AKTIVITAS INHIBITOR TRIPSIN DARI PROTEIN EKSPRESI INTRASELULAR DAN EKSTRASELULAR Gen TcPIN YANG DITRANSFORMASIKAN PADA Eschericia coli
MUHAMAD LUTFILAH
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
ABSTRAK MUHAMAD LUTFILAH. Aktivitas Inhibitor Tripsin dari Protein Ekspresi Intraselular dan Ekstraselular Gen TcPIN yang Ditransformasikan pada Eschericia coli. Dibimbing oleh TUN TEDJA IRAWADI dan TETTY CHAIDAMSARI. PIN merupakan gen pertahanan alamiah tanaman yang dapat dimanfaatkan untuk pengembangan kakao transgenik. Gen TcPIN telah diisolasi dari kulit buah kakao pada klon Ary dan Bal, serta dari biji kakao. Studi bioinformatika menunjukkan bahwa gen ini mengekspresikan protein 21 kDa yang memiliki homologi tinggi dengan inhibitor tripsin. Aktivitas protein ini diuji secara in vitro. Protein hasil ekspresi intraselular gen TcPIN dari kulit buah kakao menunjukkan aktivitasnya sebagai inhibitor tripsin. Namun, protein hasil ekspresi gen TcPIN dari biji kakao tidak menunjukkan aktivitas serupa.
ABSTRACT MUHAMAD LUTFILAH. Tripsin Inhibitor Activity of Protein Expressed Intracellularly and Extracellularly from TcPIN Gene Transformed in Eschericia coli. Supervised by TUN TEDJA IRAWADI and TETTY CHAIDAMSARI. PIN is natural defense gene in plant which is potential to be utilized for development of transgenic cacao. TcPIN gene had been isolated from cacao’s peel (pod wall) of Ary and Bal clones, and from seed of cacao (beans). Bioinformatics study showed that this gene expressed 21 kDa protein, having high homology with tripsin inhibitor. The activity of this protein was tested in vitro. Protein expressed intracellularly from TcPIN gene of the peel showed activities as tripsin inhibitor. In contrary, protein expressed by TcPIN gene from the seed did not show such activity.
AKTIVITAS INHIBITOR TRIPSIN DARI PROTEIN EKSPRESI INTRASELULAR DAN EKSTRASELULAR Gen TcPIN YANG DITRANSFORMASIKAN PADA Eschericia coli
MUHAMAD LUTFILAH
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
Judul Skripsi
Nama NIM
: Aktivitas Inhibitor Tripsin dari Protein Ekspresi Intraselular dan Ekstraselular Gen TcPIN yang Ditransformasikan pada Eschericia coli : Muhamad Lutfilah : G44076025
Disetujui Komisi Pembimbing Pembimbing I
Pembimbing II
Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, MS. NIPIrawadi 19501227 197603 200 2 Msc MSc. Ir.
Dr. Tetty Chaidamsari NIK 110400241
Diketahui Ketua Departemen Kimia
Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, MS. NIP 19501227 197603 200 2
Tanggal lulus:
PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret ini adalah uji in vitro protein ekspresi hasil transformasi gen PIN, dengan judul Uji Aktivitas Protease Inhibitor Protein Intraselular dan Ekstraselular Hasil Transformasi Pada Eschericia coli. Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, MS dan Dr. Tetty Chaidamsari selaku pembimbing. Di samping itu, penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Prof. drh. Dr. Ir. Maria Bintang Msc; Meita Nova Isda, S.Si. M.Si. atas sarannya dalam penelitian ini, kepada seluruh staf Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia yang telah banyak membantu selama penelitian terutama Mas Topani, Mas Herry, Mbak Herti, Mbak Nina, Mbak Riana, serta Budi Arifin S.Si. atas sarannya dalam penyusunan karya ilmiah ini. Terima kasih juga penulis sampaikan untuk ayah, ibu, dan seluruh keluarga atas doa dan kasih sayangnya. Penulis juga mengucapkan terima kasih atas doa dan dukungan semua sahabat dan juga teman-teman ekstensi S-1 Kimia. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Desember 2009 Muhamad Lutfilah
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 10 September 1983 dari ayah Sugito dan Ibu Yoyoh Piroh. Penulis merupakan putra pertama dari tiga bersaudara.Tahun 2001 penulis lulus dari SMUN 7 Bogor. Pendidikan Diploma ditempuh pada tahun 2001 2004 di IPB pada program studi D3 Analisis Kimia, Jurusan Kimia, Fakultas MIPA. Pada tahun 2007 penulis melanjutkan ke program studi S1 Kimia, Departemen Kimia, Fakultas MIPA, Institut Pertanian Bogor. Penulis juga pernah bekerja sebagai analis kimia di PT Panen Djaja Abadi pada tahun 2004 2005, lalu bekerja sebagai Inspektor QC di perusahaan farmasi, yaitu PT Guardian Pharmatama pada tahun 2005 2008.
DAFTAR ISI Halaman
DAFTAR GAMBAR …………….………………...………...........……………..
viii
DAFTAR LAMPIRAN ……………………………………………............……..
viii
PENDAHULUAN …………………………………….………............…..……..
1
TINJAUAN PUSTAKA Kakao (Theobroma cacao L.) ....................................................................... Penggerek Buah Kakao .............…………………….………………..……. Gen PIN pada Kakao ………………………………..……...……..………. Proteinase dan Proteinase Inhibitor ………………………..………..…….. Struktur Protein ………………………………..…………………..………. Analisis Protein ………………………………………………..……..……. Elektroforesis SDS-PAGE ………………………..…………………..……
1 2 2 2 3 3 3
BAHAN DAN LINGKUP KERJA Bahan dan Alat ……………………………………………………..…..…. Lingkup Kerja ......…………………………………….……….……..…….
3 4
HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstrak Protein …………………………………………………………... Kadar Protein Total ....................................................................................... Homologi pada Bobot Molekul Protein ..…………………….............…..... Aktivitas Inhibitor Tripsin .………………………………………..………..
5 6 6 7
SIMPULAN DAN SARAN ...………………………...........……………..……...
8
DAFTAR PUSTAKA ....…………………………………….…...……............…
8
LAMPIRAN .......……………………………………………………............…....
