ANALISIS MOLEKULER FRAGMEN GEN PENYANDI HEMAGLUTININ VIRUS AVIAN INFLUENZA SUBTIPE H5N1 DARI UNGGAS AIR
R. SUSANTI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Analisis Molekuler Fragmen Gen Penyandi Hemaglutinin Virus Avian Influenza Subtipe H5N1 dari Unggas Air adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, Januari 2008
R. Susanti NIM. B063040041
ABSTRACT SUSANTI, R. Molecular Analisis of Hemagglutinin Gene Fragment of Avian Influenza Virus Subtype H5N1 Isolated from Waterfowls. Supervisors: RETNO D. SOEJOEDONO, I GUSTI NGURAH K MAHARDIKA, I WAYAN TEGUH WIBAWAN, and MAGGY T SUHARTONO The source of avian influenza virus (AIV) subtype H5N1 transmission in poultry and human continues to be unclear. This research aimed to (1) isolate AIV, primarily subtype H5N1, from backyard waterfowls (ducks, muscovy ducks, and geese) in West Java; (2) identify the pathotype of those isolates based on molecular marker of amino acid sequence of the Hemagglutinin (HA) cleavage site; (3) analyze the important domains of HA gene of those isolates; (4) analyze the phylogenetic of fragment HA1 of HA gene of the isolates with representative of animal and human isolates from Indonesia and some countries in Asia; (5) find out cross-reactivity of those viruses with a standard Indonesian strain. Cloacal swab sample was obtained from healthy and unvaccinated backyard waterfowls from the districts of Sukabumi and Bogor. Cloacal swab was propagated in nine days old specific pathogen free (SPF) embryonated chicken eggs. Allantoic fluid was harvested at the 4th day of incubation and then tested for hemagglutination activity. Positive allantoic fluid was further tested for the present of AIV subtype H5N1 using Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) with standard primer pairs. Fragment of HA gene of the 21 isolates was amplified using RT-PCR with a primer pair that flanking cleavage site region, and with specifically-designed primer pairs. The PCR products were then sequenced using dideoxy termination method with ABI automatic sequencer (Applied Biosystems). Multiple alignment of nucleotide and deduced amino acid sequences were analyzed using ClustalW of MEGA 3.1 program. Nucleotide sequences of HA gene of AIV H5N1 isolated in this research together with other H5N1 isolates from Indonesia and Asia were aligned with ClustalW of MEGA 3.1 program. Estimation of genetic distance and phylogenetic tree construction were analyzed with Neighbor-Joining method and calculation of distance matrix with Kimura 2 –parameter. Antigenic analysis was conducted using hemagglutination inhibition (HI). Of the total 460 samples, 21 were positive AI viruses subtype H5N1 (4.57%). Another 13 were HxN1 (2.83%), 3 were H5Nx (0.65%) and 8 were HxNx (1.74%) subtypes. Of the total number (21 isolate) of AIV subtype H5N1 isolated from backyard waterfowls in West Java, 17 isolate (6.49%) from Bogor Regency and 4 isolate (2.02%) from Sukabumi Regency. The prevalence for each species are 6.67%, 4.85% and 4.04% for goose, duck and muscovy duck respectively. In Bogor regency, prevalence for goose was 8.57%, duck 6,49% and muscovy duck 5.48%. In Sukabumi regency, prevelence for goose was 4.00%, muscovy duck 3.33% and duck 1.40%. In the cleavage site analysis, the result shows that all AIV H5N1 isolates (21 isolate) pose a polybasic cleavage site with two pattern of amino acid sequence, i.e QRERRRKKR (20 isolates) and QRESRRKKR (1 isolate). Futhermore, some of biological domains of HA of the isolates, i.e. antigenic sites, receptor binding pocket, and glycosylation sites, were polymorphic. The viruses also pose conserved glutamine (Q) and glisin (G) residues at the known receptor binding site, at the position 222 and 224 respectively. Result of phylogenetic analysis indicated that all viruses from the backyard waterfowls form three distinct sublineages. One lineage is located in
