ANALISIS SEKUENS GEN PENYANDI ENZIM XILANASE EKSTRASELULAR PADA Streptomyces costaricanus 45I-3
SIPRIYADI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Analisis Sekuens Gen Penyandi Enzim Xilanase Ekstraselular pada Streptomyces costaricanus 45I-3 adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada Perguruan Tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor,
Desember 2012
Sipriyadi G351100041
ABSTRACT
SIPRIYADI. Sequences analysis of gene encoding extracellular xylanase in Streptomyces costaricanus 45I-3. Supervised by ANJA MERYANDINI and ARIS TRI WAHYUDI. Streptomyces costaricanus 45I-3 isolated from peat soil is a bacterial strain in the group of actinomycetes. This bacterium is known to produce extracellular xylanase. The objectives of this study were to analyze sequence of gene involved in the synthesis of extracellular xylanase. Complete gene encoding xylanase was isolated from the bacterial genome by Inverse Polymerase Chain Reaction (i-PCR). The resulted gene sequence in a total alignment of 1664 bp amplicons, which consisted of two open reading frame (ORF) with opposite direction. ORF1 consisted of 1029 bp and ORF2 (Partial sequence) consisted of 309 bp. BLASTX analysis showed ORF1 homology with xylanase of bacterium enrichment culture clone Xyl8B8 (GenBank accession No. AFH35005.1) that had 95% identity and 99% similarity. ORF2 homolog with glyoxalase bacterium enrichment culture clone Xyl8B8 (GenBank accession No. AFH35007.1) that had 95% identity and 98% similarity. Upstream of the ORF1 sequence was found Ribosome Binding Site (RBS) 7 bp from the start codon and putative promotor sequence at 100 bp (-35) and 77 bp (-10) from the start codon. Analysis of protein sequence deduced from ORF1 showed that there were 2 domains, i.e Glyco_hydrolase 11 (GH11) and Carbohydrate Binding Type 2 (CBM2). Active sites found on the 130 amino acid on GH11 domain. Visualization of 3 dimension structure showed that 1664 bp fragment had 19 area.
Keywords: Xilanase, Inverse-PCR, Sequence Analysis, S. costaricanus 45I-3
RINGKASAN
SIPRIYADI. Analisis sekuens gen penyandi enzim xilanase ekstraselular pada Streptomyces costaricanus 45I-3. Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan ARIS TRI WAHYUDI. Xilan merupakan komponen utama penyusun hemiselulosa yang tersusun atas rantai utama berupa unit β-xilopironosa dengan ikatan β-1,4-glikosidik dari rantai cabang berupa gugus glukoronopironosil, 4-O-metil-D-glukoronopironosil, α-L-arabinofuranosil, asetil, ataupun furulil dan p-coumaril. Endo-β-1,4-xilanase merupakan salah satu enzim yang penting dalam menghidrolisis xilan secara sempurna menjadi xilosa. Enzim Endo-β-1,4-xilanase dapat dihasilkan oleh beberapa organisme seperti bakteri, alga, jamur dan aktinomisetes, ragi, protozoa, gastropoda, dan artropoda. Salah satu bakteri yang menghasilkan Enzim Endo-β-1,4-xilanase ialah Streptomyces costaricanus 45I-3. Bakteri ini menghasilkan xilanase ekstraselular pada suhu optimum 50ºC dan pH 5 sehingga berpotensi untuk diaplikasikan di bidang industri. Produksi endoxilanase S. costaricanus 45I-3 secara komersil kurang efisien dan ekonomis karena pertumbuhannya yang lambat dibandingkan dengan bakteri pada umumnya Pendekatan teknik rekombinan DNA melalui kloning gen merupakan suatu alternatif untuk memaksimalkan potensi xilanase dari S. costaricanus 45I-3 dalam bidang industri. Langkah awal yang perlu dilakukan sebelum melakukan kloning gen adalah mengisolasi dan mengkarakterisasi gen yang terlibat dalam menghasilkan xilanase ekstraselular. Fragmen gen endoxilanase famili 11 yang telah berhasil teramplifikasi baru mencakup 40% dari keseluruhan gen utuhnya. Untuk itu perlu dilakukan penelitian lanjutan menggunakan primer yang arah perpanjangannya keluar dari DNA yang telah diketahui sekuennya yang dikenal dengan inverse-PCR (i-PCR). Penelitian ini bertujuan menganalisis sekuen DNA yang berperan dalam sintesis enzim xilanase ekstraselular pada Streptomyces costaricanus 45I-3. Isolat S. costaricanus 45I-3 diremajakan pada media agar-agar xilan dan media Yeast Malt Agar (YMA). Biakan diinkubasi pada suhu ruangan selama 4 hari. pada penelitian ini dilakukan analisis gen endoxilanase pada S. costaricanus 45I-3. Primer disusun berdasarkan data parsial gen endoxilanase yang dilaporkan Aziz (2010). Karakterisasi gen endoxilanase pada S. costaricanus 45I-3 dilakukan melalui tahapan ekstraksi DNA, Inverse PCR (pemotongan genom, ligasi dan amplifikasi), elektroforesis, serta proses sekuen. Proses sekuensing DNA menggunakan jasa sekuensing PT. Genetika Science Indonesia. Sekuen produk i-PCR diedit menggunakan program Genetyx Win versi 4.0, kemudian dilakukan alignment menggunakan ClustalX dan Mega 5.0. Analisis deduksi Asam amino dilakukan dengan menggunakan program BLASTX. Analisis Open Reading Frame (ORF) menggunakan program ORF Finder di situs NCBI, sedangkan analisis promoter dan Ribosome Binding Site (RBS) menggunakan piranti lunak dari softberry. Analisis Domain dan situs aktif enzim dilakukan dengan menggunakan program Conserved Domain Database (CDD) site yang tersedia di NCBI (http://prosite. expasy.org/), visualisasi struktur 3 dimensi dengan menggunakan program Cn3D, sedangkan penentuan massa
molekul relatif dan titik isoleketrik menggunakan program yang tersedia pada situs (http://web.expasy.org/ compute_pi/). Urutan DNA lengkap yang diisolasi dari genom bakteri dengan metode Inverse Polymerase Chain Reaction (I-PCR) diprediksi mengkodekan gen endoxilanase. Pensejajaran produk I-PCR dengan parsial gen yang dilaporkan Aziz (2010) menghasilkan total amplikon sebesar 1664 bp, yang terdiri dari dua kerangka baca terbuka (ORF) dengan arah yang berlawanan. ORF1 terdiri dari 1.029 bp dan ORF2 (Parsial) terdiri dari 309 bp. Analisis BlastX maupun BlastP menunjukkan ORF1 homologi dengan xylanase bacterium enrichment culture clone Xyl8B8 (GenBank No akses AFH35005.1) yang memiliki identitas 95% dan kesamaan 99%. ORF2 homolog dengan glyoxalase bacterium enrichment culture clone Xyl8B8 (GenBank No akses AFH35007.1) dengan identitas sebesar 95% dan kesamaan 98%. Sekuen hulu ORF1 ditemukan Ribosom Binding Site (RBS) 16 bp dari start kodon. Sekuen penyandi putatif promotor ditemukan pada 100 bp (-35) dan 77 bp (-10) dari start kodon. Analisis sekuen protein dari ORF1 menunjukkan bahwa ada 2 domain Glyco_hydrolase 11 (GH11) dan Carbohidrate Binding Module (CBM2). Situs aktif ditemukan pada asam amino 130 pada domain GH11. Visualisasi struktur 3 dimensi menunjukkan bahwa fragmen 1.664 bp memiliki 19 wilayah.
Kata Kunci: Xilanase, Inverse-PCR, Analisis Sekuens, S. costaricanus 45I-3
Hak Cipta milik IPB, tahun 2012 Hak cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
ANALISIS SEKUENS GEN PENYANDI ENZIM XILANASE EKSTRASELULAR PADA Streptomyces costaricanus 45I-3
SIPRIYADI
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Mikrobiologi
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Giyanto, M.Si
Judul Nama NRP
: Analisis Sekuens Gen Penyandi Enzim Xilanase Ekstraseluler pada Streptomyces costaricanus 45I-3 : Sipriyadi : G351100041
Disetujui, Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si. Anggota
Prof. Dr. Anja Meryandini, M.S. Ketua
Diketahui
Ketua Program Studi Mikrobiologi
Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Prof. Dr. Anja Meryandini, M.S.
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr
Tanggal Ujian: 12 November 2012
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga penelitian dan penulisan karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Karya ilmiah ini merupakan syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains di Institut Pertanian Bogor. Judul yang dipilih dalam penelitian ini ialah Analisis Sekuens Gen Penyandi Enzim Xilanase Ekstraseluler pada Streptomyces costaricanus 45I-3. Selama menjalani perkuliahan hingga terselesaikannya tesis ini, penulis banyak mendapatkan bantuan moral maupun material dari berbagai pihak. Oleh karena itu dengan ketulusan hati, penulis mengucapkan terimakasih yang sebesarbesarnya kepada: Prof. Dr. Anja Meryandini dan Prof. Dr. Aris Tri Wahyudi selaku pembimbing yang telah sabar, setia dan tulus dalam memberikan bimbingan, arahan, nasehat, dorongan semangat serta rela mengorbankan waktu selama penelitian, proses pembimbingan sampai akhir penulisan tesis. Ucapan terimakasih juga disampaikan kepada Departemen Pendidikan Tinggi Republik Indonesia atas beasiswa BPPS Tahun 2010. Kepada Rektor dan Jajaran Pimpinan Universitas Bengkulu yang telah memberikan kesempatan dan izin kepada penulis untuk melanjutkan studi S2 di Institut Pertanian Bogor. Ucapan terima kasih penulis tujukan kepada Dr. Ir. Giyanto, M.Si atas kesediaannya sebagai penguji luar komisi yang telah memberikan saran dan masukan dalam menyempurnakan penulis tesis ini. Kepada staf laboratorium Mikrobiologi Bapak Jaka, Ibu Rika Indri Astuti, dan Ibu Henni atas bantuannya selama kegiatan penelitian di laboratorium. Terimakasih juga disampaikan kepada Eryk Andreas, S.Pt, M.Si, Bapak Saefuddin Aziz, S.Si, M.Si, dan Bapak Dr. Sri Pujianto, M.Si yang telah bersedia berbagi dan sharing dalam banyak hal untuk menunjang kelancaran selama proses penelitian sampai penulisan tesis ini. Terimakasih kepada teman-teman Mikrobiologi 2010 serta teman-teman Baristar atas dukungan semangat, kebersamaan, bantuan, dan do’anya. Serta pihak-pihak lain yang terlibat dan membantu dalam penyelesaian tesis ini yang tidak dapat saya sebutkan satu-persatu.
Akhirnya dengan penuh ketulusan ucapan terima kasih disampaikan kepada Ayahanda dan Ibunda tercinta, Bapak dan Ibu Mertua, dan terkhusus untuk Istriku Henny Johan Priyadi, S.Si, M.Pd dan anak ku tersayang (M. Naufal Priyadi) yang telah berkorban dan merelakan untuk berpisah selama penulis menyelesaikan studi S2 di IPB. Saudara ku Yuyin, Rinto, Nopi, Ana dan Septi atas dukungan, doa, cinta, dan kasih sayang yang sangat besar yang telah diberikan kepada penulis. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat dan memberikan informasi untuk kepentingan dan perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor,
Desember 2012 Sipriyadi
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Tanjung Karang pada tanggal 22 September 1984 sebagai putra ketiga dari lima bersaudara pasangan Arman dan Harmi. Tahun 2010 penulis menikah dengan Henny Johan, S.Si, M.Pd dan dikaruniai satu orang putra yang bernama Muhammad Naufal Priyadi (15 Bulan). Tahun 2003 penulis lulus dari SMA Negeri 04 Manna pada tahun yang sama lulus seleksi masuk Universitas Bengkulu melalui jalur Penelusuran Potensi Akademik (PPA). Penulis memilih jurusan Biologi, Fakultas MIPA dan selesai pada Tahun 2007. Penulis pernah bekerja di PT. Survindolink (Konsultan AMDAL) dari Tahun 2007 hingga tahun 2009 dan pada Tahun 2008 penulis diterima sebagai staf pengajar di Jurusan Biologi FMIPA Universitas Bengkulu hingga saat ini. Pada tahun 2010 penulis melanjutkan perkuliahan di Sekolah Pascasarjana IPB, Mayor Mikrobiologi. Pada masa perkuliahan penulis berkesempatan menjadi asisten untuk mata kuliah “Praktikum Mikrobiologi Lanjut” Tahun ajaran 2012/2013.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ......................................................................................
xiv
DAFTAR GAMBAR ..................................................................................
xv
DAFTAR LAMPIRAN ...............................................................................
xvi
PENDAHULUAN Latar Belakang ........................................................................................ Tujuan Penelitian .................................................................................... Manfaat Penelitian ..................................................................................
1 2 2
TINJAUAN PUSTAKA Xilan ....................................................................................................... Enzim Xilanase ....................................................................................... Regulasi Biosintesis Xilan dari Mikrob ................................................... Pengelompokan Endoxilanase ................................................................. Mikrob Penghasil Xilanase ..................................................................... Isolasi dan Karakterisasi Gen Endoxilanase ............................................ Inverse Polymerase Chain Reaction (I-PCR) ...........................................
3 4 5 5 7 8 9
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ................................................................. Bahan dan Alat Penelitian ....................................................................... Peremajaan Isolat S. costaricanus 45I-3 .................................................. Isolasi DNA Genom S. costaricanus 45I-3 .............................................. Amplifikasi Gen Endoxilanase dengan Metode Inverse-PCR .................. Elektroforesis Pada Gel Agarosa 1% ....................................................... Analisis Nukleotida, Asam Amino, Open Reading Frame (ORF), Ribosomal Binding Site (RBS), Situs Aktif, dan Struktur 3 Dimensi ........
11 11 11 11 12 13 15
HASIL Peremajaan S. costaricanus 45I-3 ............................................................ Isolasi Genom S. costaricanus 45I-3 ....................................................... Analisis Gen Penyandi Enzim Xilanase S. costaricanus 45I-3 ................. Analisis Asam Amino Menggunakan BLASTX ...................................... Analisis Struktur Gen .............................................................................. Analisis Domain, Situs Aktif dan Struktur 3 Dimensi .............................. Analisis Berat Molekul dan Titik Isoelektrik ...........................................
17 17 18 19 21 24 25
PEMBAHASAN .........................................................................................
27
SIMPULAN ...............................................................................................
34
SARAN ......................................................................................................
34
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................
37
LAMPIRAN ...............................................................................................
41
DAFTAR TABEL Halaman 1
Hemiselulase dan jenis substrat yang dihidrolisis ................................
4
2
Data kuantitas genom hasil isolasi (spektrofotometer) ..........................
18
3
Analisis homologi asam amino penyusun gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3 menggunakan program BLASTX .......................
19
DAFTAR GAMBAR Halaman
1
Strategi yang digunakan untuk mengamplifikasi gen endoxilanase pada S. costaricanus 45I-3 .................................................................
