penelitian Watanabe et al. (2001) menunjukkan bahwa salah satu spesies dari Melastomaceae yaitu Melastoma malabathricum L. mampu mengakumulasi Al lebih dari 10000 mg kg-1 di dalam daun-daun tua dan lebih dari 7000 mg kg-1 di dalam daun-daun muda dengan tidak menunjukkan keracunan Al. Oleh sebab itu, tumbuhan ini

2 memiliki mekanisme detoksifikasi Al secara internal dan dapat menjadi sumber gen ketahanan terhadap cekaman asam dan Al tinggi. Pada tanah dengan keasaman yang sangat tinggi, Al3+ dapat melewati membran plasma baik melalui transpor protein yang secara normal berfungsi dalam adsorpsi ion-ion mineral lainnya ataupun melalui fase-fluida dan adsorpsi endositosis. Berdasarkan beberapa penelitian sebelumnya, Al3+ menghentikan kanal ion yang terdapat pada membran plasma sel akar. Sebagai contoh adalah Al3+ yang mengikat 107 kali lebih kuat ATP daripada Mg2+. Jumlah Al3+ kurang dari nanomolar sekalipun dapat menghambat Mg2+ pada situs P (Martin 1988). Berdasarkan bukti-bukti di atas, mekanisme transpor Al3+ tidak hanya terjadi secara aktif melalui transporter primer aktif (primary active transporters) tetapi juga melalui transporter sekunder aktif (secondary active transporter). Kemungkinan bahwa tanaman akumulator Al memiliki mekanisme detoksifikasi Al secara internal. Walaupun banyak bukti yang menunjukkan keterkaitan asam organik dalam mekanisme detoksifikasi Al secara internal dan eksternal pada tanaman, ada beberapa spesies

yang menunjukkan mekanisme yang tidak berkaitan

dengan asam organik. Kultivar gandum yang sangat toleran Al (Atlas) mempunyai mekanisme pelepasan fosfat sebagai mekanisme detoksifikasi Alnya (Pellet et al. 1996). Tanaman rumput-rumputan menghasilkan asam amino non-protein yang disebut phytosiderophore yang mampu mendetoksifikasi Al secara internal dengan cara mengkelat. Phytosiderophore dapat mengkelat Fe3+, komplek divalen, kation polyvalen dan Al3+ dengan sangat efektif sehingga tidak bersifat toksik lagi bagi tanaman saat terserap ke dalam sitoplasma (Kochian 1995). Bakteri juga mempunyai siderophore yang berfungsi dalam transpor Fe3+ yaitu enterobactin dan major facilitator superfamily (MFS) merupakan transporter enterobactin pada yeast (Heymann et al. 2000) Simmons et al. (2003) mengindikasikan bahwa MFS multidrug efflux transporter pada jagung berperan dalam resistensi terhadap patogen, eksport dan re-uptake K+, integritas membran dan viabilitas sel. Kultivar toleran Al mampu meningkatkan

aktifitas

H+-ATPase

membran

plasma

yang

mengatur

keseimbangan ion proton antara di dalam dan di luar membran plasma sel,

3 sehingga terjadi depolarisasi di membran plasma dan secara berantai mempengaruhi aktifitas metabolisme turunannya seperti aktifitas K-channel dan Ca-transporter yang masing-masing berperan dalam proses detoksifikasi Al (Kasai et al. 1993; Kinraide et al.1994; Sasaki et al. 1995; Kasai et al. 1995; Huang et al. 1996; Larsen et al. 1998; Delhaize, 2004). Fluconazole resistance 1 (FLR1) yang menyandi MFS transporter pada fungi Candida albicans terlibat di dalam induksi CAP1 dan YAP1 yang berperan dalam resistensi C. albicans dan S. cerevisiae terhadap senyawa toksik seperti cycloheximide (CYH), 4-nitroquinoline N-oxide (4-NQO), kadmium dan hidrogen peroksida sehingga hal ini mengindikasikan bahwa FLR1 merupakan regulator transkripsi CAP1 dan YAP1 (Alarco et al. 1997). Oksida radikal (ROS, reactive oxigen species) merupakan salah satu mekanisme yang muncul pertama kali pada tanaman untuk mengatasi cekaman oksidatif khususnya untuk reoksigenasi. Hidrogen peroksida (H2O2) dan superoksida (O2-) merupakan contoh yang dihasilkan di sejumlah reaksi selular karena adanya cekaman oksidatif. Reaktifitas Al juga dapat menyebabkan terbentuknya oksida radikal (ROS, reactive oxigen species) yang beracun bagi sel. Major Facilitator Superfamily merupakan transporter dengan kisaran substrat yang luas sehingga memiliki spesifisitas fungsi yang luas (Van Bambeke et al. 2000). Substrat MFS meliputi antibiotik, obat anti kanker dan anti HIV, molekul amphiphilik hingga gula, asam amino, ion logam dan molekul-molekul lainnya (Pao et al. 1998). Penelitian MFS pada organisme tingkat tinggi khususnya pada tanaman masih sangat sedikit sehingga baru sebagian kecil MFS yang ditemukan. Sebagian besar MFS telah ditemukan pada mikroorganisme dan telah diketahui fungsinya. Beberapa fungsi MFS yang sudah diketahui yaitu sebagai sistem transpor gula (Henderson et al. 1990), sistem transpor senyawa toksin, obat (drug efflux) dan senyawa metabolit pada siklus Krebs (Griffith et al. 1992; Paulsen et al. 1997), sistem transpor fosfat yaitu sebagai phosphate exchanger dan oligo sakarida (H+ simport permease) (Marger et al. 1993) serta sebagai permease asam aromatik pada bakteri (Goffeau at al. 1997). Berdasarkan peran MFS dalam berbagai mekanisme resistensi dan luasnya kisaran substrat yang dikenalinya serta masih sedikit penelitian yang

4 dilakukan pada MFS tanaman, maka peran MFS dalam resistensi berbagai senyawa toksik khususnya resistensi yang terkait dengan cekaman pH rendah dan aluminium pada tanaman Melastoma sangat penting untuk diteliti.

Tujuan Penelitian Tujuan penelitian yaitu isolasi dan pengklonan fragmen cDNA gen penyandi Major Facilitator Superfamily dari Melastoma affine L. (MaMFS) melalui teknik PCR.

Hipotesis Fragmen cDNA gen penyandi MaMFS dapat diisolasi dengan teknik PCR menggunakan primer spesifik MFSF dan MFSR yang didesain dari spesies lain.

TINJAUAN PUSTAKA

Toksisitas dan Toleransi Aluminium pada Tanaman Toksisitas Al. Aluminium bukan unsur esensial bagi pertumbuhan tanaman. Pada saat kelarutan aluminium meningkat seiring dengan turunnya pH hingga di bawah 5, unsur ini penting untuk diperhatikan karena menjadi toksik bagi tanaman. Bentuk-bentuk aluminium di dalam tanah dapat berupa ion trivalen yaitu Al(H2O)63+ atau disebut Al3+, bentuk hidroksida seperti Al(OH)+2, Al(OH)2+, Al(OH)3, Al(OH)4- atau berasosiasi dengan berbagai senyawa organik dan anorganik seperti PO4-3, SO4-2,F-, asam-asam organik, protein dan lipid (Delhaize dan Ryan 1995). Al3+ merupakan bentuk yang paling toksik dan mendominasi di lahan asam dengan pH di bawah 4.5 (Matsumoto 2000). Tanah asam terjadi karena adanya pencucian kation-kation basa dari tanah yang dipicu oleh praktek-praktek pertanian dan adanya hujan asam (Kennedy 1992). Untuk melihat pengaruh fitotoksik Al sebaiknya digunakan Al dalam bentuk Al3+, pH media 4 dan kekuatan ioniknya rendah (Kinraide 1991) Aluminium terlarut bereaksi dengan dinding dan membran sel akar serta membatasi perluasan dinding sel sehingga menghentikan pemanjangan akar. Terhentinya pemanjangan akar merupakan ciri utama dari toksisitas aluminium. Jaringan akar merupakan bagian pertama dari tanaman yang mengalami keracunan aluminium, terutama di ujung akar sehingga mengalami pemendekan dan menebal. Akar menjadi berwarna kecoklatan terutama pada akar utama serta terjadi pertumbuhan akar lateral yang gemuk dan pendek dengan percabangan yang tidak bagus (Sasaki et al. 1994; Ryan et al. 1995). Selain itu Al3+ juga dapat masuk ke sel melalui simplas setelah merusak membran sel akar dan terkadang bereaksi dengan senyawa fosfor sehingga mengganggu metabolisme fosfor pada tanaman. Akumulasi Al dalam sitoplasma memberi asumsi bahwa toksisitas terjadi karena terbentuknya kompleks Al – ligan (Ryan et al. 1995). Toksisitas aluminium melalui simplas disebabkan karena Al

6 mengikat sangat kuat senyawa donor O2 seperti Pi, nukleotida RNA, DNA, protein, asam

karboksilat,

fosfolipid,

asam

poligalakturonik,

heteropolisakarida,

lipopolisakarida, flavanoid, antosianin dan lain-lain (Haug 1984; Martin 1986). Konsentrasi Al yang kecil saja dalam simplas

berpotensi menjadi fitotoksik.

Sebagai contoh yaitu Al3+ mengikat 107 kali lebih kuat ATP daripada Mg2+. Jumlah Al3+ pada tingkat nanomolar sekalipun dapat menghambat Mg2+ pada situs P (Martin 1988). Aluminium juga diduga menghambat proses pembelahan sel dan menghalangi metabolisme asam nukleat (yaitu menghalangi reproduksi bahan genetik) pada tanaman (Helyar 1998). Menurut Matsumoto (1991) Al yang berada dalam bentuk polimer (Al3+) memiliki muatan positif yang besar serta memiliki banyak situs pengikatan. Polimer ini dapat mengikat fosfat pada kedua utas DNA sehingga mengakibatkan gagalnya pemisahan DNA utas ganda saat proses replikasi. Toleransi Al. Pada prinsipnya ada dua mekanisme toleransi tanaman terhadap cekaman Al menurut Taylor (1991), yaitu : pertama mekanisme eksternal yakni dengan mencegah Al masuk ke dalam simplas dan mencapai daerah metabolik yang dengan

imobilisasi,

kompartementasi atau detoksifikasi saat Al masuk ke dalam simplas.

Mekanisme

peka;

dan

yang

kedua

mekanisme

internal

yakni

toleransi Al pada tanaman bervariasi baik antar maupun intra spesies.

Faktor

genetik berperan penting dalam menentukan toleransi tersebut. Toleransi Al pada gandum (Triticum aestivum) dikendalikan oleh sejumlah kecil gen dominan mayor dan gen-gen ini telah dimanfaatkan dalam program pemuliaan untuk membuat kultivar yang toleransi terhadap cekaman Al (Johnson et al. 1997). Percobaan tentang mekanisme toleransi Al yang dilakukan oleh beberapa peneliti mengindikasikan beberapa hal yaitu : (a) Perbedaan akumulasi Al di dalam jaringan akar berhubungan dengan perbedaan sensitivitas tanaman terhadap Al. Tice et al. (1992), Ryan et al. (2001) dan Ma et al. (2001) membuktikan bahwa tanaman gandum yang toleran terhadap Al mengakumulasi Al lebih sedikit dalam sitoplasma dibanding tanaman yang sensitif.

7 (b) Peningkatan akumulasi ion nitrat yang lebih tinggi dibandingkan kation amonium dan induksi pH rizosfir lebih tinggi mendekati pH optimal untuk pertumbuhan tanaman berhubungan dengan sifat tanaman yang lebih toleran terhadap cekaman Al (Miyasaka et al. 1991) (c) Kultivar toleran mencirikan suatu mekanisme menghilangkan aluminium dari daerah sekitar akar yang disebabkan pengeluaran senyawa-senyawa asam dikarboksilat atau pengeluaran asam organik seperti malat, oksalat, sitrat dan fulfat propanoat seperti kaffeat untuk mengkelat Al sehingga toksisitasnya menjadi rendah (Ojima et al. 1984; Ryan et al. 1995; Sopandie et al. 1996; de la Funte et al. 1997; Ma et al. 1998; Zheng 1998; Matsumoto 2000). Beberapa genotipe tanaman bersifat toleran terhadap cekaman Al karena mereka melepaskan asam organik dari ujung akar. Beberapa asam organik memiliki kemampuan untuk mengubah kompleks Al3+ menjadi bentuk yang tidak bersifat toksik bagi tanaman, seperti pengkelatan Al sehingga akar terlindung dari toksisitas Al (Hue et al. 1986) (d) Kultivar toleran mampu meningkatkan aktifitas H+-ATPase membran plasma yang mengatur keseimbangan ion proton antara di dalam dan luar membran plasma sel sehingga terjadi depolarisasi di membran plasma dan secara berantai mempengaruhi aktifitas metabolisme turunannya seperti aktifitas K-channel dan Ca-transporter yang masing-masing berperan dalam proses detoksifikasi Al (Kasai et al.1993; Kinraide et al. 1994; Sasaki et al. 1995; Kasai et al. 1995; Huang et al. 1996; Larsen et al. 1998; Delhaize 2004) Ada tiga jenis asam organik yang sering ditemukan dalam tanaman yang toleran terhadap cekaman Al yaitu asam sitrat, asam oksalat dan asam malat. Sebagai contoh respon tanaman terhadap cekaman Al yaitu gandum mengeluarkan malat; snapbeans, jagung, Cassia toru dan kedelai melepas sitrat; buckwheat (Fagopyrum esculentum) mengeluarkan oksalat dan Triticale, rapeseed, lobak, oats dan rye mengeluarkan malat dan sitrat. Mekanisme toleransi terhadap cekaman Al dengan menggunakan asam organik ini dibagi ke dalam dua bentuk yaitu

8 detoksifikasi eksternal dan internal bahkan beberapa spesies tanaman menggunakan kedua bentuk mekanisme tersebut. Beberapa tanaman dapat mengakumulasi Al pada daun dan akarnya tanpa menunjukkan gejala keracunan. Spesies tanaman toleran Al ini mempunyai mekanisme untuk mengubah Al dalam bentuk non toksik di dalam tanaman yaitu mekanisme yang membiarkan Al masuk ke dalam tanaman dan melewati membran kemudian baru mengubahnya menjadi bentuk non toksik. Teh dan hydrangea telah dikenal sebagai akumulator Al. Daun teh tua dapat mengakumulasi Al hingga 30000 mg kg-1 pada berat kering dan akumulasi Al di daun hydrangea mencapai di atas 3000 mg

kg-1 (Ma et al. 1997). Beberapa tanaman seperti Melastoma

malabathricum dan Vaccinium macrocarpon yang beradaptasi baik pada pH rendah mengakumulasi Al dalam level yang tinggi baik di daun maupun di akar (Osaki et al. 1997). Pada tanah dengan keasaman yang sangat tinggi, Al3+ dapat melewati membran plasma baik melalui transpor protein yang secara normal berfungsi dalam adsorpsi ion-ion mineral lainnya ataupun melalui fase-fluida dan adsorpsi endositosis. Berdasarkan beberapa penelitian sebelumnya, Al3+menghentikan kanal ion yang terdapat pada membran plasma sel akar. Berdasarkan bukti-bukti di atas, mekanisme transpor Al3+ tidak hanya terjadi secara aktif melalui transporter aktif primer (primary active transporters) tetapi juga melalui transporter aktif sekunder (secondary active transporter) serta menunjukkan kemungkinan bahwa tanaman akumulator Al memiliki mekanisme detoksifikasi Al secara internal. Walaupun banyak bukti yang menunjukkan keterkaitan asam organik dalam mekanisme toleransi Al pada tanaman, ada beberapa spesies yang menunjukkan mekanisme yang tidak berkaitan dengan asam organik. Bachiaria decumbans, salah satu jenis yang sangat toleran terhadap cekaman Al, tidak mengeluarkan asam organik dalam merespon Al sehingga diyakini bahwa spesies ini pasti memiliki mekanisme yang berbeda dalam menghadapi Al pada larutan tanah (Wenzl et al. 2001). Arabidopsis mutan (alr1) meningkatkan pH yang diinduksi oleh Al dengan segera disekitar ujung akar yang dapat menurunkan aktivitas Al3+ (Dengenhardt et

9 al. 1998). Kultivar gandum yang sangat toleran Al (Atlas) mempunyai mekanisme pelepasan fosfat sebagai mekanisme toleransi Al (Pellet et al. 1996). Berbeda dengan pelepasan malat, pelepasan fosfat bersifat konstitutif tanpa dipengaruhi adanya

induksi

Al

untuk

mengaktifkannya.