11
1
DAFTAR GAMBAR Halaman
1 2 3 4
Bagian buah kakao ............................................................................................... Ilustrasi struktur protein ……………..…………………………………….…. Hasil SDS-PAGE ekstrak protein dari kulit dan biji buah kakao dengan pewarna AgNO3 (A) dan pewarna biru Coomassie (B) ……………………………….….. Hasil SDS-PAGE protein ekspresi ekstraselular (A) dan intraselular (B) …....…
1 3 6 7
DAFTAR LAMPIRAN Halaman
1 2 3 4 5 6
Diagram alir penelitian …………………………...…………………………….. Prosedur pembuatan pereaksi-pereaksi dan kultur E. coli .......…………….…… Penentuan maksimum pada pengukuran kadar protein ……………..……...... Hasil pengukuran kadar protein .............…………………………………........... Hasil pengukuran aktivitas tripsin dengan penambahan protein intraselular ....... Hasil pengukuran aktivitas tripsin dengan penambahan protein ekstraselular .....
12 13 14 15 17 19
1
PENDAHULUAN Indonesia merupakan produsen kakao terbesar ketiga di dunia dengan produksi rerata per tahun mencapai 456,000 ton, setelah negara Pantai Gading (1,276,000 ton) dan Ghana (586,000 ton). Luas lahan tanaman kakao Indonesia lebih kurang 992.448 Ha dengan produktivitas rata-rata 900 kg per ha (Depperin 2007). Saat ini, Indonesia mengekspor 40% kakao ke Malaysia, 30% ke Amerika Serikat, 15% ke Singapura, dan 15% ke Eropa. Produksi kakao Indonesia tahun 2008 dibandingkan dengan tahun 2007 menurun 4% dari 500,000 ton menjadi 480,000 ton. Harga rata-rata kakao selama tahun 2008 sebesar US$2,500 per ton dan pada tahun 2009 diperkirakan meningkat menjadi US$2,900 per ton (Husaini 2009). Karena itu, kakao merupakan salah satu komoditas ekspor nonmigas yang potensial dan produksinya perlu ditingkatkan. Agribisnis kakao Indonesia masih menghadapi berbagai masalah kompleks, antara lain mutu produksi yang masih rendah, serta masih belum optimalnya pengembangan produk hilir kakao. Produktivitasnya juga masih rendah, salah satu penyebabnya ialah serangan hama penggerek buah kakao (PBK). Hal ini menjadi suatu tantangan sekaligus peluang bagi para investor untuk mengembangkan usaha dan meraih nilai tambah yang lebih besar dari agribisnis kakao (Goenadi et al. 2007). Cara-cara yang telah diterapkan untuk mengatasi masalah hama PBK ini di antaranya pengendalian hama PBK secara nasional dan pemilihan varietas tanaman kakao yang tahan hama PBK. Cara lain yang juga potensial ialah pengembangan kakao transgenik dengan memanfaatkan gen pertahanan alami pada tanaman yang disebut gen protease inhibitor (PIN). PIN merupakan gen yang dapat menghasilkan senyawa protein antinutrisi yang dapat menghambat kerja enzim proteolitik (protease) di dalam perut serangga (Ryan 1990). Apabila termakan oleh hama PBK, protein tersebut akan berinteraksi dengan protease di dalam usus hama tersebut, terikat, dan terkunci pada tapak aktifnya (Terra et al. 1996; Walker et al. 1998) akibatnya, hama PBK kekurangan nutrisi karena terinhibisinya kerja enzim protease yang menghasilkan asam amino, sehingga pertumbuhan dan perkembangan pada hama PBK menjadi terhambat dan dapat menyebabkan kematian.
Isda et al. 2008 telah mengisolasi gen PIN dari kulit buah 2 klon kakao, yang tahan (Ary) dan yang tidak tahan (Bal), serta dari biji kakao. Gen ini selanjutnya disebut TcPIN. Gen-gen ini diklon pada Eschericia coli. Secara bioinformatika, gen tersebut menyandikan protein 21 kDa dengan homologi yang cocok dengan inhibitor tripsin. Pada penelitian ini aktivitas inhibisi tripsin dari protein ekspresi ketiga gen itu diujikan secara in vitro. Selain itu, bobot molekul protein juga dicirikan dengan elektroforesis gel poliakrilamida-natrium dodesil sulfat (SDS-PAGE). Semua pekerjaan dalam penelitian ini dikerjakan di Labolatorium Biomolekuler, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Bogor, antara bulan Maret dan Juni 2009.
TINJAUAN PUSTAKA Kakao (Theobroma cacao L.) Tanaman kakao berasal dari Amerika Selatan. Buah kakao bila dibelah akan tampak seperti Gambar 1 dan bagiannya dapat dicirikan, yaitu OPW (outer pod wall) bagian kulit terluar dari kakao, IPW (inner pod wall), kulit lapisan kedua yang berada di dalam buah, Pu (pulp) daging buah kakao, B (beans) biji kakao, dan PL (placenta) bagian tengah dari kakao. OPW IPW B Pu
PL
Gambar 1 Bagian buah kakao (Chaidamsari 2005). Pada saat ini kecenderungan perluasan areal kakao terus berlanjut, walaupun tidak setajam periode 1985 1995 yang laju reratanya di atas 20% per tahun sedangkan pada periode 1995 2002 sebesar 7.5% per tahun. Kondisi areal yang ada dan masalah serangan hama PBK yang cenderung terus meluas dapat menjadikan produksi kakao nasional menurun dalam satu dasawarsa mendatang. Hal ini disebabkan oleh peningkatan produksi dengan perluasan areal
2
saat ini tidak dapat mengimbangi penurunan produksi tanaman kakao yang tua, serta serangan hama PBK sudah menjadi ancaman bagi produksi kakao nasional (Goenadi et al. 2007). Penggerek Buah Kakao Penggerek buah kakao (PBK), Conophomorpha cramerella Snellen, dari famili Gracillariidae merupakan salah satu hama kakao yang memakan plasenta yang merupakan saluran makanan menuju ke biji sehingga mengakibatkan penurunan hasil dan mutu biji. PBK dapat menyerang buah dengan panjang buah 3 cm, tetapi umumnya lebih menyukai yang berukuran sekitar 8 cm. Ulatnya merusak dengan cara menggerek buah serta memakan kulit buah, daging buah, dan plasenta. Buah yang terserang akan lebih awal menjadi berwarna kuning dan jika digoyang tidak berbunyi. Biasanya buah ini lebih berat daripada yang sehat. Biji-bijinya saling melekat, berwarna kehitaman, dan ukuran biji yang lebuh kecil (Goenadi et al. 2007) Gen PIN dari Buah kakao Gen PIN diketahui memiliki peranan yang penting dalam sistem pertahanan tanaman pada predator dan patogen (Lawrence & Koundal 2002). Pada kakao, gen ini menyandikan protein berukuran 21 kDa dan memiliki homologi yang cocok dengan inhibitor tripsin. Telah dilaporkan oleh Tai et al (1991) bahwa protein tersebut diakumulasi selama perkembangan biji dan tidak didegradasi selama perkecambahan benih pada kakao. Keberhasilan penggunaan gen PIN dalam tanaman transgenik telah dilaporkan antara lain pada padi (Xu et al. 1996), ubi jalar (Newell et al. 1995), dan tembakau (Johnson et al. 1989). Inhibitor protease pada kakao merupakan golongan inhibitor protease serin (inhibitor tripsin dan kemotripsin) dan telah menunjukkan keefektifannya menghambat perkembangan larva beberapa jenis Lepidoptera. Protease dan Inhibitor Protease Setiap metabolisme pada kehidupan sel bergantung pada proteolisis. Protease merupakan suatu kelompok enzim yang dapat memutuskan ikatan peptida, terlibat dalam berbagai proses penting pada pengatur katabolisme protein, dan mendegradasi selektif protein yang rusak. Berdasarkan