14
Morfologi isolat S. costaricanus 45I-3 yang ditumbuhkan pada media agar-agar xilan .................................................................... .
17
Amplifikasi I-PCR terhadap gen endoxilanase famili 11 dengan primer I (F-Sc1) dan primer II (R-Sc1) ..............................................
18
Deduksi asam amino antara S.costaricanus 45I-3 terhadap sekuen asam amino pengkode xilanase pada 3 spesies lainnya ........................
20
Filogenetik berdasarkan sekuen asam amino yang dibandingkan dengan beberapa galur Streptomyces penghasil endoxilanase .............
21
Hasil analisis open reading frame (ORF) untuk Glyco_hydro_11 Superfamili ........................................................................................
22
Hasil analisis open reading frame (ORF) untuk Glo_EDI_BRP _Like Superfamily .............................................................................
22
Skema hasil penggabungan ORF Gly-Hydro (GH11) dan Glyoxalase dengan arah berlawanan ..................................................
23
9
Analisis domain menggunakan program scan prosite. ...................... .
24
10
Prediksi struktur tiga dimensi enzim endoxilanase S. costaricanus 45I-3 menggunakan program Cn3D ................................................. .
25
Hasil Input data untuk analsis berat molekul dan titik isoelektrik enzim endoxilanase S. costaricanus 45I-3 .........................................
26
2 3 4 5 6 7 8
11
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1
Sekuen primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3 menggunakan metode Inverse-PCR ……….. .........................................................................
43
2
Hasil sekuensing produk inverse PCR (1500 pb) bagian forward ...... .
44
3
Hasil sekuensing produk inverse PCR (1500 pb) bagian reverse ........
46
4
Hasil pensejajaran urutan nukleotida produk inverse-PCR dengan database di GenBank menggunakan program BLASTX .....................
48
Hasil pensejajaran urutan nukleotida produk inverse-PCR dengan 5 database di GenBank menggunakan program BLASTX .....................
49
Analisis promoter dan open reading frame (ORF) ..............................
52
5 6
PENDAHULUAN
Latar Belakang Xilan merupakan komponen utama penyusun hemiselulosa yang tersusun atas rantai utama berupa unit β-xilopironosa dengan ikatan β-1,4-glikosidik dari rantai cabang berupa gugus glukoronopironosil, 4-O-metil-D-glukoronopironosil, α-L-arabinofuranosil, asetil, ataupun furulil dan p-coumaril (Kulkarni et al. 1999; Liet al. 2000). Endo-β-1,4-xilanase merupakan salah satu enzim yang penting dalam menghidrolisis xilan secara sempurna menjadi xilosa (Esteves et al. 2004). Enzim ini dapat dihasilkan oleh beberapa organisme seperti bakteri, alga, jamur dan aktinomisetes (Beg et al. 2001), ragi, protozoa, gastropoda, dan artropoda (Collins et al. 2005). Endoxilanase memiliki aplikasi yang luas dalam industri, diantaranya digunakan untuk meningkatkan ekstraksi lignin dan melepaskan kromofor pada tahapan awal pemutihan pulp. Penggunaan enzim xilanase pada industri pulp dan kertas meningkat seiring dengan meningkatnya penemuan mikrob yang mampu menghasilkan xilanase serta aplikasinya pada bidang industri (Beg et al. 2001). Aplikasi lainnya termasuk konversi xilan pada industri pertanian dan makanan, produksi bahan baku pada industri bahan bakar dan kimia (Sunnah & Antranikian1997). Enzim ini juga dapat digunakan untuk biobleaching pada industri kertas, penjernihan dan meningkatkan aroma jus dan anggur, meningkatkan kualitas roti, dan pakan ternak. Streptomyces costaricanus 45I-3 koleksi Dr. Yulin Lestari, Bagian Mikrobiologi,
Departemen Biologi IPB, mampu
menghasilkan xilanase
ekstraselular. Ekstrak kasar xilanase menunjukkan aktivitas xilanase yang dominan pada suhu optimum 50ºC dan pH 5 (Meryandini et al. 2007), sehingga isolat ini berpotensi untuk diaplikasikan di bidang industri. Namun produksi endoxilanase S. costaricanus 45I-3 secara komersil kurang efisien dan ekonomis karena pertumbuhannya yang lambat dibandingkan dengan bakteri pada umumnya (Paul & Chlark 1996). Pendekatan teknik rekombinan DNA melalui kloning gen merupakan suatu alternatif untuk memaksimalkan potensi xilanase dari
2 S. costaricanus 45I-3 dalam bidang industri. Langkah awal yang perlu dilakukan sebelum melakukan kloning gen adalah mengisolasi dan mengkarakterisasi gen yang terlibat dalam menghasilkan xilanase ekstraseluler. Tahapan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi gen penyandi endoxilanaseS. costaricanus 45I-3 melalui pendekatan pustaka genom telah dilakukan Satria (2008). Koloni rekombinan yang membawa gen xilanase dideteksi dengan adanya zona bening pada media xilan, namun ketika diverifikasi lebih lanjut DNA sisipan tidak bisa bertahan lama. Upaya lain dilakukan oleh Aziz (2010) melalui pendekatan Polymerase Chain Reaction (PCR). Fragmen gen endoxilanase famili 11 berhasil teramplifikasi, namun baru mencakup 40% dari keseluruhan gen utuhnya. Atas dasar tersebut perlu dilakukan penelitian lanjutan menggunakan primer yang arah perpanjangannya keluar, metode ini lebih dikenal dengan inverse-PCR (i-PCR). Pada metode i-PCR fragmen gen yang telah dilaporkan Aziz (2010) dijadikan sebagai cetakan untuk perpanjangan primer ke arah hulu dan hilir parsial gen endoxilanase secara bersamaan, sehingga bisa didapat gen endoxilanase pada S. costaricanus 45I-3 secara keseluruhan. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan menganalisis sekuens gen penyandi enzim xilanase ekstraselular pada Streptomyces costaricanus 45I-3. Manfaat Penelitian Manfaat yang dapat diambil dari penelitian ini adalah diperolehnya informasi mengenai karakteristik gen yang menyandikan enzim xilanase ekstraselular pada S. costaricanus 45I-3 sebagai dasar pengembangan isolat lokal yang potensial bagi keperluan industri.
TINJAUAN PUSTAKA Xilan Xilan merupakan komponen utama penyusun hemiselulosa yang banyak ditemukan pada dinding sel tumbuhan dengan konsentrasi berkisar antara 25-30% dari berat kering total (Perez et al. 2002). Komponen terbesar hemiselulosa yaitu xilan, merupakan jenis polisakarida paling melimpah kedua di alam setelah selulosa. Xilan terdapat hampir pada semua tanaman, kebanyakan dijumpai pada tanaman tahunan dan limbah–limbah pertanian seperti tongkol jagung, bagas tebu, jerami padi, dedak gandum dan biji kapas (Subramiyan & Prema 2002). Xilan tersusun atas rantai utama berupa unit β-xilopironosa dengan ikatan β-1,4-glikosidik dari rantai cabang berupa gugus glukoronopironosil, 4-O-metilD-glukoronopironosil, α-L-arabinofuranosil, asetil, ataupun furulil dan p-coumaril (Kulkarni et al. 1999; Lie et al. 2000). Komposisi rantai cabang xilan jumlahnya sangat beragam tergantung pada sumber xilan. Xilan pada kayu keras dari golongan Angiospermae tersusun terutama oleh O-asetil-4-O metilglukoronoxilan. Xilan pada kayu lunak dari golongan Gimnospermae tersusun terutama oleh arabino-4-O-metilglukoronoxilan. Xilan pada tumbuhan semusim dan rumputrumputan tersusun terutama oleh arabinoxilan (Kulkarni et al. 1999). Xilan pada kayu keras minimal tersusun oleh 70 residu β-xilopironosa dengan derajat polimerisasi antara 150 hingga 200. Setiap residu xilosa terdapat sebuah rantai cabang asam 4-O-metil glukuronat. Pada posisi C-3 dari unit xilosa banyak mengalami asetilasi hingga mencapai lebih dari 0.5 mol asam asetat per 1 mol xilosa. Xilan dari kayu keras misalnya Birchwood xylan tersusun atas 89.3% xilosa, 1 % arabinosa, 1.4 glukosa dan 8.3 asam anhidrouronik. Xilan pada kayu lunak memiliki residu xilosa yang lebih pendek dan percabangan yang lebih sedikit dari xilan kayu keras dengan derajat polimerisasi antara 70 hingga 130. Rasio komposisi β-D-xilopironosa, asam 4-O-metil-α-D-glukuronat dan Larabinofuranosa adalah 100: 20 : 13 (Beg et al. 2001). Xilan pada tumbuhan semusim dan rerumputan sedikit mengalami percabangan. Umumnya pada posisi C3 mengalami asetilisasi dimana grup asetilnya dihubungkan olh ikatan α-1,3 glikosidik dengan gugus α-L- arabinofuranosa (Saha 2003).
4 Enzim xilanase Xilanase adalah suatu enzim hidrolase yang akan menghidrolisis xilan menjadi xilooligosakarida. Untuk menghidrolisis xilan secara sempurna menjadi monomernya yaitu xilosa dibutuhkan suatu sistem enzim. Endo-β-1,4-xilanase akan
mendepolarisasi
xilan
secara
acak
pada
rangka
β-1,4
menjadi
xilooligosakarida dengan melepas xilosa. β-xilosidase menghidrolisis xilooligosakarida menjadi oligosakarida dan melepas xilosa. Gugus-gugus substituen akan dihidrolisis oleh α-arabinofuranosidase, α-D-glucuronidase, galaktosidase dan asetil xilan esterase (Subraminyan & Prema 2002). Sistem enzim ini banyak ditemukan pada fungi dan bakteri (Beg et al. 2001). Hidrolisis hemiselulosa juga membutuhkan enzim pelengkap yang berkerja secara sinergis dalam menguraikan xilan dan manan (Tabel 1). Tabel 1 Hemiselulase dan jenis substrat yang dihidrolisis (Howard et al. 2003) Enzim Exo- β-1,4-xylosidase Endo- β-1,4-xylanase Endoβ-1,4mannosidase Endo- β-1,4-mananase Endo- a-1,5-arabinase a-Larabinofuranosidase a-glucoronidase
Substrat β-1,4-xilooligomers xylobiose β-1,4-xylan β-1,4-mannooligomers mannobiose
β-1,4-manan a-1,5-arabinan a-L-arabinofuranosyl (1 2) atau (13) xylooligomers a-1,5-arabinan 4-O-metyl-a-glucuronic acid (12) xilooligomers a-galactosidase a-galactopyranose (16) mannooligomers Endo-galactanase β-1,4-galactan Β-glucosidase Glucopyranose (1,6) mannopyronose Acetyl xilan esterases 2- atau 3-O Acetyl xilan Acetyl manan esterases 2- atau 3-O Acetyl manan Ferulic and p-cumaric 2- atau 3-O Acetyl manan acid esterase
Nomor EC 3.2.1.3.7 3.2.1.8 3.2.1.25 3.2.1.78 3.2.1.99 3.2.1.55 3.2.1.39 3.2.1.22 3.2.1.89 3.2.1.21 3.2.1.72 3.1.1.6
Xilanase dapat diklasifikasikan berdasarkan substrat yang dihidrolisis, yaitu β-xilosidase, eksoxilanase dan endoxilanase. Enzim β-xilosidase mampu menghidrolisis xilooligosakarida rantai pendek menjadi xilosa. Eksoxilanase memutus rantai polimer xilosa (xilan) pada ujung pereduksi, sehingga menghasilkan xilosa sebagai produk utama dan sejumlah oligosakarida rantai pendek. Endoxilanase mampu memutus ikatan β-1-4 pada bagian dalam rantai
5 xilan secara teratur. Xilanase pada umumnya merupakan protein kecil dengan berat molekul 15 kDa – 40 kDa, aktif pada suhu 55ºC dengan pH 9 (Yang et al. 1998; Yu et al. 1991). Xilanase yang dihasilkan oleh Streptomyces thermoviolaceus OPC-520 bersifat lebih stabil pada suhu 60ºC dan pH netral, (Tsujibo et al. 1992). Xilanase dari bakteri Streptomyces sp. (galur Lb 24D) mempunyai aktifitas tinggi pada kisaran pH 5-8, dengan pH optimal 6.5 (Rawashdeh et al. 2005). Regulasi Biosintesis Xilanase dari Mikrob Enzim xilanase banyak dihasilkan dari mikroba terutama fungi dan bakteri. Faktor penting yang harus diperhatikan dalam produksi enzim dari mikroba adalah pemilihan penginduksi yang tepat dan komposisi media yang optimum. Hal ini berhubungan dengan regulasi sintesis enzim xilanase dari mikroba. Xilan merupakan molekul besar sehingga dalam kondisi utuh tidak dapat masuk ke dalam sel. Fragmen xilan yang lebih kecil seperti xilosa, xilobiosa, xilooligosakarida dan heterodisakarida dari xilosa dan glukosa memegang peranan penting dalam biosintesis xilanase. Xilanase dapat dihasilkan secara konstitutif maupun induktif. Xilanase yang dihasilkan secara konstitutif mendegradasi xilan menjadi xilooligosakarida dan xilobiosa, sehingga molekul ini bisa diangkut ke dalam sel untuk menginduksi gen xilanase lainnya. β-xilosidase yang diproduksi baik secara konstitutif maupun induktif mengubah xilobiosa menjadi xilosa dan selanjutnya diikuti proses transglikosilasi menjadi XyIB1-2XyI dan GLcB1-2XyI. Senyawa ini akan dimasukkan ke dalam sel dan bertindak sebagai penginduksi tambahan bagi gen penyandi xilanolitik (Kulkarni et al. 1999). Pengelompokan Endoxilanase Enzim endoxilanase menurut Wang et al. (1997) dikelompokkan ke dalam glikosida hidrolase famili 10 dan 11 (disebut juga famili F dan famili G) berdasarkan komponen psikokimianya yang meliputi massa molekul relatif dan titik isoelektrik. Famili 10 merupakan kelompok endoxilanase dengan massa molekul yang relatif tinggi (>40 kDa) dengan nilai pH yang rendah (asam). Sebaliknya famili 11 merupakan kelompok endoxilanase yang relatif rendah (<40
6 kDa) dan nilai pH tinggi (basa). Famili 10 mampu menghidrolisis ikatan glikosidik di sebelah titik cabang yang mengarah ke ujung non-pereduksi dengan menggunakan dua residu xilopirinosil non-substitusi antara cabang-cabang, sedangkan famili 11 menggunakan 3 residu xilopironosil nonsubstitusi. Endoxilanase famili 10 memiliki 4 hingga 5 sisi pengikatan substrat. Sebagian besar xilanase famili 10 ini dapat menyerang ikatan xilosidik pada ujung non reduksi juga pada residu yang disubstitusi atau ikatan 1,3-β. Namun demikian enzim ini hanya mampu memotong ikatan xilosidase ketiga setelah residu yang disubstitusi dan ikatan kedua setelah ikatan 1,3-β. Struktur enzim yang berbentuk seperti mangkuk salad dengan salah satu sisi molekulnya memiliki radius yang luas (sekitar 45 Å) dan memiliki arsitektur berupa loop yang terkolaborasi (Torronen et al. 1994). Mikroorganisme penghasil xilanase famili ini antara lain Penicillium simplicissinum, Streptomyces halstedii JM INQ6, dan Streptomyces lividans (Biely et al. 1997). Endoxilanase famili 11 dapat menghidrolisis aril-β-glikosida dari xilobiosa dan xilotriosa, enzim ini sangat aktif pada oligosakarida rantai panjang dan telah diketahui bahwa famili ini memiliki celah pengikatan substrat yang besar. Enzim ini memiliki dua tempat mekanisme katalitik yang berbeda yaitu dua glutamat yang bertugas sebagai residu katalitik. Struktur enzim famili ini merupakan lipatan berputar α/β-jelly yang terdiri atas bentuk lembaran β di dalam dua layer yang mengelilingi sisi katalik (Torronen et al. 1994). Mikroorganisme penghasil xilanase golongan famili ini adalah Bacillus circulans, Bacillus subtilis B230, Streptomyces sp. S38 IHIX dan Trichoderma harzianum E58 (Sapag et al. 2002). Menurut Collins et al. (2005) selain famili 10 dan 11, enzim endoxilanase juga terdapat dalam famili 5, 7, 8, dan 43 dalam kelompok glikosida hidrolase berdasarkan perbandingan struktur primer domain katalitiknya. Endoxilanase famili 5 memiliki domain katalitik yang menunjukkan lipatan umum (β/α) delapan kali. Famili 7 tidak spesifik memiliki aktivitas xilanase saja, namun juga memiliki aktivitas α-L-arabinofuranosidase dan selulose. Enzim ini memiliki berat molekul tinggi dan nilai pH yang rendah dan memiliki sisi pengikatan substrat yang kecil. Endoxilanase famili 8 memiliki berat molekul yang besar yaitu sekitar 45 kDa serta memiliki nilai pH yang tinggi (pH 9.5). Famili ini memiliki celah luas bagi
7 sisi pengikatan substrat yang mengandung sedikitnya 6 residu untuk pengikatan xilosa, dengan sisi katalik ada di tengah dengan lipatan (α/α) 6 kali (Collins et al. 2005). Endoxilanase famili 43 memiliki kedekatan dengan gen lichenase dan hanya berbeda urutan nukleotidanya sebanyak 155 bp. Mikroorganisme penghasil xilanase famili 43 ini antara lain Paenibacillus polymyxa, Caldicellosiruptor sp., Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum dan Bacillus sp (Biely et al. 1997). Mikrob Penghasil Xilanase Berbagai mikroba dilaporkan mampu menghasilkan xilanase. Bakteri dari genus Bacillus, cendawan dari genus Trichoderma dan Aspergillus, aktinomicetes dari genus Streptomyces diketahui merupakan mikroba potensial penghasil xilanase. Mikroba tersebut memiliki relung ekologi yang bervariasi dan tersebar luas (Collins et al. 2005). Kelompok bakteri seperti Bacillus circulans, B. amylolequefaciens, B. firmus, Bacillus sp, Cellulomonas flavigena, Streptomyces cuspidosporus, Streptomyces sp QG-11-3, S. roseiscleroticus NRRL-B-11019, Aeromonas caviae telah dilaporkan menghasilkan xilanase. Bacillus spp., Rhodotermus
marinus,
Coldocellum
saccharolyticum,
Dictiogolmus
sp.