Indonesia cluster and two lineages in Asia cluster. Cross reactivity experiment between AI viruses subtype H5N1 Legok 2003 chicken strain with nine viruses isolated in this research shows that the HI titer of anti-Legok-2003 antibody with all newly isolated viruses is up to 6 log lower then the HI titer using homolog strain. The findings indicate that all of the viruses isolated in this research are highly pathogenic avian influenza (HPAI) strains. Therefore, backyard waterfowls seem to play an important role as the source of HPAI of H5N1 subtype transmission to terrestrial poultry and human being. Moreover, waterfowls might act as evolution site of the virus, while it preserves the avian receptor specificity. In the philogenetic analysis it is safe to conclude multiple introductions of AI viruses H5N1 to Indonesia have occurred. Six AI viruses subtype H5N1 from backyard waterfowls (IPB1-RS to IPB6-RS) seem to have evolved from different ancestors with AI viruses H5N1 that were isolated previously in Indonesia. Finally, cross reactivity experiment shows that all viruses isolated in this research differ antigenicaly to Legok 2003 chicken strain. Key words: waterfowls, Avian Influenza Virus, H5N1, hemagglutinin gene
RINGKASAN SUSANTI, R. Analisis Molekuler Fragmen Gen Penyandi Hemaglutin Virus Avian Influenza Subtipe H5N1 dari Unggas Air. Dibimbing oleh: RETNO D. SOEJOEDONO, I GUSTI NGURAH K MAHARDIKA, I WAYAN TEGUH WIBAWAN, dan MAGGY T SUHARTONO Sumber penularan virus avian influenza (VAI) subtipe H5N1 pada unggas dan manusia di Indonesia belum diketahui secara jelas. Penelitian ini bertujuan untuk (1) mengisolasi VAI subtipe H5N1 dari unggas air (itik, entok, angsa) di peternakan skala rumah tangga (backyard) di Jawa Barat terutama di Kabupaten Sukabumi dan Bogor; (2) menentukan patotipe virus-virus tersebut berdasarkan marka molekuler gen penyandi sekuen asam amino daerah pemotongan (cleavage site) fragmen gen hemaglutinin (HA); (3) menganalisis domain-domain penting gen penyandi HA virus AI subtipe H5N1 isolat unggas air; (4) menganalisis filogenetik fragmen HA1 dari gen HA virus AI subtipe H5N1 yang diisolasi dari unggas air dengan representasi virus asal hewan dan manusia Indonesia dan beberapa negara Asia; (5) mengetahui reaksi silang virus tersebut dengan strain virus standar Indonesia. Sampel usap kloaka diambil dari unggas air sehat dan belum divaksin di peternakan skala rumah tangga di Kabupaten Sukabumi dan Bogor. Sampel usap kloaka ditumbuhkan pada telur ayam berembrio specific pathogen free (SPF) umur sembilan hari. Cairan alantois yang dipanen pada umur inkubasi empat hari, diuji kemampuannya mengaglutinasi sel darah merah. Dari cairan alantois yang menunjukkan aktivitas hemaglutinasi, selanjutnya dilakukan identifikasi virus AI subtipe H5N1 dengan metode RT-PCR menggunakan primer baku. Patotipe virus AI subtipe H5N1 isolat unggas air yang didapatkan, disekuensing pada regio cleavage site. Fragmen gen HA diamplifikasi dengan metode RT-PCR menggunakan pasangan primer yang didisain khusus, dan disekuensing dengan metode dideoksi dengan ABI automatic sequencer (Applied Biosystems). Sekuen nukleotida gen HA virus AI H5N1 dari unggas air dan isolat VAI H5N1 dari Indonesia dan Asia disepadankan dengan ClustalW dari program MEGA 3.1. Estimasi jarak genetik dan konstruksi pohon filogeni dianalisa dengan metoda Neighbor-Joining dan kalkulasi distance matrix dengan model Kimura 2 parameter pada program yang sama. Analisis antigenik dilakukan dengan uji hambatan hemaglutinasi (hemagglutination inhibition/ HI). Hasil penelitian menunjukkan bahwa dari total 460 sampel, 21 isolat positif VAI subtipe H5N1 (4,57%), 13 isolat HxN1(2,83%), 3 isolat H5Nx (0,65%) dan 8 isolat HxNx (1,74%). Sebaran VAI subtipe