Tanaman

rumput-rumputan

menghasilkan asam amino non protein yang disebut phytosiderophore yang mampu mengkelat Fe3+, komplek divalen, kation polyvalen dan Al3+ dengan sangat efektif sehingga tidak bersifat toksik lagi bagi tanaman saat terserap ke dalam sitoplasma (Kochian 1995). Pada bakteri ditemukan juga siderophore yang berfungsi dalam transpor Fe3+ yaitu enterobactin dan major facilitator superfamily (MFS) merupakan transporter enterobactin pada yeast (Heymann et al. 2000). Penemuan-penemuan ini semakin menguatkan adanya mekanisme peningkatan toleransi Al selain dari mekanisme pelepasan asam organik.

Major Facilitator Superfamily (MFS) Major Facilitator Superfamily merupakan sistem transpor sekunder aktif berupa polipeptida tunggal dan berfungsi untuk mentranspor molekul-molekul atau solut berukuran kecil dengan menggunakan gradien ion kemiosmosis. MFS termasuk dalam kelompok pompa effluks (efflux pump) yaitu protein transporter yang berada pada membran sitoplasma sel dan bertanggung jawab dalam pengeluaran senyawa toksik dan antibiotik ke luar sel. MFS diketahui berperan dalam resistensi terhadap senyawa toksik alami dan senyawa xenobiotik lainnya (Hayashi et al. 2002). Anggota MFS bisa merupakan simporter, uniporter atau antiporter dan spesifisitasnya bisa luas maupun sempit, mulai dari antibiotik, molekul amphiphilik hingga gula, asam amino, ion logam dan molekul-molekul lainnya (Pao et al. 1998). MFS dicirikan dengan topologi protein yang mempunyai 12 domain transmembran (TM) meskipun beberapa MFS ditemukan memiliki 14 TM seperti yang disajikan pada Gambar 1 (Marger et al. 1993; Van Bambeke et al. 2000). Rubin et al. (1990) membuktikan bahwa MFS muncul akibat duplikasi

10 berulang intragenik 6 unit TM primordial sehingga dihasilkan 12 unit TM dalam bentuk polipeptida tunggal.

Gambar 1. Topologi MFS transporter dengan 12 dan 14 domain transmembran

Penelitian MFS pada organisme tingkat tinggi dan tanaman masih sedikit sehingga baru sebagian kecil MFS yang ditemukan. Sebagian besar MFS telah ditemukan pada mikroorganisme (organisme tingkat rendah) dan telah diketahui fungsinya. Beberapa fungsi MFS yang sudah diketahui adalah sebagai sistem transpor gula (Henderson et al. 1990), sistem transpor senyawa toksin, obat (drug efflux) dan senyawa metabolit pada siklus Kreb (Grifith et al. 1992; Paulsen et al. 1997), sistem transpor fosfat yaitu sebagai phosphate exchanger dan oligo sakarida (H+ simport permease) (Marger et al. 1993) serta sebagai permease asam aromatik pada bakteri (Goffeau at al. 1997). Pao et al. (1998) telah mengelompokkan MFS ke dalam 17 famili yaitu: (1) sugar porter family, (2) drug: H+ antiporter (14-spanner) (DHA14) drug efflux family, (3) drug: H+ antiporter (12-spanner) (DHA12) drug efflux family, (4) organophosphate:

inorganic

phosphate

antiporter

(OPA)

family,

(5)

+

oligosaccharide: H symporter (MHS) family, (7) fructose-galactose-glucose: H+ symporter (FGHS) family, (8) nitrate-nitrite porter (NNP) family, (9) phosphate: H+ symporter (PHS) family, (10) nucleoside: H+ symporter (NHS) family, (11) oxalate: formate antiporte (OFA) family, (12) sialate: H+ symporter (SHS) family, (13) monocarboxylate porter (MCP) family, (14) anion: cation symporter (ACS) family,

11 (15) aromatic acid: H+ symporter (AAHS) family, (16) unknown major facilitator superfamily (UMF) family, (17) cyanate permease (CP) family. Masing-masing famili mengenali dan mentranspor senyawa-senyawa yang strukturnya berbeda dan menunjukkan bahwa filogenetik dari famili MFS tersebut berhubungan erat dengan fungsinya. Major Facilitator Superfamily merupakan transporter dengan kisaran substrat yang luas sehingga memiliki spesifisitas fungsi yang luas (Van Bambeke et al. 2000). Salah satu famili MFS yaitu MFS multidrug efflux transporter diketahui berperan didalam resistensi terhadap antibiotik seperti tetrasiklin, quinolone, methicilin dan phleomycin; obat anti HIV dan anti kanker seperti triazole derivative flucanazole (FLC), methotrexate (MTX) dan benomyl; fungisida seperti oxpaconazole (Kohli et al. 2001) dan logam berat seperti kadmium (Cd2+) (Li et al. 2001). MFS multidrug efflux transporter menggunakan gradien elektrokimia transmembran dari proton atau ion sodium untuk mensekresi senyawa toksik dan xenobiotik dari dalam sel (Gambar 2). Meskipun demikian pada tanaman diduga detoksifikasi senyawa toksik dan xenobiotik dilakukan tidak dengan mensekresinya keluar sel tetapi mengirimnya ke dalam vakuola yang bertindak sebagai kompartemen bagi senyawa -senyawa toksik dan xenobiotik tersebut.

Gambar 2. MFS multidrug efflux transporter menggunakan gradien elektrokimia transmembran dari proton atau ion sodium untuk mensekresi senyawa toksik dan xenobiotik dari dalam sel

12 MFS multidrug efflux transporter pada tanaman pertama kali ditemukan pada jagung (Simmons et al. 2003). Simmons et al. (2003) mengindikasikan bahwa MFS multidrug efflux transporter pada jagung berperan di dalam resistensi terhadap patogen, eksport dan re-uptake K+, integritas membran dan viabilitas sel. Beberapa penelitian membuktikan bahwa kultivar toleran Al mampu meningkatkan aktifitas H+-ATPase membran plasma yang mengatur keseimbangan ion proton antara di dalam dan di luar membran plasma sel, sehingga terjadi depolarisasi di membran plasma dan secara berantai mempengaruhi aktifitas metabolisme turunannya seperti aktifitas K-channel dan Ca-transporter yang masing-masing berperan dalam proses detoksifikasi Al (Kasai et al. 1993; Kinraide et al. 1994; Sasaki et al. 1995; Kasai et al. 1995; Huang et al. 1996; Larsen et al. 1998; Delhaize 2004) Fluconazole resistance 1 (FLR1) yang menyandikan MFS transporter pada fungi Candida albicans terlibat di dalam induksi CAP1 dan YAP1 yang berperan dalam resistensi C. albicans dan S. cerevisiae terhadap senyawa toksik seperti cycloheximide (CYH), 4-nitroquinoline N-oxide (4-NQO), kadmium dan hidrogen peroksida sehingga hal ini mengindikasikan bahwa FLR1 merupakan regulator transkripsi CAP1 dan YAP1 (Alarco et al. 1997). Hidrogen peroksida merupakan salah satu oksida radikal (ROS, reactive oxigen species) yang dihasilkan pada sejumlah reaksi selular dan merupakan salah satu mekanisme yang muncul pertama kali pada tanaman untuk mengatasi stress oksidatif khususnya untuk reoksigenasi. Stress oksidatif disebabkan oleh berbagai faktor lingkungan diantaranya stress UV, serangan patogen (reaksi hipersensitif), herbisida dan kekurangan oksigen (Blokhina et al. 2002). Reaktifitas Al juga dapat menyebabkan terbentuknya oksida radikal (ROS, reactive oxigen species) yang beracun bagi sel. Protein MFS yang terkonservasi terdiri dari 12 simpul/helik transmembran (TM) di semua transporter MFS. Meski demikian spesifisitas fungsinya ditentukan pada variasi asam amino pada bagian pengikatan substrat (Vardy et al. 2004). Bagian terkonservasi dari MFS yaitu pada domain TM 2 dan TM 3 yang menentukan fungsi transpor MFS secara umum (Yamaguchi et al. 1992) dan domain

13 TM5 yang menentukan fungsi MFS sebagai antiporter. Bagian variasi diantaranya yaitu domain TM8 dan TM9 yang menentukan spesifisitas substrat (Ditty et al. 1999) dan pusat simpul yang panjang yang terletak di antara domain TM6 dan TM 7 berperan penting dalam menentukan fungsi protein (Weinglass et al. 2000).

Karakteristik Melastoma dan Toleransinya terhadap Aluminium Melastoma affine D. Don atau disebut juga Melastoma malabathricum L. (Meyer 1999) (Gambar 3) merupakan tanaman yang termasuk dalam super divisi Spermatophyta (tanaman berbiji), divisi Magnoliophyta (tanaman berbunga), group dikotil, famili Melastomataceae dan merupakan tanaman perennial serta mempunyai kebiasaan tumbuh sebagai herba dengan tinggi mencapai 3 m dengan bunga berwarna ungu terang atau keunguan serta buah yang berisi biji-biji kecil berwarna ungu tua atau hitam yang secara alami digunakan sebagai sistem perbanyakannya (USDA 2004).

Gambar 3. Melastoma affine L.

Melastoma malabathricum L. merupakan tanaman pengakumulasi Al berkayu yang berkembang di Asia Tenggara pada tanah asam dengan tingkat konsentrasi Al tinggi dan miskin hara (Watanabe & Osaki 2002). Melastoma malabathricum L. dapat mengakumulasi Al lebih dari 10000 mg kg-1 di dalam daun-daun yang tua dan

14 lebih dari 7000 mg kg-1 di dalam daun-daun yang muda (Watanabe & Osaki 2001). Pada daun Melastoma, Al ditemukan berada di dalam sel epidermal atas dan juga didistribusikan di dalam sel mesofil sedangkan pada akar Al ditemukan pada semua jaringan akar terutama dalam epidermis dan endodermis. Selanjutnya Watanabe dan Osaki (2003) menemukan bahwa Al mampu menembus jaringan endodermis dan masuk ke pembuluh xilem yang kemudian ditimbun di daun Melastoma. Buktibukti ini menunjukkan bahwa Melastoma memiliki kemampuan menyerap Al, memobilisasi dan menimbunnya di daun tanpa menimbulkan masalah kelainan fisiologis. Bentuk Al terlarut yang ditemukan di dalam jaringan Melastoma diidentifikasikan sebagai Al monomerik, Al-oksalat, Al-(oksalat)2 dan Al-(oksalat)3 (Watanabe et al. 1998). Selain tahan terhadap cekaman Al, pertumbuhan Melastoma juga dipacu oleh Al (Watanabe et al. 2001a). Mekanisme induksi pertumbuhan Melastoma oleh Al ini masih belum jelas. Cekaman Al pada tanaman toleran akan menginduksi sejumlah gen untuk menghindari pengaruh ion Al. Pada Melastoma, gen-gen ini diduga tidak hanya berperan dalam mendetoksifikasi Al, akan tetapi juga berperan dalam

menginduksi

hormon

pertumbuhan.

Sebagaimana

telah

diketahui

pertumbuhan tanaman diatur oleh hormon pertumbuhan seperti auksin, sitokinin dan ABA (Wareing & Philips 1981). Mekanisme translokasi dan akumulasi Al di dalam Melastoma mungkin sama dengan buckwheat. Ma dan Hiradate (2000) menunjukkan bahwa bentuk Al untuk translokasi dari akar ke tajuk di dalam buckwheat adalah kompleks Al-sitrat yang merupakan bentuk yang sama dalam Melastoma. Kelebihan oksalat membuat presipitasi dengan Ca di dalam sitoplasma akar dan xilem menghambat signal transduksi dan translokasi Ca, yang berarti bahwa bentuk Al untuk translokasi bukanlah Al-oksalat tetapi Al-sitrat di dalam spesies akumulator Al. Kandungan asam sitrat pada pembuluh xilem M. malabathricum mengalami peningkatan dengan adanya perlakuan Al sedangkan asam malat, asam suksinat, dan α-ketoglutarat menurun (Watanabe & Osaki 2002).

BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan mulai bulan Februari 2005 sampai Mei 2006 di Laboraturium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman dan di Laboratorium Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB.

Bahan Bahan yang digunakan adalah daun dan akar tumbuhan melastoma (Melastoma affine) yang tumbuh di lahan asam Jasinga Bogor Jawa Barat. Primer spesifik untuk gen penyandi MFS yang didesain berdasarkan cDNA Zm-MFS dari Zea mays dan Mt-Mfs dari Medicago truncantula dengan primer forward (MFSF) “GAAAAATGCAATTCTCTTCA” dan primer reverse (MSFR)

“GAAGCTTAGACCGATTAAC”

digunakan

untuk

mengisolasi

fragmen MFS dari Melastoma. Primer

ActF

“ATGGCAGATGCCGAGGATAT”

dan

ActR

“CAGTTGTGCGACCACTTGCA” digunakan untuk mengamplifikasi cDNA ekson1 – ekson2 dari aktin Glycine max (Ac.V00450). cDNA ekson1 – ekson2 dari aktin digunakan sebagai alat untuk mengevaluasi kemurnian RNA total dan cDNA total dari kontaminan DNA genom. Plasmid pGEM® –T Easy digunakan sebagai vektor pengklonan (Gambar 4). E. coli galur DH5α digunakan sebagai sel inang dari plasmid rekombinan.