dilaporkan menghasilkan xilanase alkali yang bersifat termostabil dengan aktivitas dan karakteristik yang beragam (Subramaniyam & Prema 2002). Beberapa bakteri dan aktinomycetes asal Indonesia dilaporkan berpotensi menghasilkan xilanase Bacillus thermoleovorans IT-08 menghasilkan β-xilosidase dan α-L arabinofuranosidase yang bersifat thermostabil dengan suhu optimum 70ºC (Puspaningsih 2004). Xilanase B. lichenoformis relatif stabil pada suhu 90ºC, pH 7.0-9.0 selama 30 menit (Nareswari 2007). Xilanase pada Streptomyces spp menghasilkan βxilosidase dan α-L arabinofuranosidase dengan suhu optimum 50-90ºC (Hendarwin 2006). Widhyastuti (2007) melaporkan bahwa xilanase dari bakteri Streptomyces sp. SKKI asal Sukabumi memiliki aktivitas optimum pada pH 4.5 dan suhu 50ºC dan stabil pada rentang pH 4-8.5 dan suhu 50ºC. Hasil ini hampir sama dengan yang dilaporkan Meryandini et al. (2007), isolat Streptomyces costaricanus 45I-3 yang diisolasi dari tanah rawa gambut di Kalimantan memiliki aktivitas optimum pada pH 5.0 dan suhu 50ºC.
8 Xilanase pada cendawan pada umumnya memiliki aktivitas pada rentang pH yang lebih rendah dibandingkan dengan xilanase bakteri dengan aktivitas optimum pada pH 5 dan stabil pada pH 3-8. Trichoderma veridei, T. Reseei dan Schzophillum commune dapat menghasilkan xilanase dengan aktivitas tinggi, yaitu berturut-turut sebesar 181.1 IU/ml, 960 IU/ml dan 1244 IU/ml. Namun demikian pada kebanyakan ekstrak xilanase cendawan terdeteksi adanya senyawa selulase yang signifikan sehingga tidak bisa diaplikasikan pada bidang industri. Xilanase Thermomyces lanuginosus dilaporkan hanya sedikit terkontaminasi oleh selulase yang aktivitasnya dapat diabaikan (Subramaniyan & Prema 2002). Isolasi dan Karakterisasi Gen Penyandi Endoxilanase Pendekatan isolasi menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) menawarkan keuntungan tersendiri. Saat ini keberhasilan untuk mendapatkan gen spesifik lebih tinggi berkat semakin berkembangnya bioinformatika. Metode PCR sering dilakukan untuk mengisolasi gen spesifik dari spesies tertentu yang dikultur dan telah diketahui urutan DNAnya. Dalam hal ini primer yang digunakan merupakan primer yang dirancang secara spesifik untuk spesies yang belum diketahui urutan DNAnya. Urutan primer ditentukan berdasarkan informasi gen dari beberapa spesies yang berkerabat dekat. Penggunaan metode PCR untuk mengisolasi gen penyandi endoxilanase dari bakteri telah banyak dilaporkan. Gen penyandi endoxilanase famili 11 sebesar 642 pb berhasil diisolasi dari sumber air panas Pawan, Riau menggunakan primer spesifik untuk genus Bacillus. Urutan primer tersebut adalah 5’-AATGCGGCCG CAATGTTTAAGTTTAAAGATTCT-3’ sebagai primer forward dan 5’-GCT CTAGATTACCACACTGTTACGTTAGAACTT-3’
sebagai
primer
reverse
(Helianti 2007). Gen xynAQ1 sebesar 642 pb yang menyandikan parsial gen xilanase dari Bacillus subtilis AQ1 juga berhasil diisolasi dengan primer spesifik tersebut (Helianti et al. 2010). Gen stxl sebesar 839 pb yang menyandikan endoxilanase famili 11 dari Streptomyces thermonitrificans berhasil diisolasi dengan primer stxF (5’-CCAG ACCGGCACCCACAACGGC-3’) dan primer stxR (5’-GCTGACCGTGGGCC AGGTCC-3’) (Cheng et al. 2008). Gen xynSW2 yang menyandikan endoxilanase famili 11 dari Streptomyces sp. SWU10 berhasil diamplifikasi dengan
9 menggunakan sepasang primer degenerate SxynFde: 5-ATGGGYTYNYAYG CC CTYCBC RGA-3, dan SxynRde: 5-TCAGGYGCGGGWCCASCGYTG YTG-3 (Deesukon et al. (2011). Fragmen gen xynA119 sebesar 347 pb yang merupakan fragmen gen penyandi endoxilanase famili 10 dari kelompok Actinobacteria berhasil diisolasi dengan primer XynA 119F (5’-CGGAATTCGGCTCCGGCG GACGCGTACCACC-3’) dan XynA11R (5’-CCCAAGCTTGTTGAAGCGGC CCTCGGCCAGC-3’) (Zeou et al. 2009). Inverse Polymerase Chain Reaction (I-PCR) Amplifikasi sekuen DNA dengan PCR pada dasarnya menggunakan primer-primer yang berhibridisasi pada utas DNA yang berlawanan. Orientasi arah pemanjangan dari primer mengarah ke dalam melewati daerah sekuen DNA di antara dua primer yang digunakan. Produk DNA yang disintesis dari satu primer berfungsi sebagai DNA templat (cetakan) bagi primer yang lain dan prosedur (sikIus) PCR akan berulang-ulang dari mulai denaturasi DNA, penempelan primer (annealing), dan pemanjangan (extention) oleh DNA polimerase, sehingga akan dihasilkan produk dengan jumlah kopi yang eksponensial dari daerah sekuens DNA yang diamplifikasi yang berada di antara dua primer yang digunakan. Pengembangan teknik PCR akan memungkinkan amplifikasi sekuen DNA yang mengapit segmen DNA yang telah diketahui sekuennya, baik bagian huIu (upstream), hilir (downstream), atau sekaligus bagian hulu dan hilir (Rich & Willis 1990). Konsep ini merupakan teknik yang sederhana yang dinamakan inverse PCR. Sintesis DNA akan memanjang ke arah luar dari DNA yang telah diketahui sekuennya tanpa melalui prosedur kloning secara konvensional. Metode Inverse PCR dapat digunakan untuk mengidentifikasi secara cepat situs penyisipan dari elemen loncat (transposable element) atau transposon, atau dapat juga untuk menganalisis daerah (region) tertentu yang berdekatan dengan sekuen yang spesifik. Metode inverse PCR juga dapat digunakan untuk mengantisipasi prosedur kloning secara konvensional jika DNA yang diklon sulit dilakukan. Fragmen DNA yang berukuran (> 12 kpb= kilo pasang basa) atau berukuran lebih besar sering akan terpotong-potong menjadi beberapa fragmen oleh enzim restriksi yang digunakan dalam pengklonan. Hal ini akan memakan
10 waktu yang cukup lama untuk mengamplifikasinya dengan prosedur kloning secara konvensional. Dengan demikian, metode inverse PCR akan menjadi altematif solusi yang baik untuk mengatasi masalah tersebut (Martin & Mohn 1999). Inverse-polymerase chain reaction (I-PCR) adalah variasi dari reaksi berantai polimerase yang digunakan untuk mengamplifikasi DNA dengan hanya satu urutan diketahui. Salah satu keterbatasan PCR konvensional adalah memerlukan primer untuk kedua utas DNA target, tetapi metode ini memungkinkan PCR dapat dilakukan meskipun hanya satu urutan yang tersedia dan primer dapat dirancang. Metode inverse PCR melibatkan serangkaian reaksi yang meliputi pemotongan utas dan ligasi, menghasilkan fragmen melingkar yang dapat dikenali oleh primer dari satu bagian urutan diketahui. Kemudian, seperti proses PCR lain, DNA diamplifikasi oleh DNA polimerase pada temperatur tertentu (Martin & Mohn 1999).
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan pada bulan Oktober 2011 sampai dengan Juni 2012. Penelitian bertempat di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Terpadu Departemen Biologi, FMIPA IPB. Bahan dan Alat Penelitian Bahan yang digunakan ialah bakteri S.costaricanus45I-3 yang berasal dari Kalimantan (koleksi Dr. Ir. Yulin Lestari, Bagian Mikrobiologi Departemen Biologi, FMIPA IPB) digunakan sebagai sumber gen endoxilanase. Bahan dan alat untuk ekstraksi DNA terdiri atas STE (0.3 M sukrosa; 25 mM Tris-HCL; 25 mM EDTA.2Na pH 8), proteinase K (5 mg/ml), enzim lisozim (20 mg/ml), PCI(Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol = 25 : 24 : 1), CIAA (Chloroform : Isoamyl alcohol = 24 : 1), fenol, isopropanol, etanol 70% (v/v), Tris-HCl EDTA ((TE) (10 mM Tris-HCl-EDTA pH 8; 1 mM EDTA)), dan tabung mikro1.5 ml. Bahan untuk campuran PCR yaitu akuades steril, primer I, primer II, dan TAKARATaq DNA Polymerase (bufer dengan 1.5 mM Mg2+, dNTP 0.4 mM, 0.5 U/µl TAKARATaq DNA polymerase). Bahan yang digunakan untuk elektroforesis adalah medium agarosa 1%, bufer 1xTAE (Tris 0.5 M, asam asetat 0.65 M, EDTA 0.02M), penanda 1kb DNA ladder (Fermentas), dan 6x loading dye (Promega). Visualisasi DNA menggunakan UV Transluminator. Peremajaan Isolat S. costaricanus45I-3 Media yang digunakan untuk meremajakan isolat S. costaricanus 45I-3 adalah media agar-agar xilan (0.5% ekstrak khamir; 10.3% sukrosa; 0.5% NaCl; 0.5% xilan Birchwood; 2% agar) dan media Yeast Malt Agar (YMA). Biakan diinkubasi pada suhu ruangan selama 4 hari. Isolasi DNA Genom S. costaricanus 45I-3 Sebanyak 1.5 ml biakan bakteri dimasukkan ke tabung mikro mikro1.5 ml lalu disentrifugasi pada kecepatan 800 rpm selama 10 menit, supernatan dibuang dan pelet yang terbentuk dicuci dengan bufer STE (komposisi: 0.3 M sukrosa; 25
12
mM Tris-HCL; 25 mM EDTA·2Na pH 8), kemudian disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 10 menit. Pelet dicuci sebanyak 3 kali secara berulang. Selanjutnya supernatan dibuang dan pada pelet yang didapat ditambahkan 200 µl bufer STE dan 45 µl lisozim (20 mg/ml), tabung dibolakbalik secara pelan lalu diinkubasi pada suhu 55ºC selama 1 jam sehingga terbentuk protoplas. Sebanyak 20 µl proteinase-K (20 mg/ml) ditambahkan pada campuran tersebut dan diinkubasi pada suhu 55ºC selama 60 menit lalu ditambahkan 400µl 10% CTAB dalam larutan 0.7 M NaCl, dan diinkubasi pada suhu 65ºC selama 30 menit. Ke dalam larutan ditambahkan 1 kali volume fenol:kloroform (25:24) dan disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Fase bening dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan 0.6 kali volume isopropanol dan 20 µl natrium asetat, dinkubasi pada suhu -20ºC selama semalam. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit, bagian sepernatan dibuang sedangkan pada pelet dicuci menggunakan alkohol 70% sebanyak 1 ml. DNA dikeringanginkan selama 1 jam untuk membuang alkohol lalu dilarutkan
ke
dalam 50 µl ddH2O steril selanjutnya disimpan pada 4 ºC atau -20ºC. Amplifikasi Gen Endoxilanase dengan Metode Inverse PCR Pemotongan DNA Genom. Untuk mengamplifikasi DNA yang mengapit fragmen bagian hulu dan hilir sekaligus, DNA genom dipotong dengan menggunakan enzim restriksi yang tidak memotong fragmen tersebut, yaitu HinfI, HindIII, EcoR1, EcoRV, BamHI, dan NdeI. Sebanyak 10 µl DNA genom ditambahkan dengan 2 µl 10x buffer RE, 1 µl enzim restriksi dan 6 µl akuades steril lalu diresuspensi dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama semalam. Selanjutnya DNA diekstrak dengan fenol-kloroform kemudian diendapkan dengan etanol 100% dan dicuci dengan etanol 70%. Selanjutnya pelet dikering anginkan pada suhu ruang selanjutnya disuspensikan ke dalam 5 µl akuades steril. Sirkularisasi DNA Hasil Pemotongan. Potongan genom hasil restriksi disirkularisasi atau diligasikan dengan menggunakan enzim ligase (DNA ligase T4, ligation kit ver.2 solution I). Ligasi dilakukan semalaman pada suhu 15ºC. Sampel DNA yang telah disirkularisasi kemudian diendapkan menggunakan
13
etanol 100%. Pelet DNA dikering anginkan selanjutnya diresuspensikan ke dalam 5 µl akuades steril. Amplifikasi Gen Penyandi Xilanase Ekstraselular. Amplifikasi fragmen gen penyandi enzim xilanase ekstraselular dengan inverse-PCR dilakukan menurut Wahyudi et al. (2001). Primer didesain berdasarkan pada sekuen parsial gen endoxilanase yang dilaporkan Aziz (2010). Primer yang digunakan yaitu primer I (Sc-F1-3’ATCAC CACCGGCAACCACTTCG-5’): dan primer II (Sc-R1 3’-TGCCCCAGTTGTCGACGATGTAG-5’), i-S1-i-S2, dan Sc-F1-Sc-R1 (Lampiran 1). DNA diamplifikasi dengan menggunakan Gene Amp System 2400, thermocycler (Perkin Elmer). Reaksi inverse-PCR meliputi : 25 µl 2x Buffer (Reaction With GC), primer masing-masing 1 µl (10 µM), 1 µl LA Taq polymerase, 3 µl sampel DNA, dan akuades steril hingga volume 50 µl. Program i-PCR sebagai berikut; denaturasi awal (94°C, 5 menit), diikuti denaturasi (94°C, 2 menit). Penempelan primer (61°C, 1 menit), pemanjangan (72°C, 1 menit) dan pemanjangan akhir (72°C, 7 menit). Amplifikasi dilakukan sebanyak 30 sikIus. Elektroforesis pada Gel Agarosa 1% DNA hasil PCR divisualisasi dengan teknik elektroforesis menggunakan Agarose biologi meolekuler (Biorad) 1%. 1 gram agarosa dilarutkan ke dalam 100 ml bufer TAE 1x kemudian dididihkan. Selanjutnya dicetak dan dibiarkan sampai membeku dan dimasukkan ke bak elektroforesis (Biored) yang telah diisi larutan bufer TAE 1x. DNA produk PCR sebanyak 5 µl dicampur dengan 2 µl loading dye, kemudian dimasukkan ke dalam sumur pada agarosa. Kondisi elektroforesis diatur pada tegangan 75 volt selama 45 menit. Selanjutnya agarosa diwarnai dalam larutan ethidium bromida (0.5 µl/ml) selama 15 menit, diamati pada UV transluminator (UV luminescence).
