KLONING GEN XILANASE TERMOZIM DARI Streptomyces costaricanus 45I-3
HERI SATRIA
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Kloning Gen Xilanase Termozim Dari Streptomyces costaricanus 45I-3 adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Agustus 2008
Heri Satria NIM P052060021
ABSTRACT HERI SATRIA. Cloning of Thermozyme Xylanase Gene from Streptomyces costaricanus 45I-3. Under the direction of ANJA MERYANDINI dan ETTY PRATIWI. Biopolymer xylan has a great potential to produce useful end product such as xylose. Xylanases is a group of enzyme that has ability to hydrolyse xylan or polymer of xyloses and xylooligosaccharides. Complete hydrolysis of xylans involves the synergistic action of a xylanolytic enzymes, including ß-xylanase, ß-xylosidase, -glucuronidase, -L-arabinofuranosidase, and acetyl xylan esterase. The aims of this research were to isolate xylanase gene from Streptomyces costaricanus 45I-3 and to clone this gene into competence Escherichia coli DH5 . Genomic DNA was obtained from S. costaricanus 45I-3 that have known has ability to produce thermostabile extracellular xylanase. Genomic DNA was partially digested with restriction enzyme Sau3A1. Genomic DNA fragments of size 4-10 kb were inserted at BamHI site in pBluescript II KS (+) vector and transformed into E. coli DH5 . Based on blue-white selection approximately 12000 recombinant colonies were obtained. The presence of xylanase gene was identified by screening employing congored plate clearance assay. One positive clone containing the xylanase gene was confirmed and was designated as pHS11. Preliminary characterization of pHS11 using EcoRI showed that it contained a 6,0 kb DNA insert. Xylanase were produced has xylanase spesific activity 6,393 U/mg, -xylosidase activity 0,208 U/ml, arabinofuranosidase activity 0,079 U/ml and acetyl xylan esterase activity 0,063 U/ml as well. Keyword: cloning, xylanase, thermozyme, Streptomyces costaricanus 45I-3
RINGKASAN HERI SATRIA. Kloning Gen Xilanase Termozim Dari Streptomyces costaricanus 45I-3. Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan ETTY PRATIWI. Biopolimer xilan mempunyai potensi yang sangat besar untuk diuraikan menjadi produk akhir yang berguna. Xilanase merupakan sistim enzim yang menghidrolisis xilan atau polimer dari xilosa. Pemecahan sempurna xilan memerlukan aktivitas sinergis beberapa enzim hidrolitik (hemiselulase), yaitu endo1,4-ß-xilanase, ß-xilosidase, -glukuronidase, -L-arabinofuranosidase, dan asetil xilan esterase. Penelitian ini bertujuan untuk mengklon gen xilanase dari Streptomyces costaricanus 45I-3 ke Escherichia coli DH5 . DNA genom diperoleh dari isolat S. costaricanus 45I-3 yang telah diteliti sebelumnya dan berpotensi menghasilkan enzim xilanase termostabil. DNA genom dipotong secara parsial dengan menggunakan enzim restriksi Sau3A1 dan disisipkan ke plasmid Bluescript II KS (+) yang didigesti dengan BamH1. Pemilihan transforman yang menggunakan metode seleksi biru-putih menghasilkan sekitar 12000 koloni rekombinan. Keberadaan gen xilanase diidentifikasi dengan melihat kemampuan koloni menghasilkan zona jernih pada media xilan yang disiram dengan congo-red. Satu koloni positif yaitu klon 11 teridentifikasi membawa gen xilanase dan membawa pHS11. Verifikasi ukuran pHS11 menggunakan EcoRI menunjukkan bahwa ukuran DNA sisipan sekitar 6 kb. Klon 11 dapat mensekresikan enzim xilanase dengan aktivitas spesifik sebesar 6,393 U/mg. Xilanase yang dihasilkan memiliki aktivitas -xilosidase sebesar 0,208 U/ml, arabinofuranosidase sebesar 0,079 U/ml dan asetil xilan esterase sebesar 0,063 U/ml.
Katakunci: kloning, xilanase, termozim, Streptomyces costaricanus 45I-3
© Hak cipta milik IPB, tahun 2008 Hak cipta dilindungi Undang-Undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tesis tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar Institut Pertanian Bogor. 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh tulis dalam bentuk apapun tanpa ijin Institut Pertanian Bogor.
KLONING GEN XILANASE TERMOZIM DARI Streptomyces costaricanus 45I-3
HERI SATRIA
Tesis Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
Judul Tesis
: Kloning Gen Xilanase Termozim Dari Streptomyces costaricanus 45I-3
Nama
: Heri Satria
NIM
: P052060021
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Etty Pratiwi, M.Si Anggota
Dr. Anja Meryandini, MS Ketua
Diketahui Ketua Program Studi Bioteknologi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Muhammad Jusuf, DEA
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, MS
Tanggal Ujian : 21 Agustus 2008
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian ini mengambil tema “Kloning Gen Xilanase Termozim Dari Streptomyces costaricanus 45I-3”, dan telah dilaksanakan sejak bulan Juli 2007 sampai bulan Juni 2008. Dalam kesempatan ini penulis ingin mengucapkan rasa terima kasih yang tak terhingga kepada : 1. Dr. Anja Meryandini, MS dan Dr. Ir. Etty Pratiwi selaku pembimbing yang telah dengan sabar memberikan bimbingan dan arahan selama berlangsungnya penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. 2. Seluruh staf pengajar di Program Studi Bioteknologi Sekolah Pascasarjana IPB atas segala ilmu yang diberikan,
beserta seluruh staf administrasi dan staf
laboratorium atas segala bantuannya selama penulis menjalankan tugas belajar di IPB. 3. Ibunda tercinta, Bapak-Ibu Mertua, Istri dan anak-anakku tersayang, dan seluruh keluarga atas dukungan dan kesabaran mendampingi penulis. Serta doa untuk Ayahanda (alm) agar kehidupannya di sana dilapangkan Allah SWT. 4. Ibu Selly, Kiki Herlina, Ibu Aminah, Ibu Titi, Pak Jajang, Pak Eep dan seluruh staf Laboratorium Mikrobiologi dan Biologi Molekuler BB-Biogen Bogor atas bantuan yang diberikan selama pelaksanaan penelitian. 5. Teman-teman seperjuangan di Program Studi Bioteknologi angkatan 2006 : Neo, Roni, Tontowi, Slamat, Ainun, Devi, Wita, Nia, atas dukungan dan bantuan yang diberikan. 6. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu yang telah memberikan bantuan kepada penulis dalam menyelesaikan penelitian ini. Penulis menyadari bahwa tesis ini masih belum sempurna. Namun demikian penulis berharap semoga penelitian ini dapat berguna bagi pihak-pihak yang memerlukannya. Bogor, Agustus 2008 Heri Satria
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Tanjungkarang, Lampung pada tanggal 1 Oktober 1971 dari pasangan bapak Martin Zainal (alm) dan Ibu Masty. Penulis merupakan anak kedua dari lima bersaudara. Tahun 2001 penulis menikah dengan Yeni Siswati, Amd dan telah dikaruniai 2 orang putri : Dzakiyyah Shoofina Jasmine Satria (6 tahun) dan Azarine Hubbie Ianthine Satria (4 tahun). Tahun 1990 penulis lulus dari SMA Negeri 2 Tanjungkarang dan diterima di Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung melalui UMPTN dan selesai tahun 1995.
Tahun 2006 penulis diterima di Program Studi Bioteknologi Sekolah
Pascasarjana IPB dengan beasiswa dari BPPS-Dikti Departemen Pendidikan Nasional. Penulis memiliki pengalaman kerja di PT. Birulaut Khatulistiwa (Shrimp Hatchery Center) di Research and Development Department (R&D) dari tahun 1996 sampai tahun 2005. Setelah itu penulis menjadi staf pengajar di Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung di Bandar Lampung hingga saat ini.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL .......................................................................................
xi
DAFTAR GAMBAR...................................................................................
xii
DAFTAR LAMPIRAN ...............................................................................
xiii
PENDAHULUAN Latar Belakang .................................................................................. Tujuan Penelitian .............................................................................. Manfaat Penelitian ...............................................................................
1 3 3
TINJAUAN PUSTAKA Karakteristik Streptomyces sp. ........................................................ Streptomyces costaricanus .................................................... Escherichia coli DH5 .................................................................... Teknologi Rekombinasi DNA ........................................................ Plasmid .......................................................................................... Struktur dan Keberadaan Xilan.......................................................... Enzim Xilanolitik ............................................................................ Mekanisme Reaksi Hidrolisis Xilanase ............................................ Regulasi Biosintesis Xilanase dari Mikroba ..................................... Kloning Gen Xilanase ...................................................................
4 5 5 7 9 11 12 15 17 19
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian............................................................ Alat dan Bahan.................................................................................. Metode Penelitian.............................................................................. Media Tumbuh .................................................................... Isolasi DNA Genom S. costaricanus 45I-3 .......................... Isolasi pBluescript II KS (+) dari E. coli .............................. Pembuatan Pustaka Genom .................................................. Ligasi ...................................................................... Pembuatan Bakteri Kompeten .................................. Proses Transformasi ................................................. Seleksi Transforman ................................................. Seleksi Klon Xilanase............................................................ Pendeteksian Aktivitas -Xilosidase ......................... Verifikasi Plasmid Rekombinan .......................................... Ekspresi Gen Penyandi Xilanase di E. coli DH5 ................ Pengujian Aktivitas Xilanase Rekombinan ................. Pengujian Aktifitas Spesifik Xilanase Rekombinan ....
21 21 22 22 22 23 24 25 25 25 26 26 26 27 27 27 28
HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi DNA Genom S. costaricanus 45I-3 ........................................ Isolasi pBluescript II KS(+) ............................................................. Pembuatan Pustaka Genom ............................................................. Seleksi Klon Rekombinan ............................................................... Pendeteksian Aktivitas -Xilosidase ................................................ Ekspresi Gen Penyandi Xilanase di E. coli DH5 ............................
30 33 33 36 38 39
SIMPULAN ....................................................................................................
43
SARAN ...........................................................................................................
43
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................
44
LAMPIRAN....................................................................................................
49
PENDAHULUAN Latar Belakang Perkembangan dan kemajuan di bidang pertanian menyebabkan peningkatan volume limbah pertanian berlignoselulosa seperti jerami padi, jerami jagung, tongkol jagung, tandan kosong kelapa sawit, dan sabut kelapa. Lignoselulosa yang tersusun atas selulosa, hemiselulosa dan lignin merupakan biopolimer yang berpotensi memiliki nilai ekonomi jika diuraikan menjadi produk akhir yang bermanfaat (Howard et al. 2003). Xilan merupakan komponen utama penyusun hemiselulosa yang kelimpahannya terbanyak kedua setelah selulosa dan banyak ditemukan pada dinding sel tumbuhan dengan konsentrasi berkisar antara 30-35% dari berat kering total. Struktur utama biopolimer xilan adalah D-xilosa yang berikatan -1,4 dan memiliki percabangan yang mengandung gugus asetil,
-L-arabinofuranosil, dan
asam 4-metil glukoronat (Baraznenok et al. 1999, Kulkarni et al. 1999, Subramaniyan dan Prema 2002).
Pendegradasian biopolimer xilan menjadi
komponen penyusunnya yang lebih sederhana bertujuan untuk mendapatkan xilooligosakarida, xilobiosa atau xilosa dan senyawa turunannya seperti xilitol dan furfural (Howard et al. 2003). Untuk menguraikan biopolimer xilan secara lengkap menjadi unit-unit penyusunnya dibutuhkan suatu sistem enzim xilanolitik yang biasanya tersusun oleh -1,4-endoxilanase,
-xilosidase,
-L-arabinofuranosidase,
-glukuronidase, asetil
xilan esterase, dan asam fenolat (asam ferulat dan p-koumerat ) esterase (Beg et al. 2001). Enzim-enzim xilanolitik banyak dihasilkan oleh mikroba yang hidup pada sisa tumbuhan seperti fungi dan bakteri. Sintesis
endo-1,4- -xilanase (1,4- -D-
xylanxylanohydrolase, EC. 3.2.1.8) dan -xilosidase (1,4- -D-xylanxylanohydrolase, EC. 3.2.1.37) biasanya berhubungan dengan penguraian sisa tumbuhan tersebut. Bakteri penghasil xilanase yang tidak berhubungan dengan sifat patogen pada tumbuhan diantaranya adalah Bacillus dan Streptomyces (Subramaniyan dan Prema 2002).
Potensi Streptomyces untuk menghasilkan antibiotik sudah dikenal sejak lama.
Selain mampu menghasikan antibiotik, Streptomyces juga memiliki
kemampuan untuk menghasilkan senyawa metabolit seperti enzim, inhibitor enzim, biopigmen dan immunomodifier (Hayawaka 2003). Kemampuan Streptomyces untuk menghasil-kan enzim ekstraselular juga sangat berhubungan dengan kemampuan bakteri ini untuk tetap bertahan pada lingkungan yang kurang menguntungkan (Alexander 1977). Xilanase yang dihasilkan dari Streptomyces umumnya memiliki kestabilan pada rentang pH 4,5 – 6,5 dan suhu 60-65 oC (Subramaniyan dan Prema 2002). Dengan karakter demikian maka xilanase dari genus ini bersifat termostabil atau diistilahkan sebagai termozim. Xilanase yang diperoleh dari isolat Streptomyces sp. 45I-3 yang teridentifikasi sebagai Streptomyces costaricanus 45I-3 memiliki karakter yang menarik. Ekstrak kasar xilanase yang dihasilkan memiliki aktivitas yang cukup tinggi dan memiliki kondisi reaksi optimum pada pH 5,0 dan suhu 50 oC, stabil pada pH dan suhu optimumnya serta tahan pada penyimpanan di refrigerator selama satu bulan. Pemurnian xilanase menggunakan pengendapan dengan polimer anion Eudagrit S100 2% dan kromatografi kolom menggunakan Sephadex G100 menghasilkan aktivitas optimum pada pH dan suhu yang sama, meningkat 25,84 kali dan
mengalami
peningkatan kestabilan sebanyak empat kali. Protein hasil pemurnian memiliki dua pita dengan berat molekul 39,2 kDa dan 43,2 kDa dengan nilai Km dan Vmax berturut-turut 9057,971 IU/mg dan 7,429 mg/ml serta diduga memiliki aktivitas endoxilanase dan
-xilosidase (Meryandini et al. 2007). Pada penelitian terpisah
dilaporkan bahwa xilanase ini dapat mendegradasi xilan yang berasal dari tongkol jagung menjadi xilobiosa dan xilosa (Meryandini et al. 2006). Kebanyakan dari xilanase yang dipelajari saat ini jarang yang dapat melepaskan xilosa sebagai produk akhir hidrolisis, melainkan xilotriosa dan xilobiosa (Kluepfel et al. 1992, Berens et al. 1996, Cannio et al. 2004, Xue dan Shao 2004).