H5N1 yang berhasil diisolasi dari unggas air di peternakan skala rumah tangga di Jawa Barat adalah 17 isolat dari Kabupaten Bogor dan 4 isolat dari Kabupaten Sukabumi. Prevalensi di masingmasing kabupaten adalah 6,49% di Bogor dan 2,02% di Sukabumi. Angka prevalensi pada masing-masing spesies adalah 6,67% pada angsa, 4,85% pada itik, dan 4,04% pada entok. Di Kabupaten Bogor, prevalensi pada angsa 8,57%, pada itik 6,49%, dan pada entok 5,48%. Di Kabupaten Sukabumi, prevalensi pada angsa 4,00%, pada entok 3,33%, dan pada itik 1,40%. Identifikasi gen penyandi sekuen asam amino cleavage site menunjukkan bahwa semua VAI H5N1 dalam penelitian ini (21 isolat) mempunyai asam amino polibasik dengan 2 pola sekuen yaitu QRERRRKKR (20 isolat) dan QRESRRKKR (1 isolat). Analisis lebih lanjut menunjukkan bahwa domain asam amino daerah antigenik, posisi glikosilasi dan kantong pengikat reseptor virus yang dianalisis menunjukkan
adanya polimorfisme. Sedangkan domain residu pengikat reseptor, semua isolat mempunyai glutamin (Q) dan glisin (G) berturut-turut pada asam amino nomor 222 dan 224. Analisis filogenetik menunjukkan bahwa VAI H5N1 isolat unggas air dari Jawa Barat membentuk tiga percabangan secara terpisah, yaitu satu percabangan pada klaster Indonesia dan dua percabangan pada klaster Asia. Titer HI antara antibodi anti VAI H5N1 strain ayam Legok 2003 dengan dengan sembilan VAI H5N1 isolat unggas air menunjukkan perbedaaan sampai 6 log lebih rendah dibandingkan dengan titer HI menggunakan strain homolog. Temuan-temuan tersebut menunjukkan bahwa semua isolat virus yang diisolasi pada penelitian ini termasuk strain patogenik tinggi (highly pathogenic avian influenza /HPAI). Dengan demikian, unggas air di peternakan skala rumah tangga di Jawa Barat berpotensi sebagai sumber penularan virus HPAI subtipe H5N1 ke unggas darat dan manusia. Hasil analisi isolat-isolat itu menunjukkan unggas air berperan sebagai tempat evolusi virus AI, namun spesifisitas reseptor avian α-2,3NeuAcGal masih tetap dipertahankan. Sedangkan dari analisis filogenetik tampak bahwa enam VAI H5N1 isolat unggas air (IPB1-RS s/d IPB6 RS) merupakan strain virus yang berbeda dengan VAI H5N1 yang telah diisolasi di Indonesia sebelumnya. Hasil analisis filogenetik menunjukkan bahwa, introduksi VAI H5N1 ke Indonesia telah terjadi lebih dari satu kali, dan burung liar migratori nampaknya juga berperan penting pada introduksi VAI H5N1 ke Indonesia. Hasil uji reaksi silang antara VAI H5N1 isolat ayam Legok 2003 dengan sembilan VAI H5N1 isolat unggas air menunjukkan bahwa semua virus mempunyai struktur antigenenik yang berbeda dengan strain ayam Legok 2003. Kata Kunci: unggas air, Virus Avian Influenza, H5N1, gen hemaglutinin
© Hak Cipta Milik IPB, tahun 2008 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa seijin IPB
ANALISIS MOLEKULER FRAGMEN GEN PENYANDI HEMAGLUTININ VIRUS AVIAN INFLUENZA SUBTIPE H5N1 DARI UNGGAS AIR
R.SUSANTI
Disertasi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Sains Veteriner
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
Judul Disertasi
:
Analisis Molekuler Fragmen Gen Penyandi Hemaglutinin Virus Avian Influenza Subtipe H5N1 dari Unggas Air
Nama
:
R. Susanti
NRP
:
B063040041
Program Studi
:
Sains Veteriner
Disetujui Komisi Pembimbing
Prof.Dr.drh. Retno D Soejoedono, MS Ketua
Dr.drh. I Gusti Ngurah K Mahardika Anggota
Dr.drh. I Wayan Teguh Wibawan, MS Anggota
Prof.Dr.Ir. Maggy T Suhartono Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Sains Veteriner
Drh. Bambang Pontjo P, MS., Ph.D.
Tanggal Ujian : 21 Januari 2008
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr.Ir.Khairil A Notodiputro,MS
Tanggal Lulus :
Penguji pada Ujian Tertutup
: Drh. Ekowati Handharyani, MSi, Ph.D.
Penguji pada Ujian Terbuka
: 1. Prof. Drh. Widya Asmara, SU., Ph.D. 2. Dr. Drh. Joko Pamungkas, M.Sc.