14
1500 1000 750 500 250
Gambar 1
Strategi yang digunakan untuk mengamplifikasi gen endoxilanase pada S. costaricanus 45I-3. Mula-mula genom dipotong secara acak menggunakan enzim restriksi yang tidak memotong sekuens 408 pb yang dilaporkan aziz, salah satunya Hinf1. Selanjutnya dilakukan sirkularisasi dan amplifikasi menggunakan primer yang arah pemanjangannya keluar. Poduk inverse-PCR selanjutnya disekuensing dan disejajarkan pada parsial gen yang dilaporkan Aziz (2010), sehingga akan didapat total amplikon yang dapat dianalsis lebih lanjut.
15
Analisis Nukleotida, Asam Amino, ORF, RBS, Situs Aktif, dan Struktur 3 Dimensi Proses sekuensing DNA menggunakan jasa sekuensing PT. Genetika Science Indonesia. Sekuen produk inverse-PCR diedit menggunakan program Genetyx Win versi 4.0, kemudian dilakukan alignment menggunakan ClustalX, Mega 4.0 (Tamura et al. 2007) dan Mega 5.0. Analisis deduksi asam amino dilakukan dengan menggunakan program BLASTX. Analisis open reading frame (ORF) menggunakan program ORF Finder di situs National Center for Biotechnology Information (NCBI), sedangkan analisis promoter dan ribosome binding site (RBS) menggunakan piranti lunak dari softberry (www. softberry.com). Analisis Domain dan situs aktif enzim dilakukan dengan menggunakan program conserved domain database (CDD) site yang tersedia di NCBI (http://prosite. expasy.org/) (Falquet et al. 2002). Visualisasi struktur 3 dimensi menggunakan program Cn3D. Penentuan berat molekul (BM) dan titik isoelektrik (pI) menggunakan program yang tersedia pada situs (http://web.expasy .org/ compute_pi/).
17
HASIL
Peremajaan S. costaricanus 45I-3 Pada penelitian ini isolat S. costaricanus 45I-3 diremajakan pada media agar-agar xilan dan YMA. Hasil yang didapat menunjukkan bahwa pertumbuhan diawali dengan perkecambahan spora menjadi hifa substrat berwarna putih pada media agar-agar xilan. Hifa substrat dan hifa aerial berwarna abu-abu pada media YMA (Gambar 2).
(b)
(a)
(c) Gambar 2 Morfologi isolat S. costaricanus 45I-3 yang ditumbuhkan pada media agar-agar xilan (a) tampak depan, (b) tampak belakang, dan (c) pada media YMA. Pada (b) terlihat media xilan berubah warna menjadi kuning tua. Isolasi Genom S. costaricanus 45I-3 Kuantitas DNA hasil isolasi genom menggunakan spektrofotometer disajikan pada Tabel 2.
18 Tabel 2 Kuantitas genom hasil isolasi No 1
OD (Optical Density) λ 260 λ 230 nm λ 280 nm nm 0.076 0.039 0.188
Kemurnian
Konsentrasi DNA
λ260/ λ280)
μg/ml
μg/μl
1.94
760
0.76
2
0.216
0.624
0.314
1.99
1090
1.92
3
0.009
0.025
0.014
1.79
438
0.44
4
0.204
0.398
0.199
2.00
696
0.697
5
0.219
0.197
0.099
1.99
344
0.345
6
0.215
0.438
0.223
1.96
766
0.767
7
0.183
0.460
0.233
1.97
805
0.805
8
0.199
0.540
0.271
1.99
9450
9.45
9
0.294
0.839
0.435
1.93
146
0.46
Kuantitas DNA (konsentrasi) hasil pengukuran dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm ialah terendah pada sampel nomor 3 yaitu 438 µg/ml sedangkan yang tertinggi pada sampel nomor 8 yaitu 9450 µg/ml (Tabel 2). Kemurnian DNA yang didapat berdasarkan nilai rasio OD260/OD280 rata-rata adalah 1.9 yang artinya DNA yang diperoleh mempunyai kemurnian yang sangat tinggi dan tidak terkontaminasi oleh protein. Analisis Gen Penyandi Enzim Xilanase S. costaricanus 45I-3 Amplifikasi menggunakan metode inverse-PCR menghasilkan fragmen DNA yang berukuran sekitar 1500 pb (Gambar 4). M
1500 1000 750 500 250
1
2
1.500 pb
Gambar 3 Amplifikasi i-PCR terhadap gen endoxilanase famili 11 dengan primer I (F-Sc1) dan primer II (R-ScI) yang arah perpanjangannya ke luar. M = marker 1 Kb ; 1 dan 2 = produk i-PCR setelah dipotong dengan enzim restriksi HinfI.
19 Produk inverse-PCR selanjutnya di sekuen dan disejajarkan untuk menentukan panjang amplikon yang dihasilkan. Data hasil sekuensing disajikan pada Lampiran 2 dan 3. Hasil pensejajaran sekuen menunjukkan bahwa enzim restriksi HinfI memotong pada nukleotida ke 694 ke arah downstream dan nukleotida ke 564 pada arah upstream. Hal ini tergambar dengan adanya daerah tumpang tindih (overlaping) pada urutan nuleotida tersebut. Dari hasil ini didapat panjang amplikon yang teramplifikasi secara keseluruhan yaitu sebesar 1664 pb. Analisis Asam Amino Menggunakan BLASTX Total amplikon sebesar 1664 pb selanjutnya dilakukan BLASTX dengan tujuan untuk menentukan homologi antara sekuen asam amino hasil penelitian dengan sekuen asam amino GenBank yang ada di situs NCBI. Hasil perbandingan sekuen asam amino menggunakan program BLASTX dapat dilihat pada Tabel 3 dan Lampiran 4 dan 5. Tabel 3 Analisis homologi menggunakan BLASTX No. Akses
AFH35005.1
ZP06710529.1 CCK28706.1
EHN73405.1
ZP06710529.1
Discription
Xylanase [bacterium enrich-ment culture clone Xyl8B8] Endo-1,4-beta-xylanase B [Streptomyces sp. e14] Endo-1,4-beta-xylanase B [Streptomyces davawensis JCM 4913] Endo-1,4-beta-xylanase [Streptomyces coelicoflavus ZG0656] Endo-1,4-beta-xylanase [Streptomyces sp. SirexAA-E]
Max Total Score Score
Q.C (%)
E. value
509
509
61
4e-175
Max Ident (%) 95
433
433
54
2e-145
81
423
423
54
2e-141
77
409
409
54
4e-136
77
423
423
54
2e-141
77
Keterangan : No. Akses = nomor akses;max score = nilai maksimal; Total Score = keseluruhan skor yang dibandingkan; Q.C = Quary Coverage; E. value = nilai kepercayaan; dan iden = identitas/ kesamaan;
20 Deduksi asam amino penyandi gen xylanase galur S. costaricanus 45I-3 dengan gen xilanase keluarga 11 lainnya ditunjukkan pada Gambar 4. Daerah yang ditandai dengan latar berwarna hitam menunjukkan kesamaan dari lima asam amino yang dibandingkan, daerah dengan latar abu-abu menunjukkan minimal ada 3 sekuen asam amino yang sama sedangkan huruf yang tidak memiliki latar menunjukkan sekuen asam amino yang berbeda sama sekali dengan sekuen asam amino lainnya. Sekuen asam amino yang digaris bawah menunjukkan tingkat kesamaan tinggi. S._c xyl_c xyl_B Xyl_Sd Xyl_Sc
S._c xyl_c xyl_B Xyl_Sd Xyl_Sc
S._c xyl_c xyl_B Xyl_Sd Xyl_Sc
S._c xyl_c xyl_B Xyl_Sd Xyl_Sc
S._c xyl_c xyl_B Xyl_Sd Xyl_Sc
S._c xyl_c xyl_B Xyl_Sd Xyl_Sc
MKI------- --GPLTSLFR GVCAVVLLAV GALTLPGAGI AGADTVITSN QTGTDNGYYY MKIRSRRERR PRGPLTSLFR GVCAVVLLAV GALTLPGAGI AGADTVITSN QTGTDNGYYY ---------- ---------- ------MLAL AVLAMPG--A ASADTVITSN QTGTNNGYYY AHADTVVTTN QTGTNNGYYY ARADTVVTTN QEGTNNGYYY
60 60 34 20 20
SFWTDGGGTV SFWTDGGGTV SFWTDGGGST SFWTDSQGTV SFWTDSQGTV
SMNLGSAGNY SMNLGSAGNY SMNLGSGGNY SMNLASGGSY SMNMGSGGQY
STNWSNTGNF STNWSNAGNF STSWTNSGNF STQWSNTGNF STSWRNTGNF
VAGKGWSNGG VAGKGWSNGG VAGKGWSTGG VAGKGWANGA VAGKGWANGG
RRSVTYSGTF RRSVTYSGTF RKAVTYSGSF RRTVTYSGTF RRTVQYSGTF
NPPGNAYLSL NPPGNAYLSL NPSGNAYLAL NPSGNAYLAL NPSGNAYLTL
120 120 94 80 80
YGWTSNPLVE YGWTSNPLVE YGWTTNPLVE YGWTANPLVE YGWTANPLVE
YYIVDNWGSY YYIVDNWGSY YYVVDNWGTY YYIVDNWGTY YYIVDNWGTY
RPTGTFKGTV RPTGTFKGTV RPTGTYKGTV RPTGTFKGTV RPTGEYKGTV
TSDGGTYDIY TSDGGTYDIY TSDGGTYDIY TTDGGTYDIY TSDGGTYDIY
ETTRTNAPSV ETTRTNAPSV ETTRVNAPSV KTTRYNAPSV KTTRVNKPSV
EGTKTFNQYW EGTKTFNQYW EGTRTFNQYW EGNKTFDQYW EGTRTFDQYW
180 180 154 140 140
SVRQFKRTGG SVRQSKRTGG SVRQSKRTGG SVRQSKRTGG SVRQSKRTGG
TITTGNHFDA TITTGNHFDA TITTGNHFDA TITTGNHFDA TITTGNHFDA
WAGHGMNLGS WAGHGMNLGS WASHGMNLGA WARAGMPLGS WARAGMPLGS
FNYYMILATE FNYYMIMATE FNYYMILATE FNYYMIMATE FNYYMIMATE
SYQSSGSSNI GYQSSGSSNI GYQSSGNSNI GYQSSGSSNI GYQSSGSSNI
TVGSSGSGGG TVGSSGSGGG TVSDGGSGGG TVGGTSGGGG NVGGTGGGGD
240 240 200 214 200
--GGGTGGGG --GGGTGGGTGGGGTGGGGGGGGTGCSA --DGGGDNG-
TGGGGTGGCT TGGGGTGGCT GGGTGTGGCT TGGGGTGGCT GGGGGTGGCT
ATVTAGQSWD ATVTAGQSWD ATLSAGQQWG ATLSAGQQWS ATLSAGQKWG
DRYNLNVSVS DRYNLNVSVS DRYNLNVSVS DRYNLNVSVT DRYNLNVSVS
GANNWTVTAN GANNWTVTAN GSSNWTVTMN GSSNWTVTMN GSDNWTVTMN
VPAPEKVLST VPAPEKVLST VPSPEKVLAT VPSPAKVLST VPSPAKVMST
300 300 274 260 260
WNVAASYPSA WNVAASYPSA WNVSASYPSA WNVSASYPSS WNINASYPSA
QVLTAKSNGS QVLTAKSNGS QVLSAKPNGS QVLTAKPNGS QTLTARSNGS
GNNWGLTVQK GNNWGLTVQK GNNWGVTIQT GNNWGVTIQH GNNWGATIQA
NGSTTWPTFS NGSTTWPTFS NGTWTWPTVT NGNYTWPTVS NGNWTWPSVS
CTAN CTAN CTAN CTA CTA
342 342 318
320 320
Gambar 4 Deduksi asam amino antara S.costaricanus 45I-3 terhadap sekuen asam amino pengkode xilanase pada 3 spesies lainnya. S._c = endoxilanase S. costaricanus 45I-3 (studi ini), xyl_c = Xylanase bacterium enrichment culture clone Xyl8B8 xyl_B = Endo-1,4-betaxylanase B Streptomyces sp. e14, Xyl_Sd = Endo-1,4-beta-xylanase Streptomyces davawensis JCM 4913, dan Xyl_Sd = Endo Streptomyces coelicoflavus.