Hal ini menjadi sesuatu yang
menarik karena kemampuan untuk menghasilkan xilosa pada tahap akhir hidrolisis merupakan sifat yang dicari dari kebanyakan penelitian.
Produksi xilanase secara komersial dari Streptomyces kurang efisien dan ekonomis disebabkan pertumbuhan Streptomyces yang lambat dibandingkan dengan bakteri pada umumnya (Paul dan Clark 1996). Pendekatan teknik rekombinasi DNA yang lebih dikenal dengan kloning gen merupakan suatu alternatif untuk memproduksi xilanase yang berasal dari S. costaricanus 45I-3 secara heterologus di Escherichia coli. Untuk mengisolasi gen spesifik dapat dilakukan dengan menyusun pustaka genom yaitu kumpulan lengkap dari potongan-potongan DNA yang dikloning dan diperoleh dari sel inang. Pustaka genom memiliki paling sedikit satu potongan DNA atau gen yang diinginkan (Alberts et al. 2002). Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengklon gen xilanase dari S. costaricanus 45I-3 ke Escherichia coli DH5 . Manfaat Penelitian Diharapkan penelitian ini dapat meningkatkan efisiensi produksi xilanase yang berasal dari S. costaricanus 45I-3.
TINJAUAN PUSTAKA Karakteristik Streptomyces sp. Sekitar
90% Actinomycetes yang diisolasi dari tanah merupakan
Streptomyces. Bakteri ini merupakan kelompok bakteri Gram positif, yang secara taksonomi
merupakan
salah
satu
genus
dari
filum
Actinobacteria,
ordo
Actinomycetales, dan famili Streptomycetaceae (Waksman dan Henrici 1943). Streptomyces bersifat termotoleran yang dapat hidup pada suhu 45-55 oC (Paul dan Clark 1996) meskipun pertumbuhan optimumnya pada suhu 25-35 oC dan pada kisaran pH yang netral (Sykes dan Skiner 1973). Hampir semua Streptomyces bersifat aerobik dan memiliki kemampuan untuk mendegradasi material yang sulit diuraikan seperti lignin, kitin, pektin, keratin, komplek aromatik, dan asam humat (Paul dan Clark 1996).
Pencirian Streptomyces seringkali diketahui dengan
terciumnya aroma tanah dari senyawa volatil geosmin. Streptomyces sp. mengalami diferensiasi selama siklus hidupnya. Pertumbuhannya pada media padat diawali dengan germinasi spora yang ditandai dengan terbentuknya hifa substrat sebagai hifa vegetatif yang akan menyerap nutrisi dari media. Kemudian hifa aerial akan tumbuh di atasnya sebagai hifa generatif. Hifa aerial membentuk miselium yang membawa rantai spora yang tersusun atas lebih dari 50 spora. Dengan menggunakan mikroskop elektron hifa aerial terlihat berpilin atau seperti rambut (Sykes dan Skinner 1973) Potensi Streptomyces untuk menghasilkan antibiotik sudah dikenal sejak lama. Beberapa antibakteri seperti eritromisin, neomisin, streptomisin, tetrasiklin, vanko-misin dan rifamisin merupakan antibiotik penting yang dihasilkannya. Selain mampu menghasikan antibiotik tersebut, Streptomyces juga memiliki kemampuan menghasil-kan senyawa-senyawa metabolit seperti enzim, inhibitor enzim, biopigmen dan immunomodifier (Hayawaka 2003).
Kemampuan Streptomyces untuk
menghasilkan enzim ekstraselular juga sangat berhubungan dengan kemampuan bakteri ini untuk tetap bertahan pada lingkungan yang kurang menguntungkan (Alexander 1977).
Kandungan basa G dan C Streptomyces sp. tergolong tinggi dengan ukuran genom sekitar 8000 kb. Bentley et al. (2002) melaporkan bahwa ukuran genom total dari S. coelicolor adalah 8667 kb yang diprediksikan terdiri atas 7825 gen dengan kandungan basa G dan C sebesar 72,12%. Ikeda et al. (2003) menyatakan panjang genom S. avermitilis adalah 9025 kb yang mengandung 7851 gen dengan kandungan basa G dan C sebesar 70,7%. Streptomyces coctaricanus.
Esnard et al.
(1995)
berhasil mengisolasi S.
costaricanus dari tanah yang banyak mengandung nematoda. Secara morfologi isolat ini memiliki hifa aerial yang berpilin terdiri atas 10-50 spora dan tidak terbungkus dalam kantong spora. Pada hifa substratnya tidak terdapat sekat (aseptat). Hifa aerialnya akan berwarna abu-abu pada medium YMA yang terdiri atas agar-agar, ekstrak khamir, dan ekstrak malt dan akan berwarna kekuningan pada media ATCC172 yang mengandung N-Z amina dan pati terlarut serta glukosa. Warna hifa tetap stabil walaupun terjadi perubahan pH pada media tumbuhnya. Secara fisiologis isolat ini dapat mentoleransi pH hingga 3,5 dan dapat menggunakan D-fruktosa, D-glukosa, D-manitol, D-xilosa, salisin dan galaktosa sebagai sumber karbon dan menghasilkan asam-asam organik.
Sumber karbon
lainnya seperti L-arabinosa, rafinosa, L-ramnosa, dan sukrosa tidak dapat digunakan untuk menghasilkan asam organik. Pertumbuhannya dihambat oleh konsentrasi NaCl diatas 5%, thalium-asetat 100 g/ml, streptomisin 20 g/ml, dan fenol 0,1%. Escherichia coli DH5 Galur E. coli DH5
merupakan salah satu galur E. coli yang banyak
digunakan dalam teknologi rekombinasi DNA. Beberapa gen pada galur E. coli ini sudah mengalami mutasi dari galur aslinya sehingga menguntungkan bila dipakai sebagai inang pada rekombinasi DNA (Woodcock et al. 1989). Gen endA1 merupakan produk mutasi titik dari gen endA. Mutasi gen endA menjadi gen endA1 dimaksudkan untuk menghindari produksi enzim endonuklease tipe I yang dapat dihasilkan oleh gen endA. Enzim ini dapat memotong plasmid
sehingga akan terbentuk nick pada plasmid atau menjadi oligonukleotidanya. Galur E. coli yang membawa mutasi gen endA (endA1) jika digunakan sebagai inang akan menghasilkan kualitas DNA plasmid yang baik karena DNA tetap utuh dan tidak terjadi nick pada DNA plasmid utas ganda ( Schoenfeld et al. 1995). Protein yang dihasilkan gen recA (RecA) berperan dalam pemasangan DNA, pembagian kromosom dan rekombinasi homolog.
Protein ini bersama protein
RecBCD akan mengenali situs chi dalam rekombinasi homolog. Untuk menjaga kestabilan plasmid DNA yang mengandung sisipan DNA didalam sel inang terhadap rekombinasi homolog, maka pada E. coli DH5 gen recA dimutasikan menjadi recA1 sehingga protein RecA tidak dihasilkan (Hanahan 1991). Gen deoR berperan dalam sintesis deoksiribosa secara konstitutif. Keberadaan gen ini di dalam galur E. coli yang digunakan sebagai inang memungkinkan untuk menjaga jumlah plasmid berukuran besar didalam sel. Hal ini sangat menguntungkan dalam penyusunan pustaka genom (Hanahan 1991). Gen gyrA96 merupakan produk mutasi dari gen gyrA. Sebelum dimutasikan gen gyrA akan menghasilkan protein DNA gyrase yang dapat menyebabkan delesi pada DNA utas ganda. Setelah dimutasikan menjadi gen gyrA96 protein DNA gyrase tidak akan dihasilkan. Galur yang membawa gen gyrA96 dapat digunakan sebagai inang untuk keperluan kloning gen karena DNA yang disisipkan pada vektor tidak akan terdelesi (Hanahan 1991). Gen lacZ M15 merupakan produk mutasi dari gen lacZ. Protein -galaktosidase merupakan produk dari gen lacZ yang terdiri atas subunit Gen lacZ M15 hanya menghasilkan subunit
dan subunit
.
(Yannisch-Perron et al. 1985). Jika
plasmid yang membawa gen yang dapat menghasilkan subunit
dari protein
-
galaktosidase dimasukkan ke dalam galur E. coli ini, maka akan terbentuk protein galaktosidase yang memiliki aktivitas menguraikan senyawa X-gal (5-bromo-4-kloro3-indolil- -D-galaktosida)
menjadi
senyawa
5-bromo-4-kloro-3-indolil
yang
berwarna biru dan D-galaktosa. Keberadaan gen lacZ M15 pada E. coli galur ini dapat dimanfaatkan untuk menyeleksi koloni yang membawa dan yang tidak membawa plasmid rekombinan. DNA akan disisipkan di Multiple Cloning Site
(MCS) yang merupakan bagian dari gen lacZ pada plasmid. Jika plasmid tidak tersisipi maka subunit
dapat dihasilkan sehingga dapat bergabung dengan subunit
yang dihasilkan inang. Gabungan kedua subunit protein tersebut akan menghasilkan protein
-galaktosidase aktif yang dapat menghasilkan koloni berwarna biru jika
terdapat senyawa X-gal pada media. Tetapi jika plasmid tersisipi maka subunit tidak akan dihasilkan sehingga walaupun terdapat senyawa X-gal pada media tumbuhnya koloni tetap akan berwarna putih (Sambrook dan Russell 2001). Teknologi Rekombinasi DNA Teknologi rekombinasi DNA berkembang setelah tahun 1970-an seiring dengan kemajuan yang pesat di bidang biologi molekular, enzimologi, dan genetika molekuler dari virus dan plasmid.
Kemajuan di bidang tersebut memungkinkan
untuk menjalankan prosedur pemindahan sekuen DNA dari satu organisme ke organisme lainnya sehingga peristilahannya sering mengarah kepada kloning gen (Glick dan Pasternak 1989). Di dalam biologi sel istilah kloning memiliki dua pengertian yaitu penggandaan sekuen tertentu dari DNA sehingga menghasilkan DNA yang identik, dan pengisolasian sekuen tertentu dari DNA suatu organisme atau sel untuk diperbanyak pada organisme atau sel yang berbeda (Alberts et al. 2002). Metode kloning umumnya mengikuti lima tahap (Nelson dan Cox 2005) meliputi : 1. pemotongan DNA dengan menggunakan enzim restriksi endonuklease yang memiliki situs pemotongan tertentu 2. memilih DNA vektor yang memiliki kemampuan bereplikasi secara otonom seperti yang dimiliki oleh virus dan plasmid 3. menggabungkan
secara
kovalen
potongan
DNA
dengan
DNA
menggunakan enzim ligase sehingga menghasilkan DNA rekombinan
vektor
4. memasukkan DNA rekombinan tersebut ke dalam sel inang yang memiliki enzimenzim yang dibutuhkan DNA rekombinan untuk bereplikasi 5. menyeleksi sel inang yang mengandung DNA rekombinan. Untuk mengisolasi gen spesifik dapat dimulai dengan menyusun pustaka genom yaitu kumpulan lengkap dari potongan-potongan DNA yang dikloning dari sel inang atau jaringan. Pustaka genom memiliki paling sedikit satu potongan DNA atau gen yang diinginkan (Alberts et al. 2002). Pemotongan seluruh DNA genom dari suatu species dengan menggunakan enzim restriksi endonuklease dan mengklonkan setiap potongan DNA yang dihasilkan kepada vektor yang sesuai dikenal sebagai shotgun kloning. Teknik ini menghasilkan potongan DNA yang cukup banyak sehingga vektor rekombinan yang diperoleh memiliki sisipan DNA yang berbeda-beda.
Vektor yang mengandung
potongan DNA genom disebut sebagai klon DNA genomik sehingga keseluruhan koleksi vektor rekombinan disebut sebagai pustaka DNA genomik.
Karena
pemotongan dilakukan secara acak maka hanya beberapa vektor rekombinan yang mengandung gen (Alberts et al. 2002). Setelah pustaka genom dibuat, klon yang diperoleh diseleksi dengan mengidentifikasi DNA sisipan yang mengandung gen yang diinginkan. Tiga metode yang umum digunakan untuk mengidentifikasi klon yang mengandung gen yang diinginkan (Glick dan Pasternak 1989) meliputi : 1. Hibridisasi DNA, keberadaan gen dilacak dengan menggunakan pelacak sehingga akan terbentuk ikatan hidrogen antara pasangan basa yang sesuai dari utas tunggal gen dan utas tunggal DNA pelacak. 2. Immunologi assay, jika DNA klon diekspresikan pada sel inang menghasilkan protein, keberadaan protein tersebut dapat dideteksi dengan antibodi primer. Untuk lebih spesifik ditambahkan antibodi sekunder yang biasanya berupa enzim yang dapat mengubah substrat menjadi produk yang berwarna, sehingga klon yang positif mengandung gen yang diinginkan akan menghasilkan warna pada media.