Gambar 4. Vektor pengklonan pGEM® –T Easy

16 Metode Penelitian Penelitian dilakukan melalui beberapa tahap yaitu isolasi RNA total, sintesis cDNA total melalui transkripsi balik, isolasi fragmen cDNA MaMfs melalui PCR, pengklonan cDNA ke dalam vektor pGEM®–T Easy, transformasi genetik E. coli DH5α dengan vektor rekombinan, analisis cDNA sisipan dan analisis urutan nukleotida MaMfs seperti ditunjukkan pada Gambar 5.

Gambar 5. Tahapan isolasi dan pengklonan fragmen cDNA Mfs dari Melastoma affine L

17 Isolasi RNA total. Isolasi RNA total dilakukan menggunakan metode CTAB (Chang et al. 1993) yang dimodifikasi. Untuk itu, 0.5 – 1 g daun segar yang dibuang tulang daunnya atau akar digerus hingga halus di dalam mortar yang berisi 10 ml buffer ekstraksi 2X CTAB (2% CTAB, 0.1 M Tris pH 9.5, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl) yang mengandung 2% PVP 25000 dan 1% β-mercapto ethanol. Setelah itu ekstrak sel dimasukkan ke dalam tabung 20 ml dan diinkubasi 10 menit pada suhu 65oC, kemudian didinginkan dan ditambah dengan 1x volume Kloroform : Isoamil alkohol (24:1), divorteks dan disentrifugasi dengan kecepatan 15000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC dengan rotor SW 11, Sorvall Ultra Pro 80. Supernatan (bagian atas cairan) dipindahkan ke tabung baru, kemudian ditambah ¼ volume LiCl 10M. Campuran diinkubasi pada suhu -20oC selama 2.5 jam. Campuran disentrifugasi dengan rotor SW 11, Sorvall Ultra Pro 80 pada kecepatan 15000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC.

Fase cairan dibuang, RNA total yang mengendap

disuspensi dengan 500 μl TE 1x (10 mM Tris HCl pH 7.4 dan 1 mM EDTA) dan dipindah ke tabung eppendorf. Selanjutnya RNA diekstraksi dengan 1x volume fenol pH 9 dan disentrifugasi pada kecepatan 15000 rpm (Jouan BR4i) selama 10 menit pada suhu kamar (20oC). Suspensi RNA (di bagian atas) diambil dan diekstraksi dengan 1 x volume fenol/kloroform/isoamilalkohol (25:24:1) serta disentrifugasi pada kecepatan 15000 rpm selama 10 menit pada suhu kamar (20oC). Cairan bagian atas diambil dan dipresipitasi dengan penambahan ¼ x V LiCl 10M dan kemudian diinkubasi semalam pada suhu -20oC. Untuk mengendapkan RNA total, campuran disentrifugasi pada kecepatan 15000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC. Cairan dibuang dan endapan RNA total dibilas dengan penambahan 500 μl ethanol 70% kemudian disentrifugasi pada kecepatan 15000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC. Endapan dikeringkan dengan vacuum dryer selama 15 menit, kemudian diresuspensikan dengan H2O yang telah diperlakukan dengan DEPC. RNA total diukur kuantitasnya menggunakan spektrofotometer UV-VIS (Cecil CE 2020) pada panjang gelombang 260 nm. Rasio absorbansi RNA pada panjang gelombang 260 dan 280 nm digunakan untuk mengetahui kemurnian RNA total dari kontaminan protein. Keutuhan RNA total diuji dengan melakukan elektroforesis RNA total di gel agarose 1% di

18 dalam buffer MOPS 1x (4.2 g/l MOPS, 0.41 g/l Na asetat, 0.37 g/l Na2- EDTA). Visualisasi RNA dilakukan di atas transluminator UV dan difoto menggunakan Digidoc. Kualitas RNA murni yang baik ditunjukkan oleh rasio absorbansi A260/280 = 1.8 sampai 2.0 dan munculnya pita ribosom 18S dan 28S pada hasil elektroforesis (Farrel 1993). Untuk memperkirakan konsentrasi RNA, diasumsikan bahwa satu satuan absorban pada panjang gelombang 260 nm setara dengan 40 μg/ml RNA (Saunders dan Parkes 1999), sehingga kuantitas (konsentrasi) RNA dapat diduga dengan rumus berikut: [RNA] = OD 260nm x fp x 40 µg/ml dimana; fp

= faktor pengenceran yaitu sebesar 700x

40

= nilai satu satuan absorban pada panjang gelombang 260 nm (40 μg/ml)

Sintesis cDNA total melalui transkripsi balik. Sintesis cDNA dilakukan dengan

metode

transkripsi

balik

(reverse

transcription)

menggunakan

SuperScript II RT (Invitrogen). Sintesis cDNA total dilakukan dengan mencampur 500 ng RNA total dengan 4 μl 5x First-Strand Buffer, 1 μl primer oligo (dT) (50 pmol/ μl), 8 μl 2.5 mM dNTP mix, 0.2 μl enzim RT (10 U/μl), 2 μl DTT (0.1 M) dan air yang diperlakukan dengan DEPC sehingga mencapai volume akhir 20 μl. RT dilakukan dengan alat PCR (MJ Research TM 100) dengan menginkubasikan campuran pada suhu 30°C, 10 menit; 42°C, 50 menit; 95°C, 5 menit; dan 15°C, 10 menit . Keberhasilan sintesis cDNA total diuji dengan keberhasilan amplifikasi cDNA ekson1 – ekson2 dari aktin melalui PCR dengan menggunakan cDNA total sebagai DNA cetakan. Untuk itu cDNA total hasil RT sebanyak 2 μl digunakan sebagai cetakan untuk reaksi PCR aktin yang dicampurkan dengan

2

μl 10x Taq buffer, 1.6 μl 2.5 mM dNTP mix, 2 μl untuk setiap pasang forward primer dan reverse primer spesifik aktin (10 pmol/ μl), 0.2 μl Taq polimerase (5 U/ μl) dan ditambahkan dH2O steril sampai volume akhir 20 μl. PCR dilakukan dengan kondisi pra-PCR pada 94°C, 5 menit; denaturasi pada 94°C, 30 detik;

19 penempelan primer pada 55°C, 30 detik; pemanjangan pada 72°C 1.5 menit dan pemanjangan akhir pada 72°C, 7 menit. PCR dilakukan sebanyak 30 siklus. Isolasi Fragmen cDNA MaMfs melalui PCR. PCR gen Mfs dilakukan dengan membuat campuran reaksi seperti pada amplifikasi cDNA aktin dengan mengganti primer aktin dengan primer spesifik MFSF dan MFSR. Kondisi PCR yang digunakan adalah: pra-PCR 94°C, 5 menit; denaturasi pada 94°C, 30 detik; penempelan primer pada 35°C, 30 detik; pemanjangan pada 72°C 1.5 menit dan pemanjangan akhir pada 72°C, 7 menit. PCR dilakukan sebanyak 35 siklus. Pengklonan cDNA ke dalam vektor pGEM® –T Easy. cDNA MaMfs hasil amplifikasi dengan PCR diklon ke dalam vektor plasmid pGEM® –T Easy (Promega) yang berukuran 3015 bp mengikuti prosedur Promega (2003). Pengklonan cDNA ke dalam pGEM® –T Easy dilakukan dengan cara mencampurkan 1 μl (50 ng/ μl) pGEM® –T Easy dengan 3 μl cDNA MaMfs, 5 μl buffer ligasi T4 DNA ligase 2X, 1 μl T4 DNA ligase (3 Weiss Unit/ μl), dan ddH2O sampai volume akhir 10 μl. Campuran diinkubasi pada suhu 4oC selama semalam. Transformasi genetik bakteri E. coli DH5α dengan vektor rekombinan. Hasil ligasi potongan cDNA MaMfs dengan pGEM® –T Easy untuk membentuk plasmid rekombinan kemudian dimasukkan ke dalam sel bakteri E. coli DH5α yang kompeten. Transformasi E. coli dilakukan dengan menggunakan metode yang dipublikasikan Suharsono (2002). Untuk itu satu koloni bakteri E. coli DH5α dikulturkan dalam 2 ml media LB cair (1% bakto-tryptona, 0.5% bakto ekstrak khamir, 1% NaCl (w/v) dan dH2O sebagai pelarut) dan diinkubasi pada suhu 37oC selama semalam pada inkubator goyang (250 rpm). E. coli DH5α hasil kultur semalam kemudian disubkultur sebanyak 200 μl di dalam 20 ml LB cair dengan kondisi yang sama seperti saat kultur, hingga mencapai densitas bakteri 4-7 x 107 sel/ml (OD600 = 0.4 - 0.5). Sel bakteri diendapkan dengan disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. Endapan bakteri disuspensikan dalam 0.33 vol buffer transformasi TB (10 mM PIPES, 15 mM CaCl2.2H2O, 250 mM KCl, 55 mM MnCl2.4H2O, pH 6.7), dan diinkubasi ke dalam es selama 10 menit. Sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm

20 pada suhu 4oC selama 10 menit. Endapan bakteri (pellet) disuspensikan dalam 8ml TB, ditambah 0.6 ml DMSO dan diinkubasikan di dalam es selama 10 menit sehingga didapatkan sel bakteri kompeten. Sel bakteri kompeten sebanyak 50 μl dicampur dengan 10 μl (50-100 μg) DNA plasmid dan diinkubasikan di dalam es selama 25 menit. Campuran tersebut selanjutnya diberi kejutan panas dengan diinkubasikan pada suhu 42oC selama 45 detik dan dimasukkkan kembali ke dalam es selama 5 menit. Campuran tersebut kemudian ditambah dengan 100 μl media 2xYT (16 g/l bacto-tryptone, 10 g/l bacto yeast extract, 5 g/l NaCl, pH 7.0) dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 20 menit. Bakteri disebar secara merata pada media LB yang mengandung 100mg/l ampisilin dan 10 μl 100 mM IPTG serta 50 μl 2% (b/v) x-gal, kemudian diinkubasikan pada suhu 37oC selama semalam. Hanya bakteri yang mengandung plasmid pGEM®–T Easy yang dapat hidup pada media yang mengandung antibiotik ampisilin. Selanjutnya adanya X-gal dan IPTG dalam media LB padat akan menghasilkan koloni bakteri yang berwarna biru dan putih. Hanya koloni bakteri yang berwarna putih yang kemudian diisolasi pada media LB yang mengandung ampisilin karena di dalamnya mengandung pGEM®–T Easy rekombinan. Bakteri yang mengandung pGEM®–T Easy rekombinan tidak mampu menghasilkan β-galaktosidase (insertional inactivation) sehingga x-gal tidak dapat diuraikan dan koloni tetap berwarna putih, sedangkan koloni yang mengandung pGEM® –T Easy non rekombinan akan berwarna biru karena mampu mengurai x-gal. Untuk verifikasi bahwa koloni putih membawa plasmid rekombinan yang berisi cDNA sisipan (MaMfs), maka PCR dilakukan dengan menggunakan koloni putih sebagai bahan cetakan. Untuk itu, koloni ditusuk dengan tusuk gigi kemudian disuspensikan ke dalam ddH2O dan dipanaskan 95 °C selama 10 menit dan didinginkan 15 °C selama 5 menit. Suspensi ini dicampur dengan 1.5 μl buffer taq, 30 mM MgCl2, 1.2 μl 2.5 mM dNTP mix, 1.5 μl (10 pmol/ μl) primer MFSF, 1.5 μl (10 pmol/ μl) primer MFSR, 4% DMSO, 0.15 μl (5 U/ μl) enzim taq DNA polymerase (Fermentas Inc.) di dalam volume 15 μl. PCR dilakukan dengan kondisi yang sama dengan PCR isolasi fragmen cDNA MaMfs.

21 Analisis cDNA sisipan.

Isolasi DNA plasmid pGEM®–T Easy

rekombinan yang terdapat di dalam E. coli DH5α dilakukan dengan menggunakan prosedur Suharsono (2002). Untuk itu satu koloni E. coli DH5α rekombinan ditumbuhkan di dalam 2 ml media LB yang mengandung 100 mg/l ampisilin dan diinkubasi didalam inkubator bergoyang (250 rpm) pada suhu 37oC selama semalam. Kultur bakteri disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. Endapan bakteri kemudian disuspensikan dalam 300 μl buffer suspensi sel (50 mM tris-HCl, pH 7.5 dan 10 mM EDTA), dan tambahkan 300 μl buffer lisis (0.2 M NaOH, dan 1% SDS), homogenkan dengan dibolak-balik perlahan beberapa kali. Setelah lisis, tambahkan 300 μl buffer netralisasi (5 M Na-Asetat, asam asetat glasial dan H2O dengan perbandingan 60:11.5:28.5, pH 4.8) dan campuran ini disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm pada suhu 4oC selama 20 menit.

Supernatan yang

mengandung DNA plasmid diambil dan kemudian diekstraksi dengan 1 x volume fenol-kloroform-isoamil alkohol (25:24:1) divorteks dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm pada suhu 4oC selama 2 menit.

Supernatan

diambil dan diperlakukan dengan RNase pada suhu 37oC selama semalam untuk menghilangkan RNA. Larutan kemudian diekstraksi kembali dengan PCI dan disentrifugasi seperti ekstraksi sebelumnya.

Supernatan kemudian diambil

dengan hati-hati dan dipresipitasi dengan menambahkan 0.1 x volume 3M sodium asetat, pH 5.2 dan 2 x volume etanol absolut.

Selanjutnya larutan

diinkubasi pada suhu -35oC selama 2 jam dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm pada suhu 4oC selama 20 menit. Endapan (DNA plasmid) dibilas dengan 1 x volume etanol 70% dan dikeringkan dengan vakum. DNA plasmid yang sudah kering disuspensikan di dalam 5-10 μl ddH2O. Plasmid yang dihasilkan dari isolasi plasmid kemudian dipotong dengan enzim restriksi EcoR1 (Promega Inc.) untuk mengeluarkan cDNA sisipan dengan cara mencampur 100 ng DNA plasmid, 10 U enzim restriksi EcoR1, buffer 1 x dan ddH2O sampai volumenya 20 µl. Inkubasikan campuran reaksi pada suhu 37oC selama 8 jam.

22 Analisis urutan nukleotida MaMfs dan protein MaMFS. Pengurutan DNA dilakukan dengan menggunakan mesin pengurut DNA otomatis (Automated DNA Sequencer ABI Prism 310, Perkin-Elmer). Identifikasi urutan nukleotida hasil pengurutan DNA dilakukan dengan beberapa analisis. Analisis kesejajaran lokal (local alignment) MaMfs berdasarkan urutan nukleotida dan asam amino dengan data yang ada di GenBank dilakukan dengan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tools) yang disediakan NCBI (National Center for Biotechnology Information) melalui http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/ (Rashidi & Buehler 2000). Daftar sandi asam amino disajikan pada Lampiran 1. Analisis

situs

restriksi

dilakukan

dengan

menggunakan

program

NEBCutter (http://www.firstmarket.com/cutter/cut2. htm). Analisis kemiripan atau similaritas dan filogenetik Mfs dan MFS dari berbagai spesies dilakukan dengan menggunakan program MAFFT versi 5.8 (Katoh et al. 2005). Domain fragmen

MaMfs

ditentukan

(http://www.expasy.ch/prosite/).

dengan

Analisis

program

hidrofobisitas

motif fragmen

scan MaMFS

menggunakan fragmen MtMFS sebagai pembanding dan dilakukan dengan menggunakan program BioEdit versi 7.0.0.

HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi RNA Total RNA total dari M. affine telah berhasil diisolasi dari bahan tumbuhan berupa daun yang telah membuka sempurna yang kemudian disebut dengan daun tua, daun pucuk, dan akar. Kuantifikasi RNA total dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm menunjukkan bahwa rendemen isolasi RNA berkisar antara 171 μg dan 247 μg tiap g bahan tumbuhan (Tabel 1). Rendemen tertinggi diperoleh dari bahan tumbuhan berupa daun pucuk. Daun pucuk mempunyai sel yang sangat aktif melakukan metabolisme sehingga proses transkripsi yang menghasilkan RNA juga sangat intensif. Tabel 1. Rendemen Isolasi RNA Total No

Bahan Tumbuhan

1 2 3

Akar Daun Daun Pucuk

Nilai Absorbansi λ260 λ 280 0.229 0.203 0.294

0.122 0.109 0.155

Rasio Absorbansi (λ260/λ280) 1.87 1.86 1.90

Rendemen isolasi RNA (μg/g bahan tumbuhan) 192 171 247

Pengujian kemurnian RNA total yang dilakukan dengan membandingkan nilai OD260 dan OD280 menunjukkan bahwa RNA total yang diisolasi mempunyai kemurnian yang tinggi karena mempunyai rasio berkisar antara 1.86 dan 1.9. Menurut Farrel (1993) RNA yang mempunyai rasio absorbansi pada 260 nm dan 280 nm antara 1.8 dan 2.0 adalah murni yang bebas dari kontaminan protein. Keutuhan RNA total dianalisis dengan melakukan elektroforesis di gel agarose yang terdenaturasi yang mengandung formaldehide (Gambar 6). Hasil elektroforesis RNA total menunjukkan adanya 2 pita RNA yang dominan pada RNA total yang diisolasi dari akar, daun tua dan daun pucuk yang kemungkinan adalah RNA ribosomal (rRNA) 28S dan 18S. Selain kedua pita dominan tersebut, RNA total dari daun tua dan daun pucuk, juga mengandung beberapa pita RNA yang kemungkinan adalah rRNA yang terdapat pada mitokondria dan kloroplas. rRNA mitokondria dan kloroplas berukuran 23S, 16S, dan 5S.

24 1

2

3

28S 18S

Gambar 6. RNA total yang terdapat pada ketiga sampel yaitu akar (1), daun tua (2) dan daun pucuk (3).

Sintesis cDNA Total cDNA total telah disintesis melalui proses transkripsi balik dengan RNA total sebagai cetakan (template). Dengan primer oligo-dT, hanya mRNA yang dapat disintesis menjadi cDNA melalui transkripsi balik. PCR dengan primer spesifik untuk cDNA ekson1-ekson2 dari aktin digunakan untuk mengetahui keberhasilan sintesis cDNA total, dan kemurnian cDNA total dan RNA total dari kontaminan DNA. PCR dengan menggunakan primer untuk ekson1 - ekson2 dari gen aktin (ActF dan ActR) dan dengan cetakan cDNA total, menghasilkan pita DNA yang berukuran sekitar 450 pb (gambar 7). Hasil ini menunjukkan bahwa daerah yang diamplifikasi adalah cDNA ekson1-ekson2 bukan DNA ekson1 - ekson2 dari gen aktin. DNA ekson1 - ekson 2 akan berukuran lebih besar daripada 450 pb karena diantara kedua ekson tersebut terdapat intron yang dibuang pada saat pembentukan mRNA. DNA antara ekson1 dan ekson2 berukuran sekitar 600 pb. M

1

2

3

1000 pb 500 pb

Gambar 7. Pita cDNA ekson1-ekson2 dari aktin yang dihasilkan dari PCR menggunakan cetakan cDNA dari daun tua (1), daun pucuk (2) dan akar (3)

25 Teramplifikasinya cDNA dengan primer ActF dan ActR dengan ukuran 450 pb menunjukkan bahwa cDNA total telah berhasil disintesis melalui proses transkripsi balik dan murni dari kontaminan DNA.

Selain itu, hal ini juga

membuktikan bahwa RNA total yang telah diisolasi mempunyai kualitas yang sangat bagus, karena selain dapat digunakan untuk mensintesis cDNA juga terbebas dari DNA. Isolasi Fragmen cDNA MaMfs Melalui PCR PCR dengan cDNA total sebagai cetakan dan primer spesifik fragmen Mfs, menghasilkan fragmen cDNA berukuran sekitar 500 pb, yang kemudian disebut dengan fragmen MaMfs yang merupakan fragmen cDNA dari kandidat gen penyandi MFS dari M. affine. Adanya DNA yang berukuran sama yaitu sekitar 500 pb yang dihasilkan dari PCR dengan cDNA total sebagai cetakan baik dari akar maupun daun pucuk (gambar 8) menunjukkan bahwa Mfs diekspresikan baik pada akar maupun pada daun. Walaupun masih memerlukan konfirmasi dengan menggunakan kontrol internal untuk ekspresi, berdasarkan intensitas pita DNA hasil PCR menunjukkan bahwa tingkat ekspresi Mfs di akar lebih tinggi daripada di daun. 1kb

1

2

1000 pb 500 pb

Gambar 8. Pita fragmen cDNA MaMfs hasil amplifikasi dengan teknik PCR menggunakan cetakan cDNA sampel daun (1) dan sampel akar (2)

26 Pengklonan Fragmen MaMfs ke dalam Plamid pGEM®–T Easy Fragmen MaMfs telah diligasikan dengan plasmid pGEM-T Easy di tengah gen lacZ dan hasil ligasi kemudian diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5α. Seleksi terhadap E. coli yang mengandung plasmid rekombinan pembawa sisipan fragmen cDNA MaMfs dilakukan di media seleksi yang mengandung antibiotik ampisilin, X-gal dan IPTG. E. coli yang dapat bertahan hidup di media seleksi mengandung plasmid, dan koloni E. coli yang berwarna putih di media seleksi adalah

E. coli yang mengandung plasmid rekombinan, dan yang berwarna biru

adalah E. coli yang mengandung plasmid non-rekombinan (gambar 9).

Koloni putih Koloni biru

Gambar 9. Seleksi bitu putih koloni E. coli DH5α yang ditransformasi dengan hasil ligasi antara pGEM®–T Easy dan MaMfs pada media seleksi yang mengandung X-gal, IPTG dan antibiotik ampisilin

Gen lacZ menyandi β-galactosidase (β-gal) yang mengubah substrat X-gal yang tidak berwarna menjadi berwarna biru bila ada IPTG yang berfungsi menginduksi promoter lacZ. Bila fragmen MaMfs menyisip pada bagian tengah dari gen lacZ, yang berarti menghasilkan plasmid rekombinan, maka gen lacZ tidak dapat diekspresikan sehingga koloni E. coli berwarna putih. Bila tidak ada penyisipan pada lacZ, yang berarti menghasilkan plasmid non-rekombinan, koloni yang terbentuk berwarna biru. Adanya sisipan fragmen cDNA MaMfs di dalam koloni E. coli putih dikonfirmasi dengan PCR terhadap koloni yang kemudian disebut dengan PCRkoloni. PCR-koloni terhadap koloni putih menghasilkan DNA yang berukuran

27 sekitar 500 pb yang menunjukkan bahwa koloni putih mengandung fragmen MaMfs (gambar 10). 1 kb

DH5α

1000 pb 500 pb

Gambar 10.

Hasil PCR terhadap koloni E. coli DH5α (koloni putih) sebagai cetakan

Untuk memastikan bahwa fragmen cDNA MaMfs telah tersisip di dalam pGEM-T Easy, maka DNA plasmid rekombinan telah diisolasi dari koloni putih. Pemotongan terhadap DNA plasmid rekombinan dengan EcoR1 yang mengapit daerah penyisipan menghasilkan dua fragmen yaitu fragmen sekitar 3000 pb yang merupakan vektor pGEM-T Easy dan fragmen yang berukuran sama dengan fragmen cDNA MaMfs yaitu sekitar 500 pb (gambar 11).

Hal ini

menunjukkan bahwa fragmen MaMfs telah tersisip di dalam pGEM-T Easy. 1 kb

3000 pb

1

2

Vektor

1000 pb 500 pb

Gambar 11.

Sisipan

Plasmid pGEM®–T Easy rekombinan utuh (1) dan hasil pemotongan plasmid dengan enzim restriksi EcoR1 (2)

28 Analisis Fragmen MaMfs Pengurutan DNA terhadap fragmen MaMfs menghasilkan 511 pb yang menyandi 168 asam amino (Gambar 12). Keseluruhan hasil pengurutan DNA termasuk posisi primer dan situs pengklonan pada pGEM®-T Easy disajikan pada Lampiran 2.

Analisis kesejajaran lokal (local alignment) berdasarkan

urutan nukleotida dengan data di genBank menggunakan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) menunjukkan bahwa fragmen cDNA MaMfs mempunyai kesamaan 74% dengan bagian coding sequence (cds) A. thaliana (AY056374), 73% dengan klon mth2-61c11 Medicago truncantula (AC148655) pada bagian cds 29835-35720 yang menyandi Major Facilitator Superfamily (MFS_1) dan 71% dengan bagian mRNA (complete cds) yang menyandi tetracycline resistance efflux protein like protein (MFS_1) dari Arabidopsis thaliana (AK230262). Hasil selengkapnya disajikan pada Lampiran 3. Salah satu contoh analisis kesejajaran lokal antara MaMfs dengan MtMfs disajikan pada Lampiran 4.

Gambar 12. Urutan nukleotida fragmen cDNA MaMfs dan deduksi asam aminonya

29 Analisis kesejajaran berdasarkan urutan asam amino yang dideduksi dari cDNA Mfs menunjukkan bahwa fragmen MaMFS mempunyai kesamaan 80% dengan bagian MFS_1 dari M. truncantula (Q1S1V4), 77% dengan bagian hypotetical protein A. thaliana (O82747), 73% dengan OsMFS_1 dari padi (Q7XTZ1), 73% dengan bagian MFS_1 M. truncantula (Q2HV19), 73% dengan bagian tetracycline resistance efflux protein like protein (MFS_1) A. thaliana (Q9LQ03), 30% dengan bagian putative MFS multidrug efflux pump (MFS_1) dari bakteri Yersinia pseudotuberculosis (Q66DU6) dan 30% dengan bagian multidrug efflux transporter (MFS_1) dari bakteri Wollinela succinogenes (Q1Q9B7). Hasil selengkapnya disajikan pada Lampiran 5. Contoh analisis kesejajaran lokal berdasarkan urutan asam amino disajikan pada Lampiran 6. Karena banyak kesamaan dengan MFS dari spesies lain, maka fragmen cDNA yang diperoleh pada penelitian ini adalah termasuk fragmen cDNA penyandi Major Facilitator Superfamily (MFS) dari Melastoma affine. Analisis situs pemotongan untuk enzim restriksi pada suatu fragmen DNA sangat penting untuk rekayasa genetika. Fragmen MaMfs tidak mengandung situs EcoR1 (gambar 13). Situs EcoR1 terdapat pada vektor pengklonan yang digunakan yaitu pGEM-T Easy yang mengapit daerah sisipan sehingga EcoR1 dapat digunakan untuk mengeluarkan sisipan MaMfs dari plasmid rekombinan secara utuh. Situs Pst1 terdapat di dalam MaMfs sehingga tidak dapat digunakan untuk mengeluarkan sisipan MaMfs dari pGEM®-T Easy.

Gambar 13. Situs pemotongan enzim restriksi endonuklease pada fragmen MaMfs menggunakan program NEB Cutter

30 Analisis kesamaan berdasarkan urutan nukleotida Mfs dari berbagai spesies disajikan dalam matriks kesamaan pada Tabel 2. Fragmen MaMfs memiliki kesamaan tertinggi dengan MtMfs yang berasal dari tanaman M. truncantula yaitu sebesar 53.5%. Kesamaannya dengan Mfs tanaman lainnya yaitu sebesar 52.2% dengan A. thaliana Mfs dan 49.5% dengan O. sativa Mfs. Kesamaannya dengan Mfs selain tanaman yaitu Mfs yang berasal dari bakteri, yeast dan manusia berkisar dari 20.9% hingga 28.3%. Berdasarkan nilai kesamaan nukleotida Mfs dari berbagai spesies maka pohon filogenetik disusun (Gambar 14). Pada pohon filogenetik yang berdasarkan urutan nukleotida, MaMfs terdapat dalam satu kelompok dengan MtMfs. Analisis kesamaan berdasarkan deduksi asam amino fragmen MaMFS dengan asam amino fragmen MFS yang terdapat pada data Gen Bank disajikan pada Tabel 3. Fragmen MaMFS memiliki kesamaan tertinggi dengan MtMFS yaitu sebesar 66.6%. Kesamaannya dengan MFS tanaman lainnya yaitu sebesar 61.2% dengan A. thaliana MFS dan 60.7% dengan O. sativa MFS. Kesamaanya dengan MFS yang bukan berasal dari tanaman (bakteri, yeast dan manusia) berkisar dari 3.5% hingga 8.3%. Berdasarkan kesamaan urutan asam amino, MaMFS dari M. affine terdapat dalam satu kelompok dengan MtMFS dari M. truncantula pada pohon filogenetik (Gambar 15). Kedekatan MaMFS dengan MtMFS karena primer yang digunakan adalah bagian terkonservasi hasil penyejajaran antara urutan nukleotida MtMFS dan ZmMFS sehingga ada kemungkinan teramplifikasi bagian yang sama antara Melastoma dan Medicago, namun pada dendogram terlihat ZmMFS mempunyai jarak yang jauh dengan MaMFS dengan kesamaan yang kecil (24.5%) (Tabel 3). Ini mungkin saja terjadi karena bagian yang kesamaannya tinggi antara Melastoma, Medicago dan Zea mays adalah bagian terkonservasi sehingga ada kemungkinan teramplifikasi bagian yang tidak sama. Nilai kesamaan yang ditunjukkan pada tabel matriks kesamaan dan digambarkan dalam pohon filogenetik berbeda dengan nilai kesejajaran lokal melaui BLAST. BLAST hanya menyejajarkan atau membandingkan MaMfs dan MaMFS dengan bagian tertentu dari Mfs dan MFS dari spesies lain sedangkan analisis kesamaan berdasarkan MAFFT adalah membandingkan MaMfs dan

31 MaMFS dengan seluruh Mfs dan MFS secara utuh.

Oleh sebab itu nilai

homologi hasil BLAST lebih tinggi dari pada nilai kesamaan berdasarkan MAFFT. Susunan nukleotida dan asam amino MaMFS memiliki kesamaan yang cukup tinggi dengan MFS dari spesies lain sehingga MaMFS diduga mempunyai kesamaan peran sebagai transporter senyawa toksik dan transporter berbagai obat (MFS multidrug efflux transporter). MFS multidrug efflux transporter berperan di dalam resistensi suatu organisme terhadap: (1) antibiotik seperti tetrasiklin, quinolone, methicilin dan phleomycin, (2) obat anti HIV, dan (3) anti kanker seperti triazole derivative flucanazole (FLC), methotrexate (MTX) dan benomyl, (4) fungisida seperti oxpaconazole (Kohli et al. 2001) dan logam berat seperti cadmium (Li et al. 2001). Karena Al3+ memiliki kemiripan dengan Cd2+, kemungkinan MFS mempunyai peranan yang sama dalam detoksifikasi terhadap Al3+.