beberapa penelitian terakhir dari proteolisis, diketahui bahwa protease bukan hanya penting dalam penyediaan metabolit primer untuk pertumbuhan dan perkembangan sel. Protease juga merupakan sarana untuk berbagai proses kunci seperti pemutusan spesifik ikatan peptida pada protein yang belum sempurna atau penghancuran sinyalsinyal target dari praprotein setelah translokasinya pada bagian-bagian sel yang cocok. Karena itu, enzim proteolitik yang sebelumnya disebut ‘katalis penghancur’ terutama dalam menghidrolisis asupan protein, sekarang dianggap sebagai pusat pengendali dari unsur-unsur dalam perkembangan banyak kehidupan organisme (Wolf 1992). Protease dapat diklasifikasikan berdasarkan mekanisme katalitiknya. Empat kelas mekanisme yang diusulkan oleh The Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) adalah protease serin, protease kristein, protease aspartat, dan metaloprotease. Klasifikasi ini lebih lanjut telah diperluas pembagiannya berdasarkan hubungan evolusioner dari proteasenya (Rawling & Barrett 1993). Data tentang klasifikasi protease ini tersedia di basis data Swissport. Protease juga dapat terinhibisi oleh adanya suatu inhibitor. Berdasarkan kelompok mekanisme dari protease maka proses inhibisinya pun bersifat selektif dan mengikuti mekanisme dari kerja enzimnya. Menurut Ryan (1990), klasifikasi inhibitor protease pada jaringan tanaman dibagi menjadi 10 kelompok: inhibitor Kunitz (tripsin kedelai), Bowman-Birk, tripsin jewawut, kentang I, kentang II, ketela, ragi 1−2/jagung bifungsional, karboksipeptidase A dan B, protease kristein (kristatin), dan protease aspartil. Protein yang berperan sebagai inhibitor protease alami adalah protein kecil yang banyak terdapat di alam termasuk di dalam tubuh mahluk hidup (Fritz 2000). Inhibitor protease umumnya merupakan inhibitor kompetitif (inhibitor yang berikatan dengan tapak aktif enzim), dan berinteraksi dengan enzim sesuai dengan kelas mekanismenya. Sebagai contoh, inhibitor protease serin akan berikatan dengan protease serin, dan contoh protease serin adalah tripsin, kemotripsin, elastase, subtilisin, trombin, dan asetilkolinesterase (Ryan 1981; Foard et al. 1983).
3
Struktur Protein Protein (akar kata protos dari bahasa Yunani yang berarti "yang paling utama") adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari asam amino. Struktur protein (Gambar 2) dapat dilihat sebagai suatu hirarki. Struktur primer protein merupakan urutan asam-asam amino penyusun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida (amida). Sementara, struktur sekunder protein adalah struktur 3 dimensi lokal dari berbagai rangkaian asam amino pada protein yang distabilkan oleh ikatan hidrogen. Gabungan dari aneka ragam struktur sekunder akan menghasilkan struktur 3 dimensi yang dinamakan struktur tersier. Srtuktur inilah yang memungkinkan beberapa molekul seperti enzim untuk berinteraksi secara efisien dan spesifik menghasilkan aktivitas katalitik terhadap substratnya. Ketika struktur tersier tersebut rusak, protein akan kehilangan aktivitas fisiologisnya, proses ini dinamakan denaturasi (Steavens 2007). Kumpulan beberapa struktur tersier protein menghasilkan struktur kuaterner, yang dapat pula melibatkan molekul protein lain atau gugus-gugus nonprotein.
Struktur primer
Struktur sekunder
Struktur tersier
Struktur kuaterner
Gambar 2 Ilustrasi struktur protein (Berg et al. 2000) Analisis Protein Metode analisis protein antara lain metode Lowry, Bradford, FeCl3, dan Biuret. Pemilihan metode merupakan hal yang tidak dapat diabaikan, karena pengukuran konsentrasi secara akurat menjadi sangat penting peranannya, mengingat hasil penetapan ini digunakan dalam perhitungan lainnya, seperti penentuan aktivitas enzim. Metode Bradford adalah metode analisis kadar protein total yang didasarkan pada pengikatan secara langsung zat warna biru brilian Coomassie G250 (CBBG) oleh protein yang mengandung residu asam amino dengan rantai samping aromatik (tirosina, triptopan, dan fenilalanin)
atau bersifat basa (arginin, histidin, dan leusin). Reagen CBBG bebas berwarna merah-kecokelatan (λmaks 465 nm), sedangkan dalam suasana asam, reagen CBBG akan berada dalam bentuk anion yang akan mengikat protein membentuk warna biru (λmaks 595 nm). Jumlah CBBG yang terikat pada protein proporsional dengan muatan positif yang ditemukan pada protein (Sudarmanto 2007). Elektroforesis SDS-PAGE SDS-PAGE adalah teknik yang lazim dilakukan pada elektroforesis protein. Teknik ini memberikan perkiraan massa dari suatu molekul polipeptida, dan memberikan hasil analisis dengan resolusi tinggi dari campuran kompeks protein. Namun teknik ini bersifat destruktif, karena membutuhkan protein terdenaturasi untuk efektivitas pemisahan. Untuk memisahkan protein ke dalam rantairantai polipeptida tunggal, surfaktan SDS diperlukan dalam kombinasi dengan pereduksi. Protein akan mengikat 1.4 g SDS/g protein, molekul-molekul surfaktan tersebut menempel pada molekul protein. Kompleks protein-SDS secara efektif menudungi muatan awal protein, gugus-gugus sulfat pada detergen menjadikannya secara keseluruhan kompleks protein-SDS ini bermuatan negatif. Elektroforesis dengan penambahan SDS efektif memberikan muatan protein yang seragam dan pemisahan didasarkan pada massa molekul relatif dari rantai-rantai polipeptida (Richards et al. 1998). Medium yang digunakan pada teknik SDS-PAGE ini adalah poliakrilamida yang memiliki kekuatan tarik yang baik, konduktivitas listrik yang rendah, penyerapan sinar ultraviolet (UV) yang rendah, dan ukuran pori yang mudah diatur. Sebagai pereduksi dapat digunakan 2-merkaptoetanol untuk memutus ikatan-ikatan sulfida, dan untuk memunculkan pita-pita hasil pemisahan dapat digunakan pewarnaan biru Coomassie R250 (CBBR) atau AgNO3.
