PROPOSAL METODOLOGI PENELITIAN (BM-3001)
KLONING DAN OVEREKSPRESI GEN celD DARI Clostridium thermocellum ATCC 27405 DALAM pET-BLUE VECTOR 1
Penyusun: Chandra
10406014
Dosen Narasumber: Dra. Maelita Ramdani Moeis, Ph.D Akhmaloka, Ph.D
PROGRAM STUDI SARJANA MIKROBIOLOGI SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI HAYATI INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG BANDUNG 2008
1.1 Latar Belakang Clostridium thermocellum ATCC 27405 merupakan eubakteri gram positif yang bersifat anaerob termofilik dan berbentuk batang. Bakteri ini sudah diketahui dapat memproduksi enzim endoglukanase termostabil yang sangat aktif. Salah satu enzim endoglukanase yang dihasilkan adalah endoglukanase D atau EGD. Enzim yang termasuk ke dalam keluarga enzim selulase ini dikode oleh gen celD (Mishra et al., 1990). Kebutuhan akan enzim endoglukanase (terkait dengan enzim selulase) yang termostabil semakin meningkat, terutama saat ini untuk menghasilkan kebutuhan bioenergi berupa bioetanol. Untuk memproduksi bioetanol secara massal dibutuhkan banyak sumber glukosa. Glukosa tersebut akan terfermentasi dan menghasilkan bioetanol. Masalahnya ketersediaan glukosa tidak banyak namun ketersediaan selulosa justru yang melimpah. Maka dari itu dibutuhkan banyak enzim endoglukanase untuk menguraikan selulosa yang ada menjadi monomer glukosa sehingga kemudian dapat digunakan untuk kebutuhan bioenergi. Salah satu usaha untuk memperbanyak produksi enzim selulase yang termostabil adalah lewat penelitian rekayasa genetika mikroba yang meliputi isolasi gen pengkode enzim
endoglukanase
yang
termostabil
dari
mikroba
termofilik
dan
mengoverekspresikannya ke vektor yang sesuai sehingga diharapkan dapat meningkatkan perolehan enzim yang banyak dibutuhkan ini. Sebelumnya telah dilakukan penelitian tentang kloning dan overekspresi gen celD Clostridium thermocellum ini pada vektor ekspresi pUC8 dengan inang E. coli (Jollif et al., 1986). Pada penelitian kali ini akan dilakukan kloning dan overekspresi gen yang sama pada pET-Blue 1 dengan inang E. coli Tuner (DE3) pLacI. pET-Blue 1 ini digunakan karena memiliki keunggulan di antaranya dalam hal high multiple copy numbers dan pengaturan ekspresi gen. Dengan penelitian ini diharapkan enzim endoglukanase yang dihasilkan lebih banyak dan lebih terkontrol.
1.2 Tujuan •
Mengkloning gen celD Clostridium thermocellum ATCC 27405 ke vektor ekspresi pET-Blue 1 dan mengoverekspresikannya dalam E. coli Tuner (DE3) pLacI.
•
Menguji adanya aktivitas enzim endoglukanase D atau EGD yang dihasilkan.
1.3 Hipotesis Gen celD Clostridium thermocellum ATCC 27405 yang dikloning ke dalam vektor ekspresi pET-Blue 1 dapat dioverekspresikan dalam E. coli galur Tuner (DE3) pLacI.
BAB II METODOLOGI PENELITIAN
2.1 Metode Kerja Vektor kloning + gen celD - PCR - Elektroforesis - Purifikasi Gen celD
pET-Blue 1 Restriksi oleh enzim EcoRV
Ligasi pET-Blue cutted Transformasi ke E. coli Tuner (DE3) pLacI Screening biru-putih
SDS PAGE
Uji aktivitas
a. Desain primer Pada tahap ini dirancang primer yang sesuai dengan gen target celD. Selain itu pada primer juga ditambahkan sisi pengenalan enzim restriksi EcoRV. Untuk desain primer digunakan program Primer3.
b. PCR Pada tahap ini dilakukan PCR dengan suhu denaturasi 94oC, annealing 50oC, dan elongasi 72oC. Suhu annealing yang optimum akan dicari dengan melakukan optimasi PCR.