21 Xilanase S. costaricanus 45I-3 Streptomyces costaricanus 45I-3
100
xylanase bacterium enrichment culture clone Xyl8B8
33
endo-14-beta-xylanase B Streptomyces sp. e14 endo-14-beta-xylanase Streptomyces sp. SirexAA-E
80
endo-14-beta-xylanase B Streptomyces griseoaurantiacus M045 xylanase II Streptomyces thermoviolaceus
49
100 xylanase B precursor Streptomyces thermocyaneoviolaceus
endo-14-beta-D-xylanase precursor Streptomyces sp. THW31 4-xylanase Streptomyces coelicoflavus ZG0656
65 100
endo-beta-14-xylanase Streptomyces sp. SWU10 Endo-14-beta-xylanase
85 100
endo-14-beta-xylanase B Streptomyces coelicolor A3(2)
59 endo-14-beta-xylanase B Streptomyces lividans TK24
0.02
Gambar 5 Filogenetik berdasarkan sekuen asam amino yang dibandingkan dengan beberapa galur Streptomyces penghasil endoxilanase famili 11 dengan metode NJ dan Bootstrap 1000x. Xilanase isolat S. costaricanus 45I-3 ditunjukkan dengan tanda panah. Analisis Struktur Gen Hasil analisis Basic Local Alignment Tools X (BLASTX) memberikan informasi bahwa fragmen gen sekitar 1664 pb yang diperoleh dari hasil penggabungan sekuen yang ditemukan dari penelitian ini dan sekuen 408 pb, mengekspresikan protein Glyco_hydro dan dan Glyoxalase. Untuk mengetahui lebih lanjut tentang kedua gen ini, maka dilakukan analisis ORF Finder. Hasil analisis ORF akan memberikan informasi ada tidaknya kodon awal (ATG) dan kodon akhir (TAA/TAG/TGA). Hasil analisis ORF menunjukkan ada 2 ORF yaitu Glyco_hydro_11 Superfamily dari nukleotida urutan 316 sampai dengan 1344 (Gambar 6). ORF ini telah lengkap karena memiliki start kodon dan stop kodon. ORF lainnya ditemukan pada nukleotida ke 1355 sampai dengan 1663 (Gambar 7), kodon ini hanya memiliki stop kodon namun belum ada start kodon.
22
Gambar 6 Hasil analisis open reading frame (ORF) untuk glyco_hydro_11 Superfamily.
Gambar 7 Hasil analisis open reading frame (ORF) untuk Glyo_EDI_BRP_Like Superfamily Berdasarkan hasil analisis ORF Finder diketahui bahwa protein Glyco_Hidro 11 dan Gly_BRP tidak pada operon yang sama, ditandai dengan adanya kodon akhir dengan posisi yang berlawanan. Karena ada dua ORF dengan operon yang berbeda, perlu diketahui RBS atau Shine Delgarno, dan promoter untuk masing-masing operon. Hasil analisis promoter menunjukkan bahwa arah transkripsi ke dua gen ini berlawanan (Gambar 8).
23 P RBS
1 bp
Gly_Hydro 11 ORF 1 (1029 bp)
Glyoxalase ORF2 (309pb)
1664 bp
agtcaccatgagggtgactgtagcggcgagggtctgacaatggctccccatgggctccgaaac tttcgaaagggccccaccccctctggatcttgctctctccgccgcctcgaataagtctgtgac gttcgcacaagatggcgtctcaccagcatgcaaatcccttgagtgcatgggactttgatgacc atttcgaaataactaccgaaactattgactgcctttgtgtacatcgcctcaacactgatgcac -35 promoter -10 cccgcgcagcgcgtcgctccaccctcatccggctccatcgatccatgaggaggaagcacgtcc
Kodon awal
T
RBS
ATGAAGATCCGCAGCCGAAGAGAACGCCGCCCCCGGGGACCTCTCACCTCGCTCTTCCGAGGTGTC 1 M K I R S R R E R R P R G P L T S L F R G V TGTGCCGTTGTTCTGCTCGCCGTCGGGGCGCTGACCCTGCCCGGCGCCGGGATCGCCGGCGCCGAC C A V V L L A V G A L T L P G A G I A G A D ACGGTCATCACCTCGAACCAGACCGGTACCGACAACGGGTACTACTACTCGTTCTGGACCGACGGC T V I T S N Q T G T D N G Y Y Y S F W T D G GGTGGCACCGTCTCCATGAACCTGGGGTCCGCAGGCAACTACAGCACCAACTGGAGCAACGCCGGC G G T V S M N L G S A G N Y S T N W S N A G AACTTCGTGGCCGGCAAGGGCTGGAGCAACGGCGGGCGCCGCAGCGTGACCTACTCCGGCACTTTC N F V A G K G W S N G G R R S V T Y S G T F AACCCGCCCGGCAACGCGTATCTGTCGCTGTACGGCTGGACCTCGAACCCGCTGGTCGAGTACTAC N P P G N A Y L S L Y G W T S N P L V E Y Y ATCGTCGACAACTGGGGCAGCTACCGGCCCACCGGCACCTTCAAGGGCACGGTCACCAGTGACGGC I V D N W G S Y R P T G T F K G T V T S D G GGGACGTACGACATCTACGAGACGACCCGGACCAACGCCCCGTCGGTGGAGGGCACCAAGACCTTC G T Y D I Y E T T R T N A P S V E G T K T F AACCAGTACTGGAGCGTGCGGCAGTTCAAGCGGACCGGCGGCACCATCACCACCGGCAACCACTTC N Q Y W S V R Q F K R T G G T I T T G N H F GACGCCTGGGCCGGCCACGGGATGAACCTGGGCAGCTTCAACTACTACATGATCATGGCGACCGAG D A W A G H G M N L G S F N Y Y M I M A T E AGCTACCAGAGCAGCGGCAGCTCCAACATCACCGTGGGCAGCTCCGGTTCGGGCGGCGGTGGTGGC S Y Q S S G S S N I T V G S S G S G G G G G GGCACGGGTGGCGGCGGAACCGGCGGCGGTGGCACCGGCGGCTGCACGGCGACCGTGACCGCGGGC G T G G G G T G G G G T G G C T A T V T A G CAGTCCTGGGACGACCGGTACAACCTGAACGTCTCGGTCAGCGGGGCGAACAACTGGACGGTGACC Q S W D D R Y N L N V S V S G A N N W T V T GCGAACGTCCCGGCCCCGGAGAAGGTCCTGTCGACCTGGAACGTGGCCGCGAGCTATCCCAGTGCC A N V P A P E K V L S T W N V A A S Y P S A CAGGTGCTGACCGCCAAGTCCAACGGCAGCGGCAACAACTGGGGTCTGACCGTGCAGAAGAACGGC Q V L T A K S N G S G N N W G L T V Q K N G
Kodon Akhir
I
381 22 447 44 513 579 88 645 110 711 132 777 154 843 176 909 198 975 220 1041 242 1107 264 1173 286 1239 308 1305 330
Kodon Akhir
TCCACCACCTGGCCGACGTTCAGCTGCACGGCCAACTGAggccgaagcCTAGGCCCTGACGACG 1370 S T T W P T F S C T A N * * A L T T 342/5 ATCTGCTTCCCGCACGGAGCCCCGGACCTCCTCGTGAGGTGGCGCAAGGAGGGCCCGCAGTTCGAG 1436 C F P H G A P DL L V R W R K E G P Q F E 27 CCGAAGACCGCCGGCCTGGGACTCCTCCGGCGGGAGGCCGCCGACCTGGACGACGTGGGCCTGGAG 1502 P K T A G L G L L R R E A A D L D D V G L E 49 ATCCATGCCCAGAAGGGCCAGGCCCCCGACCCGTGGACCCCCCCGCGCTACGACGCCGTCCGGACC 1568 I H A Q K G Q A P D P W T P P R Y D A V R T 71 TTCGGCCTCGGCCCCACCGGCGAGACCGGCCTCCTGGTCTTCGACGACACCGCCTTCCTCGCCCGC 1634 F G L G P T G E T G L L V F D D T A F L A R 93 TACGGTCTCCTGGAGGGCTACTTCAGCGCC 1664 Y G L L E G Y F S A 104
Gambar 8
Skema hasil penggabungan ORF Gly-Hydro (GH11) dan Glyoxalase dengan arah berlawanan. RBS terdapat pada basa ke 7 arah upstream (hulu) dari kodon awal. Promoter terdapat pada nukleotida ke 225 sampai dengan 232 diapit oleh daerah -35 dan -10. P: promoter.
24 Analisis Domain, Situs Aktif dan Struktur 3 Dimensi Hasil analisis domain menggunakan program Conserved Domains Database (CDD) yang tersedia di situs NCBI menunjukkan bahwa fragmen gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3 memiliki dua domain yaitu kelompok glikosil hidrolase famili 11 (GH11) dan pada bagian ujung fragmen terdapat domain carbohydrate binding module type 2 (CBM2) yang merupakan daerah pengikatan substrat xilan atau selulosa. Berdasarkan analisis menggunakan scan prosite situs aktif enzim ini terdapat pada asam mino ke-130 (Gambar 9).
MKIRSRRERRPRGPLTSLFRGVCAVVLLAVGALTLPGAGIAGADTVITSNQTGTDNGYYYSFW TDGGGTVSMNLGSAGNYSTNWSNAGNFVAGKGWSNGGRRSVTYSGTFNPPGNAYLSLYGW TSNPLVEYYIVDNWGSYRPTGTFKGTVTSDGGTYDIYETTRTNAPSVEGTKTFNQYWSVRQFK RTGGTITTGNHFDAWAGHGMNLGSFNYYMIMATESYQSSGSSNITVGSSGSGGGGGGTGGG GTGGGGTGGCTATVTAGQSWDDRYNLNVSVSGANNWTVTANVPAPEKVLSTWNVAASYPS AQVLTAKSNGSGNNWGLTVQKNGSTTWPTFSCTAN
Gambar 9
Analisis domain menggunakan program Scan Prosite. Huruf berwarna merah menunjukkan posisi situs aktif (active site) domain Glyco_Hydrolase 11 (GH11). Huruf dengan latar kuning menunjukkan asam amino penyusun domain CBM2. Situs aktif terdapat pada asam amino ke-130.
25
(a)
(b)
(a)
(b)
Gambar 10 Prediksi struktur tiga dimensi enzim endoxilanase S. costaricanus 45I-3 menggunakan program Cn3D. (a) domain glikosil hidrolase famili 11, (b) domain CBM2. Hasil visualisasi struktur 3 dimensi fragmen endoxilanase 11 menggunakan program Cn3D menunjukkan bahwa fragmen ini memiliki bentuk seperti tangan kanan yang tertutup, dimana bentuk ini merupakan ciri umum dari endoxilanase famili 11. Lipatan domain katalitik terbagi menjadi dua lembar β (A dan B) merupakan helai antiparalel β dan satu helix alpha pendek yang menyerupai tangan kanan tertutup. Loop antara helai B7dan B8 membentuk 'thumb' dan loop yang menghubungkan helai B6 dan B9 ialah 'cord'. Gambar 10b menunjukkan struktur 3D dari domain Carbohydrate Binding module keluarga 2 (CBM2). CBM2 terbagi atas CBM2a dan CBM2b. CBM2 yang ditemukan pada penelitin ini merupakan CBM2a yang spesifik mengikat substrat yang berupa selulosa. CBM keluarga 2a memiliki permukaan yang bersifat hidrofobik terdiri dari tiga residu triptofan, yang diperlukan untuk mengikat selulosa. CBM 2a membentuk struktur β-sheet yang luas dengan lipat βbarrel. Analisis Berat Molekul dan Titik Isoelektrik Berat molekul (BM) merupakan massa molekul relatif yang dimiliki oleh enzim xilanase GH11, sedangkan titik isoelektrik (pI) adalah derajat keasaman atau pH ketika suatu makromolekul bermuatan nol akibat bertambahnya proton atau kehilangan muatan oleh reaksi asam-basa. Penghitungan berat molekul dan
26 titik isoelektrik
dilakukan dengan cara menginput data asam amino yang
menyusun domain GH11 ke situs (http://web.expasy.org/compute_pi/). Compute pI/Mw Theoretical pI/Mw (average) for the user-entered sequence: 10 MKIRSRRERR
20 PRGPLTSLFR
30 GVCAVVLLAV
40 GALTLPGAGI
50 AGADTVITSN
60 QTGTDNGYYY
70 SFWTDGGGTV
80 SMNLGSAGNY
90 STNWSNAGNF
100 VAGKGWSNGG
110 RRSVTYSGTF
120 NPPGNAYLSL
130 YGWTSNPLVE
140 YYIVDNWGSY
150 RPTGTFKGTV
160 TSDGGTYDIY
170 ETTRTNAPSV
180 EGTKTFNQYW
190 SVRQFKRTGG
200 TITTGNHFDA
210 WAGHGMNLGS
220 FNYYMIMATE
230 SYQSSGSSNI
240 TVGSSGSGGG
250 GGGTGGGGTG
260 GGGTGGCTAT
270 VTAGQSWDDR
280 YNLNVSVSGA
290 NNWTVTANVP
300 APEKVLSTWN
310 320 330 VAASYPSAQV LTAKSNGSGN NWGLTVQKNG STTWPTFSCT AN
340
Theoretical pI/Mw: 9.26 / 35.67495
Gambar 11 Hasil Input data analisis berat molekul (BM) dan nilai titik isoelektrik (pI) Untuk GH11. Dari hasil analisis diketahui bahwa enzim endoxilanase keluarga 11 (GH11) dari S. costaricanus 45I-3 memiliki berat molekul sebesar 35.67 kDa dengan nilai isolektrik 9.26 A.
PEMBAHASAN Amplifikasi
gen
penyandi
enzim
xilanase
ekstraselular
pada
Streptomyces costaricanus 45I-3 menggunakan dua pendekatan yang berbeda, yaitu dengan pendekatan PCR menggunakan primer forward dan primer reverse dan metode Inverse-PCR menggunakan primer dengan perpanjangan ke arah luar parsial
gen
endoxilanase
yang
telah
dilaporkan
Aziz
(2010).