3. Aktivitas protein, jika gen target dapat menghasilkan protein enzim maka pemilihan klon dapat dilakukan dengan menggunakan aktivitas enzim untuk mengkatalis substrat menjadi produk pada media. Jika protein enzim yang dihasilkan penting untuk pertumbuhan sel inangnya maka sel inang memiliki kemampuan untuk tumbuh pada media minimum yang hanya mengandung substrat untuk enzim yang dihasilkan tersebut. Plasmid Plasmid merupakan DNA ekstra kromosomal dari prokariot dengan ukuran sangat bervariasi dari 1 kb hingga 200 kb. Sebagian besar plasmid berbentuk sirkuler dan dalam keadaan superkoil. Bentuk sirkuler atau superkoil ini memudahkan dalam pemisahan dengan DNA kromosom pada saat isolasi menggunakan metode alkalin. Keistimewaan DNA plasmid adalah kemampuannya bereplikasi secara otonom tanpa bergantung pada replikasi DNA kromosom. Hal ini disebabkan oleh sekuen replikon yaitu bagian kecil dari plasmid yang merupakan elemen yang berhubungan dengan cis-acting dan memiliki situs untuk berdifusi dengan perangkat protein replikasi dari sel inang pada inisiasi sintesis DNA. Dengan demikian pada pembelahan sel inang jumlah plasmid yang terbawa sel turunannya akan sama banyaknya. Plasmid juga membawa gen yang menyandikan beberapa enzim yang berguna bagi inangnya seperti gen penyandi resistensi terhadap antibiotik, gen penyandi protein yang dapat menguraikan senyawa-senyawa organik komplek, gen yang dapat memproduksi kolisin, enterotoksin dan enzim-enzim restriksi (Sambrook dan Russell 2001). Plasmid dapat masuk atau ke luar sel tanpa mengganggu pertumbuhan sel, oleh karena itu plasmid dapat digunakan sebagai vektor untuk membawa gen tertentu. Beberapa hal yang menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai vektor dalam rekombinasi DNA adalah karena memiliki ori, memiliki berat molekul rendah, mampu mengekspresikan gen yang dibawanya dari sel asal ke sel inang, memiliki situs pemotongan tunggal untuk kebanyakan enzim restriksi endonuklease, dan mempunyai dua atau lebih gen penanda (Primose 1991).
Salah satu plasmid yang dapat digunakan sebagai vektor dalam rekombinasi DNA adalah pBluescript II KS (+).
Plasmid ini disebut juga phagemid karena
membawa dan menggunakan ori dari utas tunggal bakteriofag berfilamen (M13 atau f1) (Sambrook dan Russell 2001). Ukuran plasmid pBluescript II KS (+) adalah sekitar 3 kb, membawa gen resitensi terhadap antibiotik ampisilin dan gen reporter lacZ. Pada lacZnya terdapat polylinker ekstensif dengan 21 situs pengenalan enzim restriksi endonuklease yang unik. Pada bagian ujung polylinker terdapat T7 dan T3 promotor RNA polimerase yang terletak pada bagian N terminal gen lacZ dan dapat digunakan untuk mensintesis RNA secara in vitro. Gambar 1 menunjukkan peta pBluescript II KS (+). Jika plasmid ini ditransformasikan pada sel E. coli DH5 kompeten dan ditumbuhkan pada media yang mengandung X-gal maka koloni yang tumbuh akan berwarna biru. Hal ini disebabkan oleh bergabungnya protein subunit yang dihasilkan plasmid dan subunit
yang dihasilkan sel E. coli DH5 . Gabungan
dua subunit ini menghasilkan protein -galaktosidase aktif yang mampu memecah ikatan pada X-gal menghasilkan senyawa berwarna biru. Bila daerah polylinker tersisipi oleh DNA insert maka koloninya akan berwarna putih (Anonim 2003).
~
Gambar 1 Struktur pBluescript II KS (+) (Anonim 2003 dalam www.stratagene.com)
Struktur dan Keberadaan Xilan Secara kimiawi xilan merupakan heteropolimer kompleks dengan rantai utamanya tersusun atas xilosa yang berikatan -1,4-glikosida sehingga rantai utama ini sering disebut sebagai residu
-xilopiranosa.
Selain rantai utama penyusun
polimernya terdapat rantai samping yang berupa arabinosa, galaktosa, asam glukoronat, asam asetat, asam ferulat dan asam p-koumarat.
Dari struktur yang
dibentuknya xilan dapat digolongkan menjadi homoxilan linier, arabinoxilan, glukuronoxilan dan glukurono-arabinoxilan (Beg et al. 2001; Saha 2000). Gambar 2 menggambarkan struktur hipotetikal dari molekul xilan.
Ikatan -1,4-D-xilopiranosa
ENDOXILANASE
-xilosidase
Ikatan asam -1,2-4-0metil-D-glukuronat
ASETIL- XILANESTERASE Ikatan -1,3-Larabinofuranosida
GLUKURONIDASE
Ac : gugus asetil R-H : asam p-kumarat R-OCH3 : asam ferulat
- LARABINOFURANOSIDASE
FERULIL dan p-KUMAROIL ESTERASE
Gambar 2 Struktur hipotetikal xilan dari tumbuhan dan berbagai enzim xilanolitik yang bekerja untuk menghidrolisis ikatan yang terdapat pada struktur xilan tersebut (Beg et al. 2001). Xilan merupakan komponen utama penyusun hemiselulosa yang banyak ditemukan pada dinding sel tumbuhan dengan konsentrasi berkisar antara 30-35% dari berat kering total. Kandungan xilan pada tumbuhan berkayu keras dari golongan Angiospermae lebih tinggi (15-30%) dibandingkan dengan tumbuhan berkayu lunak dari golongan Gimnospermae (7-12%). Xilan pada kayu keras berupa O-asetil-4-Ometilglukoronoxilan yang rantai utamanya tersusun oleh paling sedikit 70 residu -
xilopiranosa dengan derajat polimerisasi antara 150-200 yang membentuk ikatan 1,4-glikosida. Setiap sepuluh residu xilosa terikat asam 4-O-metil glukuronat pada posisi atom C nomor 2 di xilosa kedua. Pada kayu keras ini asetilasi xilan lebih banyak ditemukan pada posisi atom C nomor 3 dibanding dengan atom C nomor 2. Adanya asetil menyebabkan xilan dapat larut di air. Gugus asetil dapat dihilangkan dengan perlakuan basa (Beg et al. 2001). Pada kayu lunak, xilan tersusun atas arabino-4-O-metilglukuroxilan dan dengan kandungan asam 4-O-metilglukuronat yang lebih tinggi dibanding xilan pada kayu keras. Asam 4-O-metilglukuronat terikat pada atom C nomor 2 dari xilosa. Xilan pada kayu lunak tidak terasetilasi karena atom C nomor 3-nya telah mengikat -L-arabinofuranosa dengan membentuk ikatan -1,3 glikosida.
Perbandingan
-D-xilopiranosa, asam 4-O-metil- -D-glukuronat,
dan L-arabinofuranosa adalah 100:20:13 (Puls dan Scuseil 1993 dalam Beg et al. 2001). Struktur xilan pada kayu lunak lebih pendek dan percabangannya lebih sedikit jika dibandingkan dengan xilan kayu keras dengan derajat polimerisasi antara 70-130. Kandungan monomer penyusun xilan dari beberapa tumbuhan disajikan pada Tabel 1. Tabel 1 Komposisi monomer (%) berbagai sumber xilan (Saha 2003). Jenis xilan Birchwood Rice bran Wheat arabinoxilan Corn fiber
Xilosa
Arabinosa
Glukosa
Manosa
Galaktosa 6,1 0,1
Asam anhiro Uronat 8,3 1,1 -
Asam glukuronat -
89,3 46 65,8
1 44,9 33,5
1,4 1,9 0,3
0,1
46-54
33-35
-
-
5-11
-
3-6
Enzim Xilanolitik Hidrolisis molekul xilan menjadi molekul penyusunnya secara sempurna memerlukan sistem enzim xilanolitik yang bergantung dari struktur xilan itu sendiri. Enzim-enzim xilanolitik terdiri atas -1,4-endoxilanase, -xilosidase,
-L-arabino-
furanosidase, -glukuronidase, asetil xilan esterase, dan asam fenolat (asam ferulat dan p-koumarat ) esterase (Beg et al. 2001). Gambaran cara kerja enzim-enzim
hidrolitik tersebut dapat dilihat pada Gambar 2. Keberadaan sistim enzim xilanolitik terdapat pada berbagai mikroorganisme seperti fungi, actinomycetes, dan bakteri. Enzim endo-1,4- -xilanase (1,4- -D-xylanxylanohydrolase, EC. 3.2.1.8) menghidrolisis secara acak struktur dasar xilan menjadi xilooligosakarida. Kelompok rantai sampingnya dihidrolisis oleh -L-arabinofuranosidase, asetil xilan esterase.
-glukuronidase, dan
Enzim endo-1,4- -xilanase sebagian besar dihasilkan oleh
mikroorganisme seperti bakteri dan fungi, dan beberapa diantaranya juga dihasilkan oleh tumbuhan dan hewan (Subramaniyan dan Prima 2002). Enzim -xilosidase (1,4- -D-xylanxylanohydrolase, EC. 3.2.1.37) menghidrolisis 1,4- -D-xilooligosakarida dari ujung nonpereduksi serta menyederhanakan xilooligosakarida menjadi xilosa. Enzim ini mampu pula menghidrolisis substrat arilxilosida.
Selain itu beberapa enzim
furanosidase (13% dari
-xilosidase memiliki aktivitas
-L-arabino-
-xilosidase), namun tidak memiliki aktivitas glikosidase
yang lainnya ( Yaw et al. 2000). Enzim
-L-arabinofuranosidase (EC. 3.2.1.55) menghidrolisis ujung non
pereduksi antara ikatan
-L-arabinofuranosida dengan berbagai polisakarida yang
mengandung arabinofuranosa. Adanya rantai samping L-arabinofuranosida dalam struktur xilan dapat memberikan halangan ruang untuk aktivitas endoxilanase dan xilosidase karena strukturnya yang besar dapat menghalangi kedua enzim tersebut untuk mengakses ikatan glikosidik pada molekul xilan. Oleh karena itu keberadaan enzim arabinofuranosidase sangat penting dalam degradasi total molekul xilan (Debeche et al. 2002; Shallom et al. 2002). Enzim
-D-glukuronidase (EC 3.2.1.1) dibutuhkan untuk menghidrolisis
ikatan 1,2- -glikosidik antara xilosa dengan asam D-glukuronat atau ikatan -O-metil ester. Hidrolisis lengkap glukuronoxilan memerlukan enzim golongan esterase untuk melepaskan ikatan asam asetat dan fenol. Enzim asetil xilan esterase (EC 3.1.16) menghidrolisis ikatan antara xilosa dengan asam asetat, rantai sisi gula reduksi arabinosa dengan asam ferulat (feruloyl esterase), dan rantai sisi gula reduksi arabinosa dengan asam p-koumarat (p-coumaroyl esterase). Hidrolisis ikatan-ikatan tersebut pada rantai utama xilan oleh enzim asetil xilan esterase membantu dalam
mereduksi lignin pada biobleaching pulp. Hal ini disebabkan oleh terputusnya ikatan ester antara lignin dan hemiselulosa sehingga struktur dinding sel menjadi lebih longgar (Subramaniyan dan Prema 2002). Enzim xilanase yang berasal dari mikroba diklasifikasikan oleh Wong et al. (1988) ke dalam dua famili utama berdasarkan sifat fisiko-kimianya, yaitu massa molekul relatif dan titik isoelektrik atau point isoelectric-nya (pI). Famili GH10 (disebut juga famili F) merupakan kelompok endoxilanase dengan massa molekul relatif tinggi dengan nilai pI yang rendah. Sebaliknya famili GH11 (disebut juga famili G) merupakan kelompok endoxilanase yang memiliki massa molekul relatif yang rendah dan nilai pI yang tinggi. Perbedaan antara keduanya terletak pada aksi enzim tersebut dimana famili 10 mampu menyerang ikatan glikosidik di sebelah titik cabang dan mengarah keujung nonpereduksi dengan menggunakan dua residu xilopiranosil nonsubstitusi antara cabang-cabang, sedangkan famili 11 menggunakan tiga residu xilopiranosil nonsubstitusi.
Berdasarkan hal tersebut famili 10
mempunyai beberapa aktivitas katalitik yang sesuai dengan dengan -xilosidase. Pengklasifikasian enzim xilanase saat ini tidak hanya digunakan untuk enzimenzim xilanase tetapi juga untuk enzim-enzim glikosidase (EC 3.2.1.x). Dasar utama pengelompokannya adalah aktivitas enzim dalam menghidrolisis ikatan glikosida dan dilanjutkan dengan kesamaan struktur utama dari sekuen katalitik domain. Hingga saat ini terdapat 96 famili enzim berdasarkan sistem pengelompokannya (Collins et al. 2005). Beberapa isolat Streptomyces diketahui mampu menghasilkan enzim xilanolitik.
Streptomyces halstedii JM8, S. lividans dan S. olivaceoviridis E-86
menghasilkan endo-1,4- -xilanase (EC 3.2.1.8) dan selobiohidrolase (EC 3.2.1.91) yang termasuk dalam famili 10. Streptomyces sp. S38 dapat menghasilkan xilanase famili 11 (Collins et al. 2005). Famili 11 ini bersifat monospesifik yang hanya menghidrolisis 1,4- -D-xilooligosakarida melalui pelepasan secara berturut-turut gula reduksi D-xilosa dari ujung non pereduksinya.
Mekanisme Reaksi Hidrolisis Xilanase Model yang dapat menjelaskan mekanisme molekular reaksi hidrolisis xilanase terhadap polimer xilan dihasilkan oleh dua mekanisme yaitu retensi dan inversi. Hal ini memerlukan satu atau dua keadaan transisi dari komplek enzim substrat. Pemindahan glikosil merupakan hasil dari substitusi nukleofilik pada gugus karbon dari gula pereduksi yang terlarut pada pusat anomerik dan diperoleh melalui kedua mekanisme yaitu retensi atau inversi. Enzim selulase dan xilanase kebanyakan diketahui menghidrolisis substratnya dengan konfigurasi retensi dari C1 anomerik. Hal ini membutuhkan mekanisme pemindahan ganda untuk retensi anomerik dari produk. Mekanisme pemindahan ganda mengikuti tahapan sebagai berikut : i. katalis asam akan memprotonasi substrat ii. gugus karboksil dari enzim terbentuk iii. terbentuk ikatan kovalen intermediat glikosil enzim dimana gugus karboksilat membentuk konfigurasi anomerik pada gula yang berseberangan dari substrat yang dihidrolisis. iv. ikatan kovalen intermediat ini dicapai dari dua arah menuju keadaan transisi yang memerlukan ion-ion oxokarbonium v. variasi dari interaksi non kovalen yang terjadi sangat berperan dalam memperbaiki laju reaksi (Subramaniyan dan Prema 2002). Sebagai contoh untuk menjelaskan mekanisme reaksi hidrolisis xilanase disajikan pada Gambar 3 yang merupakan mekanisme hidrolisi xilanase dari Bacillus circulans.