BAHAN DAN LINGKUP KERJA Bahan dan alat Bahan-bahan yang digunakan antara lain kulit dan biji kakao segar dari daerah Jember, gen TcPIN yang telah diklon pada E. coli, Tripsin (No cat T-7409, Sigma), bufer trisHCl, kasein, etilenadiaminatetraasetat
4
(EDTA), 2-merkaptoetanol, standar tirosina, asam trikloroasetat (TCA), pereaksi FolinCiocalteu, fenol, KH2PO4, K2HPO4, N2 cair, standar albumin serum sapi (BSA) (Sigma), pereaksi CBBG (sigma), CBBR (sigma), asam ortofosfat 85% (Sigma), akrilamida, SDS 10%, amonium persulfat (APS) 10%, dan N’,N’,N’,N’-tertrametiletilenadiamina (TEMED). Alat-alat yang digunakan adalah spektrofotometer UV-VIS, tabung eppendorf, pipet mikro, penangas air, lemari pendingin, peralatan elektroforesis SDS-PAGE, sentrifus, dan alat-alat kaca. Lingkup Kerja Penelitian ini terdiri atas 4 tahap. Tahap pertama ialah ekstraksi protein pada kulit dan biji kakao serta protein intraselular dan ekstraselular hasil E. coli yang telah diklon gen TcPIN baik dari kulit buah kakao (Ary dan Bal) maupun dari biji buah kakao (Biji). Tahap kedua ialah penentuan kadar protein hasil ekstraksi dengan metode Bradford. Tahap ketiga ialah identifikasi bobot molekul protein dengan elektroforesis SDS-PAGE dan tahap keempat ialah uji aktivitas inhibisi protease protein oleh hasil ekstraksi secara in vitro dengan metode spektrofotometri. Tahapan ini tergambar pada diagram alir penelitian (Lampiran 1) dan prosedur pembuatan pereaksi yang digunakan terdapat pada Lampiran 2. Ekstraksi Protein Protein diekstraksi menggunakan salah satu metode yang dikemukakan oleh Pirovani et al. (2008), dengan sejumlah modifikasi. Contoh dalam bentuk kulit dan biji buah kakao ditambahkan N2 cair dan digerus dengan mortar. Sekitar 2 g hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung sentrifus yang berisi 20 ml aseton dingin dan dikocok kuat. Campuran disentrifugasi dengan laju 10,000 g dengan suhu 4 °C selama 15 menit. Endapan yang dihasilkan diberi 10 ml aseton yang mengandung TCA 10%, dikocok kuat lalu disentrifugasi pada kondisi yang sama seperti di atas. Hal ini dilakukan 3 kali. Selanjutnya endapan dicuci dengan TCA 10% dalam pelarut air kemudian aseton 80% masingmasing satu kali. Endapan yang dihasilkan disuspensikan dengan larutan SDS-dense sebanyak 10 ml dan didiamkan selama 15 menit. Setelah itu, diberi 20 ml larutan fenol, dikocok, dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu -20 oC sebelum disentrifugasi dengan
laju 10,000 g dengan suhu 4 oC selama 10 menit. Fase atas diambil dan diberi 40 ml aseton kemudian dinkubasi pada suhu -20 oC selama 18 jam. Endapan yang terbentuk kemudian diambil dengan cara disentrifugasi dengan laju 10,000 g pada suhu 4 oC selama 5 menit, lalu endapan yang diperoleh dilarutkan dengan bufer fosfat pH 6.5 sebanyak 2.5 ml. Contoh berupa kultur E. coli yang membawa gen TcPIN disentifugasi dengan laju 10,000 g dengan suhu 4 oC selama 15 menit, untuk memisahkan medium kultur sebagai supernatan dan bakteri E. coli hasil biakan sebagai pelet. Supernatan yang diperoleh diambil sebagai protein ekspresi ekstraselular dan dilakukan prakonsentrasi dengan mengendapkan protein dengan aseton (supernatan-aseton 1:4), dan dilarutkan kembali dengan bufer fosfat pH 6.5. Sementara itu, pelet yang terpisah ditimbang, digerus dengan mortar dengan penambahan sedikit N2 cair sampai halus, lalu ditetesi dengan bufer fosfat pH 6.5 (dingin) 0.05 M dengan nisbah 1 ml untuk 2 g pelet. Suspensi yang didapat disentrifugasi dengan kecepatan 10,000 g dengan suhu 4 oC selama 15 menit. Supernatan yang diperoleh diambil sebagai protein hasil ekspresi intraselular. Analisis Protein Analisis protein dilakukan dengan menggunakan metode Bradford (1976) dengan beberapa modifikasi. Ekstrak protein dianalisis dengan cara memasukkan sejumlah tertentu larutan contoh dan akuades hingga mencapai volume 100 l ke dalam tabung Eppendorf, lalu ditambahkan ke dalamnya 100 mL NaOH 0.1 M dan 3 ml pereaksi Bradford. Campuran digoyang dan didiamkan selama 30 menit, lalu diukur serapannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum ( maks sekitar 595 nm. Sebagai pembanding, digunakan model kalibrasi hubungan antara konsentrasi dan serapan dari sejumlah deret standar. Standar yang digunakan ialah 100 l BSA dengan beberapa konsentrasi berbeda yang dianalisis dengan cara yang sama. Sementara blangko ialah 100 l akuades yang dianalisis dengan cara yang sama. Identifikasi Elektroforesis SDS-PAGE Ekstraksi protein dari kultur sel serta dari kulit dan biji buah kakao diidentifikasi dengan elektroforesis SDS-PAGE (Laemmli 1970) untuk mengetahui bobot molekulnya. Gel pemisah dibuat dengan konsentrasi 12%