32

Tabel 2. Matriks kesamaan urutan nukleotida fragmen MaMfs dan Mfs dari organisme lain Gen

MaMfs

MtMfs

AtMfs

OsMfs

PseMfs SerrMfs

ArcMfs OceMfs SalMfs

YerMfs

ExiMfs

BacilMfs

AzoMfs ZmMfs

SsacMfs

SacMfs

CalMfs CmalMfs HmMfs EcoMfs

VibMfs CochMfs TricMfs

ShewMfs MariMfs

Whtpht1 Atpht15

Solpht1

MaMfs

ID

0.535

0.522

0.495

0.274

0.254

0.249

0.274

0.250

0.231

0.229

0.276

0.243

0.245

0.252

0.245

0.283

0.258

0.266

0.209

0.239

0.261

0.255

0.229

0.247

0.276

0.294

0.266

MtMfs

0.535

ID

0.750

0.715

0.243

0.241

0.271

0.251

0.263

0.253

0.257

0.275

0.225

0.253

0.269

0.270

0.266

0.266

0.202

0.240

0.253

0.228

0.259

0.239

0.277

0.251

0.267

0.273

AtMfs

0.522

0.750

ID

0.719

0.259

0.235

0.278

0.214

0.257

0.280

0.253

0.275

0.245

0.239

0.278

0.249

0.256

0.272

0.217

0.248

0.267

0.219

0.250

0.253

0.298

0.247

0.255

0.249

OsMfs

0.495

0.715

0.719

ID

0.257

0.249

0.271

0.233

0.280

0.257

0.259

0.271

0.216

0.247

0.269

0.254

0.248

0.241

0.233

0.244

0.253

0.238

0.236

0.241

0.288

0.229

0.263

0.249

PseMfs

0.274

0.243

0.259

0.257

ID

0.682

0.345

0.616

0.610

0.636

0.273

0.288

0.316

0.231

0.252

0.231

0.262

0.219

0.262

0.228

0.250

0.234

0.261

0.276

0.264

0.250

0.282

0.257

SerrMfs

0.254

0.241

0.235

0.249

0.682

ID

0.369

0.600

0.730

0.766

0.293

0.286

0.298

0.224

0.272

0.222

0.264

0.229

0.270

0.201

0.260

0.213

0.250

0.280

0.249

0.232

0.282

0.255

ArcMfs

0.249

0.271

0.278

0.271

0.345

0.369

ID

0.337

0.353

0.330

0.274

0.290

0.272

0.226

0.241

0.243

0.246

0.215

0.250

0.250

0.258

0.242

0.276

0.298

0.284

0.246

0.278

0.275

OceMfs

0.274

0.251

0.214

0.233

0.616

0.600

0.337

ID

0.552

0.578

0.251

0.294

0.274

0.230

0.254

0.256

0.279

0.264

0.266

0.205

0.280

0.198

0.244

0.262

0.260

0.255

0.280

0.297

SalMfs

0.250

0.263

0.257

0.280

0.610

0.730

0.353

0.552

ID

0.698

0.303

0.276

0.285

0.226

0.284

0.212

0.248

0.249

0.289

0.228

0.287

0.225

0.253

0.305

0.245

0.222

0.273

0.240

YerMfs

0.231

0.253

0.280

0.257

0.636

0.766

0.330

0.578

0.698

ID

0.305

0.282

0.254

0.243

0.270

0.225

0.275

0.229

0.264

0.215

0.270

0.213

0.229

0.266

0.232

0.246

0.280

0.271

ExiMfs

0.229

0.257

0.253

0.259

0.273

0.293

0.274

0.251

0.303

0.305

ID

0.276

0.263

0.251

0.247

0.272

0.234

0.270

0.258

0.275

0.265

0.244

0.238

0.331

0.216

0.226

0.251

0.273

BacilMfs

0.276

0.275

0.275

0.271

0.288

0.286

0.290

0.294

0.276

0.282

0.276

ID

0.250

0.257

0.264

0.283

0.248

0.231

0.239

0.240

0.284

0.219

0.278

0.278

0.284

0.259

0.265

0.273

AzoMfs

0.243

0.225

0.245

0.216

0.316

0.298

0.272

0.274

0.285

0.254

0.263

0.250

ID

0.249

0.215

0.206

0.203

0.207

0.245

0.209

0.274

0.236

0.263

0.281

0.250

0.220

0.253

0.244

ZmMfs

0.245

0.253

0.239

0.247

0.231

0.224

0.226

0.230

0.226

0.243

0.251

0.257

0.249

ID

0.259

0.254

0.247

0.249

0.254

0.281

0.247

0.269

0.255

0.253

0.226

0.233

0.222

0.210

SsacMfs

0.252

0.269

0.278

0.269

0.252

0.272

0.241

0.254

0.284

0.270

0.247

0.264

0.215

0.259

ID

0.247

0.283

0.276

0.221

0.251

0.256

0.257

0.255

0.284

0.249

0.265

0.273

0.332

SacMfs

0.245

0.270

0.249

0.254

0.231

0.222

0.243

0.256

0.212

0.225

0.272

0.283

0.206

0.254

0.247

ID

0.285

0.277

0.254

0.276

0.229

0.265

0.257

0.218

0.216

0.243

0.266

0.274

CalMfs

0.283

0.266

0.256

0.248

0.262

0.264

0.246

0.279

0.248

0.275

0.234

0.248

0.203

0.247

0.283

0.285

ID

0.293

0.266

0.246

0.254

0.217

0.280

0.246

0.235

0.244

0.283

0.291

CmalMfs

0.258

0.266

0.272

0.241

0.219

0.229

0.215

0.264

0.249

0.229

0.270

0.231

0.207

0.249

0.276

0.277

0.293

ID

0.256

0.271

0.203

0.269

0.238

0.207

0.192

0.256

0.254

0.301

HmMfs

0.266

0.202

0.217

0.233

0.262

0.270

0.250

0.266

0.289

0.264

0.258

0.239

0.245

0.254

0.221

0.254

0.266

0.256

ID

0.230

0.249

0.253

0.240

0.250

0.230

0.315

0.266

0.274

EcoMfs

0.209

0.240

0.248

0.244

0.228

0.201

0.250

0.205

0.228

0.215

0.275

0.240

0.209

0.281

0.251

0.276

0.246

0.271

0.230

ID

0.230

0.271

0.248

0.189

0.247

0.226

0.222

0.217

VibMfs

0.239

0.253

0.267

0.253

0.250

0.260

0.258

0.280

0.287

0.270

0.265

0.284

0.274

0.247

0.256

0.229

0.254

0.203

0.249

0.230

ID

0.207

0.217

0.376

0.256

0.251

0.235

0.281

CochMfs

0.261

0.228

0.219

0.238

0.234

0.213

0.242

0.198

0.225

0.213

0.244

0.219

0.236

0.269

0.257

0.265

0.217

0.269

0.253

0.271

0.207

ID

0.238

0.211

0.266

0.246

0.261

0.238

TricMfs

0.255

0.259

0.250

0.236

0.261

0.250

0.276

0.244

0.253

0.229

0.238

0.278

0.263

0.255

0.255

0.257

0.280

0.238

0.240

0.248

0.217

0.238

ID

0.251

0.290

0.221

0.198

0.259

ShewMfs

0.229

0.239

0.253

0.241

0.276

0.280

0.298

0.262

0.305

0.266

0.331

0.278

0.281

0.253

0.284

0.218

0.246

0.207

0.250

0.189

0.376

0.211

0.251

ID

0.271

0.224

0.227

0.238

MariMfs

0.247

0.277

0.298

0.288

0.264

0.249

0.284

0.260

0.245

0.232

0.216

0.284

0.250

0.226

0.249

0.216

0.235

0.192

0.230

0.247

0.256

0.266

0.290

0.271

ID

0.267

0.256

0.281

Whtpht1

0.276

0.251

0.247

0.229

0.250

0.232

0.246

0.255

0.222

0.246

0.226

0.259

0.220

0.233

0.265

0.243

0.244

0.256

0.315

0.226

0.251

0.246

0.221

0.224

0.267

ID

0.567

0.614

Atpht15

0.294

0.267

0.255

0.263

0.282

0.282

0.278

0.280

0.273

0.280

0.251

0.265

0.253

0.222

0.273

0.266

0.283

0.254

0.266

0.222

0.235

0.261

0.198

0.227

0.256

0.567

ID

0.614

Solpht1

0.266

0.273

0.249

0.249

0.257

0.255

0.275

0.297

0.240

0.271

0.273

0.273

0.244

0.210

0.332

0.274

0.291

0.301

0.274

0.217

0.281

0.238

0.259

0.238

0.281

0.614

0.614

ID

33

Gambar 14.

Filogenetik berdasarkan urutan nukleotida fragmen MaMfs dengan Mfs dari organisme lainnya (angka menunjukkan jarak)

34 Tabel 3. Matriks kesamaan asam amino fragmen MaMFS dan MFS dari organisme lain Gen

MaMfs MtMfs

AtMfs

OsMfs PseMfs SerrMfs ArcMfs OceMfs SalMfs YerMfs ExiMfs BacilMfs AzoMfs ZmMfs SsacMfs SacMfs CalMfs CmalMfs HmMfs EcoMfs VibMfs CochMfs TricMfs ShewMfs MariMfs Whtpht1