Gambar 3 Mekanisme reaksi dari xilanase B. circulans (1XNB). A : Struktur helikal xilan ada pada Tyr 65 dan Tyr 69, Glu 172 adalah katalis asam basa dan Glu 78 adalah nukleofilik. B : Glikon terikat pada Glu 78 membentuk intermediat yang terus dipertahankan selama reaksi transglikosilasi. C : Molekul air memindahkan nukleofilik. D : Disosiasi dan diffusi dari glikon (xilobiose) memungkinkan perpindahan enzim pada posisi yang baru terhadap substrat. Xilanase famili 11 menunjukkan mekanisme endo secara acak yang disebabkan oleh glikon yang dihasilkan pada tahap B dan D (Subramaniyan dan Prema 2002).
Regulasi Biosintesis Xilanase dari Mikroba Enzim xilanase banyak dihasilkan dari mikroba terutama fungi dan bakteri. Faktor penting yang harus diperhatikan dalam produksi enzim dari mikroba adalah pemilihan induser yang tepat dan komposisi media yang optimum. Hal ini berkenaan dengan regulasi sintesis enzim xilanase dari mikroba. Xilan merupakan molekul besar sehingga dalam kondisi utuh tidak dapat masuk ke dalam sel. Fragmen xilan dengan berat molekul lebih kecil seperti xilosa, xilobiosa, xilooligosakarida dan heterodisakarida dari xilosa dan glukosa memegang peranan penting dalam biosintesis xilanase.
Xilanase dapat dihasilkan secara
konstitutif maupun indusif. Xilanase yang dihasilkan secara konstitutif mendegradasi xilan menjadi xilooligosakarida dan xilobiosa, sehingga molekul ini dapat diangkut kedalam sel untuk menginduksi gen xilanase lainnya. Xilanase indusibel lebih lanjut akan mendegradasi xilan menjadi xilooligosakarida dan xilobiosa.
-xilosidase yang
diproduksi baik secara konstitutif dan/atau indusif mengubah xilobiosa menjadi xilosa dan selanjutnya diikuti oleh proses transglikosilasi menjadi XylB1-2Xyl dan GlcB1-2Xyl. Senyawa ini akan dimasukkan ke dalam sel dan bertindak sebagai induser tambahan bagi gen penyandi xilanolitik (Kulkarni et al. 1999). Selengkapnya regulasi biosintesis xilanase dapat dilihat pada Gambar 4.
Membran Sel Sitoplasma
Glukosa/Xilosa
Ekspresi Xilanase
Cairan Kultur Ekstra Selular
Mesin sekresi
Permease
Mesin sekresi
Aktivitas Xilanase Konstitutif Induksi Xilanase Primer
Xilan Xilooligosakarida Xilosidase Xilobiosa
Homo/Hetero Disakarida
Xilobiosa Xilosa
Glukosa
Induksi Xilanase Tahap Kedua
Xilanase Xilosidase Transglikosi dase
Gambar 4 Model hipotetik regulasi biosintesis xilanase (Kulkarni et al. 1999). Xilanase sebagian besar dihasilkan oleh mikroba secara indusif antara lain oleh Trametes trogii (Levin dan Forsciassin 1998 dalam Beg et al. 2001), Aspergillus awamori (Siendenberg et al. 1998 dalam Beg et al 2001), dan Streptomyces sp. QG-11-33 (Beg et al. 2000).
Induksi xilanase oleh berbagai
senyawa seperti L-sorbose, beragam xilooligosakarida, xilosa, dan lignoselulosa dilaporkan oleh banyak peneliti antara lain diinduksi oleh L-sorbose pada Sclerotium rolfsii (Sachslehner et al. 1998 dalam Beg et al 2001) dan Trichoderma reesei PC-3-7 (Xu et al. 1998). Induksi oleh xilosa dan glukosa bersifat sebagai aktivator terdapat pada Bacillus sp. BP-7 (Lopez et al. 1998), dan Trichosporon cutaneum SL409 (Liu et al. 1998 dalam Beg et al. 2001).
Dalam beberapa kondisi dilaporkan metabolit
sederhana seperti glukosa dan/atau xilosa yang merupakan hasil aktivitas xilanase dapat menjadi represor untuk biosintesis xilanase (Beg et al. 2001).
Kloning Gen Xilanase Untuk tujuan komersial dan peningkatan nilai ekonomis dari produksi xilanase sangatlah penting untuk mencari organisme yang mampu melakukan overproduksi enzim tersebut. Teknik rekombinasi DNA merupakan salah satu teknik yang dapat digunakan untuk memperbaiki produksi xilanase. Gen xilanase yang terdapat pada mikrooorganisme banyak
dijumpai
berhubungan dengan fungsi gen yang menyandikan selulase contohnya pada Pseudomonas fluorescens, selulase, xilanase dan arabinofuranosidase ditranskripsikan pada arah yang sama dan hanya dipisahkan oleh 148 bp. Walaupun letak gen-gen tersebut berdekatan tetapi belum cukup bukti untuk mengatakan bahwa transkripsinya berlangsung secara polisistronik (Kulkarni et al. 1999). Aktivitas xilanase yang digunakan pada industri kertas diharapkan bebas dari dari aktivitas selulase, oleh sebab itu Biely (1985) mengatakan bahwa tujuan dari kloning gen xilanase adalah : (i) untuk mengkonstruksi produser yang menghasilkan sistim xilanolitik yang bebas dari enzim selulolitik; (ii) Memperbaiki karakteristik industrial mikroorganisme dengan memasukkan gen xilanase dan xilosidase. Sejumlah gen xilanase telah di kloning baik secara heterologus maupun homologus. Pada kloning heterologus menggunakan E. coli sebagai inang aktivitas xilanase sering mengalami penurunan yang disebabkan oleh adanya modifikasi pasca translasi dan adanya akumulasi xilanase rekombinan di dalam sel (Kulkarni et al. 1999).
Untuk menghindari hal tersebut, teknik over-ekspresi banyak dilakukan
dengan menggunakan promotor kuat pada vektor yang digunakan. Sebagai mikroba potensial penghasil enzim-enzim metabolik, Streptomyces dapat dijadikan alternatif untuk digunakan sebagai penghasil xilanase. Walaupun masih sedikit studi yang dilakukan dibandingkan dengan studi dengan menggunakan mikroba lainnya, beberapa peneliti telah melakukan kloning gen baik secara heterologus maupun homologus dari gen xilanase Streptomyces. Tabel 2 menyajikan kloning gen xilanase yang berasal dari beberapa Streptomyces yang diekspresikan secara heterologus maupun homologus.
Tabel 2 Kloning gen xilanase dari Streptomyces Organisme S. lividans
Vektor yang digunakan pIJ702
Inang Nama S. lividans
Keterangan
Referensi
Tiga klon memiliki sisipan fragmen DNA rata-rata 2 kb
Mondou et al.
yang membawa seluruh gen struktural. Klon mensekresi-
1986
kan xilanase dengan berat molekul 43 kDa. S. halstedii JM8
pIJ702 dan pIJ487
S. lividan, S. albus,
Terdapat aktivitas xilanase yang terdiri dari 2 pita protein
Ruiz-Arribas
dan S. parvulus
berukuran 45 dan 35 kDa yang merupakan ekspresi dari
et al. 1995
xys1L dan xys1S S. thermoviolaceus
pUC18 dan pUC19, phage
E. coli JM 109 dan
Tiga gen menyandikan dua tipe endo-xilanase (STX-I dan
Tsujibo et al.
OPC-520
M13mp18, phage M13mp19 dan
S.griseus PSR2
STX-II) dan asetil xilan- esterase (STX-III). Transforman
1997
pIJ702
E. coli membawa sisipan fragmen 3,3 kb (fragmen BamHI) yang membawa 1,005 kb stxII dan 0,993 kb stxIII. Transforman S. griseus membawa sisipan 2,7 kb (fragmen SphI) ORF stxI terdapat pada sekuen 121 – 1549.
S. thermoviolaceus
pUC18 dan pUC19, pET-20b
E. coli JM 109 dan
pBXL1 membawa sisipan 3,8 kb yang membawa gen
Tsujibo et al.
OPC-520
untuk ekspresi
E. coli BL21(DE3)
bxlA (2,1 kb) yang mengekspresikan -xilosidase.
2001
S. thermoviolaceus
pUC18 dan pUC19, phage
E. coli JM 109
pXY95 membawa sisipan 2,8 kb yang membawa gen stxI
Tsujibo et al.
OPC-520
M13mp18, phage M13mp19 dan
dan stxIV ( -L-arabinofuranosidase). Gen stxIV berada
2002
pIJ702
1,47 kb di atas gen stxI yang terpisah oleh 663 nukleotida dan ditranskripsikan secara divergen.
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juli 2007 sampai bulan Juni 2008 di : 1. Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis PPSHB IPB 2. Laboratorium Mikrobiologi Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika Pertanian Bogor. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah autoklaf (ISO LAB, Germany), inkubator bergoyang (GFL 3031, Germany), laminar air flow (Esco, Singapore), sentrifuge (Mikro 22R Hettich, Germany dan Himac Centrifuge CR2092 Hitachi, Japan), inkubator (Memert, Germany), analytical balance (Precisa XR 305A, Switzerland), microwave oven (National NN-5557WF, Indonesia), elektroforesis sistem (Mupid, Japan), Chemi-Doc EQ (Biorad, USA), UV-Vis spektrofotometer (SmartSpeck Biorad, USA), UV-Vis spektrofotometer (Hitachi, Japan), slow speed rotomix (Thermolyne, USA) dan pipet mikro (Gilson, France). Isolat bakteri S. costaricanus 45I-3 yang digunakan berasal dari Kalimantan koleksi Dr. Ir. Yulin Lestari, Biologi IPB, E. coli DH5
Bagian Mikrobiologi Departemen
yang digunakan merupakan koleksi Laboratoium
BIORIN PPSHB IPB, dan plasmid yang digunakan sebagai vektor adalah pBluescript II KS(+) (Stratagene, USA) koleksi dari Laboratorium Mikrobiologi Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika Pertanian Bogor. Semua bahan kimia yang digunakan berspesifikasi pro-analisis (p.a.) kecuali jika disebut khusus.
Metode Penelitian Media Tumbuh Isolat S. costaricanus 45I-3 secara rutin ditumbuhkan pada media agaragar xilan dengan komposisi (%) : 1,0 ekstrak khamir; 10,3 sukrosa; 0,5 xilan birchwood (Sigma); 15,0 agar-agar. Untuk tujuan isolasi DNA, S. costaricanus 45I-3 dikultur pada media YM (komposisi (%) : 0,4 ekstrak khamir; 1,0 ekstrak malt; 1,5 glukosa; atau media YEME (komposisi (%) : 0,3 ekstrak khamir; 0,3 ekstrak malt; 1 glukosa; 0,3 peptone; 34 sukrosa; 0,0515 MgCl2; 0,5 glycine) lalu diinkubasi dan diagitasi pada inkubator bergoyang pada kecepatan 130 rpm pada suhu ruang selama 5 hari. E. coli DH5 ditumbuhkan pada media Luria Betani (LB) pada suhu 37 oC selama 16-18 jam dengan penambahan antibiotika ampisilin (150
g/ml) jika
diperlukan. Isolasi DNA Genom S. costaricanus 45I-3 Untuk isolasi DNA genom digunakan lisozim dan SDS 10% dan CTAB sebagai pelisis sel serta fenol kloroform untuk pemurniannya (Tripathi dan Rawal, 1998). Sebanyak 50 ml biakan S. costaricanus 45I-3 disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm pada 4 oC selama 10 menit, supernatannya dibuang dan pelet yang terbentuk dicuci dengan bufer STE (komposisi: 0,3M sukrosa; 25,0mM Tris-HCl; 25,0mM EDTA.2Na pH 8), kemudian disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm 4 o
C selama 10 menit. Supernatannya dibuang dan terhadap pelet yang diperoleh
ditambahkan 8,55 ml bufer STE dan 950 l lisozim ( 20 mg/ml dalam bufer STE), dibolak-balik secara halus lalu diinkubasi pada 30 oC selama 20-30 menit hingga terbentuk protoplas. Sebanyak 500
l SDS 10% dan 50
l
proteinase-K
(20mg/ml) ditambahkan pada campuran tersebut dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 60 menit. Setelah itu ke dalam campuran ditambahkan 1,8 ml 5M NaCl dan dibolak-balik secara halus, dan ditambahkan 1,5 ml 10% CTAB larutan 0,7M NaCl lalu diinkubasi pada suhu
dalam
o
65 C selama 20 menit. Kemudian
ke dalam larutan ditambahkan 1 kali volume fenol:kloroform (25:24) dan disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm pada 16 oC selama 10 menit. Fase bening dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan 0,6 kali volume isopropanol,
inkubasikan pada suhu
-20 oC selama 30 menit. DNA yang terbentuk diangkat
dengan menggunakan ujung pipet lalu DNA dikeringkan hingga berwarna transparan dan dilarutkan dengan 50 l ddH2O steril. Larutan DNA disimpan pada suhu 4 oC atau -20 oC untuk pemakaian dalam jangka panjang. Isolasi pBluescript II KS (+) dari E. coli E. coli (pBluescript II KS(+)) ditumbuhkan pada media LB yang mengandung 150 g/ml ampisilin lalu diinkubasi dan diagitasi pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 180 rpm pada suhu 37 oC selama 16-18 jam. Sebanyak 1500 l biakan E. coli dipindahkan ke tabung mikro lalu disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit. Supernatannya dibuang dan pelet sel diresuspensi dalam 150 l larutan A (50mM glukosa, 25mM tris HCl
pH 8 ,
10mM EDTA pH 8) dingin selama 10 menit. Setelah itu sebanyak 200 l larutan B (0,2N NaOH, 1% w/v SDS) ditambahkan dan dibolak-balik secara halus lalu ditambahkan 150 l larutan C (5M Na-asetat, 11,5% asam asetat glasial) dan dibiarkan selama 5 menit. Larutan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit lalu supernatan dipindahkan ke tabung mikro yang baru dan ditambahkan 500 l fenol:kloroform (25:24) dan divortek selama 1 menit. Campuran kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit dan fase cair pada bagian atas dipindahkan ke tabung mikro yang baru. Sebanyak 2 kali volum isopropanol ditambahkan ke fase cair yang diperoleh lalu dibolakbalik secara halus dan diinkubasi pada suhu -20 oC selama 30 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan terhadap pelet yang diperoleh ditambahkan 300
l 70% etanol dan
disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan hingga berwarna transparan dan dilarutkan dalam 50 ddH2O steril.
o
Larutan DNA disimpan pada suhu 4 C atau -20
pemakaian dalam jangka panjang.
o
l
C untuk
Pembuatan Pustaka Genom DNA genom hasil isolasi dipotong secara parsial menggunakan enzim Sau3A1 (Sigma, Germany).