5
dengan cara mencampur 3.35 ml akuades, 2.5 ml tris-HCl 1.5 M pH 8.8, 0.1 ml SDS 10%, 4 ml akrilamida, 0.1 ml APS 10%, dan 0.015 ml TEMED ke dalam Erlenmeyer, lalu dimasukkan ke dalam cetakan sampai batas tertentu (sesuai dengan tinggi sisir). Isopropanol ditempatkan secara perlahan ke atas gel tersebut untuk meratakannya, lalu dibiarkan membeku, dan sisa isopropanol dibersihkan dari permukaan gel dengan kertas saring. Larutan stacking gel 4.5% dituang ke atas permukaan gel tersebut, kemudian sisir dipasang dan dibiarkan membeku. Sisir lalu dibuka secara perlahan dan gel siap digunakan. Setelah peralatan elektroforesis disiapkan, larutan bufer loading ditempatkan pada alat. Setelah itu, sampel dimasukan ke dalam sumur pada gel SDS-PAGE, dipanaskan selama 4 menit, lalu diberi arus listrik hingga pewarna mencapai ujung gel (tegangan yang dipakai 110 150 V). Setelah elektroforesis selesai, dilanjutkan dengan pewarnaan. Perwarnaan dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu dengan biru Coomassie atau dengan AgNO3. Pewarnaan dengan biru Coomassie dilakukan dengan merendam gel dengan larutan pewarna CBBR selama 90 menit, kemudian dilakukan dekolorisasi (pemucatan warna sehingga muncul pita-pita hasil pemisahan) dengan merendam gel dalam air mendidih selama 10 menit. Sementara itu, pewarnaan dengan AgNO3 dilakukan dengan cara merendam gel dalam larutan fiksatif selama 1 jam, lalu dicuci selama 30 menit sebanyak 2 kali dalam campuran metanol-air 1:1. Setelah itu gel direndam dalam larutan pewarna AgNO3 selama 15 menit dan direndam dengan akuades sebanyak 5 kali. Pita-pita pada gel dimunculkan warnanya dengan cara merendam gel tersebut pada larutan revelasi selama 3 5 menit. Aktivitas Inhibitor Tripsin Aktivitas inhibitor tripsin ditentukan secara tidak langsung dari aktivitas tripsinnya. Aktivitas tripsin diukur dengan metode yang dikemukakan oleh Walter (1984) yaitu memasukkan berturut-turut 150 l bufer trisHCl pH 7.8, 50 l larutan contoh, dan 350 l substrat kasein 2%, dan setelah itu divorteks. Campuran diinkubasi selama 0 dan 15 menit pada suhu 37 oC. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 1 ml TCA 0.3 M, lalu divorteks kembali, dan didiamkan selama 10 menit pada suhu ruang. Setelah itu, campuran disentrifugasi dengan laju 10,000 g pada suhu
4 oC selama 10 menit. Supernatan yang dihasilkan dipipet sebanyak 0.4 ml ke dalam tabung Eppendorf yang bersih lalu ditambahkan ke dalamnya 0.85 ml NaOH 0.5 M dan 0.25 ml pereaksi Folin-Ciocalteu. Larutan lalu didiamkan selama 15 menit dan diukur serapannya pada 728 nm. Sebagai pembanding digunakan model kalibrasi dari sederet standar. Standar yang digunakan ialah tirosina yang dianalisis dengan cara yang sama Aktivitas inhibitor tripsin dari masingmasing ekstrak protein diukur dengan cara mencampur 25 l ekstrak protein dan 25 l larutan stok tripsin 1 mg/ml ke dalam tabung Eppendorf, untuk selanjutnya diuji aktivitas tripsinnya. Aktivitas inhibisi diperoleh dengan membandingkan nilai yang didapat dengan aktivitas tripsin tanpa penambahan ekstrak protein.
HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstrak Protein Sel dipecahkan dengan penggerusan menggunakan mortar. N2 cair ditambahkan selama penggerusan sel agar tetap stabil. Bufer ektraksi yang digunakan memiliki pH 6.5, dan pada pH ini diharapkan protein target yang berada di bagian dalam sel dapat terekstraksi dengan baik. Pada ekstraksi protein ekstraselular dilakukan prakonsentrasi menggunakan aseton. Hal ini dikarenakan nisbah antara protein ekstraselular dan medium yang digunakan sangat kecil. Protein ini pun masih bercampur dengan sisa nutrien dalam medium. Hasil pengendapan dengan cara ini tidak seluruhnya dapat larut kembali ketika ditambahkan bufer fosfat pH 6.5. Sisa endapan yang tidak larut kemudian disaring sehingga diperoleh protein terlarut yang digunakan untuk pengujian selanjutnya. Ekstraksi protein dari kulit buah kakao sangat sulit karena kandungan pektinnya yang membentuk gel saat dilarutkan dengan air. Pada saat pencucian dengan TCA 10% berair, terbentuk gel yang pekat. Molekul protein diduga terperangkap dalam matriks gel ini, sehingga ekstraksi menjadi tidak efektif. Pada metode yang dilakukan oleh Pirovani et al. (2008) menggunakan sonikator untuk memecah gel yang terbentuk, dan menjadikannya larut dalam air. Di sisi lain, ekstraksi protein pada biji tidak membentuk gel. Protein hasil ekstraksi dari kulit dan biji
6
kakao ini berupa endapan putih. Namun, endapan yang terbentuk ini tidak seluruhnya dapat larut sempurna dalam bufer fosfat pH 6.5. Penyaringan dilakukan untuk menghilangkan protein yang tidak terlarut.