Untuk
mengamplifikasi gen menggunakan pendekatan PCR, sebanyak 9 pasang primer berhasil dirancang berdasarkan gen endoxilanase Streptomyces yang tersedia di GenBank. Namun amplifikasi menggunakan 9 pasang primer tesebut tidak ada yang menghasilkan pita target yang sesuai dengan prakiraan panjang amplikon pada setiap pasang primer. Sembilan
kombinasi
primer
tidak
berhasil
mengamplifikasi
gen
endoxilanase S. costaricanus 45I-3 mungkin disebabkan karena primer yang disusun tidak cocok sehingga tidak menempel pada target yaitu gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3. Ketidakcocokan ini karena adanya perbedaan nukleotida primer dengan gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3. Primer dapat bekerja dengan baik apabila sekuen nukleotida primer cocok dengan lokasi gen target yang akan saling berkomplemen (Hillis et al. 1996). Daerah yang digunakan sebagai cetakan adalah daerah yang conserve dari gen target yang akan mendukung kecocokan dari primer (Birt & Baker 2000). Kemungkinan yang lain adalah perbedaan suhu penempelan primer yang berbeda jauh antara primer forward dan reverse serta adanya struktur hairpin dan dimer. Penentuan suhu penempelan primer adalah langkah yang paling penting di dalam proses PCR (Koressaar & Remm 2007). Struktur sekunder pada primer dapat menyebabkan masalah selama proses PCR, sehingga perlu dihindari sekuen yang saling berkomplemen di dalam primer (hairpin) atau sekuen yang saling berkomplemen antara primer forward dan reverse (primer-dimer) itu sendiri (Newton & Graham 1997; McDowell 1999; Birt 2000; Rapley 2000). Kesulitan dalam mengamplifikasi gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3 menggunakan pendekatan PCR disebabkan karena banyaknya sekuen nukleotida yang tidak lestari terutama pada bagian hulu gen endoxilanase kelompok
28 Streptomyces. Dengan banyaknya perbedaan sekuen nukleotida yang berbeda maka dapat terjadi kegagalan primer menempel pada cetakan yang sesuai. Adanya sekuen nukleotida yang cukup beragam pada daerah hulu gen endoxilanase mengindikasikan bahwa gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3 memiliki sekuen yang berbeda dengan sekuen gen endoxilase bakteri lain. Kegagalan mengamplifikasi gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3 menggunakan metode PCR mendorong dilakukan pendekatan dengan metode Inverse-PCR (i-PCR). Metode i-PCR secara prinsip hampir sama dengan metode PCR biasa, namun perbedaan mendasar terdapat pada pola amplifikasi gen yang mengarah keluar gen. Amplifikasi dengan i-PCR menggunakan tiga pasang primer yang berbeda (Lampiran 1). Dari ketiga pasang primer tersebut hanya satu diantaranya (Sc-F1 & Sc-R1) yang menghasilkan pita target dengan ukuran 1500 pb. Produk i-PCR selanjutnya di sekuen dan disejajarkan untuk menentukan panjang amplikon yang dihasilkan. Hasil pensejajaran menunjukkan bahwa enzim restriksi HinfI memotong sekuen nukleotida ke 694 ke arah hilir parsial gen (Aziz 2010) dan nukleotida ke 562 pada arah hulu parsial gen. Hal ini tergambar dengan adanya daerah tumpang tindih (overlaping) pada urutan nuleotida tersebut. Dari hasil ini didapat panjang amplikon yang teramplifikasi secara keseluruhan yaitu sebesar 1664 pb. Tingkat kemiripan antara sekuen asam amino domain endoxilanase S. costaricanus 45I-3 dibandingkan dengan sekuen asam amino yang ada di NCBI paling tinggi terhadap xylanase bacterium enrichment culture clone Xyl8B8 yaitu dengan kemiripan (identitas) sebesar 95%, terhadap endo-1,4-beta-xylanase B Streptomyces sp. e14 dengan kemiripan sebesar 81%. Terhadap gen endo-1,4beta-xylanase tiga isolat lainnya, yaitu
Streptomyces davawensis JCM 4913,
Streptomyces
dan
coelicoflavus
ZG0656,
Streptomyces
sp.
SirexAA-E
menunjukkan kemiripan sebesar 77%. Semakin tinggi nilai kemiripan menunjukkan bahwa sekuen gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3 semakin tepat. Dua fragmen DNA dikatakan homolog jika 70% sekuen basa atau 25% sekuen asam amino identik (panjang sekuen minimal 100 pasang basa) (Claviere & Notredame 2003).
29 Nilai probabilitas atau peluang yang terhitung secara statistik dalam kesamaan sekuen antara gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3 di GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) digambarkan dengan nilai Expectation value (E-value). Tabel 4 menujukkan bahwa nilai E.value terkecil pada gen xyalanase bacterium enrichment culture clone Xyl8B8 yaitu 4e-175, berikutnya endo-1,4-beta-xylanase B Streptomyces sp. e14 sebesar 2e-145 dan berturut-turut 2e-134, 4e-136, dan 2e141 pada endo-1,4-beta-xylanase dari Streptomyces davawensis JCM 4913, Streptomyces coelicoflavus ZG0656, dan Streptomyces sp. SirexAA-E. Hasil BLASTP asam amino penyandi gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3 ini bersifat signifikan. Pada analisis melalui BLAST, E-value signifikan apabila nilainya 1x10-10 atau lebih kecil (Altschul et al. 1990). Gen penyandi xylanase pada bacterium enrichment culture clone Xyl8B8 berhasil diamplifikasi oleh Christel et al. (2012). Isolat bacterium enrichment culture clone Xyl8B8 merupakan bakteri Gram-positif yang diisolasi dari usus rayap (Reticulitermes santonensis). Lebih lanjut dijelaskan bahwa dari 5 ORF lengkap yang berhasil diisolasi salah satunya ialah gen endo-1,4-beta-xilanase yang dikodekan oleh 340 asam amino (XylB8) dan merupakan anggota keluarga glikosil hidrolase 11 (GH11). Deduksi asam amino menunjukkan bahwa gen gen xilanase keluarga 11 memiliki daerah yang sangat lestari di bagian tengah-tengah gen (sekuen yang ditandai dengan garis bawah pada Gambar 4. Berbeda dengan sekuen asam amino penyusun bagian hulu gen (asam amino 1 sampai dengan 40) dari kelima sekuen gen yang dibandingkan hanya 1 sekuen yang memiliki kesamaan dengan sekuen asam amino gen GH11 S. costaricanus 45I-3 yaitu dengan gen xilanase dari bacterium enrichment culture clone Xyl8B8 yang ditemukan oleh Cristel et al. (2012). Untuk bagian hilir gen daerah yang tidak lestari ditemukan pada asam amino 240-252 (asam amino S. c sebagai patokan) yang ditandai dengan cukup beragamnya sekuen asam amino penyusun gen xilanase pada daerah tersebut. Dari kelima sekuen asam amino yang dibandingkan (Gambar 4) terlihat bahwa hanya tiga diantaranya yang memiliki asam amino N terminal. Hal ini karena asam amino terakhir penyusun gen xilanase pada Streptomyces davawensis JCM 4913 (Jankowitsch et al. 2012) dan Streptomyces coelicoflavus adalah asam amino serin
30 (s). Ini artinya kemungkinan amplifikasi gen xilanase pada kedua bakteri ini masih parsial ialah belum memiliki stop kodon pada kerangka baca (ORF). Analisis open reading frame (ORF) menunjukkan ada ORF dari urutan nukleotida 316 sampai dengan 1344. Urutan tersebut membawa kodon awal (ATG) pada posisi 316, sedangkan kodon akhir (TGA) pada posisi 1344. ORF tersebut telah lengkap karena memiliki kodon awal dan kodon akhir. ORF mempunyai 342 asam amino. Setelah dilakukan BLASTP, ORF ini diduga mengekspresikan protein Glyco_hydro 11 yang merupakan keluarga glikosil hidrolase 11 (GH11). Salah satu enzim yang termasuk ke dalam keluarga GH11 adalah endo-1,4-beta-xilanase (Christel et al. 2012). Analisis ORF menunjukkan bahwa ada ORF lainnya dari urutan nukleotida 1355 sampai dengan 1663. ORF ini membawa kodon akhir (TAG) pada posisi 1355 tetapi belum ada kodon awal. ORF memiliki 102 asam amino. Hasil BLASTP menunjukkan bahwa ORF ini mengekspresikan glyoxalase/bleomycin resistance protein (Gly_BRP). Berdasarkan hasil analisis ORF Finder diketahui bahwa protein Glyco_Hidro 11 dan Gly_BRP tidak pada operon yang sama, ditandai dengan adanya kodon akhir dengan posisi yang berlawanan. Karena ada dua ORF dengan operon yang berbeda, oleh sebab itu perlu diketahui RBS atau Shine Delgarno, dan promoter untuk masing-masing operon (Tang 1991, Baldini et al. 1999). Hasil analisis promoter (Lampiran 6) menunjukkan bahwa arah transkripsi ke dua gen ini berlawanan (Gambar 8). Gen penyandi endoxilanase mengkodekan protein enzim yang memiliki peranan penting dalam menghidrolisis xilan secara sempurna menjadi xilosa (Esteves et al. 2004). Enzim ini dapat dihasilkan oleh beberapa organisme seperti bakteri, alga, jamur dan aktinomisetes (Beg et al. 2001). Berdasarkan hasil beberapa penelitian, panjang ORF gen endoxilanase pada bakteri berbeda-beda. Pada bacterium enrichment culture clone Xyl8B8, gen endoxilanase tersusun atas 1025 pb nukleotida (Christelet al. 2012), pada Streptomyces sp.9 tersusun atas 1023 pb nukleotida (Li et al. 2008). Penelitian yang dilakukan Deesukon et al. (2011) menemukan bahwa nukleotida penyusun gen endoxilanase pada bakteri Streptomyces sp. SWU10 tersusun atas 1011 pb.
31 Berdasarkan analisis menggunakan scan prosite situs aktif enzim ini terdapat pada asam mino ke-130 (Gambar 9). Dalam struktur enzim dapat ditemukan satu atau lebih situs pengikatan substrat (situs aktif). Molekul (substrat) berupa xilan akan melekat pada situs aktif untuk membentuk kompleks enzim-substrat dan menghasilkan pembentukan ikatan atau perusakan dengan pelepasan satu atau beberapa produk. Proses reaksi terjadi pada tingkat lebih cepat untuk menghambat aktivasi enzim yang lebih rendah dengan menurunkan energi aktivasi. Tanpa aktivitas enzim reaksi sel akan terlalu lambat untuk mempertahankan hidup. Menurut hipotesis “lock dan key" bentuk sebuah situs aktif hanya cocok satu bentuk substrat. Kekhususan ini mencegah reaksi acak serta pengendalian terhadap ketidak spesifikan substrat. Endoxilanase famili 11 merupakan salah satu famili glikosil hidrolase dengan Glutamat (Glu) sebagai basa nukleofil maupun donor protonnya. Topologi enzim ini berupa lipatan pita β yang saling tumpuk (Christel et al. 2012). Törrönen dan Rouvinen (1997) mengemukakan bahwa untuk menjadi enzim yang aktif, endoxilanase famili 11 secara keseluruhan harus memiliki 19 area yang terdiri atas N, B1, B2, A2, A3, B3, A5, B5, B6, Cord, B9, B8, Thumb, B7, A6, Helik, B4, A4 dan C terminal. Berdasarkan hasil visualisasi Cn3D yang telihat (Gambar 10), ke-19 area tersebut telah berhasil teramplifikasi sehingga enzim ini dapat untuk diekspresikan menjadi enzim fungsional. Struktur tiga dimensi dari endoxilanase famili11 telah ditentukan pada beberapa enzim, baik dari bakteri maupun jamur. Lipatan domain katalitik terbagi menjadi dua lembar β (A dan B) merupakan helai antiparalel β dan satu helix alpha pendek yang menyerupai tangan kanan tertutup. Loop antara helai B7dan B8 membentuk 'thumb' dan loop yang menghubungkan helai B6 dan B9 ialah 'cord'. Dua residu asam glutamat telah ditemukan masing-masing pada helai B4 dan B6 dan merupakan katalis penting dalam aktivasi enzim xilanase ekstraselular (Törrönen & Rouvinen1997). Analisis domain menunjukkan bahwa fragmen gen glikosil hidrolase yang berhasil diamplifikasi memiliki dua domain yaitu glikosil hidrolase famili 11 (GH11) dan pada bagian ujung fragmen terdapat domain carbohydrate binding type 2 (CBM2) yang merupakan daerah pengikatan substrat xilan dan selulosa
32 tergantung pada jenis CBM2. CBM2 terbagi atas CBM2a dan CBM2b. CBM2 yang ditemukan pada penelitin ini merupakan CBM2a yang spesifik mengikat substrat yang berupa selulosa. Seperti domain CBM lainnya domain CBM2 berisi struktur β-sheet yang berinteraksi dengan ligan melalui strip hidrofobik residu aromatik. CBM keluarga 2a memiliki permukaan yang bersifat hidrofobik terdiri dari tiga residu triptofan, yang diperlukan untuk mengikat selulosa, sedangkan CBM keluarga 2b hanya memiliki 2 tryptopan yang saling berbeda orientasi. CBM 2a membentuk struktur β-sheet yang luas dengan lipat β-barrel. Titrasi dengan cellohexaose, [beta-D-glucopyranosyl-(1,4)] 5-D-glukosa, menunjukkan bahwa Trp 54 dan 72 berperan dalam mengikat selulosa (Xu GY et al. 1995). Salah satu kegunaan CBM ialah untuk meningkatkan konsentrasi enzim pada permukaan substrat (Arantes & Saddler 2010; Shoseyov et al. 2006). Lokasi CBM dalam Conserved Domain dapat ditemukan pada bagian N-terminal atau pada C-terminal, yang terhubung ke CD dengan urutan linker dengan berbagai ukuran. Umumnya kaya akan asam amino serin atau treonin (Gilbert & Hazlewood 1993). Berdasarkan hasil analisis Berat molekul dan titik isoelektrik diketahui bahwa enzim endoxilanase keluarga 11 (GH11) dari S. costaricanus 45I-3 memiliki berat molekul sebesar 35.67 kDa dengan nilai isolektrik 9.26 A. Hasil ini sesuai dengan yang dikemukakan oleh Wang et al. (1997) enzim endoxilanase dikelompokkan ke dalam glikosida hidrolase famili 10 dan 11 (disebut juga famili F dan famili G) berdasarkan komponen psikokimianya yang meliputi berat molekul dan titik isoelektrik. Famili 10 merupakan kelompok endoxilanase dengan massa molekul yang relatif tinggi (>40 kDa) denga nilai pH yang rendah (asam). Sebaliknya famili 11 merupakan kelompok endoxilanase yang relatif rendah (<40 kDa) dan nilai pH tinggi (basa). Nilai BM dan pI protein enzim xilanase keluarga 11 pada S. costaricanus 45I-3 ini hampir sama dengan protein enzim xilanase pada bacterium enrichment culture clone Xyl8B8 yang dilaporkan oleh Cristel et al. (2012) yaitu dengan berat molekul sebesar 35.4 kDa dan pI sebesar 9.2 A. Hasil pediksi BM menggunakan situs (http://web.expasy.org/compute_pi/) ini tidak terlalu jauh berbeda dengan salah satu nilai BM isolat Streptomyces sp. 45I-3 yang dilaporkan oleh
33 Meryandini et al. (2007), yang lebih lanjut menyatakan bahwa pemurnian enzim xilanase dari Streptomyces sp. 45I-3 menggunakan polimer anionik Eudragit S100 diperoleh 2 pita protein enzim yang saling berdekatan dengan berat molekul masing-masing 39.2 kDa dan 43.2 kDa.