PRAKATA Segala puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas rahmat dan hidayahnya sehingga penulis dapat menyelesaikan disertasi yang berjudul Analisis Molekuler Fragmen Gen Penyandi Hemaglutinin Virus Avian Influenza Subtipe H5N1 dari Unggas Air. Disertasi ini disusun sebagai salah satu syarat penyelesaian studi Program Doktor di Program Studi Sains Veteriner Sekolah Pascasarjana IPB. Ungkapan terima kasih dan penghargaan setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada: 1. Ibu Prof. Dr. Drh Retno D Soejoedono, MS atas bimbingan, saran, bantuan dan berbagai kemudahan penggunaan fasilitas penunjang penelitian dan kelancaran studi 2. Bapak Dr. Drh. I Gusti Ngurah K Mahardika, Bapak Dr. Drh. I Wayan Teguh Wibawan, MS serta Ibu Prof. Dr. Ir. Maggy T Suhartono atas bimbingan dan saran serta berbagai bantuan untuk kelancaran penyelesaian studi. 3. Ibu Drh. Ekowati Handharyani, M.Si, Ph.D, Bapak Prof. Drh. Widya Asmara, SU., Ph.D dan Bapak Dr. Drh. Joko Pamungkas, MSc atas saran-sarannya. 4. Teman-teman seperjuangan di Laboratorium Terpadu IPHK (drh. Okti Nadia Poetri MSi; Drh. Dwi Desmiyeni Putri MSi; Efrizal SP.MSi; Drh. Ni Luh Putu Ika Mayasari; Drh. Sofi MSi; Drh. Ketut Karuni MSi, dan Ibu Dr. Drh. Sri Murtini MSi, atas bantuannya selama penelitian. 5. Mas Lukman, Mas Wahyu, Pak Enur dan Mas Ifan atas bantuannya selama penelitian. 6. Teman-teman seperjuangan dari Jurusan Biologi FMIPA UNNES (Mbak Amin, Bu Enni, Mbak Eta dan Pak Ulung) atas doa dan dukungannya 7. Teman-teman di Pondok Putri Arum (Bu Yeti, Bu Tetri, Ami, Sofi, Kim, Ina, Ema, Niken) atas doa dan dukungannya 8. Suami tercinta atas restu, doa, perhatian dan dukungannya 9. Ibu dan semua keluarga, atas doa, perhatian dan dukungannya
Bogor, Januari 2008 R Susanti
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Sragen, 23 Maret 1969 dari ayah Sukardi Indriatmoko, BA dan ibu Sumi. Penulis merupakan putri kedua dari tiga bersaudara. Penulis menempuh pendidikan dasar sampai menengah atas di kota Sragen. Pada tahun 1988 penulis melanjutkan pendidikan jenjang S1 di Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Gadjah Mada dan kemudian melanjutkan pendidikan Profesi Dokter Hewan di tempat yang sama pada tahun 1992. Pada tahun 1997 sampai sekarang penulis bekerja sebagai pengajar di Universitas Negeri Semarang. Pada tahun 1998 penulis melanjutkan pendidikan jenjang S2 di Program Studi Sains Veteriner, Program Pascasarjana Universitas Gadjah Mada. Pada tahun 2004 penulis melanjutkan pendidikan jenjang S3 pada Program Studi Sains Veteriner, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ………………………………… ….……………………...
xii
DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………….
xiv
DAFTAR LAMPIRAN …………………………………………………………
xvi
PENDAHULUAN Latar Belakang ……………………………………………………….. Tujuan Penelitian ………………………………………………..........
1 5
TINJAUAN PUSTAKA Klasifikasi, Morfologi dan Nomenklatur Virus Influenza…………..... Siklus Replikasi Virus Influenza………………………………………. Patogenesitas Virus Avian Influenza…………………………………. Protein NS1………………………………………………………. Protein PB1-F2 ………………………………………………….. Glikoprotein hemaglutinin ……………………………………… Mutasi dan Perubahan Antigen ……………… ……………………… Hanyutan antigenik …………………………………………….. Reasorsi dan transmisi Virus Avian Influenza ………………. Profil Glikoprotein Hemaglutinin …………….………………………. Sekuen yang bersifat stabil ……………………………………. Daerah pemotongan (cleavage site) hemaglutinin…..………. Daerah antigenik (antigenic sites) .. .……………….………… Kantong pengikat reseptor (receptor binding pocket) ..…….. Residu pengikat reseptor (receptor binding sites) . .………… Posisi glikosilasi (N-link glycosylation sites) ………………….. Peptida fusi (fusion peptide) .………………………………… Peran Unggas Air pada Penyebaran Virus Avian Influenza ..…….. Epidemiologi Virus Avian Influenza ………..………………………… Telaah Virus Avian Influenza di Indonesia …………………………..