Ke dalam tabung mikro secara berurutan
ditambahkan 39 l ddH2O, 5 l bufer 10X, 5 l DNA, dan 1 l enzim Sau3A1. Larutan ini diinkubasi pada suhu 37 oC selama 5 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan blue juice atau diinkubasi pada suhu 65 oC selama 5 menit. DNA hasil pemotongan dielektroforesis dengan menggunakan 0,8% agarosa dalam 1X TAE bufer. Fragmen DNA berukuran 4–10 kb dipotong dari gel dan dipindahkan ke tabung mikro. Selanjutnya DNA diisolasi kembali dengan menggunakan glass bead (Geneclean BIO101, USA). Sebanyak 3 kali volume 6M NaI ditambahkan ke potongan gel yang diperoleh, lalu tabung dibolak-balikkan sambil diinkubasi pada suhu 55 oC hingga seluruh gel larut. Ke dalam larutan tersebut ditambahkan 7 l suspensi glass bead dan diinkubasi pada suhu ruang sambil dibolak-balik, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 30 detik, supernatannya dibuang dan endapannya diresuspensikan dalam 500 l larutan pencuci (larutan stok terdiri atas 20mM Tris-HCl pH 7.4, 1mM EDTA, 100mM NaCl; ketika akan digunakan 14 ml larutan stok pencuci dilarutkan dalam 140 ml dH2O steril dan 155 ml etanol absolut), pencucian pelet diulang sebanyak 3 kali. Tabung kembali disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 30 detik untuk mendapatkan endapan. Kemudian endapan dilarutkan dalam 20 l ddH2O steril dan diinkubasi pada suhu 55-60 oC selama 30 menit. Setelah itu tabung disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 3 menit, supernatan yang berisi DNA dipindahkan ke tabung baru dan disimpan pada suhu
4 oC untuk penggunaan selanjutnya.
Vektor pBluescript II KS (+) dipotong dengan enzim BamHI. Ke dalam tabung mikro secara berurutan ditambahkan 43 l ddH2O, 5 l bufer 10X, 1 l vektor, dan 1 l BamH1 lalu diinkubasi pada suhu 37 oC selama satu malam. Reaksi dihentikan dengan penambahan blue juice atau diinkubasi pada suhu 65 oC selama 10 menit.
Ligasi. Sebanyak 3 l ddH2O, 3 l (60 ng) fragmen DNA, 1 l (50 ng) vektor pBluescript II KS (+) yang telah dipotong dengan BamH1, dan 2 l bufer ligasi 5X dicampur dalam 0,5 ml tabung mikro lalu dipanaskan pada suhu 45 oC selama 5 menit. Sebanyak 1 l T4 DNA ligase (invitrogen) ditambahkan dan kemudian diinkubasikan pada suhu 16 oC selama 16-24 jam. Pembuatan Bakteri Kompeten. E. coli DH5 dikulturkan dalam 20 ml media LB cair pada suhu
37 oC selama 16-18 jam. Setelah itu sebanyak 0,5 ml biakan
tersebut disubkultur pada 25 ml media LB cair lalu diinkubasi dan diagitasi menggunakan inkubator bergoyang dengan kecepatan 130 rpm pada suhu 37 oC sampai diperoleh kerapatan optik mendekati 0,4 pada panjang gelombang 600nm (kerapatan sel ~108 cfu/ml).
Selanjutnya kultur bakteri diinkubasi di atas es
selama 10 menit dan dipindahkan sebanyak 1500 l kedalam tabung mikro dan disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm pada suhu 4 oC selama 10 menit. Filtrat dibuang dan pelet dikeringkan dengan membalikkan tabung di atas kertas tisu hingga semua media cair keluar. Pelet yang diperoleh diresuspensikan dalam 1 ml 0,1M CaCl2 dingin dan dibiarkan di dalam es selama 10 menit. Setelah itu campuran disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm pada suhu 4 oC selama 10 menit. Filtrat dibuang dan pelet dikeringkan dengan membalikkan tabung di atas kertas tisu hingga semua media cair keluar.
Pelet yang diperoleh kemudian
diresuspensikan dalam 100 l 0,1M CaCl2 dingin dan selanjutnya disimpan di dalam es selama 10 menit
sehingga didapatkan bakteri yang kompeten
(Sambrook dan Russell 2001). Proses Transformasi. kurang dari 10
Sebanyak 10-50 ng plasmid rekombinan (volumenya
l) dicampurkan dengan 100
l bakteri kompeten dan
diinkubasikan dalam es selama 30-60 menit. Selanjutnya terhadap campuran tersebut dilakukan heat shock pada suhu 42 oC selama 90 detik dan kemudian segera diinkubasi ke dalam es selama 1-2 menit. Sebanyak 400 l media LB cair ditambahkan ke dalam bakteri trans-forman lalu diinkubasikan dengan agitasi pada suhu 37 oC selama 45 menit pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 200 rpm untuk memulihkan kondisi sel bakteri.
Seleksi transforman. Untuk menyeleksi keberhasilan proses transformasi ke media agar-agar LB ditambahkan 0,1 M IPTG (0,5 l / ml) dan 2% X-Gal (40 g / ml). Bakteri transforman disebar di atas media agar-agar LB dan diinkubasi selama 16-18 jam pada suhu 37 oC. Kontrol positif dibuat dengan menyebar bakteri transforman pada media agar-agar LB yang diberi suplemen antibiotik ampisilin sedangkan kontrol pertumbuhan bakteri transforman pada media agaragar LB dibuat dengan menyebar bakteri pada media agar-agar LB
tanpa
antibiotik. Seleksi Klon Xilanase Dengan menggunakan tusuk gigi steril seluruh koloni berwarna putih dipindahkan ke media agar-agar LB yang mengandung ampisilin dan X-gal. Untuk mengujikan aktivitas xilanase koloni digoreskan ke atas media agar-agar LB yang mengandung ampisilin dan ditambahkan 0,5% (w/v) xilan birchwood (Sigma Co., USA) lalu diinkubasi selama 18-20 jam pada suhu 37 oC dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 50 oC selama 2 jam. Larutan 1% congo red disebar di atas permukaan media dan dibiarkan selama 15 menit, kemudian ditambahkan larutan 1M NaCl dan dibiarkan selama 15 menit. Klon yang memiliki aktivitas xilanase akan membentuk zona jernih (Teather dan Wood, 1982). Pendeteksian Aktivitas
-Xilosidase.
Aktivitas
-xilosidase diamati melalui
kemampuan klon menghidrolisis senyawa 4-metilumberilferil- -D-xilosida (Sigma). Klon yang ditumbuhkan pada media agar-agar LB yang mengandung ampisilin dan 0,5% xilan birchwood diinkubasi pada suhu 37 oC selama 16-18 jam lalu ditetesi dengan 0,1 mM 4-metilumberilferil- -D-xilosida dalam bufer sitrat-fosfat pH 5 dan diinkubasi pada suhu 50 oC selama 2 jam.
Reaksi
dihentikan dengan penambahan CaCO3 jenuh beberapa tetes. Klon yang positif akan berpendar jika diamati di bawah sinar UV pada 2000).
340 nm (Kaneko et al.
Verifikasi DNA Plasmid Rekombinan Verifikasi DNA plasmid rekombinan yang membawa sisipan gen penyandi xilanase dilakukan dengan memotong plasmid rekombinan menggunakan enzim EcoR1. Sebanyak 15 l ddH2O, 2 l bufer 10X, 2 l plasmid, dan 1 l enzim dicampurkan ke dalam tabung mikro lalu diinkubasi pada suhu 37 oC selama satu malam. Reaksi dihentikan dengan penambahan blue juice atau diinkubasi pada suhu 65 oC selama 10 menit. Ekspresi Gen Penyandi Xilanase di E. coli DH5 Pengujian
ekspresi
gen
penyandi
xilanase
dilakukan
dengan
menumbuhkan klon pada media LB cair yang mengandung xilan birchwood 0,5%, dan diinkubasi selama 16-18 jam di inkubator bergoyang dengan kecepatan 150 rpm pada suhu
37 oC. Biakan disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm
selama 10 menit, filtrat yang diperoleh dipisahkan untuk dilakukan pengujian aktivitas xilanasenya. Sebagai kontrol positif digunakan pengujian aktivitas xilanase dari S. costaricanus 45I-3.
Bakteri ini ditumbuhkan pada media xilan cair dengan
komposisi (%) : 1,0 ekstrak khamir; 10,3 sukrosa; 0,5 xilan birchwood, lalu diinkubasi dengan agitasi ada 120 rpm selama 5 hari.
Setelah itu biakan
disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit, filtrat yang diperoleh dipisahkan untuk dilakukan pengujian aktivitas xilanasenya. Sebagai kontrol negatif digunakan pengujian aktivitas xilanase dari E. coli DH5 . Bakteri ini ditumbuhkan pada media LB cair yang mengandung xilan birchwood 0,5%, dan diinkubasi selama 18-20 jam di inkubator bergoyang dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 37 oC. Biakan disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit, filtrat yang diperoleh dipisahkan untuk dilakukan pengujian aktivitas xilanasenya. Pengujian Aktivitas Xilanase Rekombinan. Blanko : Sebanyak 500 l substrat 0,5% birchwood xilan ditambahkan 500
l 0,02M bufer sitrat fosfat pH 5.
Kemudian larutan ini ditambahkan 1000 l pereaksi DNS lalu dihomogenisasi dan dipanaskan pada suhu 100 oC selama 15 menit dan didinginkan pada suhu ruang.
Kontrol : Sebanyak 500 l substrat 0,5% xilan birchwood ditambahkan 450 l 0,02M bufer sitrat fosfat pH 5 lalu diinkubasi pada suhu 50 oC selama 30 menit. Kemudian larutan ini ditambahkan 1000 l pereaksi DNS dan 50 l ekstrak kasar xilanase dihomogenisasi dan segera dipanaskan pada suhu 100 oC selama 15 menit dan didinginkan pada suhu ruang. Sampel : Sebanyak 500 l substrat 0,5% xilan birchwood ditambahkan 450
l 0,02M bufer sitrat fosfat pH 5.
Kemudian larutan ini ditambahkan 50 l ekstrak kasar xilanase dihomogenisasi lalu diinkubasi pada suhu 50 oC selama 30 menit lalu ditambahkan 1000 pereaksi DNS dan segera dipanaskan pada 100 didinginkan pada suhu ruang.
l
o
C selama 15 menit dan
Pengukuran absorbansi masing-masing larutan
dilakukan pada 540 nm (Miller 1959). Konsentrasi gula pereduksi diperoleh dengan menggunakan kurva standar xilosa pada konsentrasi 0,00-0,35 mg/ml.
Satu unit aktivitas xilanase
didefinisikan sebagai jumlah mol xilosa yang dihasilkan permenit untuk setiap ml enzim pada kondisi optimumnya. Pengujian Aktivitas Spesifik Xilanase Rekombinan. Untuk mengetahui jenis xilanase yang ada dilakukan pengujian aktivitas dengan substrat spesifik menurut metode Saha (2001) menggunakan senyawa turunan p-nitrofenil masing-masing : •
p-nitrofenil- -D-xilanopiranosida untuk -xylosidase
•
p-nitrofenil- -L-arabinofuranosida untuk -L-arabinofuranosidase
•
p-nitrofenil- -D-galaktopiranosida untuk -D-galaktopiranosidase
•
p-nitrofenil- -D-glukoropiranosida untuk -D-glukoropiranosidase
•
p-nitrofenil-asetat untuk asetil xilan esterase
Sebanyak 450 l substrat turunan p-nitrofenil dengan konsentrasi 1 mM dan 400 l 0,02M bufer sitrat fosfat pH 5 diinkubasi bersama 100 l ekstrak kasar xilanase pada suhu 50
o
C selama 30 menit.
Reaksi dihentikan dengan
penambahan 50 l 0,4M Na2CO3. Pengukuran absorbansi dilakukan pada
405
nm. Kadar p-nitrofenol yang terbentuk diperoleh dengan menggunakan kurva standar p-nitrofenol dengan konsentrasi 0,00-0,50mM. Sebanyak 950 l masingmasing konsentrasi p-nitrofenol diinkubasi pada suhu 50 oC selama 30 menit kemudian ditambahkan 50
l 0,4 M Na2CO3.
Aktivitas xilanase diperoleh
dengan menghitung jumlah p-nitrofenol yang terbentuk dengan menggunakan kurva standar yang diperoleh. Satu unit aktivitas enzim xilanase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menyebabkan perubahan 1 mol berbagai substrat turunan p-nitrofenil menjadi p-nitrofenol permenit pada keadaan optimumnya.
HASIL DAN PEMBAHASAN Isolat S. costaricanus 45I-3 adalah isolat Streptomyces sp. 45I-3 yang telah digunakan pada penelitian sebelumnya. Hasil identifikasi dengan menggunakan amplifikasi gen 16S-rRNA menunjukkan isolat tersebut memiliki homologi sebesar 99,9% dengan S. costaricanus (tidak dipublikasikan). Secara rutin isolat diremajakan pada media xilan yang memiliki dua sumber karbon yaitu sukrosa dan xilan. Pertumbuhan isolat S. costaricanus 45I-3 pada media tersebut akan tampak jelas pada hari ketiga dengan terlihatnya spora berwarna putih keabuabuan (Gambar 5) dan menimbulkan bau khas tanah yang disebabkan adanya senyawa yang disebut geosmin (Paul dan Clark 1996).