tripsin dengan adanya penambahan ekstrak protein dibandingkan dengan tanpa penambahan ekstrak (kontrol) menjadi identitasnya sebagai inhibitor tripsin. Homologi pada Bobot Molekul Protein
Kadar Protein Total Pengukuran kadar protein bertujuan untuk mengetahui nisbah awal antara volume sampel dan tripsin yang digunakan dalam pengujian aktivitas inhibisi tripsin. Namun data protein ini tidak dapat digunakan untuk menentukan sifat inhibisi dari protein inhibitor tripsin itu sendiri. Protein yang diuji masih merupakan ekstrak kasar dan perlu dilakukan fraksionasi untuk memisahkan protein target yang akan diuji dari protein lainnya. Pengukuran serapan pada penentuan kadar protein ini dilakukan pada 592 nm. Hal ini sesuai dengan nilai serapan tertinggi pada saat pemilihan 3). Nilainya maks (Lampiran berbeda dengan maks yang direkomendasikan oleh Sudarmanto (2007) dan Mikkelsen (2004), yaitu berturut-turut 595 dan 590 nm. Namun, perbedaan ini tidak menimbulkan penyimpangan yang berarti pada hasil pengukuran. Pada maksimum, serapan akan memberikan respons yang optimum sehingga nisbah antara sinyal analat dan sinyal yang akibat derau akan semakin tinggi. Perbedaan maksimum ini dapat terjadi karena perbedaan kondisi alat dan lingkungan saat pengukuran dilakukan. Hasil pengukuran dengan metode Bradford dapat dilihat pada Lampiran 4. Berdasarkan hasil pengukuran kadar protein, aktivitas inhibitor tripsin protein intraselular dan ekstraselular, diuji pada nisbah volume ekstrak protein pada volume tripsin sebesar 1:1, dengan konsentrasi tripsin aktual yang digunakan adalah 1.03 mg/ml. Hal ini agar pada saat pengukuran aktivitas tripsin, serapan yang diperoleh berada pada daerah kurva standar tirosina. Akan tetapi, aktivitas inhibitor spesifik dari protein 21 kDa yang terekspresi sulit ditentukan, terlebih untuk membandingkan sifat inhibisinya. Hal ini karena menggunakan ekstrak protein kasar yang belum mengalami fraksionasi. Walaupun demikian, pengujian aktivitas inhibitor tripsin dengan nisbah 1:1 antara ekstrak protein dan tripsin yang digunakan, diharapkan dapat memberikan pembuktian bahwa gen TcPIN yang diklon pada E. coli memang mengekspresikan protein 21 kDa yang aktif sebagai inhibitor tripsin. Penurunan aktivitas
Uji homologi dengan SDS-PAGE ni bertujuan memperkirakan jenis dan fungsi protein yang terekspresi berdasarkan bobot molekulnya. Namun, bobot molekul yang homolog tidak sepenuhnya dapat memberi kepastian akan fungsi molekul protein itu sendiri. Pengujian yang lebih spesifik diperlukan untuk menunjukkan fungsi sesungguhnya dari protein tersebut. Pencirian bobot molekul pada protein hasil ekstraksi dari kulit dan biji buah kakao dengan metode SDS-PAGE diperlihatkan pada Gambar 3A. Hasilnya, terlihat pita pada ekstrak protein Biji (3) dengan bobot molekul yang sedikit lebih tinggi dari penanda standar 21 kDa (M). Pita yang terlihat pun berbayang, hal ini diduga disebabkan oleh masih adanya polisakarida yang mengganggu (Pirovani et al. 2008). Pada ekstrak protein dari kulit buah sama sekali tidak nampak pita di daerah sekitar 21 kDa, baik pada klon Ary (1) maupun Bal (2). Hal ini disebabkan metode ekstraksi pada penelitian ini tidak dapat mengekstraksi protein dari matriks contoh kulit buah dan ekstrak protein dari kulit dan buah kakao ini tidak dilanjutkan ke tahap pengujian aktivitas inhibitor tripsin. Hal serupa diperoleh pula pada pewarnaan dengan AgNO3 seperti terlihat pada Gambar 3B. A
B
21 kDa
1 2 3 M 1 2 3 M Keterangan: 1 = Ary, 2 = Bal, 3 = Biji, M = Standar
Gambar 3 Hasil SDS-PAGE ekstrak protein dari kulit dan biji buah kakao dengan pewarna biru Coomassie (A) dan pewarna AgNO3 (B). Pada pencirian protein ekstraselular dari kultur E. coli yang diklon gen TcPIN (Gambar
7
4A), tidak terlihat jelas pita pada daerah sekitar 21 kDa, baik pada kulit kakao Bal (2) maupun Ary (3). Akan tetapi, Biji (1) terlihat ekspresinya pada daerah sekitar 21 kDa. Pewarnaan yang digunakan untuk memunculkan pita pada bagian ini adalah pewarna AgNO3 yang memiliki sensitivitas 100 kali lebih tinggi daripada pewarna biru Coomassie (Merril et al. 1979). Hal ini dilakukan karena pita-pita yang terbentuk pada pewarnaan dengan biru Coomassie tidak dapat dianalisis (data tidak ditampilkan). Pada pencirian protein intraselular (Gambar 4B). Pita di daerah sekitar 21 kDa teramati pada protein intraselular Ary (3) dan Bal (2). Kedua pita ini terlihat doublet, hal ini diduga disebabkan kadar 2-merkaptoetanol pada loading bufer kurang mencukupi atau telah mengalami kerusakan pada saat penyimpanan (Bio-rad 2009). Pita yang sejajar dengan penanda standar 21 kDa (M) terlihat sedikit berimpitan dengan pita yang memiliki bobot molekul lebih tinggi. Namun, protein 21 kDa cukup teridentifikasi dengan jelas dan dapat menunjukkan bahwa kedua bakteri E. coli yang diklon gen TcPIN yang mengekspresikan protein 21 kDa. Pada protein intraselular Biji (1), bobot molekul protein yang teramati lebih besar dari 21 kDa, dan perbedaan bobot molekul ini terlihat cukup jelas. Berdasarkan hal ini dapat dikatakan bahwa E. coli yang diklon gen TcPIN dari biji buah kakao tidak mengekspresiakan protein yang berukuran 21 kDa. A