7 10 15 15 16 17 17 20 21 22 23 24 25 26 26 28 28 29 32 33
ISOLASI VIRUS AVIAN INFLUENZA SUBTIPE H5N1 PADA UNGGAS AIR Abstract …………………………………………………………………. Abstrak ………………………………………………………………….. Pendahuluan……………….. ………………………………………..... Metode Penelitian ………….………………………………………..... Hasil dan Pembahasan ……… ……………………………………..... Simpulan ……………….……………………………………………….. Saran …………………………………………………………………….
36 37 38 40 45 54 55
x
IDENTIFIKASI PATOGENESITAS VIRUS AVIAN INFLUENZA SUBTIPE H5N1 ISOLAT UNGGAS AIR BERDASARKAN SEKUEN ASAM AMINO BAGIAN CLEAVAGE SITE HEMAGLUTININ Abstract …………………………………………………………………. Abstrak ………………………………………………………………….. Pendahuluan……………….. ………………………………………..... Metode Penelitian ………….………………………………………..... Hasil dan Pembahasan ……… ……………………………………..... Simpulan ……………….……………………………………………….. Saran .……………………………………………………………………
56 56 57 59 60 69 69
ANALISIS GEN PENYANDI HEMAGLUTININ VIRUS HIGHLY PATHOGENIC AVIAN INFLUENZA SUBTIPE H5N1 ISOLAT UNGGAS AIR Abstract …………………………………………………………………. Abstrak ………………………………………………………………….. Pendahuluan……………….. ………………………………………..... Metode Penelitian ………….………………………………………..... Hasil dan Pembahasan ……… ……………………………………..... Simpulan …………….………………………………………………….. Saran …………………………………………………………………….
70 70 71 73 74 84 84
ANALISIS FILOGENETIK DAN ANTIGENIK VIRUS AVIAN INFLUENZA SUBTIPE H5N1 ISOLAT UNGGAS AIR Abstract. ………………………………………………………………… Abstrak ………………………………………………………………….. Pendahuluan……………….. ………………………………………..... Metode Penelitian ………….………………………………………..... Hasil dan Pembahasan … …………………………………………..... Simpulan ……………….……………………………………………….. Saran …………………………………………………………………….
94 95 96 97 98 108 109
PEMBAHASAN UMUM ………………………………………………………
110
SIMPULAN UMUM ……… ………………………………………………….
120
SARAN …………………………………………………………………………
122
DAFTAR PUSTAKA …………………………………………………………
123
LAMPIRAN ..............................................................................................
140
xi
DAFTAR TABEL Halaman 1
2
3
4
5
6
7
Segmen genom virus influenza A serta fungsi protein yang disandinya .....................................................................................
9
Sampel usap kloaka dari setiap kecamatan berdasarkan jenis hewan .............................................................................................
41
Sekuen basa primer untuk mengamplifikasi gen H5, N1 dan ND serta besaran produk yang diharapkan ……………………………..
44
Jumlah inokulum berdasarkan jenis hewan dan hasil uji hemaglutinasi ..................................................................................
45
Hasil identifikasi subtipe H5N1 virus avian influenza isolat unggas air …………………………..……………………………………………
48
Jumlah dan prevalensi virus avian influenza subtipe H5N1 yang diisolasi dari unggas air ..................................................................
48
Penamaan virus avian influenza subtipe H5N1 isolat unggas air yang diisolasi pada penelitian ini ………….………………………….
49
8
Sekuen asam amino daerah pemotongan (cleavage site) virus avian influenza subtype H5N1 isolat unggas air pada penelitian ini
9
Variasi sekuen daerah pemotongan virus avian influenza H5N1 di Indonesia dari tahun 2003-2007 ………………………………….…
62
10
Sekuen nukleotida primer untuk mengamplifikasi gen HA …… ..…
74
11
Jumlah substitusi sinonim dan nonsinonim gen hemaglutinin virus avian influenza subtype H5N1 isolat unggas air …………………..
77
Asam amino daerah antigenik pada hemaglutinin virus avian influenza subtype H5N1 isolat unggas air ….……………………….