Gambar 5 Hasil goresan S. costaricanus 45I-3 pada media xilan Isolasi DNA Genom S. costaricanus 45I-3 Isolasi DNA genom dari S. costaricanus 45I-3 menggunakan metode yang diterapkan oleh Tripathi dan Rawal (1998) dengan modifikasi yaitu menarik DNA pelet yang diperoleh menggunakan pipet kemudian dikeringkan untuk selanjutnya dilarutkan menggunakan ddH2O. Untuk mendapatkan DNA dengan kuantitas yang baik disarankan bakteri ditumbuhkan pada media YEME.
Tetapi
pertumbuhan pada media tersebut menghasilkan pelet sedangkan pertumbuhan pada media YM menghasilkan bentuk terlarut. Perbandingan pertumbuhan isolat S. costaricanus 45I-3 pada kedua media dapat dilihat pada Gambar 6.
a
b
Gambar 6 Perbedaan bentuk pertumbuhan isolat S. costaricanus 45I-3 pada media YM dan YEME. a : bentuk terlarut pada media YM, b : bentuk pelet pada media YEME Perbedaan bentuk pertumbuhan isolat pada kedua media tersebut akan mempengaruhi hasil ekstraksi DNA genom.
Dalam bentuk terlarut sel lebih
mudah dilisis sehingga meningkatkan jumlah DNA yang terekstraksi (Tripathi dan Rawal 1998). Hal ini dapat terbukti karena secara kuantitas DNA yang diperoleh lebih banyak pada media YM dibandingkan dengan media YEME (Tabel 3 dan Gambar 7). Bufer STE sebagai pencuci pada metode isolasi dapat menghilangkan sisa media dan ekstrak selular yang dikeluarkan sel pada permukaan sel, sehingga meningkatkan kemurnian DNA yang diperoleh. CTAB, larutan NaCl dengan konsentrasi diatas 0,4 M, serta fenol dan kloroform sangat efektif untuk menghilangkan komponen polisakarida dan protein (Tripathi dan Rawal 1998). Tingkat kemurnian DNA yang diisolasi dapat dilihat dari perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm (λ260: λ280). DNA dikatakan murni jika perbandingan serapan pada panjang gelombang tersebut berada pada kisaran 1,8-2,0 (Ausubel et al. 1992).
Kontaminasi RNA dan fenol akan
menurunkan nilai serapan pada panjang gelombang 260 nm sedangkan kontaminasi protein akan menaikkan serapan pada panjang gelombang 280 nm (Saunders 1999). Tabel 3 dan Gambar 7 menunjukkan perbandingan hasil isolasi DNA genom dari S. costaricanus 45I-3 yang ditumbuhkan pada media yang berbeda dengan metode isolasi DNA menggunakan CTAB. Dari gambar tersebut terlihat integritas ulangan 3 dari pertumbuhan di media YM sangat baik karena tidak terlihat pita smear yang mengindikasikan banyaknya patahan DNA seperti yang tampak pada ulangan lainnya. Karena kualitas dan kuantitas yang baik maka untuk selanjutnya ulangan 3 ini digunakan untuk keperluan kloning. Tabel 3 Pengukuran konsentrasi dan rasio 260 : 280 DNA hasil isolasi.
No
Media tumbuh Streptomyces
Absorbansi λ=260 nm
Absorbansi λ=280 nm
Ratio 260 : 280
Konsentrasi (ng/ l)
1
YM
0,301
0,195
1,5
3.005,0
2
YM
0,436
0,256
1,7
2.180,0
3
YM
0,945
0,552
1,7
4.724,0*)
4
YM
0,493
0,317
1,5
2.466,0 12.375,0
Jumlah Total DNA 1
YEME
0,133
0,083
1,61
666,5
2
YEME
0,452
0,229
1,97
2.261,8
3
YEME
0,123
0,064
1,92
614,3
4
YEME
0,134
0,072
1,87
668,1
5
YEME
0,298
0,154
1,94
1.489,6
6
YEME
0,323
0,162
1,99
1.615,1
7
YEME
0,097
0,061
1,58
484,2
8
YEME
0,333
0,168
1,98
1.662,8
9
YEME
0,181
0,099
1,83
907,3 10.369,7
Jumlah Total DNA Catatan : konsentrasi DNA setelah dikalikan faktor pengenceran 100x *) digunakan untuk isolasi fragmen DNA genom pada kloning
a
M 1
2
3
4
b
1
2
3 4 5
6
7
8
9
Gambar 7 Hasil elektroforesis DNA S. costaricanus 45I-3 yang diisolasi mengguna-kan metode CTAB. a. Hasil isolasi dari media YM (M : standard 100 ng/ l, 1-4 : DNA hasil isolasi ulangan 1-4 seperti penomoran di Tabel 3). b. Hasil isolasi dari media YEME (1-9 : DNA hasil isolasi ulangan 1-9 seperti penomoran di Tabel 3).
Isolasi pBluescript II KS (+) dari E. coli Plasmid Bluescript II KS (+) dari sel E. coli diisolasi menggunakan metode alkalin lisis.
Untuk mengetahui plasmid yang diisolasi merupakan
pBluescript II KS (+) dilakukan pemotongan menggunakan enzim BamH1. Dari hasil elektroforesis tampak satu pita yang ukurannya sesuai dengan ukuran pBluescript II KS (+) yaitu sekitar 3.0 kb (Gambar 8). Sebelum dilinierisasi bentuk plasmid dapat berupa supercoiled atau covalently closed circular sehingga jika dijalankan pada elektroforesis letaknya berada dibawah ukuran yang sebenarnya karena lebih cepat bermigrasi (Snyder dan Champness 2003). M 1 2
3 kb 1 2 3
Gambar 8
Hasil elektroforesis pBluescript II KS(+) yang diisolasi dengan metode alkalin lisis. M. 1 kb DNA ladder, 1. pBluescript II KS(+) utuh, 2. pBluescript II KS(+)-BamH1.
Pembuatan Pustaka Genom Gen xilanase yang berasal dari beberapa mikroba merupakan kelompok gen yang berukuran besar. Tsujibo et al. (1997) melakukan kloning xilanase dari S. thermoviolaceus OPC-520 dan mempelajari struktur sisipan DNA dengan panjang 3,3 kb pada pXY95 yang dikonstruksi dari pUC19 dan membawa gen yang menyandi-kan xilanase (stxI dan stxII) dan asetil xilan esterase (stxIII). Pada penelitian
selanjutnya
ditemukan
gen
stxIV
yang
menyandikan
-L-
arabinofuranosidase yang ditranskripsikan secara terpisah dan letaknya 1,47 kb di atas stxI (Tsujibo et al. 2002). Kulkarni et al. (1999) menyatakan gen penyandi xilosidase dan endoxilanase dari
B. stearothermophilus 21 berukuran 4,2 kb.
Karena besarnya ukuran gen yang menyandikan enzim xilanolitik tersebut, dan untuk mendapatkan struktur gen secara lengkap yang dapat diekspresikan maka dalam penelitian ini dilakukan kloning shotgun.
DNA genom dari S.
costaricanus 45I-3 dipotong secara parsial menggunakan enzim Sau3A1 kemudian diligasikan pada vektor pBluescript II KS (+) yang telah dilinierkan dengan enzim BamH1 dan ditransformasikan pada E. coli DH5 sebagai inang. Enzim Sau3A1 mengenali sekuen 4 pasang basa 5’- GATC-3’. Ukuran DNA genom pada kisaran 4-10 kb diperoleh dari digesti DNA genom menggunakan enzim Sau3A1 dengan konsentrasi 0,2 U/ l selama 5 menit pada suhu 37 oC. Penggunaan konsentrasi yang lebih tinggi atau waktu inkubasi yang lebih dari 5 menit lebih banyak menghasilkan potongan DNA berukuran di bawah 3 kb. Pemotongan DNA genom menghasilkan ujung 5’ yang kohesif (5’ over hangs) yang siap diligasikan dengan ujung 3’ kohesif dari vektor. Untuk menyiapkan DNA berukuran 4-10 kb, dipotong pada ukuran tersebut (Gambar 9a).
DNA pada gel agarosa
Pemotongan dilakukan dengan
bantuan penanda 1 kb DNA ladder. DNA pada gel yang telah dipotong diisolasi kembali dengan menggunakan glass bead.
Prinsip teknik isolasi ini adalah
mengikatkan molekul DNA yang bermuatan negatif dengan komplek silika yang bermuatan positif secara ionik dan kemudian DNA dilarutkan dengan air bidestilata pada suhu 55-60 oC. Dengan menggunakan metode ini didapatkan recovery perolehan DNA sebesar
79,62% (Gambar 9b) dengan konsentrasi
412,89 ng/ l dari konsentrasi DNA genom awal 518,59 ng/ l. Kemurnian DNA yang diperoleh juga cukup tinggi karena rasio 260 : 280 sebesar 1,98.
a
M
1
2
M
10 kb 4 kb 3 kb
b
M 1
10 kb 4 kb
Gambar 9 Isolasi DNA insert 4-10 kb dari DNA genom S. costaricanus 45I-3. a. M: 1 kb DNA ladder, 1 dan 2 : Hasil pemotongan parsial DNA genom dengan Sau3A1. b. M : 1 kb DNA ladder, 1 : DNA genom hasil isolasi dari potongan gel agarose dengan menggunakan glass bead. Untuk mengkonstruksi plasmid yang membawa gen yang menyandikan enzim xilanolitik digunakan pBluescript II KS(+) yang telah dipotong dengan enzim restriksi BamH1. Enzim ini mengenali sekuen 6 pasang basa 5’-G ATCC3’ sehingga pemotongannya menghasilkan ujung 3’ yang kohesif (3’ over hangs) yang siap diligasikan dengan ujung 5’ DNA yang akan disisipkan.
Dengan
demikian situs restriksi BamH1 pada daerah MCS akan hilang karena sekuen 5’GATCC-3’ tidak dihasilkan kembali setelah ligasi. Karena hasil pemotongan pBluescript II KS(+) dan DNA genom S. costari-canus 45I-3 merupakan ujung kohesif, maka dengan penyimpanan pada suhu 4 oC akan memungkinkan terjadinya ligasi antar molekul sendiri (self ligation). Untuk mengatasi hal tersebut larutan DNA dipanaskan pada suhu 45 oC selama 5 menit sebelum larutan DNA ditambahkan enzim ligase (George 2001).
Ligasi dilakukan menggunakan enzim T4 DNA ligase dengan konsentrasi 3 U/ l pada suhu 16 oC. Perbandingan volume vektor dan sisipan DNA adalah 3 : 1, dimana DNA sisipan yang digunakan sebanyak 437,04 ng (volume 3
l)
sedangkan DNA vektor yang digunakan sebanyak 58,27 ng (volume 1 l). Untuk menjamin keberhasilan ligasi reaksi dibiarkan selama 1 malam. Plasmid yang telah dikonstruksi ditransformasikan kedalam sel E. coli DH5 kompeten dengan melakukan heat shock pada suhu 42 oC. Membran E. coli DH5 yang permeabilitasnya dikondisikan dengan konsentrasi Ca2+ (dari CaCl2) akan membuka dan plasmid yang telah dikonstruksi diharapkan dapat masuk ke dalam sel (Snyder dan Champness 2003). Seleksi Klon Rekombinan Seleksi
transforman
dilakukan
pada
media
agar-agar
LB
yang
mengandung ampisilin 150 g/ml dan X-gal 40 g/ml. Dengan adanya antibiotik ampisilin sel yang tidak mengandung plasmid yang ditransformasikan tidak akan tumbuh karena tidak memiliki gen penyandi resistensi terhadap ampisilin. Sel yang mengandung plasmid yang membawa sisipan DNA akan berwarna putih pada media karena gen lacZ pada plasmid tidak dapat mengekspresikan protein subunit
dari -galaktosidase.
Sedangkan sel yang
mengandung plasmid yang tidak membawa sisipan DNA akan berwarna biru. Hal ini disebabkan oleh ekspresi gen lacZ yang dibawa oleh plasmid menghasilkan protein subunit dengan subunit
dari -galaktosidase Subunit
yang dihasilkan akan bergabung
dari sel inang sehingga menjadi bentuk aktif dari protein -
galaktosidase yang akan menguraikan X-gal menjadi komponennya yaitu 5bromo-4-kloro-3-indolil dan D-galaktosa.
Penumpukan senyawa 5-bromo-4-
kloro-3-indolil yang tidak larut ini akan menghasilkan warna biru pada media (Sambrook dan Russell 2001). Hasil pertumbuhan bakteri yang ditransformasikan pada media LB yang ditambahkan ampisilin dan X-gal dapat dilihat pada Gambar 10.
Gambar 10 Seleksi transforman pada media LA yang disuplementasi dengan ampisilin dan X-gal. Dari sekitar 12000 koloni putih yang didapatkan, satu koloni (klon 11) yang mampu menghasilkan enzim xilanase.
Hal ini ditunjukkan dengan
terbentuknya zona bening di sekitar koloni yang menandakan koloni transforman mampu menguraikan substrat xilan birchwood yang ditambahkan (Gambar 11). Koloni akan terlihat jelas jika pada media diwarnai dengan 2% congo red selama 15 menit kemudian dicuci dengan 1M NaCl. Zat warna congo red akan terikat dengan ikatan glikosidik pada xilan menghasilkan warna merah sehingga jika ikatan glikosidik ini diuraikan congo red tidak dapat terikat sehingga warna media tetap bening (Teather dan Wood 1982).
a
b
Klon 11
DH5α
Klon 11
DH5α
Gambar 11 Koloni yang menghasilkan zona bening pada media LB yang mengandung ampisilin, X-gal dan xilan birchwood setelah inkubasi 37 oC selama 16-18 jam diikuti dengan inkubsi 50 oC selama 2 jam. Gambar a : sebelum media diwarnai dengan congo red dan gambar b : setelah media diwarnai dengan congo red.