Atpht15 Solpht1

MaMfs

ID

0.666

0.612

0.607

0.035

0.059

0.065

0.047

MtMfs

0.666

ID

0.822

0.806

0.043

0.064

0.053

0.037

AtMfs

0.612

0.822

ID

0.806

0.037

0.048

0.069

0.032

OsMfs

0.607

0.806

0.806

ID

0.037

0.043

0.053

0.053

PseMfs

0.035

0.043

0.037

0.037

ID

0.088

0.101

SerrMfs

0.059

0.064

0.048

0.043

0.088

ID

0.103

0.065

0.065

0.071

0.065

0.035

0.023

0.063

0.064

0.044

0.065

0.074

0.059

0.071

0.072

0.065

0.076

0.083

0.071

0.087

0.071

0.048

0.069

0.069

0.075

0.043

0.016

0.100

0.075

0.064

0.095

0.085

0.059

0.091

0.077

0.075

0.075

0.068

0.064

0.064

0.053

0.043

0.053

0.069

0.059

0.053

0.016

0.094

0.075

0.064

0.095

0.090

0.059

0.069

0.077

0.080

0.053

0.073

0.064

0.075

0.069

0.059

0.059

0.069

0.064

0.053

0.010

0.073

0.069

0.079

0.080

0.080

0.064

0.075

0.077

0.086

0.075

0.088

0.080

0.075

0.069

0.056

0.063

0.107

0.063

0.075

0.101

0.044

0.047

0.043

0.044

0.040

0.058

0.063

0.012

0.051

0.086

0.069

0.058

0.054

0.065

0.071

0.096

0.058

0.883

0.103

0.083

0.051

0.064

0.105

0.032

0.039

0.045

0.058

0.178

0.045

0.041

0.093

0.070

0.049

0.054

0.054

0.081

ArcMfs

0.065

0.053

0.069

0.053

0.101

0.103

ID

0.223

0.217

0.116

0.072

0.090

0.078

0.059

0.078

0.043

0.024

0.045

0.048

0.082

0.085

0.056

0.055

0.085

0.073

0.060

0.076

0.049

OceMfs

0.047

0.037

0.032

0.053

0.056

0.096

0.223

ID

0.606

0.096

0.099

0.090

0.086

0.066

0.047

0.070

0.029

0.060

0.042

0.082

0.126

0.031

0.074

0.093

0.049

0.060

0.071

0.054

SalMfs

0.065

0.048

0.043

0.059

0.063

0.058

0.217

0.606

ID

0.051

0.092

0.077

0.093

0.080

0.057

0.064

0.024

0.075

0.058

0.063

0.120

0.051

0.080

0.113

0.039

0.076

0.049

0.049

YerMfs

0.065

0.069

0.053

0.059

0.107

0.883

0.116

0.096

0.051

ID

0.103

0.090

0.051

0.051

0.110

0.027

0.034

0.040

0.058

0.184

0.032

0.046

0.124

0.070

0.058

0.060

0.049

0.065

ExiMfs

0.071

0.069

0.069

0.069

0.063

0.103

0.072

0.099

0.092

0.103

ID

0.123

0.125

0.026

0.036

0.048

0.034

0.035

0.042

0.076

0.112

0.036

0.093

0.132

0.044

0.049

0.071

0.054

BacilMfs

0.065

0.075

0.059

0.064

0.075

0.083

0.090

0.090

0.077

0.090

0.123

ID

0.077

0.064

0.073

0.048

0.039

0.050

0.058

0.133

0.129

0.046

0.086

0.090

0.039

0.071

0.060

0.060

AzoMfs

0.035

0.043

0.053

0.053

0.101

0.051

0.078

0.086

0.093

0.051

0.125

0.077

ID

0.091

0.031

0.075

0.049

0.050

0.053

0.044

0.088

0.062

0.093

0.115

0.058

0.043

0.071

0.065

ZmMfs

0.023

0.016

0.016

0.010

0.044

0.064

0.059

0.066

0.080

0.051

0.026

0.064

0.091

ID

0.063

0.010

0.009

0.015

0.053

0.063

0.068

0.046

0.062

0.054

0.049

0.027

0.021

0.016

SsacMfs

0.063

0.100

0.094

0.073

0.047

0.105

0.078

0.047

0.057

0.110

0.036

0.073

0.031

0.063

ID

0.057

0.054

0.080

0.057

0.073

0.031

0.082

0.073

0.063

0.058

0.057

0.063

0.052

SacMfs

0.064

0.075

0.075

0.069

0.043

0.032

0.043

0.070

0.064

0.027

0.048

0.048

0.075

0.010

0.057

ID

0.054

0.080

0.080

0.059

0.037

0.082

0.081

0.048

0.053

0.054

0.064

0.070

CalMfs

0.044

0.064

0.064

0.079

0.044

0.039

0.024

0.029

0.024

0.034

0.034

0.039

0.049

0.009

0.054

0.054

ID

0.059

0.064

0.049

0.044

0.094

0.044

0.029

0.044

0.069

0.079

0.084

CmalMfs

0.065

0.095

0.095

0.080

0.040

0.045

0.045

0.060

0.075

0.040

0.035

0.050

0.050

0.015

0.080

0.080

0.059

ID

0.085

0.040

0.060

0.075

0.055

0.070

0.063

0.050

0.040

0.045

HmMfs

0.074

0.085

0.090

0.080

0.058

0.058

0.048

0.042

0.058

0.058

0.042

0.058

0.053

0.053

0.057

0.080

0.064

0.085

ID

0.053

0.048

0.088

0.053

0.042

0.073

0.080

0.058

0.053

EcoMfs

0.059

0.059

0.059

0.064

0.063

0.178

0.082

0.082

0.063

0.184

0.076

0.133

0.044

0.063

0.073

0.059

0.049

0.040

0.053

ID

0.057

0.093

0.031

0.070

0.034

0.032

0.038

0.043

VibMfs

0.071

0.091

0.069

0.075

0.012

0.045

0.085

0.126

0.120

0.032

0.112

0.129

0.088

0.068

0.031

0.037

0.044

0.060

0.048

0.057

ID

0.062

0.074

0.204

0.049

0.065

0.065

0.071

CochMfs

0.072

0.077

0.077

0.077

0.051

0.041

0.056

0.031

0.051

0.046

0.036

0.046

0.062

0.046

0.082

0.082

0.094

0.075

0.088

0.093

0.062

ID

0.072

0.062

0.078

0.056

0.041

0.051

TricMfs

0.065

0.075

0.080

0.086

0.086

0.093

0.055

0.074

0.080

0.124

0.093

0.086

0.093

0.062

0.073

0.081

0.044

0.055

0.053

0.031

0.074

0.072

ID

0.062

0.044

0.049

0.054

0.054

ShewMfs 0.076

0.075

0.053

0.075

0.069

0.070

0.085

0.093

0.113

0.070

0.132

0.090

0.115

0.054

0.063

0.048

0.029

0.070

0.042

0.070

0.204

0.062

0.062

ID

0.039

0.054

0.054

0.071

MariMfs

0.083

0.068

0.073

0.088

0.058

0.049

0.073

0.049

0.039

0.058

0.044

0.039

0.058

0.049

0.058

0.053

0.044

0.063

0.073

0.034

0.049

0.078

0.044

0.039

ID

0.044

0.029

0.024

Whtpht1

0.071

0.064

0.064

0.080

0.054

0.054

0.060

0.060

0.076

0.060

0.049

0.071

0.043

0.027

0.057

0.054

0.069

0.050

0.080

0.032

0.065

0.056

0.049

0.054

0.044

ID

0.661

0.628

Atpht15

0.087

0.064

0.075

0.075

0.065

0.054

0.076

0.071

0.049

0.049

0.071

0.060

0.071

0.021

0.063

0.064

0.079

0.040

0.058

0.038

0.065

0.041

0.054

0.054

0.029

0.661

ID

0.825

Solpht1

0.071

0.053

0.069

0.069

0.071

0.081

0.049

0.054

0.049

0.065

0.054

0.060

0.065

0.016

0.052

0.070

0.084

0.045

0.053

0.043

0.071

0.051

0.054

0.071

0.024

0.628

0.825

ID

35

Gambar 15.

Filogenetik berdasarkan asam amino fragmen MaMFS dengan MFS dari organisme lainnya (angka menunjukkan jarak)

36 Analisis Domain Fragmen MaMFS MaMFS memiliki kesamaan tertinggi dengan MtMFS. MtMFS memiliki 12 domain putatif transmembran. Protein MFS tersusun dari 12-14 domain putatif transmembran (TMS) yang diduga terjadi karena duplikasi berulang intragenik dari 6 unit TMS sebelumnya (Rubin et al. 1990; Pao et al. 1998; Van Bambeke et al. 2000). Hasil analisis kesejajaran asam amino fragmen MaMFS yang terdiri dari 168 asam amino dengan MtMFS menunjukkan bahwa fragmen MaMFS sejajar dengan MtMFS pada asam amino ke-209 sampai dengan asam amino ke-375 yang mengandung 4 domain putatif transmembran yaitu TM6, TM7, TM8 dan TM9 (Gambar 16) sebagaimana hasil prediksi transmembran fragmen MaMFS dengan program TMpred 2.0 (Tabel 4). Bagian terkonservasi dari MFS yaitu pada domain TM 2 dan TM 3 yang menentukan fungsi transpor MFS secara umum (Yamaguchi et al. 1992) dan domain TM 5 yang menentukan fungsi MFS sebagai antiporter. Bagian variasi diantaranya yaitu domain TM8 dan TM9 yang menentukan spesifisitas substrat (Ditty et al. 1999)

MFS Melastoma

Gambar 16. Posisi fragmen MFS Melastoma (MaMFS) pada MFS Medicago (MtMFS) berdasarkan hasil analisis kesejajaran asam amino

37 Tabel 4. Analisis domain transmembran menggunakan program TMpred versi 2.0 Segmen Domain TM

Bagian pada Asam amino

Pusat TM (Asam amino ke-)

TM6 (o-i) TM7 (i-o) TM8 (o-i) TM9 (i-o)

46 - 62 73 - 93 113 - 132 126 - 152

54 83 121 136

Nilai TMpred 1078 2034 2052 1533

Keterangan: TM (domain transmembran); i : inside, o : outside (orientasi transmembran heliks); Segmen TM signifikan jika nilai TMpred diatas 500.

Domain TM6 dan TM 7 merupakan domain transmembran yang diketahui menentukan berfungsinya protein (Weinglass et al. 2000) dan domain TM 8 dan TM 9 merupakan domain transmembran yang menentukan spesifisitas substrat MFS. Berdasarkan analisis kesejajaran antara fragmen MFS pada TM6 dan TM7 (asam amino ke-46 sampai dengan asam amino ke-93 pada MaMFS) serta TM8 dan TM9 (asam amino ke-113 sampai dengan asam amino ke-152 pada MaMFS) kemungkinan MaMFS mempunyai peran yang sama dengan MFS lainnya yaitu dalam transpor senyawa toksik dan multidrug transporter. Hasil analisis kemiripan terhadap TM6 – TM9 dari MaMFS dan TM MFS dari beberapa spesies lainnya secara umum menunjukkan bahwa TM6-TM9 MaMFS mempunyai kesamaan dengan TM6-TM9 MFS dari kelompok tanaman dan berbeda dengan TM MFS yang berasal dari kelompok bakteri, Archaea dan manusia. Hasil analisis kemiripan TM6-TM9 MaMFS dengan MtMFS, AtMFS dan OsMFS disajikan pada Tabel 5. TM6-TM9 dari MaMFS mempunyai kesamaan dengan TM6-TM9 MFS dari M. truncantula (MtMFS), A. thaliana (AtMFS) dan O. sativa (OsMFS) yang ditunjukkan dengan persentase kemiripan berkisar dari 75.00% sampai dengan 100.00%. Hasil analisis kesejajaran transmembran dan pusat transmembran TM6-TM9 MaMFS dengan MtMFS, AtMFS dan OsMFS disajikan pada Gambar 17. MaMFS mempunyai pusat TM6, TM7 dan TM9 yang sama dengan MtMFS, AtMFS dan OsMFS yaitu berturut-turut asam amino tirosin (Y) pada asam amino ke-54, asam amino isoleusin (I) pada asam amino ke-83 dan asam amino leusin (L) pada asam amino ke-136. Pusat TM8 MaMFS, MtMFS, AtMFS dan

38 OsMFS adalah asam amino yang berbeda. TM8 MaMFS mempunyai pusat asam amino isoleusin (I), pusat TM8 MtMFS adalah alanin (A) dan pusat TM8 AtMFS sama dengan OsMFS yaitu asam amino leusin (L). Tabel 5. Kemiripan TM6, TM7, TM8 dan TM9 dari MaMFS dengan MtMFS, AtMFS dan OsMFS Nama MFS

Kemiripan/identities dengan MaMFS (%) TM6

TM7

TM8

TM9

MtMFS

94.12

90.48

90.00

81.48

AtMFS

100.00

85.71

80.00

77.78

OsMFS

94.12

80.95

75.00

85.18

Keterangan: Biru : Asam amino nonpolar tidak bermuatan Merah : Asam amino polar tidak bermuatan Huruf dalam lingkaran merah adalah pusat transmembran

Gambar 17. Analisis kesejajaran transmembran TM6, TM7, TM8 dan TM9 MaMFS dengan MtMFS, AtMFS dan OsMFS

39 Berdasarkan polaritas asam amino penyusunnya, TM6-TM9 tersusun dari asam amino dengan gugus R non polar (hidrofobik) dan gugus R polar (hidrofilik). Asam amino dengan gugus R non polar mendominasi pada masingmasing TM tersebut. Hal ini sesuai dengan sifat protein transpor yang terintegrasi di dalam membran yang mempunyai hidrofobisitas tinggi karena tersusun dari fosfolipid.

Walaupun demikian, untuk menjalankan fungsinya

sebagai transporter protein ini kadang kala memiliki saluran hidrofilik yang digunakan sebagai saluran oleh molekul tertentu untuk melewati membran. Nilai kemiripan yang tinggi pada domain TM6-TM9 antara MaMFS dan MFS dari M. truncantula, A. thaliana dan O. sativa dapat menjadi indikasi bahwa MaMFS mempunyai fungsi yang sama dan mirip dengan fungsi dari MtMFS, AtMFS dan OsMFS. Walaupun demikian, untuk mengetahui fungsi atau peran MaMFS secara pasti, isolasi cDNA utuh dari MaMfs perlu dilakukan. TM6-TM9 MaMFS mengandung lima motif domain yaitu (1) tiga domain tempat fosforilasi kasein kinase II (CK2), (2) empat domain tempat miristiolasi, (3) dua domain tempat fosforilasi protein kinase C (PKC), (4) dua domain tempat glikosilasi dan (5) satu domain tempat target sinyal mikrobodi C terminal yang terletak pada asam amino ke 153 sampai dengan asam amino ke-155. Domain tempat fosforilasi kasein kinase II terletak pada asam amino ke-29 sampai dengan asam amino ke-32, asam amino ke-30 sampai dengan asam amino ke-33 dan asam amino ke-64 sampai dengan asam amino ke-67. Domain tempat miristiolasi terletak pada asam amino ke-73 sampai dengan asam amino ke-78, asam amino ke-80 sampai dengan asam amino ke-85, asam amino ke-143 sampai dengan asam amino ke-148 dan asam amino ke 145 sampai dengan asam amino ke-150. Domain fosforilasi PKC terletak pada asam amino ke-101 sampai dengan asam amino ke-103 dan asam amino ke-146 sampai dengan asam amino ke-148. Domain glikosilasi terletak pada asam amino ke-102 sampai dengan asam amino ke-105 dan asam amino ke-151 sampai dengan asam amino ke-154. Domain tempat target sinyal mikrobodi C terminal terletak pada asam amino ke153 sampai dengan asam amino ke-155. Lima motif domain pada fragmen MaMFS disajikan pada Gambar 18.

40

Kasein Kinase II

Kasein Kinase II

PKC Kasein Kinase II

Glikosilasi

Miristiolasi PKC

Glikosilasi Mikrobodi C

Gambar 18. Motif domain pada TM6-TM9 dari MaMFS

Analisis Hidrofobisitas Fragmen MaMFS Hasil analisis hidrofobisitas menunjukkan profil hidrofobisitas fragmen MaMFS yang mirip dengan MFS dari M. truncantula (Gambar 18). Kemiripan profil ini dimulai dari asam amino ke-207 sampai dengan 361 pada M. truncantula. Berdasarkan hal ini untuk sementara dapat diketahui bahwa domain transmembran yang dimiliki fragmen MaMFS adalah TM6 , TM7, TM8 dan TM9.

Domain TM6 dan TM 7 diketahui menentukan fungsi protein

(Weinglass dan Kaback 2000) dan domain TM8 dan TM 9 diketahui menentukan spesifisitas substrat (Ditty dan Hardwood 1999). TM6, TM7, TM8 dan TM9 dari MaMFS bersifat hidrofobik. Keempat domain TM ini tersisip di dalam membran plasma yang tersusun dari fosfolipid yang juga bersifat hidrofobik. Di akhir TM9 yang berada di sisi luar (outside) bersifat hidrofilik. Bila TM ini terdapat di dalam organel maka sisi luar dari membran adalah sitosol. Adanya asam amino hidrofilik pada TM9 kemungkinan digunakan sebagai saluran lewatnya molekul tertentu.

41

Gambar 19. Profil hidrofobisitas MFS M. truncantula

TM6

TM7

TM8

TM9

Gambar 20. Profil hidrofobisitas fragmen MaMFS dan fragmen MFS M. truncantula (garis merah : MaMFS ; garis biru: MFS M. tuncantula)

KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Fragmen cDNA Mfs yang berukuran 511 pb telah berhasil diisolasi dari M. affine (MaMfs) dan diklon ke dalam vektor pGEM-T Easy. MaMfs mempunyai kesamaan yang tinggi dengan MtMfs dari M. truncantula. Berdasarkan urutan asam amino yang dideduksi dari cDNA dan kesejajaran terhadap MtMFS, fragmen MaMFS mengandung empat domain transmembran, yaitu TM6, TM7, TM8 dan TM9 yang mempunyai hidrofobisitas yang tinggi. Saran Untuk mengetahui kesamaan MFS dari M. affine dengan spesies lain dan perannya dalam mekanisme resistensi terhadap senyawa-senyawa toksik khususnya Al, cDNA utuh dari gen Mfs harus diisolasi. Isolasi cDNA MaMfs utuh dapat dilakukan melalui penapisan terhadap pustaka cDNA dengan menggunakan fragmen MaMfs yang didapat dari penelitian ini sebagai pelacak. Selain itu, metode RACE (Rapid Amplified cDNA End) juga dapat digunakan untuk mengisolasi cDNA utuh dengan menggunakan fragmen cDNA MaMfs sebagai dasar melakukan desain primer.

DAFTAR PUSTAKA

Alarco AM, Balans I, Talibi D, Mainville N, Raymond M. 1997. AP1-mediated multidrug resistance in Saccharomyces cerevisiae requires FLR1 encoding a transporter of the major facilitator superfamily. J Biol Chem 272:19304-19313. Blokhina O, Virolainen E, Fagerstedt KV. 2002. Antioxidants damage and oxygen deprivation stress: a review. Ann Bot 91:179-194. Chang S, Puryear J, Cairney J. 1993. A Simple and efficient method for isolating RNA from pine trees. Plant Mol. Biol. Rep. 11: 113-116. de la Funte JM, Ramirez-Rodriguez V, Cabrera-Ponce JL, Herreea-Estrella L. 1997. Aluminum tolerance in transgenic plant by alterration of citrate synthesis. Sci. 276 (5318): 1566-1568. Delhaize E, Ryan PR. 1995. Aluminum toxicity and tolerance in plant. Plant Physiol 107:315-321. Delhaize E. 2004. Aluminum Toxicity Tolerance. http://www.plantstress. com /Articles/toxicity_m/Tolerance.htm. [20 Maret 05] Dengenhardt J, Larsen PB, Howell SH, Kochian LV. 1998. Aluminum resistance in the Arabidopsis mutant alr-104 is caused by an aluminum increase in rhizosphere pH. Plant Physiol 122: 657-666. Ditty JL, Hardwood CS. 1999. Concerved cytoplasmic loops are important for both the transport and chemotaxis functions of PcaK, a protein from Pseudomonas putida with 12 membrane-spanning regions. J Bact 181: 5068-5074. Farrel RE. 1993. RNA Methodologies. A Laboratory Guide for Isolation and Characterization. Academic Press Inc. USA. 317p. Griffith JK, Baker ME, Rouch DA, Page MGP, Skurray RA, Paulsen IT, Chater KF, Baldwin SA, Henderson PJF. 1992. Membrane transport proteins:implications of sequence comparison. Curr Opin Cell Biol 4:684-695. Goffeau A, Park J, Paulsen IT, Jonniaux JL, Dinh T, Mordant P, Saier Jr MH. 1997. Multidrug-resistant transport proteins in yeast: complete inventory and phylogenetic characterization of yeast open reading frames within the major facilitator superfamily. Yeast 13:43-54. Haug A. 1984. Molecular aspects of aluminum toxicity. CRC Crit Rev. Plant Sci 1:345-373. Hall, TA. 1999. BioEdit : a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nuc Acids Symp Ser 41:95-98.