35
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Amplifikasi DNA dengan inverse PCR menghasilkan amplikon 1664 pb, mengandung 2 open reading frame (ORF). ORF 1 terdiri atas 1029 bp dan ORF2 (partsial sekuen) dengan 309 pb. Analisis BlastX maupun BlastN menunjukkan ORF1 homologi dengan xilanase (glycosil hidrolase 11) bacterium enrichment culture clone Xyl8B8 yang memiliki identitas 95% dan kesamaan 99%. ORF2 homolog dengan glyoxalase bacterium enrichment culture clone Xyl8B8 dengan identitas 95% dan kesamaan 98%. Kedua gen ini ditranskrip pada arah yang berlawanan. Gen GH11 memiliki putative (dugaan) promotor dan RBS yang menjadi tempat penempelan pada ribosom sebelum terjadinya proses translasi di bagian hulu dari kodon awal (ATG). Gen GH11 juga memiliki situs aktif pada asam amino ke-130 dan pada bagian akhir fragmen terdapat domain Carbohyrate Binding Module keluarga 2 (CBM2) yang secara spesifik merupakan daerah pengikatan substrat selulosa. Enzim xilanase keluarga 11 (GH11) dari S. costaricanus 45I-3
memeiliki berat molekul sebesar 35.67 kDa dan nilai
isoelektrik sebesar 9.26A.
Saran Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk melihat kemampuan ekspresi gen GH11 (endoxilanase) menjadi enzim xilanase ekstraseluler yang dapat diaplikasikan dalam bidang industri.
37
DAFTAR PUSTAKA Altschul SF, Gish W, Myers EW, Lipman DJ. 1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215:403-410. Arantes V, Saddler JN. 2010. Access to cellulose limits the efficiency of enzymatic hydrolysis: the role of amorphogenesis. Biotechnology for Biofuels 4:1754-1768 Aziz S. 2010. Isolasi fragmen gen penyandi endoxilanase Streptomyces costaricanus 45I-3 melalui pendekatan PCR [tesis]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Baldini RL, Tahara ST, Rosato YB. 1999. A rolling circle miniplasmid on Xhanthomonas campestris pv campestris. the nucleotida sequence and its use as a cloning vector. Plasmid 42:126-133. Beg QK, Kapoor M, Mahajan L, Hoondal GS. 2001. Microbial xylanase and their industrial application. Appl Microbiol Biotechnol 56:326-338. Biely P, Vrsanska M, Tenkanen M, Kluepfel D. 1997. Endo-b-xylanases families: differences in catalytic properties. J Biotechnol 57:151-160. Birt TP, Baker AJ, Baker AJ. 2000. Molecular Methods in Ecology. London: Blackwell Science Ltd. Cheng HL, Wang PI, Chen YC. 2008. Cloning, characterization and phylogenetic relationships of stxI, and endoxylanase-encoding gen from Streptomyces thermonitrificans. Biores Technol 99:227-231. Christel M et al. 2012. Identification and characterization of a new xylanase from Gram-positive bacteria isolated from termite gut (Reticulitermes santonensis). Prot Expres Purif 83:117-127. Claviere JM, Notredame J. 2003. Bioinformatics for Dummies. Indianapolis: Willey Publishing Inc. Collins T, Gardy C, Feller G. 2005. Xylanase, xylanase families and extremophilic xylanase. FEMS Microbiol Rev 29:3-23. Deesukon W, Yuichi N, Naoki H, Tatsuji S, Wasana S. 2011. Purification, characterization and gene cloning of two forms of a thermostableendoxylanase from Streptomyces sp. SWU10. Proc Biochem 46:2255–2262.
38 Esteves FD, Reulle V, Lamotte BJ. 2004. Acidophilic adaption of family 11 endoβ-1,4-xilanase: Modeling and mutational analysis. Prot Sci 13:1209-1218. Falquet R, Catherine B, Cédric T. 2002. PROSITE database, its status in 2002. Nucl Acid Res 30:235-238. Gilbert HJ, Hazlewood GP. 1993. Bacterial cellulases and xylanases. Journal of General Microbiology 139:187-194. Helianti I, Nurhayati N, Ulfah M, Wahyuntari B, Setyahadi S. 2010.Constitutive high level expression of an endoxylanase gene from the newly isolated Bacillus subtilis AQ1 in Escherichia coli. J Biomed Biotechnol 2010:1-12. Hendarwin, T. 2006. Keragaman karakter xilanase dari tiga isolat Streptomyces asal Indonesia [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Hillis DM, Moritz C, Mable BK. 1996. Molecular Systematics. Ed ke-2. Sunderland: Sinauer Associates Inc. Howard RL, Abotsi E, Jansen V, Rensburg EL, Howard S. 2003. Lignocellulose biotecnhology: issue of bioconversion and enzyme production. Afr Biotechnol 2:602-619. Jankowitsch et al. 2012. The genome sequence of the bacterium Streptomyces davawensis JCM and heterologous production of the unique antibiotic. J Bacteriol 176:1467-1475. Koressaar T, Remm M. 2007. Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics 23:1289-1291. Kulkarni N, Shendye A, Rao M. 1999. Molecular and biotechnological aspects of xilanases. FEMS Microbiol Rev 23:411-418. Li Ning et al. 2008. Cloning, expression, and characterization of a news xylanase with broad temperature adaptability from Streptomyces sp. S9. Appl Microbiol Biotechnol 80:231–240. Li YK, You HJ, Pan H. 2000. Mechanistic study of β-xylosidase from Trichoderma koningii G-39. J Biochem 127:315-320. Martin VJ, Mohn WW. 1999. An alternative inverse PCR (IPCR) method to amplify DNA sequences flanking Tn5 transposon insertion. J Microbiol Methods 35:163-166.
39 McDowell D, Saunders, Parkes. 1999. Analytical Molecular Biology Quality and Validation. Cambridge: Royal Society of Chemistry. Meryandini A, Safrudin D, Prihandono PA, Akhdiya A, Hendarwin T. 2007. Characterization of Streptomyces sp. 45I-3 xylanase. Biotropia 14:32-42. Nareswari A. 2007. Enzim xilanase Bacillus lichinoformis AQ1: Pemekatan, Studi termostabilitas, dan zimogram [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika Dan ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Newton CM, Graham A. 1997. PCR. Ed ke-2. New York: Bios Scientific Pub. Paul EA, Chlark FE. 1996. Soil Microbiology and Biochemestry. Ed ke-2. San Diego: Academic Press. Perez J, Munoz DJ, Rubia TDL, Martinez J. 2002. Biodegradation and Biological treatment of cellulose, hemicellulose and lignin: an overview. Int Microbiol 5:53-63. Puspaningsih NTT. 2004. Purifikasi dan karakterisasi xilanase ekstraseluler Streptomyces sp. 45I-3 asal Kalimantan [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Rapley R, Walker JM, Rapley R. 2002. Molecular Biology and Biotechnology. Ed ke-4. Cambridge: Royal Society of Chemistry. Rawashdeh R, Saadoun I, Mahasneh A. 2005. Effect of cultural condition on xylanase production by Streptomyces sp (strain 1b 24D) and its potensial to utilize Tomato Pomace. Biotechnology 4:251-255. Saha BC. 2003. Hemicellulose bioconversion. J Microbiol Biotechnol 30:279-291 Sapag A, et al. 2002. The endoxylanases from family 11: computer analysis of protein sequences reveals important structural and phylogenetic relationships. J Biotechnol (In Press). Satria H. 2008. Kloning gen xilanase termozim dari Streptomyces costaricanus 45I-3 [tesis]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Shoseyov O, Shani Z, Levy I. 2006. Carbohydrate binding modules: biochemical properties and novel applications. Microbiol Mol Biol Rev 2: 283–295. Subramiyan S, Prema S. 2002. Biotechnology of microbial xylanases: enzymology, molecular biology and aplication. Critical Rev Biotechnol 22:33-64
40 Sunna A, Antranikian G. 1997. Characterization of the xilanase from the new isolated thermophilic xylan-degrading Bacillus thermoleovaransgalur K3d and Bacillus flavothermus galur LB3A. FEMS Microbial Lett 148:209216. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol 153:311320. Tang J. 1991. Genetic and analysis of a cluster of rpf genes involved in positive regulation of synthesis of extracellular enzymes and polysaccharides in Xanthomonas campestris pv campestris. Mol Gen Gene 199:338-343. Törrönen R, Rouvinen T. 1997. Structural and functional properties of low molecular weight endo-1,4-xylanases. J Biotechnol 57:137-149. Tsujibo et al. 1992. Cloning and sequencing analysis of gene encoding xylanase and acetyl xylan esterase from Streptomyces thermoviolaceus OPC-520. Appl Envirol Microbiol 63:661-664. Wahyudi AT, Takeyama H, Matsunaga T. 2001. Isolasi of Magnetospirillum magneticum AMB-1 mutans detective in bacterial magnetic particle synthesis by transoson mutagenesis. Appl Biochem Biotechnol 91:147-154. Wang D et al. 1997. Fermentation and Enzyme Technology. New York: John Wiley and Sons. Widhyastuti N. 2007. Purifikasi dan karakterisasi xilanase ekstraseluler Streptomyces sp. SKK1 asal Sukabumi [tesis]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Xu GY et al. 1995. Solution structure of a cellulose-binding domain from Cellulomonas fimi by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry 21:6993-7009. Yang RCA, McKenzi CR, Billous D, Seligny CL, Narang SA. 1998. Molecular cloning and expression of xylanase gen from Bacillus polymyxa in Eschericia coli. Environ Microbiol 54:1023-1029. Yu EKC, Tan LUL, Chan MKH, Deschatelet L, Saddler JN. 1991. Production of thermostabile xylanase by a thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus. Enzyme Microbiol Technol 9:16-24. Zou et al. 2009. Cloning of a new xylanase gene from Streptomyces sp. TN119 using a modified thermal asymetric interlaced-PCR spesific for GC-rich genes and biochemical characterization. Appl Biochem Biotechnol 160:1277-1292.