petunjuk adanya aktivitas sebagai inhibitor tripsin. Penurunan ini disebabkan oleh adanya interaksi protein dengan tapak aktif dari tripsin, yang akan menginhibisi aktivitasnya sebagai enzim protease. Waktu inkubasi yang dipilih pada percobaan ini ialah 15 menit. Pada waktu inkubasi ini diharapkan serapan pada saat pengukuran tetap berada pada kisaran kurva standar tirosina yang digunakan. Pada Tabel 1 terlihat penurunan aktivitas tripsin untuk pengujian dengan penambahan ekstrak protein intraselular dari E. coli yang diklon gen TcPIN dari kulit buah kakao baik pada klon Ary maupun Bal. Penurunan ini terjadi dari aktivitas tripsin tanpa penambahan ekstrak protein (kontrol), yaitu sebesar 0.4434 U/mg berturut-turut menjadi 0.4245 U/mg dan 0.4169 U/mg. Penurunan ini berturut-turut nyata dan sangat nyata berdasarkan uji tstudent two-tails. Adanya penurunan ini menunjukkan bahwa pita 21 pada hasil SDSPAGE (Gambar 4B) merupakan protein yang aktif sebagai inhibitor tripsin. Selain itu juga membuktikan bahwa gen TcPIN dari kulit buah kakao klon Bal (2) dan Ary (3) yang ditransformasikan merupakan gen yang mengekspresikan protein 21 kDa yang aktif sebagai inhibitor tripsin. Hasil yang berkebalikan ditunjukkan pada penambahan ekstrak protein Biji. Aktivitas tripsinnya justru meningkat dari aktivitas kontrol menjadi 0.5514 U/mg. Data lengkap hasil pengujian protein intraselular ini terdapat pada Lampiran 5. Tabel 1 Hasil pengukuran aktivitas tripsin Aktivitas Penambahan ekstrak tripsin rerata protein (U/mg) Intraselular Kontrol 0.4434
B
21 kDa
Ekstraselular 1 2 3 M 1 2 3 M Keterangan: 1 = Biji, 2 = Ary, 3 = Bal, M = Standar
Gambar 4
Hasil elektroforesis SDS-PAGE protein ekspresi ekstraselular (A) dan intraselular (B).
Aktivitas Inhibitor Tripsin Penurunan aktivitas tripsin dengan penambahan ekstrak protein merupakan
Ary
0.4245*
Biji
0.5514
Bal Kontrol Ary
0.4169** 0.1864 0.2933
Biji
0.2001
Bal
0.2171
Keterangan: penurunan aktivitas tripsin secara statistik berbeda: (*) nyata, (**) sangat nyata
Pada hasil pengujian protein ekstraselular ketiganya tidak menunjukkan penurunan aktivitas tripsin, dan data lengkap hasil pengujian ini terdapat pada Lampiran 6. Aktivitas kontrol pada saat pengujian protein
8
ektraselular dan intraselular berbeda, yaitu berturut-turut 0.4434 dan 0.1864 U/mg. Hal ini karena waktu pengujian yang berbeda 5 hari dengan pengujian pada ekstrak protein intraselular. Penurunan dapat terjadi karena adanya galat pada pengaturan kondisi percobaan diantara pengujian protein ekstraselular dan intraselular. Kendatipun demikian, hal ini tidak menjadikan hasil pengujian inhibitor tripsin ini menjadi bias. Pengujian protein ekstraselular maupun intraselular, masing-masing dibandingkan dengan kontrol yang dianalisis pada waktu dan kondisi yang sama. Adanya kemungkinan terjadinya galat dari perbedaan hasil pengukuran aktivitas tripsin dengan ataupun tanpa perlakuan diharapkan dapat diminimumkan pada kondisi percobaan seperti ini. Pada hasil SDS-PAGE (Gambar 4A), walaupun terlihat pita pada daerah sekitar 21 kDa ditunjukkan ada pada ekstrak protein ekstraselular gen TcPIN dari biji (1), tetapi uji in vitro tidak menunjukkan penurunan aktivitas tripsin. Hal serupa juga diperoleh pada pengujian aktivitas inhibitor tripsin pada protein intraselularnya. Hal ini mempertegas bahwa gen TcPIN yang diisolasi dari biji kakao ini tidak mengekspresikan protein yang berperan sebagai inhibitor tripsin. Menurut Tai et al. (1991) protein 21 kDa yang ditemukan dalam jumlah yang besar di biji merupakan protein simpanan. Secara fisiologis biji berfungsi sebagai jaringan penyimpan (sink tissue) maka metabolit yang dikandung di dalamnya adalah cadangan makanan atau metabolit tersimpan. Pada protein ektraselular E. coli yang diklon gen TcPIN dari kulit buah kakao, baik dari klon Ary ataupun Bal, keduanya menunjukkan hasil yang bersesuaian, yaitu antara hasil pencirian dengan SDS-PAGE tidak menunjukkan adanya pita di daerah sekitar 21 kDa. Hasil uji in vitro pun tidak menunjukkan aktivitas inhibitor tripsin. Berdasarkan hasil ini maka diketahui bahwa gen TcPIN ini tidak terekspresi secara ekstraselular. Berdasarkan hasil penelitian Isda et al. 2008, gen yang menunjukkan fungsi sebagai gen TcPIN dari kakao akan mengekpresikan protein 21 kDa yang memiliki homologi dengan inhibitor tripsin. Pada hasil penelitian ini terbukti gen TcPIN yang diisolasi dari kulit buah kakao baik dari klon Ary maupun Bal menunjukkan aktivitas inhibitor tripsin pada protein hasil ekspresi intraselular. Sementara
gen TcPIN yang diisolasi dari biji kakao, ekspresi proteinnya tidak menunjukkan aktivitas sebagai inhibitor tripsin, baik pada protein hasil ekspresi secara ekstraselular maupun intraselular.
SIMPULAN DAN SARAN E. coli hasil trasformasi gen TcPIN yang diisolasi dari kulit buah kakao dari klon Ary ataupun Bal mengekspresikan secara intraselular protein yang aktif sebagai inhibitor tripsin. Di sisi lain, hasil transformasi gen TcPIN yang diisolasi dari biji kakao tidak mengekspresikan protein yang aktif sebagai inhibitor tripsin, baik secara intraselular, maupun ekstraselular. Masih diperlukan fraksionasi pada ekstrak protein terekspresi agar dapat diketahui karakter penghambatan spesifik dari protein 21 kDa yang diekspresikan oleh gen-gen tersebut. Hal ini untuk mengetahui apakah karakter dari protein yang diekspresikan oleh gen TcPIN tanaman kakao memberikan pengaruh terhadap serangan hama PBK.