c. Elektroforesis Fragmen DNA hasil PCR dimasukkan ke dalam jel agarosa kemudian dialirkan aliran listrik untuk memisahkan fragmen DNA target. Untuk mengetahui DNA target (berdasarkan panjangnya), maka digunakan ladder sebagai pembanding.
d. Purifikasi DNA Fragmen DNA target pada jel agarosa dipotong kemudian dipurifikasi dengan menggunakan kit purifikasi sehingga didapatkan fragmen DNA target dalam bentuk cair.
e. Restriksi Fragmen DNA target dan vektor ekspresi diberi enzim restriksi EcoRV sehingga keduanya menghasilkan ujung lekat yang saling melengkapi.
f. Ligasi Fragmen DNA dan vektor ekspresi yang dilekatkan satu sama lain dengan kit ligasi.
g. Transformasi Fragmen DNA yang sudah terinsert ke dalam pET-Blue 1 dimasukkan ke dalam sel E. coli Tuner (DE3) pLacI dengan metode heat-shock.
h. Seleksi biru-putih E. coli galur Tuner (DE3) pLacI yang telah ditransformasi kemudian ditumbuhkan ke dalam medium yang mengandung IPTG dan X-gal. Koloni yang tumbuh dan berwarna putih kemudian diambil dengan tusuk gigi steril dan ditumbuhkan dalam LB yang mengandung IPTG.
i. SDS PAGE Kultur tersebut disentrifuga kemudian diambil supernatannya dan dilakukan SDS PAGE.
j. Uji aktivitas Crude extract enzyme yang didapat dari proses sebelumnya diuji aktivitas selulasenya secara kualitatif.
2.2 Rencana Kerja
No
Perihal
Bulan ke1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1
Studi literatur
v v v v v v v v v v
2
Desain primer
v v
3
PCR-elektroforesis
4
Kloning ke vektor ekspresi
5
Transformasi-skrining biru putih
v
v
v v v v v v
6
SDS PAGE
v v
7
Uji aktivitas
v
v
8
Pembuatan laporan
v v v
v
v
DAFTAR PUSTAKA
Mishra, Saroj, Beguin, Pierre, dan Jean-Paul Aubert. 1990. Transcription of Clostridium thermocellum Endoglucanase Genes celF and celD, Journal of Bacteriology volume 173 nomor 1 halaman 80-85. Washington: American Society for Microbiology. Joliff, Gwennael, Pierre Bdguin, dan Jean-Paul Aubert. 1986.
Nucleotide
sequence of the cellulase gene celD encoding endoglucanase D of Clostridium thermocellum, Nucleic Acids Research Journal halaman 86058613. Oxford: Oxford University Press.
LAMPIRAN Rincian Biaya Penelitian Total Biaya
No.
Justifikasi
Jumlah
1
PCR mix (PROMEGA)
1 kit
1,700,000
100
2,000,000
100 mg
2,500,000
2
Oligonucleotide primers sythesis @ US$ 2/nucleotide
(Rp)
3
X-GAL (PROMEGA)
4
Kultur E. coli Tuner (DE3) pLacI
5
IPTG-dioxan free (PROMEGA)
1g
1,500,000
6
Agarose (PROMEGA)
100 g
3,000,000
7
Ethidium bromide (PROMEGA)
0,5 mL
2,500,000
8
Chloramphenicol
9
Medium kultur bakteri (Luria Bertani):
500,000
200,000
Yeast extract
500 g
1,000,000
Bacto tryptone
250 g
1,500,000
Bacto peptone
500 g
1,500,000
Bacto agar
1 lb
1,500,000
10
Gel extraction Kit (PROMEGA)
1
2,500,000
11
Plasmid isolation kit (PROMEGA)
1
2,000,000
12
Enzim restriksi EcoRV(PROMEGA)
13
Enzim ligasi (PROMEGA)
2 kit
2,000,000
14
Vektor ekspresi pET-Blue 1 (Novagen)
1 kit
2,000,000
15
Cawan Petri
3 buah
37,500
16
Pipet tips
1 pack
1,000,000
17
PCR tube
1 pack
1,000,000
18
Mikrotube 1,5 mL
1 pack
1,000,000
19
Sekuensing dan pengiriman sampel
2 enzim @ 1 kit
1,600,000
1,000,000 TOTAL
33,537,500