41
LAMPIRAN
42
43 Lampiran 1 Sekuen primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3 menggunakan metode InversePCR Posisi R F
Nama Primer i-PCR1 i-PCR2
R F
i-S1 i-S2
F R
Sc-F1 Sc-R1
Urutan
Ukura
Tm
n 58.45 57.58
% GC 68.42 68.42
CCGTTGCTCCAGCCCTTGC CGGCCACGGGATGAACCTG
19 nt 19 nt
GGAAGTTGGTCATGACCTCG TGGTCGAGTACTACATCGTC
20 nt 20 nt
55.00 50.00
ATCACCACCGGCAACCACTTCG TGCCCCAGTTGTCGACGATGTAG
22 nt 24 nt
59 54
44 Lampiran 2 Hasil sekuensing produk inverse PCR (1500 pb) bagian forward
45
46 Lampiran 3 Hasil sekuensing produk inverse PCR (1500 pb) bagian reverse
47
48 Lampiran 4 Hasil pensejajaran urutan nukleotida produk inverse-PCR dengan database di GenBank menggunakan program BLASTX No. Akses AFH35005.1 ZP_06710529.1
CCK28706.1 EHN73405.1 ZP_06710529.1
YP004800841.1
ZP_08286756.1
ZP_06531359.1
Description
Max Score
Xylanase [bacterium enrichment c.c Xyl8B8] Endo-1,4-beta-xylanase B [Streptomyces sp. e14] Endo-1,4-beta-xylanase B [Streptomyces davawensis JCM 4913] 4-xylanase [Streptomyces coelicoflavus ZG0656] Endo-1,4-beta-xylanase [Streptomyces sp. SirexAA-E] endo-1,4-beta-xylanase [Streptomyces sp. SirexAA-E] secreted endo-1,4-betaxylanase B [Streptomyces griseoaurantiacus M045] >gb|EGG47324.1| secreted endo-1,4-betaxylanase B [Streptomyces lividans TK24] >gb|EFD69609.1|
61%
E. value 4e-175
Max Ident. 95%
433
54%
2e-145
81%
423
423
54%
2e-141
409
409
54%
4e-136
77%
423
423
54%
2e-141
77%
409
409
54%
8e-136
76%
408
408
54%
2e-135
80%
407
407
54%
8e-135
76%
509
Total Score 509
433
Q.C
77%
NP_626540.1
endo-1,4-beta-xylanase B [Streptomyces coelicolor A3(2)
406
406
54%
8e-135
76%
BAK39579.1
putative endo-beta-1,4xylanase [Streptomyces sp. SWU10]
406
406
54%
1e-134
75%
BAD02383.1
xylanase II [Streptomyces thermoviolaceus]
401
401
54%
9e-133
76%
ADP65781.1
endo-1,4-beta-D-xylanase precursor [Streptomyces sp. THW31]
400
400
54%
1e-132
74%
AAF04601.1
xylanase B precursor [Streptomyces thermocyaneoviolaceus]
400
400
54%
2e-132
76%
400
400
54%
2e-132
75%
397
397
54%
4e-131
72%
P26515.3 AEH04392.1
RecName: Full=Endo-1,4beta-xylanase B [Streptomyces lividans 1326] endo-beta-1,4-xylanase [Thermobifida halotolerans]
Keterangan : ident = identitas; No. Akses = nomor akses; QC= Quary Coverage
49 Lampiran 5 Hasil pensejajaran urutan nukleotida produk inverse-PCR dengan database di GenBank menggunakan program BLASTX
gb|AFH35005.1| xylanase [bacterium enrichment culture clone Xyl8B8] > Length=341 509 bits (1311), Expect = 4e-175, Method: Compositional matrix adjust. Score = Identities = 324/342 (95%), Positives = 325/342 (95%), Gaps = 1/342 (0%) Frame = +1 Query 316 MKIrsrrerrprGPLTSLFRgvcavvllavgaltlpgagIAGADTVITSNQTGTDNGYYY 495 MKIRSRRERRPRGPLTSLFRGVCAVVLLAVGALTLPGAGIAGADTVITSNQTGTDNGYYY Sbjct 1 MKIRSRRERRPRGPLTSLFRGVCAVVLLAVGALTLPGAGIAGADTVITSNQTGTDNGYYY 60 Query
496
SFWTDGGGTVSMNLGSAGNYSTNWSNAGNFVAGKGWSNGGRRSVTYSGTFNPPGNAYLSL SFWTDGGGTVSMNLGSAGNYSTNWSNAGNFVAGKGWSNGGRRSVTYSGTFNP GNAYLSL SFWTDGGGTVSMNLGSAGNYSTNWSNAGNFVAGKGWSNGGRRSVTYSGTFNPSGNAYLSL
675
Sbjct
61
Query 676 YGWTSNPLVEYYIVDNWGSYRPTGTFKGTVTSDGGTYDIYETTRTNAPSVEGTKTFNQYW YGWTSNPLVEYYIVDNWGSYRPTGTFKGTVTSDGGTYDIYETTRTNAPSVEGTKTFNQYW Sbjct 121 YGWTSNPLVEYYIVDNWGSYRPTGTFKGTVTSDGGTYDIYETTRTNAPSVEGTKTFNQYW
855
Query
856
1035
Sbjct
181
Query
1036
Sbjct
240
Query
1216
Sbjct
300
SVRQFKRTGGTITTGNHFDAWAGHGMNLGSFNYYMIMATESYQssgssnitvgssgsggg SVRQ KRTGGTITTGNHFDAWAGHGMNLGSFNYYMIMATE YQ S S+ S GG SVRQSKRTGGTITTGNHFDAWAGHGMNLGSFNYYMIMATEGYQ-SSGSSNITVGSSGSGG gggtggggtggggtggctatvtagQSWDDRYNLNVSVSGANNWTVTANVPAPEKVLSTWN GGG GGGTGGGGTGGCTATVTAGQSWDDRYNLNVSVSGANNWTVTANVPAPEKVLSTWN GGGGTGGGTGGGGTGGCTATVTAGQSWDDRYNLNVSVSGANNWTVTANVPAPEKVLSTWN VAASYPSAQVLTAKSNGSGNNWGLTVQKNGSTTWPTFSCTAN VAASYPSAQVLTAKSNGSGNNWGLTVQKNGSTTWPTFSC AN VAASYPSAQVLTAKSNGSGNNWGLTVQKNGSTTWPTFSCAAN
1341 341
120
180
239 1215 299
50 ref|ZP_06710529.1| endo-1,4-beta-xylanase B [Streptomyces sp. e14] gb|EFF93651.1| endo-1,4-beta-xylanase B [Streptomyces sp. e14] Length=313 Score = 433 bits (1113), Expect = 2e-145, Method: Compositional matrix adjust. Identities = 246/302 (81%), Positives = 276/302 (91%), Gaps = 1/302 (0%) Frame = +1 Query 436 AGADTVITSNQTGTDNGYYYSFWTDGGGTVSMNLGSAGNYSTNWSNAGNFVAGKGWSNGG 615 A ADTVITSNQTGT+NGYYYSFWTDGGG+ SMNLGS GNYST+W+N+GNFVAGKGWS GG Sbjct 13 ASADTVITSNQTGTNNGYYYSFWTDGGGSTSMNLGSGGNYSTSWTNSGNFVAGKGWSTGG 72 Query
616
Sbjct
73
Query
796
Sbjct
133
Query
976
Sbjct
192
Query
1156
Sbjct
252
Query
1336
Sbjct
312
RRSVTYSGTFNPPGNAYLSLYGWTSNPLVEYYIVDNWGSYRPTGTFKGTVTSDGGTYDIY R++VTYSG+FNP GNAYL+LYGWT+NPLVEYY+VDNWG+YRPTGT+KGTVTSDGGTYDIY RKAVTYSGSFNPSGNAYLALYGWTTNPLVEYYVVDNWGTYRPTGTYKGTVTSDGGTYDIY
795
ETTRTNAPSVEGTKTFNQYWSVRQFKRTGGTITTGNHFDAWAGHGMNLGSFNYYMIMATE ETTR NAPS+EGT+TFNQYWSVRQ KRTGGTITTGNHFDAWA HGMNLG+FN YMI+ATE ETTRVNAPSIEGTRTFNQYWSVRQSKRTGGTITTGNHFDAWASHGMNLGAFN-YMILATE
975
SYQssgssnitvgssgsggggggtggggtggggtggctatvtagQSWDDRYNLNVSVSGA YQSSG+SNITV GSGGG GG G GG GGG GGCTAT++AGQ W DRYNLNVSVSG+ GYQSSGNSNITVSDGGSGGGTGGGGTGGGGGGTGGGCTATLSAGQQWGDRYNLNVSVSGS NNWTVTANVPAPEKVLSTWNVAASYPSAQVLTAKSNGSGNNWGLTVQKNGSTTWPTFSCT +NWTVT NVP+PEKVL+TWNV+ASYPSAQVL+AK NGSGNNWG+T+Q NG+ TWPT +CT SNWTVTMNVPSPEKVLATWNVSASYPSAQVLSAKPNGSGNNWGVTIQTNGTWTWPTVTCT AN AN AN
emb|CCK28706.1|
132
191 1155 251 1335 311
1341 313
Endo-1,4-beta-xylanase B [Streptomyces davawensis JCM 4913]
Length=320 423 bits (1087), Expect = 2e-141, Method: Compositional matrix adjust. Score = Identities = 233/301 (77%), Positives = 257/301 (85%), Gaps = 9/301 (3%)
Frame = +1 Query 436 AGADTVITSNQTGTDNGYYYSFWTDGGGTVSMNLGSAGNYSTNWSNAGNFVAGKGWSNGG A ADTV+T+NQTGT+NGYYYSFWTD GTVSMNL S G+YST WSN GNFVAGKGW+NG Sbjct 28 AHADTVVTTNQTGTNNGYYYSFWTDSQGTVSMNLASGGSYSTQWSNTGNFVAGKGWANGA
615
Query
616
795
Sbjct
88
RRSVTYSGTFNPPGNAYLSLYGWTSNPLVEYYIVDNWGSYRPTGTFKGTVTSDGGTYDIY RR+VTYSGTFNP GNAYL+LYGWT+NPLVEYYIVDNWG+YRPTGTFKGTVT+DGGTYDIY RRTVTYSGTFNPSGNAYLALYGWTANPLVEYYIVDNWGTYRPTGTFKGTVTTDGGTYDIY
Query
796
975
Sbjct
148
ETTRTNAPSVEGTKTFNQYWSVRQFKRTGGTITTGNHFDAWAGHGMNLGSFNYYMIMATE +TTR NAPSVEG KTF+QYWSVRQ KRTGGTITTGNHFDAWA GM LGSFNYYMIMATE KTTRYNAPSVEGNKTFDQYWSVRQSKRTGGTITTGNHFDAWARAGMPLGSFNYYMIMATE
Query
976
1155
Sbjct
208
SYQssgssnitvgssgsggggggtggggtggggtggctatvtagQSWDDRYNLNVSVSGA YQ S S GGT GGG GGGG GC+AT++AGQ W DRYNLNVSV+G+ GYQ---------SSGSSNITVGGTSGGGGGGGGGTGCSATLSAGQQWSDRYNLNVSVTGS
Query
1156
Sbjct
259
NNWTVTANVPAPEKVLSTWNVAASYPSAQVLTAKSNGSGNNWGLTVQKNGSTTWPTFSCTA +NWTVT NVP+P KVLSTWNV+ASYPS+QVLTAK NGSGNNWG+T+Q NG+ TWPT SCTA SNWTVTMNVPSPAKVLSTWNVSASYPSSQVLTAKPNGSGNNWGVTIQHNGNYTWPTVSCTA
87
147
207
258 1338 319
51 >gb|EHN73405.1|
4-xylanase [Streptomyces coelicoflavus ZG0656]
Length=337 409 bits (1052), Expect = 4e-136, Method: Compositional matrix adjust. Score = Identities = 231/301 (77%), Positives = 258/301 (86%), Gaps = 3/301 (1%) Query 436 AGADTVITSNQTGTDNGYYYSFWTDGGGTVSMNLGSAGNYSTNWSNAGNFVAGKGWSNGG 615 A ADTV+T+NQ GT+NGYYYSFWTD GTVSMN+GS G YST+W N GNFVAGKGW+NGG Sbjct 39 ARADTVVTTNQEGTNNGYYYSFWTDSQGTVSMNMGSGGQYSTSWRNTGNFVAGKGWANGG 98 Query
616
Sbjct
99
Query
796
Sbjct
159
Query
976
Sbjct
219
Query
1156
Sbjct
276
RRSVTYSGTFNPPGNAYLSLYGWTSNPLVEYYIVDNWGSYRPTGTFKGTVTSDGGTYDIY RR+V YSGTFNP GNAYL+LYGWT+NPLVEYYIVDNWG+YRPTG +KGTVTSDGGTYDIY RRTVQYSGTFNPSGNAYLTLYGWTANPLVEYYIVDNWGTYRPTGEYKGTVTSDGGTYDIY
795 158
ETTRTNAPSVEGTKTFNQYWSVRQFKRTGGTITTGNHFDAWAGHGMNLGSFNYYMIMATE +TTR N PSVEGT+TF+QYWSVRQ KRTGGTITTGNHFDAWA GM LGSFNYYMIMATE KTTRVNKPSVEGTRTFDQYWSVRQSKRTGGTITTGNHFDAWARAGMPLGSFNYYMIMATE
975
SYQssgssnitvgssgsggggggtggggtggggtggctatvtagQSWDDRYNLNVSVSGA YQ SS + + G GGGG GGG GGGG GGCTAT++AGQ W DRYNLNVSVSGA GYQ---SSGSSNINVGGTGGGGDDGGGDNGGGGGGGCTATLSAGQKWGDRYNLNVSVSGA
1155
NNWTVTANVPAPEKVLSTWNVAASYPSAQVLTAKSNGSGNNWGLTVQKNGSTTWPTFSCTA ++WTVT NVP+P KV+STWN+ ASYPSAQ LTA+SNGSGNNWG T+Q NG+ TWP+ SCTA SDWTVTMNVPSPAKVMSTWNINASYPSAQTLTARSNGSGNNWGATIQANGNWTWPSVSCTA
>ref|YP_004800841.1|
218
275 1338 335
endo-1,4-beta-xylanase [Streptomyces sp. SirexAA-E]
Length=335 Score = 409 bits (1050), Expect = 8e-136, Method: Compositional matrix adjust. Identities = 228/300 (76%), Positives = 260/300 (87%), Gaps = 5/300 (2%) Frame = +1 Query 436 AGADTVITSNQTGTDNGYYYSFWTDGGGTVSMNLGSAGNYSTNWSNAGNFVAGKGWSNGG 615 A ADTV+T+NQTG +NGYYYSFWTDGGG VSMNL S G+YST+W+N GNFVAGKGWS GG Sbjct 39 ASADTVVTTNQTGNNNGYYYSFWTDGGGQVSMNLASGGSYSTSWTNTGNFVAGKGWSTGG 98 Query
616
Sbjct
99
Query
796
Sbjct Query
159 976
Sbjct Query
218 1156
Sbjct
274
RRSVTYSGTFNPPGNAYLSLYGWTSNPLVEYYIVDNWGSYRPTGTFKGTVTSDGGTYDIY R+SVTYSGTFNP GNAYL+LYGW++NPLVEYYIVDNWG+YRPTGTFKGTV+SDGGTYDIY RKSVTYSGTFNPSGNAYLTLYGWSTNPLVEYYIVDNWGTYRPTGTFKGTVSSDGGTYDIY ETTRTNAPSVEGTKTFNQYWSVRQFKRTGGTITTGNHFDAWAGHGMNLGSFNYYMIMATE ETTRTNAPS+EGTKTF Q+WSVRQ KRTGGTITTGNHFDAWA +GMNLG+ N YMI+ATE ETTRTNAPSIEGTKTFKQFWSVRQSKRTGGTITTGNHFDAWARNGMNLGTMN-YMILATE SYQssgssnitvgssgsggggggtggggtggggtggctatvtagQSWDDRYNLNVSVSGA YQ S+ + + S GG GG G G GGGG GGCTAT++AG+ W DRYNLNV+VSG+ GYQ----SSGSSNITVSEGGSGGGGDNGGGGGGGGGCTATLSAGEKWGDRYNLNVAVSGS NNWTVTANVPAPEKVLSTWNVAASYPSAQVLTAKSNGSGNNWGLTVQKNGSTTWPTFSCT +NWTVT NVP+ EKVLSTWN++ASYPS+QVL AK NGSGNNWG T+Q NG+ TWPT SCT SNWTVTMNVPSAEKVLSTWNISASYPSSQVLVAKPNGSGNNWGATIQANGNWTWPTVSCT
795 158 975 217 1155 273 1335 333
52 Lampiran 6 Analisis Promoter dan Open reading frame (ORF) Promoter > test sequence Length of sequence1664 Threshold for promoters - 0.20 Number of predicted promoters 1 Promoter Pos: 251 LDF- 1.60 -10 box at pos. 236 CTCAACACT Score -35 box at pos. 216 TTGACT Score
15 61
Oligonucleotides from known TF binding sites: For promoter at 251: rpoD15: TTTGTGTA at position
225 Score -
14
Prediction of potential genes in microbial genomes Time: Tue Jan 1 00:00:00 2005 Seq name: Length of Number of Number of N 1 2 3 4
test sequence sequence - 1664 bp predicted genes - 4 transcription units - 3, operons - 1 Tu/Op Conserved S Start pairs(N/Pv) 1 Op 1 . CDS 3 1 Op 2 . CDS 146 2 Tu 1 . + CDS 316 3 Tu 1 . CDS 1355 -
End 171 298 1344 1663
Predicted protein(s): >GENE 1 3 171 84 56 aa, chain MHSRDLAGETPSCANVTDLFEAAERARSRGGGALSKVSEPMGSHCQTLAATVTLMV >GENE 2 146 298 72 50 aa, chain MDRWSRMRVERRAARWCISVEAYTKAVNSFGSYFETFGSSKSHALKGFGW >GENE 3 316 1344 442 342 aa, chain + MKIRSRRERRPRGPLTSLFRGVCAVVLLAVGALTLPGAGIAGADTVITSNQTGTDNGYYY SFWTDGGGTVSMNLGSAGNYSTNWSNAGNFVAGKGWSNGGRRSVTYSGTFNPPGNAYLSL YGWTSNPLVEYYIVDNWGSYRPTGTFKGTVTSDGGTYDIYETTRTNAPSVEGTKTFNQYW SVRQFKRTGGTITTGNHFDAWAGHGMNLGSFNYYMIMATESYQSSGSSNITVGSSGSGGG GGGTGGGGTGGGGTGGCTATVTAGQSWDDRYNLNVSVSGANNWTVTANVPAPEKVLSTWN VAASYPSAQVLTAKSNGSGNNWGLTVQKNGSTTWPTFSCTAN >GENE 4 1355 1663 272 102 aa, chain ASFYGELLGYRALFATDDFVLLGTEGTPGLGFTRVADYRPPTWPDPAQGKQAHIELGVDD LDAAERRLLGLGATKPEFQPGEKRWRVLLDPAGHPFCITTLA
Score 84 72 442 272