79
Sekuen asam amino hemaglutinin virus avian influenza subtype H5N1 isolat unggas air yang berpotensi sebagai posisi glikosilasi
80
Asam amino pembentuk kantong pengikat reseptor pada hemaglutinin virus avian influenza subtype H5N1 isolat unggas air
82
12
13
14
61
xii
15
16
17
Jarak genetik (genetic distance) fragmen gen hemaglutinin antara virus-virus AI subtipe H5N1 isolat unggas air asal Jawa Barat (No 1-9) dengan isolat manusia dan hewan asal Indonesia yang diperoleh dari GenBank ……………………………. ..………………
104
Jarak genetik (genetic distance) fragmen gen hemaglutinin antara virus-virus AI subtipe H5N1 isolat unggas air asal Jawa Barat (No 1-9) dengan isolat asal Asia diperoleh dari GenBank ……………..
105
Hasil uji HI virus avian influenza subtype H5N1 isolat unggas air terhadap antibodi hasil vaksinasi dengan vaksin AI H5N1 (strain ayam Legok 2003) ……..
107
xiii
DAFTAR GAMBAR Halaman 1
Bentuk pleiomorfik virus influenza ……………………………………
7
2
Struktur dan segmen-segmen genom virus influenza A. ..…………
10
3
Siklus replikasi virus influenza …………..……………………………
11
4
Struktur protein hemaglutin……………………………………………
23
5
Elektroforegram RT-PCR gen H5 menggunakan primer H5-1 dan H5-3 (produk 219bp) ..................................................... ……….....
46
Elektroforegram RT-PCR gen N1 menggunakan primer CU-N1F dan CU-N1R (produk 131bp) …………………………………………
46
6
7
Elektroforegram RT-PCR menggunakan primer NDVF dan NDVR (produk 202bp) ………………………………………………………
8
Elektroforegram RT-PCR dengan primer HA01 dan HA645 (produk 645bp) …………………………………………………………
75
Elektroforegram RT-PCR dengan primer HA548 dan HA1215 (produk 667bp) …………………………………………………………
76
Elektroforegram RT-PCR dengan primer H5-155F dan H5-699R (produk 545bp) …………………………………………………………
76
Gen penyandi hemaglutinin dan turunan asam aminonya virus isolat A/muscovy duck/Klapanunggal/IPB1-RS/2006 (H5N1) …….
85
Gen penyandi hemaglutinin dan turunan asam aminonya virus isolat A/goose/Bojonggenteng/IPB2-RS/2006 (H5N1) ……. ……...
86
Gen penyandi hemaglutinin dan turunan asam aminonya virus isolat A/duck/Leuwiliang/IPB3-RS/2006 (H5N1) ……………………
87
Gen penyandi hemaglutinin dan turunan asam aminonya virus isolat A/goose/Leuwiliang/IPB4-RS/2006 (H5N1) ………………….
88
9
10
11
12
13
14
15
Gen penyandi hemaglutinin dan turunan asam aminonya virus isolat A/muscovy duck/Cileungsi/IPB5-RS/2006 (H5N1) …………..
16
Gen penyandi hemaglutinin dan turunan asam aminonya virus isolat A/duck/Nagrak/IPB6-RS/2006 (H5N1) …………………….….
47
89
90
xiv
17
18
19
20
21
Gen penyandi hemaglutinin dan turunan asam aminonya virus isolat A/goose/Klapanunggal/IPB7-RS/2006 (H5N1) ………………
91
Gen penyandi hemaglutinin dan turunan asam aminonya virus isolat A/duck/Parung/IPB8-RS/2006 (H5N1) ……………………….
92
Gen penyandi hemaglutinin dan turunan asam aminonya virus isolat A/duck/Parung/IPB9-RS/2006 (H5N1) ……………………….
93
Pohon filogenetik 1074 basa gen HA virus H5N1 isolat unggas air asal Jawa Barat disepadankan dengan virus asal Indonesia baik dari hewan dan manusia, serta virus asal Asia …………………..
99
Titik-titik polimorfik asam amino fragmen gen HA1 virus AI subtipe H5N1 isolat unggas air asal Jawa Barat dengan representatif virus isolat manusia dan hewan asal Indonesia dan Asia ………...
103
xv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Hasil uji hemaglutinasi (HA) pada cairan alantois …………………
140
2
Sekuen nukleotida gen hemaglutinin virus avian influenza subtipe H5N1 isolat unggas air yang disepadankan dengan isolat Gs/GD/1/96 ....................................................................................
141
Sekuen asam amino turunan gen hemaglutinin virus avian influenza subtipe H5N1 isolat unggas air yang disepadankan dengan isolat Gs/GD/1/96 .............................................................
144
Nomor akses GenBank isolat virus avian influenza subtipe H5N1 yang dianalisa dalam penelitian ini.................................................
146
3
4
xvi