Plasmid yang dibawa oleh klon 11 yang memiliki aktivitas xilanase untuk selanjutnya dinamakan pHS11. Verifikasi plasmid rekombinan pHS11 dilakukan menggunakan enzim restriksi EcoR1. Hasil digesti menunjukkan ada dua pita pada gel hasil elektroforesis masing-masing berukuran 3 kb dan 6 kb (Gambar 12). Pita berukuran 6 kb ini merupakan DNA sisipan, sedangkan pita berukuran 3 kb merupakan vektor pBluescript II KS(+). M
1
2
6.0 kb
DNA sisipan
3.0 kb
Vektor pBluescript II KS (+)
Gambar 12 Hasil elektroforesis plasmid rekombinan (pHS11). M : 1 kb DNA ladder, 1 : pHS11 utuh, 2 : pHS11- EcoR1. Pendeteksian Aktivitas -Xilosidase Hasil positif untuk pengujian aktivitas -xilosidase dapat diketahui dengan melihat adanya koloni berpendar di atas UV-transiluminator. Hal ini disebabkan oleh adanya penumpukan 4-metilumberil-feron hasil penguraian substrat 4metilumberil-feril- -D-xilosida (4-MUF-Xyl) oleh enzim -xilosidase (Kaneko et al. 2000). Dari pengujian dengan menggunakan substrat tersebut diketahui bahwa klon 11 memiliki aktivitas
-xilosidase (Gambar 13).
Aktivitas enzim
-
xilosidase pada substrat xilan akan melepaskan xilosa sebagai produk akhir dari rantai polimer D-xilosida yang lebih pendek hasil penguraian enzim endo- xilanase (Kulkarni et al. 1999 ; Subramaniyan dan Prema 2002).
Gambar 13
Perpendaran klon 11 di bawah UV-transiluminator karena adanya senyawa 4-metilumberilferon dari aktivitas -xilosidase menguraikan substrat 4-MUF-Xyl.
Ekspresi Gen Penyandi Xilanase di E. coli DH5 Ekspresi gen penyandi xilanase pada kon 11 yang membawa sisipan gen xilanase dilakukan dalam dua tahap. Tahap pertama dilihat kemampuan klon mengekspresikan enzim xilanase menggunakan substrat xilan birchwood (Miller 1959), dan tahap kedua melihat jenis enzim xilanolitik yang diekspresikan dengan menggunakan substrat spesifik turunan senyawa nitrofenol (Saha 2001). Untuk membandingkan aktivitas enzim yang dihasilkan digunakan enzim yang berasal dari S. costaricanus 45I-3 (ekstrak kasar) sebagai kontrol positif dan yang berasal dari E. coli DH5 sebagai kontrol negatif. Pelepasan gula pereduksi akibat aktivitas xilanase dapat diukur menggunakan metode DNS.
Klon 11 mampu menghasilkan enzim xilanase
ekstraselular yang dilepaskan ke media tumbuhnya dengan aktivitas sebesar 0,532 unit/ml. Jika dibandingkan dengan aktivitas xilanase S. costaricanus 45I-3 (1,947 unit/ml), aktivitas spesifik klon 11 lebih rendah. menjelaskan bahwa penurunan aktivitas xilanase
Kulkarni et al. (1999)
yang diekspresikan E. coli
rekombinan merupakan hal umum yang dijumpai dalam setiap penelitian. Adanya modifikasi post-translasi pada E. coli seperti glikosilasi dan adanya akumulasi xilanase rekombinan intraselular merupakan hal yang dapat menjelaskan fenomena ini. Ghangas et al. (1989) juga memperoleh hasil yang sama dimana aktivitas xilanase yang dihasilkan oleh klon E. coli HB101 lebih rendah jika dibandingkan dengan isolat asalnya (Thermo-monospora fusca) dan klon S. lividans. Hasil pengujian aktivitas xilanase disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4 Hasil pengujian aktivitas dan kadar protein xilanase ekstrak kasar Isolat
Aktivitas (Unit/ml)
Kadar Protein (mg/ml)
S. costaricanus 45I-3
1,947
0,161
Klon 11
0,532
0,083
E. coli DH5
0,000
0,024
Pengujian aktivitas xilanase terhadap substrat spesifik turunan senyawa nitrofenol
menunjukkan xilanase pada S. costaricanus 45I-3 dan klon 11
memiliki aktivitas
-xilosidase, arabinofuranosidase dan asetil xilan esterase.
Aktivitas -xilosidase dan asetil xilan esterase klon 11 memiliki kedekatan nilai jika dibandingkan dengan S. costaricanus 45I-3 (Tabel 5), tetapi untuk aktivitas arabinofuranosidase aktivitas klon 11 jauh lebih rendah. Dari beberapa penelitian sebelumnya dikatakan enzim xilanase yang berasal dari Trichoderma reesei (Clark et al. 1996) merupakan enzim bifungsional yang dapat memiliki aktivitas xilanase dan arabinofuranosidase. Li et al. (2000) melaporkan enzim -xilosidase dari Tricoderma koningii mampu menghidrolisis substrat p-nitrofenil- -Larabinofuranosida (pNP-A). Shallom et al. (2002) mengatakan enzim arabinofuranosidase dari Geobacillus stearothermophillus T-6 mampu menghidrolisis substrat p-nitrofenil- -xilanopiranosida (pNP-X). Kemampuan kedua enzim ini dalam menghidrolisis substrat baik pNP-X maupun pNP-A disebabkan oleh kemampuan kedua substrat untuk menempati ruang yang sama pada daerah katalitik enzim dengan cara berikatan dengan residu triptopan298 (Hovel et al. 2003).
Tabel 5 Hasil pengujian aktivitas substrat spesifik xilanase ekstrak kasar Substrat spesifik
Aktivitas (Unit/ml) S. costaricanus 45I-3
Klon 11
E. coli DH5
pNP- -D-xilanopiranosida
0,340
0,208
0,000
pNP- -L-arabinofuranosida
0,202
0,079
0,000
pNP- -D-glukoropiranosida
0,000
0,000
0,000
pNP- -D-galaktopiranosida
0,000
0,000
0,000
pNP- asetat
0,093
0,063
0,000
Analisa HPLC (High Performance Liquid Chromatography) menunjukkan xilanase yang berasal dari Streptomyces sp. 45I-3 (S. costaricanus 45I-3) mampu menghasilkan xilosa dan arabinosa masing-masing dengan konsentrasi 280,22 ppm dan 106,13 ppm (Meryandini et al. 2007). Hasil ini mengindikasikan bahwa pada
S. costaricanus 45I-3 terdapat gen penyandi
-xilosidase dan
arabinofuranosidase, tetapi belum menjelaskan adanya aktivitas asetil xilan esterase. Tsujibo et al. (1996 dan 2001) mengatakan ORF gen penyandi xilanase dari
S. thermoviolaceus OPC-520 saling berlapis dan berdampingan dan
diekspresikan secara terpisah. Gen stxI dan stxII yang menyandikan xilanase hanya dipisahkan oleh 37 nukleotida dengan gen stxIII yang menyandikan asetil xilan esterase, sedangkan gen stxIV yang menyandikan arabinofuranosidase terpisah sejauh 663 nukleotida dari stxI. Vincent et al. (1997) telah berhasil mengidentifikasi gen abfB yang menyandi-kan arabinofuranosidase dari sisipan DNA S. lividans sepanjang 7 kb yang dibawa oleh pIAF31.
Letak gen ini
dipisahkan oleh 391 nukleotida pada daerah intersistronik dari gen xlnA yang menyandikan xilanase A. Dupont et al. (1996) menyatakan analisis dari 5,5 kb sisipan DNA S. lividans pada pIAF42 menunjukkan bahwa sekuen katalitik dari gen axeA yang menyandikan asetil xilan esterase terletak dibawah gen xlnB yang menyandikan xilanase B.
Domain pengikatan substrat pada axeA dan xlnB
memiliki tingkat kesamaan yang tinggi dan terletak pada bagian C-terminal dari kedua gen tersebut.
Perbedaan
aktivitas arabinofuranosidase antara klon 11 dan S.
costaricanus 45I-3 yang sangat jauh dapat disebabkan oleh letak gen yang menyandikan arabinofuranosidase dan -xilosidase pada genom S. costaricanus 45I-3 berjauhan.
Hal ini dapat menyebabkan gen yang dikloningkan hanya
membawa sebagian gen penyandi arabinofuranosidase. Oleh karena itu, sekuensing dan analisis terhadap DNA sisipan yang terbawa pada klon 11 sangat diperlukan untuk mengetahui letak gen-gen yang menyandikan enzim-enzim xilanolitik yang dihasilkan oleh klon 11 sehingga lebih dapat menjelaskan tingkat aktivitas xilanase yang dihasilkan terhadap substrat spesifik yang diujikan.
SIMPULAN Kloning gen xilanase termozim dari S. costaricanus 45I-3 secara shotgun mendapatkan satu klon positif yang membawa DNA sisipan sepanjang 6 kb. Klon dapat mensekresikan enzim xilanase dengan aktivitas sebesar 0,532 U/ml dan aktivitas spesifik sebesar 6,393 U/mg. Xilanase yang dihasilkan memiliki aktivitas -xilosidase sebesar 0,208 U/ml, arabinofuranosidase sebesar 0,079 U/ml dan asetil xilan esterase sebesar 0,063 U/ml.
SARAN Untuk penelitian selanjutnya disarankan melakukan sekuensing terhadap DNA sisipan yang dibawa oleh pHS11 agar panjang dan posisi gen pada DNA sisipan dapat diketahui. Juga perlu dilakukan upaya untuk meningkatkan aktivitas enzim xilanase yang dihasilkan dengan over produksi menggunakan vektor ekspresi.
DAFTAR PUSTAKA Anonim. 2003. pBluescript® II Phagemid Vectors: Instruction http://www.stratagene.com/.../[bluescript.pdf] [12 Juli 2007]
Manual.
Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. 2002. Molecular Biology of Cell. 4th ed. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.../www.garlandscience.com [10 Mei 2007] Alexander M. 1977. Introduction to Soil Microbiology. 2nd ed. New York: J Wiley. Baraznenok VA, Becker EG, Ankudinova NV, Okunev NN. 1999. Characterization of neutral xylanase from Chaetomium cellulolyticum and their biobleaching effect on eucalyptus pulp. Enzyme Microb Technol 25:651-659 Beg QK, Bhushan B, Kapoor M, Hoondal GS. 2000. Production and characterization of thermostable xylanase and pectinase from a Streptomyces sp. QG-11-33. J Ind Microbiol Biotechnol 24:396-402 Beg QK, Kapoor M, Mahajan L, Hoondal GS. 2001. Microbial xylanases and their industrial applications : a review. Appl Microbiol Biotechnol 56:326-338 Bentley SD, Chater KF, Cerdeno-Tarraga AM, Challis GL, James KD, Harris DE, Quail MA, Kieser H, Harper D, Baterman A, Brown S, Chandra G, Collins M, Cronin A, Fraser A, Goble A, Hidalgo J, Hornsby T, Howarth S, Huang CH, Kieser T, Larke L, Murphy L, Oliver K, O’Neil S, Rabbinowitsch E, Rajandream RA, Rutherford K, Rutter S, Seeger K, Saunders D, Sharp S, Squares S, Taylor K, Warren T, Wietzorrek A, Woodward J, Barrell BG, Parkhill J, Hapwood DA. 2002. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature 417:141-147 Berens S, Kaspari H, Klemme JH. 1996. Purification and characterization of two different xylanases from thermophilic actinomycetes Microtetraspora flexuosa S11X. Antonie Van Leeuwenhoek 69:235-241 Biely P, 1985. Microbial xylanolytic systems. Trends in Biotechnol 3:286 Cannio R, Prizito ND, Rossi M, Morana A. 2004. A xylan-degrading strain of Sulfolobus solfataricus : isolation and characterization of the xylanase activity. Extremophiles 8:117-124 Clark EM, Tenkanen M, Nakni-Sentana T, Pentika M. 1996. Cloning of gene encoding -L-arabinofuranosidase and -xilosidase from Trichoderma reesei by expression in Saccharomyces cereviceae. Appl Environ Microbiol 62:3840-3846 Collins T, Gerday C, Feller G. 2005. Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases. FEMS Microbiol Rev 29:3-23.