44 Hayashi K, Schoonbeek H, De Waard MA. 2002. Bcmfs1, a novel major facilitator superfamily transporter from Botrytis cinerea, provides tolerance towards the natural toxic compounds camptothecin and cercosporin and towards fungicides. Appl Environmental Microb 68:4996-5004. Helyar. 1998. The symptoms and effect on plants of nutrient disorders in acid soils. Dalam: 25 years of the Riverina Outlook Conference, Wagga Wagga, 1973-1998 (online). http://www.regional.org.au/au/roc/1981 /roc198147.htm Henderson PJF, Maiden MCJ. 1990. Homologous sugar transport proteins in Escherichia coli and their relatives in both prokaryotes and eukaryotes. Philos.Trans.R.Soc. London Ser.B 326:391-410. Heymann P, Joachim F, Winkelmann G. 2000. A gene of the major facilitator superfamily encodes a transporter for enterobactin (Enb1p) in Saccharomyces cerevisiae. Chem Materials Sci 13: 65-72. Huang JW, Pellet PM, Papernik LA, Kochian LV. 1996. Aluminum interaction with voltage dependent calcium transport in plasma membrane vesicle isolated from roots of aluminum-sensitive and resistant wheat cultivars. Plant Physiol 110:561-569. Hue NV, Craddoc GR, Adams F. 1986. Effect of orgnic acids on aluminum toxicity in subsoils. Soil Sci Am J 50:28-34. Johnson JP, Cerver BF, Baligar VC. 1997. Expression of aluminum tolerance transferred from Atlas 66 to hard winter wheat. Crop Sci 37:103-108. Kasai M, Sasaki M, Tanakamuru S, Yammamoto Y, Matsumoto H. 1993. Possible involvement of absicis acid in increases in activities of two vacuolar H+- pumps in barley roots under aluminum stress. Plant cell Physiol 34(8):1335-1338. Kasai M, Sasaki M, Yamasita K, Yammamoto Y, Matsumoto H. 1995. Increased of ATP-dependent H+pump activity of tonoplast of barley roots by aluminum stress: Possible involvement of absisic acid for the regulation. Hlm:341-344. Dalam Date RA (ed), Plant Soil Interactions at Low pH. Kluwer Acad Publ, Netherland. Katoh K, Kuma K, Toh H, Muyata T. 2005. MAFFT version 5: improvement in accuracy of multiple sequence alignment. Nuc Ac Res 33(2):511–518. Kennedy IR. 1992. Acid Soil and Acid Rain. Second Edition. John Wiley & Sons inc. New York. 254p. Kinraide TB, Ryan RR, Kochian LV. 1994. Al3+- Ca3+ interaction in aluminum rhizotoxicity. II. Evaluating the Ca2+ displacement hypotesis. Planta 192:104-109.

45 Kinraide TB. 1991. Identity of the rhizotoxic aluminum species. Plant Soil 134: 167-178. Kochian LV. 1995. Cellular mechanism of aluminum toxicity and resistance in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 46:237-260. Kohli A, Gupta V, Krishnamurthy S, Hasnain SE Prasad R. 2001. Specificity of drug transport mediated by CaMDR1: a major facilitator superfamily of Candida albicans. J Biosci 26:333-339. Larsen PB, Degenhardt J, Tai Chin-Yin, Stenzler LM, Howell SH, Kochian LV. 1998. Aluminum resistant arabidopsis mutants that exhibit altered patterns of aluminum accumulation and organic acid release from roots. Plant Physiol 117:9-18. Li L, He Z, Pandey GK, Tsuchiya T, Luan S. 2001. Functional cloning and characterization of a plant efflux carrier for multidrug and heavy metal detoxification. J Biol Chem 277:5360-5368. Ma JF, Hiradate S, Nomoto K, Iwashita T, Matsumoto H. 1997. Internal detoxification mechanism of Al in Hydrangea. Identification of Al form in the leaves. Plant Physiol 113:1033-1039. Ma JF, Hiradate S dan Matsumoto H. 1998. High aluminum resistant in buckwheat. II Oxalic acid detoxifies aluminum internally. Plant Physiol 117:753-759. Ma JF, Hiradate S. 2000. Form of aluminum for uptake and translocation in buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench). Planta 211: 355-360. Ma JF, Ryan PR, Delhaize E. 2001. Aluminum tolerance in plants and the complexing role of organic acids. Trends Plant Sci 6:273-278. Martin RB. 1986. The chemistry of aluminum as related to biology and medicine. Clin Chem 32:1797-1806 Martin RB. 1988. Bioinorganic chemistry of aluminum. Di dalam: Sigel H, Sigel A, editor. Metal Ions in Biological Systems: Aluminum and Its Role in Biology. Vol.24. New York:Marcel-Dekker. hlm 1-57. Marger MD, Saier MH. 1993. A major superfamily of transmembrane facilitators catalyzing uniport, symport and antiport. Trends Biochem Sci 18:13-20. Matsumoto H. 2000. Cell biology of aluminum toxicity and tolerance in higher plants. Internat Rev cyt Vol 200:1-46. Matsumoto H. 1991. Biochemical mechanism of the toxicity of aluminum and the sequestration of aluminum in plant cell. Dalam: Wright RJ, editor. Plant-Soil Interactions at low pH. Netherlands: Kluwer academic Press. hlm 825-838.

46 Meyer K. 1999. Introduction to Melastoma. http://www.uni-mainz.de /FB/ Biologie/Botanikspeziell/web_old/Botanikspeziell/oldPages/Melastoma taceae/Melastoma1.html. [23 Januari 2005] Miyasaka SC, Buta JG, Howell RK, Foy CD. 1991. Mechanism of aluminum tolerance in snapbeans: root exudation of citric acid. Plant Physiol 96:737-743. Ojima K, Abe H, Ohira K. 1984. Release of citric acid into the medium by aluminum tolerant carrot cells. Plant cell Physiol 25:885-854. Osaki M, Watanabe T, Tadano T. 1997. Beneficial effect of aluminum on growth of plants adapted to low pH soils. Soil Sci Plant Nutr 43: 551563. Pao SS, Paulsen IT, Saier JMH. 1998. Major facilitator superfamily. Microb Mol Biol Rev 62:1-34. Paulsen IT, Beness AM, Saier Jr MH. 1997. Computer-based analyses of the protein constituents of transport system catalyzing export of complex carbohydrates in bacteria. Microb 143:2685-2699. Pellet DM, Papernik LA, Kochian LV. 1996. Multiple aluminum-resistance mechanism in wheat. Roles of root apical phosphate and malate exudation. Plant Physiol 125:292-305. Promega. 2003. Technical Manual: pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vector Systems. USA: Promega Corporation. Puslitbang Tanah. 1999. Tipe tanah. Bogor: Pengembangan Tanah dan Agroklimat.

Pusat Penelitian dan

Rashidi HH, Buehler LK. 2000. Bioinformatics Basic. CRC Press LLC. New York. Rubin RA, Levy SB, Heinrikson RL, Kezdy FJ. 1990. Gene duplication in the evolution of the two complementing domains of Gram-negative bacterial tetracycline efflux proteins. Gene 87:7-13. Ryan PR, Delhaize E. Jones DL. 2001. Function and mechanism of organic anion exudation from plant roots. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 52:527-560. Ryan PR, Delhaize E, Randall PJ. 1995. Malate efflux from root apices and tolerance to aluminum are highly correlated in wheat. Plant Physiol 22:531-536. Saunders GC, Parkes HC. 1999. Analytical Molecular Biology. Wiltshire UK : Redwood Books Ltd.

47 Sasaki M, Kasai M, Yammamoto Y, Matsumoto H. 1995. Involvement of plasma membrane potential in the tolerance mechanism of plant roots to aluminum toxicity. Hlm:285-290. Dalam: Date RA, editor. Plant Soil Interactions at Low pH. Kluwer Acad. Publ., Netherland. Sasaki M, Kasai M, Yammamoto Y, Matsumoto H. 1994. Comparison of the early response to aluminum stress between tolerant and sensitive wheat cultivar: root growth, aluminum content and efflux of K+. Plant Nutr 17(7):1275-1288. Simmons CR, Fridlender M, Navarro PA, Yalpani Y et al. 2003. A maize defense-inducible gene is a major facilitator superfamily member related to bacterial multidrug resistance efflux antiporters. Plant Mol Biol 52:433-446. Sopandie D, Jusuf M, Hamim, Supiatno. 1996. Fisiologi dan Genetik Daya Adaptasi Kedelai terhadap Cekaman kekeringan dan pH Rendah dengan Al tinggi. Laporan Riset Unggulan Terpadu (RUT I). Suharsono. 2002. Konstruksi pustaka genom kultivar Slamet. Hayati 9 (3): 67-70. Taylor GJ. 1991. Current views of the aluminum stress response: the physiological basis of tolerance. Biochem Physiol 10:57-93. Tice KR, Parker DR, deMason DA. 1992. Operationally defined apoplastic and symplastic aluminum fractions in root tips of aluminum-intoxicated wheat. Plant Physiol 100:309-318. USDA. 2004. http://plants.usda.gov/cgibin/topics.cgi?earl=plant_profile.cgi & symbol=MEMA. [23 Januari 2005] Van Bambeke F, Balzi E, Tulkens PM. 2000. Antibiotic efflux pumps. Biochem Pharmacology 60: 457-470. Vardy E, Arkin IT, Gottschalk KE, Kaback HR, Schuldiner S. 2004. Structural conservation in the major facilitator superfamily as revealed by comparative modeling. Prot Sci 13:1832-1840. Wareing PF, Philips IDJ. 1981. Growth and Differentiation in Plants. 3rd Ed. New York: Oxford-Pergamon Press. Watanabe T, Jansen S, Osaki M. 2003. A physiological study of Melastoma malabathricum, an aluminum accumulating woody plant. http://www.keele.ac.uk/depts/ch/groups/aluminum/watanabe.Po.pdf. [15 Pebruari 2004]. Watanabe T, Osaki M. 2002. Role of organic acids in aluminum accumulation and plant growth in Melastoma malabathricum. Tree Physiol. 22: 785792 (serial online). http://heronpublishing.com/tree/pdf/volume22/22785.pdf. [29 Februari 2002].

48 Watanabe T, Osaki M. 2001. Influence of aluminum and phosphorus on growth and xylem sap composition in Melastoma malabathricum L. Plant and soil 237: 63-70. Watanabe T, Osaki M, Tadano T. 2001a. Al uptake kinetics in roots of Melatoma malabathricum L. –an Al accumulator plant. Plant and Soil 231:283-291. Weinglass AB, Kaback HR. 2000. The central cytoplasmic loop of the major facilitator superfamily of transport protein governs efficient membrane insertion. Proc Natl Acad Sci 97:8938-8943. Wenzl P, Platino GM, Chaves AL, Meyer JE, Rao IM. 2001. The high level of aluminum resistance in signalgrass is not associated with known mechanism of aluminum detoxification in root apices. Plant Physiol 125:1473-1484. Yamaguchi A, Someya A, Sawai T. 1992. Metal-tetracycline-proton antiporter of Escherichia coli encoded by transposon TN10. The role of a conserved sequence motif GXXXXRXGRR in a putative cytoplasmic loop between helices 2 and 3. J Biol Chem 267:19155-19162. Zheng SJ, Ma JF, Matsumoto H. 1998. High aluminum resistant in buckwheat. Al-induced specific secretion of oxalic acid from root tips. Plant Physiol 117:753-759.

49 Lampiran 1. Daftar asam amino dan polaritas

No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Singkatan Singkatan (3 huruf) (1 huruf) Ala A Arg R Asn N Asp D Cys C Glu E Gln Q Gly G His H Ile I Leu L Lys K Met M Phe F Pro P Ser S Thr T Trp W Tyr Y Val V

Asam Amino

Polaritas

Alanin Arginin Asparagin Asam aspartat Sistein Asam glutamat Glutamin Glisin Histidin Isoleusin Leusin Lisin Metionin Fenilalanin Prolin Serin Treonin Triptofan Tirosin Valin

Nonpolar, tidak bermuatan Polar, bermuatan positif Polar, tidak bermuatan Polar, bermuatan negatif Nonpolar, tidak bermuatan Polar, bermuatan negatif Polar, tidak bermuatan Nonpolar, tidak bermuatan Polar, bermuatan positif Nonpolar, tidak bermuatan Nonpolar, tidak bermuatan Polar, bermuatan positif Nonpolar, tidak bermuatan Nonpolar, tidak bermuatan Nonpolar, tidak bermuatan Polar, tidak bermuatan Polar, tidak bermuatan Nonpolar, tidak bermuatan Polar, tidak bermuatan Nonpolar, tidak bermuatan

50 Lampiran 2. Hasil sekuensing DNA sisipan (fragmen MaMfs) pada pGEM®-T Easy menggunakan primer sp6

Sekuen SP6 P4 AGCATCAACGCGTTGGGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCAGG CGGCCGCGAATTCACTAGTGATTGAAGCTTAGACCGATTAACTCA TCCAACAAACTTTTTGAATTTCTTGGCTCAACATGCCTTCATCATT CAAGAAGAATTGCCTGCTTCTACTGATGAAGAAGCTGCAGACCAA AAATATCATCTCATGTCGCTTCTTTTGAACCTGGGGAACACTTTC CTGTACATGGTGAATACCTATATCATTGTTCCCACAGCGGATGAT TATGCAACCAGCCTTGGTGCTGCTGCTACCGTATGTGGCATCGTC ATTGGTGCGATGGCTGTGGCTCAAATATTCTCCTCTGTTTACTTC AGCGCTTGGTCAAATAAGTCGTACTACAGGCCACTCATATTTAGC AGCATTGTTCTCTTTCTGGGAAATATAATGTATGCATTGGCCTAT GATCTCAATTCAATTGGTGTTCTCCTTGTCGGTAGGCTTTTCTGT GGTCTAGGCTCTGCCAGAGCTGTTAATCGGTCTAAGCTTCAATCG AATTCCCGCGGCCGCCATGGCGGCCGGGAGCATGCGACGTCAGG CCGAATTCTCCCTATATGGGTCGTATTATAATGAATAGTCCTGCC TCCCCCTCCCCAACAAAAAAAAAAGCGGAAGCTTAATTGTGAAGG CGGGGGGGGCGGAAGGGAGGGCTACCCCCATTTCTTTTTGTTGC TTAGCCCCCCCCCTTCCCCCCCGGAAAAAAGTTGGGCCCCCTGCT TAT Keterangan: Hitam : DNA sisipan Hijau : Primer spesifik MFS-Forward dan MFS-Reverse Merah : Situs restriksi EcoR1 Biru : Bagian dari vektor pGEMT-easy

Lampiran 3. Hasil analisis penyejajaran urutan nukleotida fragmen MaMfs dengan gen pada data GenBank menggunakan program Blast WU-Blast2 Summary Table SUBMISSION PARAMETERS Title

Sequence Database

embl

Sequence length

510

n

Program

WU-blastn Version

Number of scores

100

Expected threshold 10 View filter

Alignment

DB:ID

Sequence type

2.0MP-WashU [01-Jan-2006]

Number of alignments 50 Filter

dust

yes

Source

Length

Score Identity% Positives%

E()

1

EM_PL:AK243620

Oryza sativa (japonica cultivar-group) cDNA, clone: J100085P12, full insert sequence.