Debeche T, Bliard C, Debire P, O’Donohue MJ. 2002. Probing the catalytically essential residues of the -L-arabinofuranosidase from Thermobacillus xylanolyticus. Protein Engineering 15:21-28 Dupont C, Daigneault N, Shareck F, Morosoli R, Kluepfel D. 1996. Purification and characterization of an acetyl xylan esterase produced by Streptomyces lividans. J Biochem 319:881-886 Esnard J, Potter TL, Zuckerman BM. 1995. Streptomyces costaricanus sp. nov. isolated from nematode-suppressive soil. Int J Sys Bacteriol 45:775-779 George SP. 2001. Molecular and Biochemical Aspects of Extremophilic Actinomycete [Thesis]. India: Division of Biochemical Sciences National Chemical Laboratory Pune. Glick BR, Pasternak JJ. 1989. Molecular Biotechnology Principles and Application of Recombinant DNA. Washington: ASM Press. Ghangas GS, Hu YJ, Wilson DB. 1989. Cloning of a Thermomonospora fusca xylanase gene and its expression in Escherichia coli and Streptomyces lividans. J Bacteriol 171:2963-2969 Hanahan D, Jessee J, Bloom FR. 1991. Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria. Method Enzymol 204:63-113 Hayawaka M. 2003. Selective Isolation of Rare Actinomycete Genera Using Pretreatment Techniques. Ipek Kurtboke (Editor). Queensland:University of The Sunshine Coast, Faculty of Science Hovel K, Shallom D, Niefind K, Belakhov V, Shoham G, Baasov T, Shoham Y , Schombung D. 2003. Crystal structure and snapshots along the reaction pathway of family 51 -L-arabinofuranosidase. EMBO J 22:4922-4932 Howard RL, Abotsi E, Jansen van Rensburg EL, Howard S. 2003. Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. Afr J Biotechnol 2:602-619 Ikeda H, Ishikawa J, Hanamoto A, Shinose M, Kikuchi H, Shiba T, Sakaki Y, Hattori M, Omura S. 2003. Complete genome sequence and comparative analysis of the industrial microorganism Streptomyces avermitilis. Nat Biotechnol 21: 526–531 Kaneko S, Kitaoka M, Kuno A, Hayashi K. 2000 Syntheses of 4-methylumbelliferyl- D-xylobioside and 5-bromo-3-indolyl- -D-xilobioside for sensitive detection of xylanase activity on agar plate. Biosci Biotechnol Biochem 64:741-745 Kluefpel D, Daignealut N, Morosoli R, Shareck F. 1992. Purification and characterization of a new xylanase (xylanase C) produced by Streptomyces lividans 66. Appl Microbiol Biotechnol 36:626-631
Kulkarni NA, Shendye, Rao M. 1999. Molecular and biotechnological aspects of xylanases. FEMS Microbiol Rev 23: 411-456. Levin L, Forschiassin F. 1988. Influence of growth conditions on the production of xylanolytic enzymes by Trametes trogii.World J Microbiol Biotechnol 14:443-446 Li YK, You HJ, Pan H. 2000. Mechanistic study of -xylosidase from Trichoderma koningii G-39. J Biochem 127:315-320 Liu W, Zhu W, Lu Y, Kong Y, Ma G. 1998. Production, partial purification and characterization of xylanase from Trichosporon cutaneum SL409. Process Biochem 33:326-331 Lopez C, Blanco A, Pastor FIJ. 1998. Xylanase production by new alkali-tolerant isolate of Bacillus. Biotechnol Lett 20:243-246 Meryandini A, Lestari Y, Sunarti TC. 2006. Karakterisasi Xilanase Aktinomiset Asal Indonesia dalam Upaya Menggali Mikrob Penghasil Enzim Komersial. Laporan Hibah Bersaing Institut Pertanian Bogor. IPB Meryandini A, Hendarwin T, Prihandono PA, Akhdiya A. 2007. Streptomyces spp. 45I-3 xylanase. BIOTROPIA 14:32-42
Characterization
of
Miller GI. 1959. Dinitrosalisilic assay. Anal Chem 31:426-428 Mondou F, Shareck F, Morosoli R, Kluepfel D. 1986. Cloning of the xylanase gene of Streptomyces lividans. Gene 49:323-329 Nelson DL, Cox MM. 2005. Lehninger Principles of Biochemistry. 4th ed. New York: Worth; 37:306-343 Paul EA, Clark FE. 1996. Soil Microbiology and Biochemistry. 2nd ed. California: Academic Press; 30: 69-99 Primose SB, 1991. Molecular Biotechnology. London: Blackwell Scientific. Puls J, Schuseil J. 1993 Chemistry of Hemicelluloses: Relationship between Hemicellulose Structure and Enzyme Required for Hydrolysis. Coughlan MP, Hazlewood GP (editor) Hemicellulose and Hemicellulases. London: Portland Press ; 28: 1-28 Ruiz-Arribas A, Fernandez-Abalos JM, Sanchez P, Garda AL, Santamaria RI. 1995. Overproduction, purification, and biochemical characterization of a xylanase (Xys1) from Streptomyces halstedii JM8. Appl Environ Microbiol 61:2414-2419 Saha BC. 2000. -L-arabinofuranosidases: biochemistry, molecular biology and application in biotechnology. Rev Biotech Adv 18:403-423
Saha BC. 2001. Purification and characterization of an extracellular -xylosidase from a newly isolated Fusarium verticillioides. J Indust Microbiol Biotechnol 27:241-245 Saha BC. 2003. Hemicellulose bioconversion. J Ind Microbiol Biotechnol 30:279-291 Sachslehner A, Nidetzky B, Kulbe KD, Haltrich D. 1998. Induction in mannanase, xylanase and endoglucanase activities in Sclerotium rolfsii. Appl Environ Microbiol 64:594-600 Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular Cloning a Laboratory Manual. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Schoenfeld T, Mendez J, Storts D.R. 1995. Effect of bacterial strains carrying endA1 genotype on DNA quality isolated with wizard ™ plasmid purification system. Promega Notes Magazine 53:12-15 Shallom D, Belakhov V, Solomon D, Shoham G, Baasov T, Shoham Y. 2002. Detailed kinetic analysis and identification of the nucleophile in -L-arabinofuranosidase from Geobacillus stearothermophilus T6, a family 51 glycoside hydrolase. J Biol Chem 277:43667-43673 Siedenberg D, Gerlach SR, Schugerl K, Giuseppin MLF, Hunik J. 1998. Production of xylanase by Aspergillus awamori on synthetic medium in shake flask culture. Process Biochem. 33: 429-433 Snyder L, Champness W. 2003. Molecular Genetics of Bacteria. 2nd ed. Washington: ASM Press. Subramaniyan S, Prema P. 2002. Biotechnology of microbial xylanases : enzymology, molecular biology, and application. Critical Rev Biotechnol 22: 33-64. Sykes G, Skinner FA. 1973. Actimomycetales: Characteristics and Practical Importance. London: Academic Press. Teather R, Wood PJ, 1982. Use of congo red-polysaccharide interaction in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovin rumen. Appl Environ Microbiol 43:777-780. Tripathi, G., S.K. Rawal. 1998. Simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from Streptomyces aureofaciens. Biotechnol Techniques 3:629-631 Tsujibo H, Ohtsuki T, Iio T, Yamazaki I, Miyamoto K, Sugiyama M, Inamori Y. 1997. Cloning and sequence analysis of gene encoding xylanases and acetyl xylan esterases from Streptomyces thermoviolaceus OPC-520. Appl Environ Microbiol 63:661
Tsujibo H, Takada C, Tsuji A, Kosaka M, Miyamoto K, Inamori Y. 2001. Cloning, sequencing, expression of gene encoding an intracellular -D-xilosidase from Streptomyces thermoviolaceus OPC-520. Biosci Biotechnol Biochem 65:18241831 Tsujibo H, Takada C, Wakamatsu Y, Kosaka M, Tsuji A, Miyamoto K, Inamori Y. 2002. Cloning and expression of an -L-arabinofuranosidase gene (stxIV) from Streptomyces thermoviolaceus OPC-520. Biosci Biotechnol Biochem 66:434-438 Vincent P, Shareck F, Dupont C, Morosoli R, Kluepfel D. 1997. New -Larabinofuranosidase produced by Streptomyces lividans : cloning and DNA sequence of the abfB gene and characterization of the enzyme. J Biochem 322:845-852 Waksman SA, Henrici AT. 1943. The nomenclature and classification of the actinomycetes. J Bacteriol 46: 337 Wong KKY, Tan LUL, Saddler JN. 1998. Multiplicity of -1,4-xylanase in microorganisms: function and application. Microbiol Rev 52:305 Woodcock DM, Crowther PJ, Doherty J, Jefferson S, DeCruz E, Noyer-Weidner M, Smith SS, Michael MZ, Graham MW. 1989. Quantitative evaluation of Escherichia coli host strains for tolerance to cytosine methylation in plasmid and phage recombinants. Nucleid Acid Research 17:3469-3478 Xu J, Nogawa M, Morikagawa Y. 1998. Xylanase induction by L-sorbose in a fungus Trichoderma reesei PC-3-7. Biosci Biotechnol Biochem 62: 1555-15559 Xue Y, Shao W. 2004. Expression and characterization of a thermostabile -xylosidase from hyperthermophile Termotoga maritima. Biotechnol Lett 26:1511-1515 Yanisch-Perron C, Vieira J, Messing J. 1985. Improved M13 phage cloning vector and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33:13-19 Yaw-Kuen Li, Hsin-Jan Yao, I-Hong Pan. 2000. Mechanistic study of Trichoderma koningii G-39. J Biochem 127: 315-320
-xylosidase from
LAMPIRAN
Lampiran 1 Komposisi media dan cara pembuatan reagen. Media YM. Ekstrak khamir 0,4%, ekstrak malt 1 %, glukosa 1,5% dalam air destilata. Untuk media YM padat ditambahkan 1,5% agar-agar. Media YEME. Ekstrak khamir 3 gram/l, ekstrak malt 3 gram/l, peptone 3 gram/l, glukosa 10 gram/l, sukrosa 340 gram/l, MgCl2 5 mM, glisin 0,5% dalam air destilata. Media Xilan. Ekstrak khamir 1%, sukrosa 10,3%, xilan birchwood 0,5%, dalam air destilata. Untuk media xilan padat ditambahkan 1,5% agar-agar. Media Luria Betani (LB). NaCl 0,5%, ekstrak khamir 0,5%, tripton 1%, dalam air destilata. Untuk media LB padat ditambahkan 1,5% agar-agar. Jika diperlukan ditambahkan ampisilin 150 g/ml, 0,1M IPTG 0,5 l/ml, X-gal 40 g/ml. Media LB Xilan.
Komposisi sama dengan media LB ditambahkan xilan
birchwood 0,5%. Jika diperlukan ditambahkan ampisilin 150 g/ml, 0,1M IPTG 0,5 l/ml, X-gal 40 g/ml. STE Bufer. 10mM TrisHCl (pH 8), 0,1M NaCl, 1mM EDTA (pH 8). Disterilisasi dengan autoklaf, simpan pada suhu 4 oC. 0,5M EDTA pH 8. 186,1 gram EDTA.2Na dalam 800 ml air destilata. pH larutan diatur dengan meneteskan 1M NaOH hingga pH mencapai 8. 1M TrisHCl pH 8. 121,1 gram Tris base dalam 800 ml air destilata. pH larutan diatur dengan menambahkan 42 ml HCl pekat dan volume ditera menjadi 1 liter. Disterilisasi dengan autoklaf. Larutan Alkalin Lisis I (Larutan A). 50mM glukosa, 25mM TrisHCl pH 8, 10mM EDTA pH 8 dengan volume akhir 100 ml. Disterilisasi dengan autokalf dan disimpan pada suhu 4 oC.
Larutan Alkalin Lisis II (Larutan B). 0,2N NaOH, 1% SDS dengan volume akhir 100 ml. Disimpan pada suhu ruang. Larutan Alkalin Lisis III (Larutan C). 60 ml 5M K-asetat, 11,50 ml asam asetat glasial, dan 28,50 ml air destilata. Simpan pada suhu 4 oC dan tetap didalam es saat digunakan. Lisozim. 100 mg Lisozim dalam 10 ml TrisHCl pH 8. 50x TAE Bufer. 242 gram Tris base, 1,864 gram EDTA.2Na, 89,6 ml asam asetat glasial, air destilata hingga volume 1000 ml. Blue Juice. 0,25% bromofenol blue, 30% gliserol dalam air bidestilata. Simpan pada suhu 4 oC. 6M NaI. 8,99 gram NaI dalam 10 ml dimetilformamid. Dialikuot masing-masing 1,5 ml, disimpan pada suhu -20 oC. 2% X-Gal. 20 mg X-Gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil- -D-galaktosida) dalam 1 ml dimetilformamid. Simpan pada suhu -20 oC. Pereaksi DNS. Larutan A : 3 gram NaOH, 0,6 gram fenol, 3 gram DNS dalam 240 ml air destilata. Larutan B : 0,25 gram Na-sulfit, 2 gram Na-K-tartarat dalam 5 ml air destilata. 3 ml larutan B ditambahkan pada larutan A ditambahkan air destilata hingga volume 300 ml. disimpan pada suhu 4 oC dalam botol gelap. Pereaksi Bradford. 0,05 gram CBB G-250 dilarutkan dengan 25 ml 95% etanol dan 50 ml 85% asam fosfor lalu ditambahkan air destilata sampai volume 500 ml. Larutan dikocok kuat dan disaring dengan kertas saring lalu disimpan pada suhu 4 o
C dalam botol gelap.
Buffer Fosfat Sitrat pH 5. Larutan A : 19,21 gram asam sitrat dalam 1000 ml air destilata. Larutan B : 35,5 gram Na2HPO4.2H2O dalam 1000 ml air destilata. Campurkan 24,3 ml larutan A dan 25,7 ml larutan B.
Lampiran 2 Peta Plasmid pBluescript II KS (+) (Anonim 2003 dalam www.stratagene.com).
~
Lampiran 3 Kurva Standar Xilosa, BSA, dan p-Nitrofenol.
Kurva Standard Xilosa
Absorbansi (540 nm)
1,200 1,000
y = 3,1143x - 0,0861 R2 = 0,9961
0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
Konsentrasi Xilosa (m g/m l)
Kurva Standar BSA
Absorbansi (595 nm)
0,800 0,600
y = 3,4957x + 0,333 R2 = 0,9871
0,400 0,200 0,000 0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
Konsentrasi BSA (m g/m L)
0,100
0,120
Kurva Standar Nitrofenol
Absorbansi 405 nm
1,000 0,800
y = 2,6779x - 0,0056 R2 = 0,9983
0,600 0,400 0,200 0,000 0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
Konsentrasi nitrofenol (mg/ml)
0,35
0,40
Lampiran 4 Penentuan aktivitas xilanase dengan metode DNS (Miller 1959). Bahan Substrat Bufer pH optimum Enzim DNS Aquades
Jumlah 500 µl 450 µl 50 µl 1000 µl 250 µl
Kontrol Ya Ya Ya (setelah DNS) Ya -
Sampel Ya Ya Ya (sebelum DNS) Ya (setelah inkubasi) -
Aktivitas xilanase (U/ml) dihitung berdasarkan rumus : Aktivitas (U/ml) =
(Xs − Xk) x FP x 1000 BM xilosa (150,31) x waktu (30 menit)
Keterangan : UA : Jumlah enzim yang dapat menghasilkan satu µmol xilosa per menit (U/ml) Xs : Kadar xilosa sampel Xk : Kadar xilosa kontrol T : Waktu inkubasi (30 menit) Fp : Faktor pengenceran
Blanko Ya Ya Ya
Lampiran 5 Penentuan aktivitas enzim xilanolitik dengan substrat spesifik. Bahan Substrat (p-nitrofenol) Bufer pH optimum Enzim Na2 CO 3
Jumlah 450 µl
Kontrol Ya
Sampel Ya
Blanko Ya
400 µl 100 µl 50 µl
Ya Ya Ya (sebelum inkubasi)
Ya Ya Ya (setelah inkubasi)
Ya Ya
Aktivitas enzim (U/ml) dihitung berdasarkan rumus : Aktivitas (U/ml) =
(Xs − Xk) x Fp x 1000 Waktu (30 menit)
Keterangan : UA : Jumlah enzim yang dapat menghasilkan satu µmol p-nitrofenol per menit (U/ml) Xs : Kadar p-nitrofenol sampel Xk : Kadar p-nitrofenol kontrol T : Waktu inkubasi (30 menit) Fp : Faktor pengenceran (10X)