2211

1144 73

73

2.5e-44

2

EM_PL:AY056374

Arabidopsis thaliana AT4g22990/F7H19_170 mRNA, 2428 complete cds.

1148 74

74

2.8e-44

3

EM_PL:AK241359

2782

1126 73

73

4.6e-43

4

EM_PL:AL031018

139316

1111 73

73

7.3e-42

Oryza sativa (japonica cultivar-group) cDNA, clone: J065151E04, full insert sequence. Arabidopsis thaliana DNA chromosome 4, BAC clone F7H19 (ESSA project)

51

5

EM_PL:AL161558

Arabidopsis thaliana DNA chromosome 4, contig fragment No. 58

193550

1111 73

73

7.3e-42

6

EM_PL:AY035094

Arabidopsis thaliana unknown protein (At1g63010) mRNA, complete cds.

2013

1080 71

71

1.3e-41

7

EM_PAT:CQ805036

Sequence 1447 from Patent WO2004035798.

2100

1080 71

71

2.0e-41

8

EM_PL:AC148655

Medicago truncatula clone mth2-61c11, complete sequence.

89884

1100 73

73

2.3e-41

9

EM_PL:AK230262

Arabidopsis thaliana mRNA for tetracycline resistance efflux protein like protein, complete cds, clone: RAFL23-26-B19.

2809

1080 71

71

6.2e-41

10

EM_PL:AP000391

Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic DNA, chromosome 6, PAC clone:P0538C01.

155643

1063 73

73

1.1e-39

11

EM_PL:AP005775

Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic DNA, chromosome 2, BAC clone:OSJNBb0005A04.

140723

1057 71

71

2.0e-39

12

EM_PL:AP005823

Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic DNA, chromosome 2, PAC clone:P0663F07.

159046

1057 71

71

2.0e-39

13

EM_PL:AP008208

Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic DNA, chromosome 2.

35954743 1057 71

71

2.0e-39

14

EM_PL:AK066068

Oryza sativa (japonica cultivar-group) cDNA clone:J013056J05, full insert sequence.

2706

1031 70

70

1.0e-38

15

EM_PL:AP008212

Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic DNA, chromoso me 6.

30731886 1063 73

73

1.0e-37

16

EM_PL:AC011000

Sequence of BAC F16P17 from Arabidopsis thaliana 98412 chromosome 1, complete sequence.

71

5.5e-37

1003 71

52

17

EM_PL:AC010795

Arabidopsis thaliana chromosome 1 BAC F16M19 genomic sequence, complete sequence.

100512

1003 71

71

5.5e-37

18

EM_PL:AC148817

Medicago truncatula chromosome 7 BAC clone mth2-22c10, complete sequence.

123020

979

71

71

6.7e-36

19

EM_PL:CR855158

Oryza sativa genomic DNA, chromosome 4, BAC clone: OSIGBa0147H17.

79528

939

70

70

4.2e-34

20

EM_PL:AL606640

Oryza sativa genomic DNA, chromosome 4, BAC clone: OSJNBa0019K04.

154865

939

70

70

4.3e-34

35498469 939

70

70

4.3e-34

90824

915

73

73

5.2e-33

21

EM_PL:AP008210

Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic DNA, chromosome 4.

22

EM_PL:AL078606

Arabidopsis thaliana DNA chromosome 4, BAC clone T26M18 (ESSA project)

23

EM_PL:AL161532

Arabidopsis thaliana DNA chromosome 4, contig fragment No. 32

198788

915

73

73

5.2e-33

24

EM_PL:AY951945

Triticum monococcum TmBAC 60J11 FR-Am2 locus, 103866 genomic sequence.

860

65

65

1.6e-30

25

EM_PL:AP006859

Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic 41326 DNA, chromosome 9, fosmid clone:OSJNOa273B05.

799

69

69

8.8e-28

26

EM_PL:AP008215

Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic DNA, chromosome 9.

22696651 799

69

69

9.1e-28

27

EM_PL:AC126009

Medicago truncatula clone mth2-15c20, complete sequence.

118705

68

68

2.2e-25

746

53

28

EM_PL:AC137822

Medicago truncatula clone mth2-31e20, complete sequence.

140561

746

68

68

2.2e-25

29

EM_PL:BT000805

Arabidopsis thaliana clone At1g63010 mRNA sequence.

1468

475

72

72

1.7e-13

30

EM_PAT:AR690453

Sequence 15 from patent US 6906243.

311

222

70

70

0.042

31

EM_PAT:AX224654

Sequence 1 from Patent WO0161021.

1502

264

60

60

0.048

32

EM_HUM:AM408131

Homo sapiens partial mRNA for T cell receptor delta 354 chain variable region (TCRDV1 gene), isolate MY2

215

100

100

0.084

33

EM_PL:AJ309392

Atropa belladonna partial mRNA, 3'UTR, clone nh21.1

260

217

95

95

0.090

34

EM_PAT:AR690451

Sequence 13 from patent US 6906243.

314

215

69

69

0.095

35

EM_PAT:AR690452

Sequence 14 from patent US 6906243.

314

212

69

69

0.13

36

EM_FUN:AM159634

Trichosporon mucoides partial ITS1, clone K28

350

210

100

100

0.15

37

EM_FUN:AM159621

Wallemia sebi partial ITS1, clone K13

343

210

100

100

0.15

38

EM_PAT:BD262146

Composition and methods for the modification of gene expression.

288

210

100

100

0.18

39

EM_PAT:DD014284

Compositions and Methods for the Modification of Gene Expression.

288

210

100

100

0.18

40

EM_PAT:AR360931

Sequence 38 from patent US 6596925.

288

210

100

100

0.18

54

41

EM_PAT:CS029092

42

EM_OM:AB103899

43

EM_PAT:CQ809274

44

EM_PAT:AX320063

45

EM_PAT:DD270966

46

EM_OV:AB275897

47

EM_PAT:CQ809391

48 49

50

Sequence 165 from Patent WO2004113528.

214

210

100

100

0.25

337

206

95

95

0.25

318

201

97

97

0.47

534

237

76

76

0.50

HER-2 Receptor Tyrosine Kinase Molecules and Uses Thereof. 884

243

67

67

0.54

2523

244

58

58

0.77

Sequence 694 from Patent WO2003097790.

135

204

72

72

0.79

EM_FUN:AM159628

Eurotium amstelodami partial ITS1, clone K56

371

210

100

100

0.86

EM_PAT:DD270964

HER-2 Receptor Tyrosine Kinase Molecules and Uses 2132 Thereof.

242

64

64

0.95

EM_PAT:DD234601

Method for measuring influences on DNA of an individual so far given to the individual by exposure 419 to chemical substances.

222

72

72

1.1

Equus caballus DNA, microsatellite TKY681. Sequence 577 from Patent WO2003097790. Sequence 20 from Patent WO0181606.

Gallus gallus STAT4 mRNA for STAT4, complete cds.

55

57 Lampiran 4.

Hasil analisis kesejajaran lokal berdasarkan urutan nukleotida antara MaMfs dengan MtMfs

Lampiran 5. Hasil analisis penyejajaran urutan asam amino fragmen MaMFS dengan data GenBank menggunakan program Blast

WU-Blast2 Summary Table SUBMISSION PARAMETERS Title Sequence length Program Matrix

Sequence 169 WU-blastp BLOSUM62

Number of alignments 50

Alignment 1

2

DB:ID

Database Sequence type Version Number of scores

uniprot p 2.0MP-WashU [01-Jan-2006] 100

Expected threshold 10

Source

Length Score Identity% Positives%

SPX, N-terminal; Major UNIPROT:Q1S1V4_MEDTR facilitator superfamily 665 MFS_1. Hypothetical protein UNIPROT:O82747_ARATH F7H19.170 (Hypothetical 598 protein AT4g22990).

E()

640

80

88

1.1e-61

630

77

90

1.3e-60

3

UNIPROT:Q93ZQ5_ARATH

AT4g22990/F7H19_170. 699

630

77

90

1.3e-60

4

UNIPROT:Q9T050_ARATH

Hypothetical protein AT4g11810.

612

74

85

1.1e-58

707

58

5

UNIPROT:Q658H5_ORYSA

6

UNIPROT:Q01JW8_ORYSA

7

UNIPROT:Q6EPQ3_ORYSA

8

UNIPROT:Q7XTZ1_ORYSA

9

UNIPROT:Q0JAW2_ORYSA

10

UNIPROT:Q0DYP3_ORYSA

11

UNIPROT:Q0DEX8_ORYSA

12

UNIPROT:Q2V4F9_ARATH

13

UNIPROT:Q94C80_ARATH

14

SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domain-containing protein-like. OSIGBa0147H17.5 protein. SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domain-containing protein-like. OSJNBa0019K04.6 protein. Os04g0573000 protein (Fragment). Os02g0678200 protein. Os06g0129400 protein. Protein At1g63010.

Hypothetical protein At1g63010. Hypothetical protein UNIPROT:Q9CAP0_ARATH F16M19.18.

698

611

75

88

1.3e-58

696

606

73

88

4.5e-58

697

606

73

88

4.5e-58

725

606

73

88

4.5e-58

770

606

73

88

4.5e-58

657

606

73

88

4.5e-58

946

611

75

88

4.7e-58

697

600

73

88

2.0e-57

646

600

73

88

2.0e-57

525

600

73

88

2.0e-57

59

15

UNIPROT:Q9LQ03_ARATH

16

UNIPROT:Q2HVI9_MEDTR

17

UNIPROT:Q2VQ31_TRIMO

18

UNIPROT:Q64MA4_ORYSA

F16P17.18 protein (Tetracycline resistance 699 efflux protein like protein). Beta-lactamase, class A; SPX, N-terminal; Major 708 facilitator superfamily MFS_1.

600

73

88

2.0e-57

592

73

90

1.4e-56

SPX domain-like protein. 693

587

71

87

4.7e-56

Hypothetical protein OSJNOa273B05.6.

570

572

70

85

1.8e-54

19

UNIPROT:Q1SR64_MEDTR Hypothetical protein.

133

402

62

79

1.9e-36

20

UNIPROT:Q4P5F8_USTMA

Hypothetical protein.

514

146

33

55

2.4e-08

21

UNIPROT:O74921_SCHPO

SPCC757.11c protein.

471

138

33

52

1.5e-07

137

27

51

2.1e-07

128

30

50

2.0e-06

126

30

51

2.2e-06

22

UNIPROT:Q12519_SCHPO

23

UNIPROT:YCS1_SCHPO

24

UNIPROT:Q5FJ70_LACAC

Hypothetical protein (DNA sequence with open reading frame and ARS 500 elements) (SPCC330.07c protein). Hypothetical protein 497 CC613.01. Putative transporter392 membrane protein.

60

25

UNIPROT:Q54X11_DICDI

26

UNIPROT:A0KME4_AERHY

27

UNIPROT:Q4K562_PSEF5

28

UNIPROT:O07037_PSEAE

29

UNIPROT:A0IR84_9ENTR

30

UNIPROT:Q1IFT6_9PSED

31

UNIPROT:Q0W2N8_9EURY

32

UNIPROT:Q1N2F2_9GAMM

33

UNIPROT:Q2XH28_PSEPU

34

UNIPROT:Q88QK6_PSEPK

35

UNIPROT:Q3J6T2_NITOC

36

UNIPROT:Q8ZRC8_SALTY

Hypothetical protein.

567

Inner membrane transport 453 protein YajR. Major facilitator family 464 transporter. Hypothetical protein 132 (Fragment). Major facilitator 454 superfamily MFS_1. Putative transporter, MFS 464 superfamily. Putative permease (Major 395 facilitator superfamily). Major facilitator family 444 transporter. Major facilitator family 464 transporter. Major facilitator family 464 transporter. Major facilitator 472 superfamily MFS_1 precursor. Putative MFS family 449 transporter.

128

26

49

2.4e-06

125

31

52

3.6e-06

124

28

53

4.8e-06

115

26

48

4.9e-06

122

31

53

2.3e-05

122

28

52

2.4e-05

121

29

60

3.1e-05

121

33

54

3.8e-05

121

28

52

4.0e-05

121

28

52

4.0e-05

121

29

54

4.2e-05

120

29

52

7.4e-05

61

37

UNIPROT:Q1C4J7_YERPA

Putative transporter.

454

120

29

53

7.5e-05

38

UNIPROT:Q1CL76_YERPN

Transporter.

454

120

29

53

7.5e-05

454

120

29

52

7.5e-05

456

120

29

53

7.6e-05

456

120

29

53

7.6e-05

465

120

27

52

7.8e-05

398

119

28

50

9.1e-05

403

119

24

54

9.3e-05

454

119

28

49

0.00011

39

40 41 42

43

44

45

Hpothetical major facilitator family transport UNIPROT:Q8Z8W1_SALTI protein (Hypothetical major facilitator family transport protein). Putative MFS multidrug UNIPROT:Q66DU6_YERPS efflux pump. Putative transport protein UNIPROT:Q7CK36_YERPE (Putative transporter). General substrate UNIPROT:Q3K617_PSEPF transporter. General substrate transporter:Major UNIPROT:Q41C45_9BACI facilitator superfamily MFS_1. Major facilitator (MFS) UNIPROT:Q5WGK5_BACSK superfamily multidrug resistance protein. Putative sugar efflux transporter, Major UNIPROT:Q4FR26_PSYAR facilitator superfamily (MFS).

62

46

UNIPROT:Q7N0K2_PHOLL

Similar to probable transport protein YajR of 459 Escherichia coli.

119

31

50

0.00011

47

UNIPROT:O74902_SCHPO

SPCC613.02 protein.

497

119

28

50

0.00013

48

UNIPROT:Q4IWN9_AZOVI

518

119

26

50

0.00014

384

118

28

54

0.00014

453

118

30

52

0.00019

49 50

General substrate transporter. Putative MFS family UNIPROT:Q5P301_AZOSE transporter. Putative transport UNIPROT:Q2NV88_SODGM protein.

63

64 Lampiran 6. Hasil analisis kesejajaran lokal berdasarkan urutan asam amino antara MaMFS dengan MtMFS