DAFTAR PUSTAKA Berg JM, Tymaczko JL, Stryer L. 2000. Biochemistry. Ed ke-5. New York: WH Freeman. [Bio-rad.]. 2009. SDS-PAGE molecular weight standards, broad range. http://www.bio-rad.com/webroot/web/ pdf/ lsr/ literature/Bulletin_9515.pdf. [17 Nov 2009]. Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for quantitation of protein utilization: The principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-254. Chaidamsari T. 2005. Biotechnology for cacao pod borer resistance in cacao, [disertasi]. Wagenigen: Plant Research International, Wagenigen University. [Depperin]. Departemen Perindustrian. 2007. Gambaran Sekilas Industri Kakao. Jakarta: Sekertariat Jenderal Departemen Perindustrian. Foard DE, Murdock LL, Dunn PE. 1983. Engineering of crop plants with resistance
9
to herbivores and pathogens: An approach using primary gene products. Plant Mol Biol 2:223-233. Fritz H. 2000. Foreword. Di dalam: Helm K Von der, Korant BD, Cheronis JC. Protease as Targets for Therapy. Berlin: Springer-Verlag. hlm v-vii. Goenadi DH et Pengembangan 2. Jakarta: Pengembangan Pertanian.
al. 2007. Arah Dan Agribisnis Kakao. Ed keBadan Penelitian dan Pertanian, Departemen
Husaini A. 2009. Pengusaha kakao minta PPN tetap 0%. Kontan Online [terhubung berkala] http://www.kontan.co.id/ pengusaha [10 Jan 2009]. Isda MN, Kasim M, Mansyurdin, Chaidamsari T, Santoso D. 2008. Kloning dan karakterisasi gen penyandi inhibitor proteinase dari kulit buah kakao. Menara Perkebunan 76:83-92. Johnson R, Narraez J, An G, Ryan CA. 1989. Expression of proteinase inhibitors I and II in transgenic tobacco plant: Effects on natural defense against man-duga sexta larvae. Proc Natl Acad Sci USA 86:98719875. Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural protein during the assembly of head of bacteriophage T-4. Nature 227:680-685. Lawrence PK, Koundal KR. 2002. Plant protease inhibitors in control of phytophagous insects. J Biotech 5:93-109. Merril CR et al. 1979. Trace polypeptides in cellular extracts and human body fluids detected by two-dimensional electrophoresis and a highly sensitive silver stain. Proc Natl Acad Sci USA 76:4335-4339. Mikkelsen SR, Corton E. 2004. Bioanalitycal Chemistry. New Jersey: J Wiley. Newell CA. 1995. Transformation of sweet potato [Ipomoea batatas (L.) Lam.] with Agrobacterium tumefaciens and regeneration of plants expressing cowpea trypsin inhibitor and snowdrop lectin. Plant Sci 107:215-227.
Pirovani CP et al. 2008. Protein extraction for proteome analysis from cacao leaves and meristems, organs infected by Moniliophthora perniciosa, the causal agent of the witches’ broom disease. Weinheim: Electroforesis 29:2391-2401. Rawlings ND, Barrett AJ. 1993. Evolutionary families of peptidases. Biochem J 290:205-218. Richards P et al. 1998. Molecular Biomethods Handbook. Rapley R, Walker JM. Totono, editor. NewJersey: Humana Pr. Ryan CA. 1981. Proteinase Inhibitors. Di dalam: Stumpf PK, Conn EE editor. The Biochemistry of Plants—A Comprehensive Treatis. New York: Acad Pr. hlm:351-370. Ryan CA. 1990. Proteinase inhibitors in plants: Genes for improving defenses against insect and pathogens. Annu Rev Phytopathol 28:425-449. Steavens PM. 2007. Kimia Polimer. Sofyan L, penerjemah. Jakarta: Pradya Paramita. Terjemahan dari Polymer Chemistry: An Introductory. Sudarmanto A. 2007. Penetapan kadar protein dengan metode Bradford. [terhubung berkala] http://ariebs.staff.ugm.ac.id/?tag= analisis-protein [18 Jan 2009]. Terra WR, Ferreira C, Jordao BP, Dillon BJ. 1996. Digestive enzymes. Di dalam: Biology of The Insect Midgut. Lehane MJ, Billingsley PF, editor. London: Chapman & Hall. hlm:3-25. Tai H, McHenry L, Fritz PJ, Furtek DB. 1991. Nucleid acid sequence of 21 kDa cocoa seed protein with homology to the soybean trypsin inhibitor (Kumitz) family of protease inhibitor. Plant Mol Biol 16:913915. Walker AJ. et al. 1998. Characterisation of the midgut digestive proteinase activity of the two-spot ladybird (Adalia bipunctata L.) and its sensitivity to proteinase inhibitors. Insect Biochem and Mol Biol 28:173-180. Walter HE. 1984. Method with haemoglobin, casein, and azocoll as substrate. Di dalam: Bergmeyer HU. Methods of enzymatic
10
analysis. Deerfield Beach Florida Basel: Verlag Chemie. Wolf DH. 1992. Proteases as biological regulators introductory remarks. Experientia 48:117-118.
Xu at al. 1996. Expression of a late embryogenesis abundant protein cene, HVA7, from barley confers tolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice. Plant Physiol 11:249-257.
11
LAMPIRAN
12
Lampiran 1 Diagram alir penelitian
Kultur E. Coli (Hasil transformasi)
Contoh segar: Kulit buah kakao Biji buah kakao
Sentrifugasi
Ekstraksi protein
Supernatan
Pelet
Prakonsentrasi SDS-PAGE
Ekstraksi protein
Penentuan kadar protein (metode Bradford)
Uji aktifitas proteinase inhibiitor
13
Lampiran 2 Prosedur pembuatan pereaksi-pereaksi dan kultur E. coli Pembuatan pereaksi Bradford Sebanyak 50 mg kristal biru brillian Coomassie G250 dilarutkan dengan 25 ml etanol, lalu ditambahkan 50 ml asam ortofosfat dan diaduk, lalu ditera dengan akuades sampai 500 ml. Pembuatan bufer fosfat pH 6.5 Bufer fosfat dibuat dengan mencampur larutan KH2PO4 0.2 M dan K2HPO4 0.2 M lalu ditepatkan menjadi pH 6.5, KH2PO4 0.2 M dibuat dengan cara melarutkan 1.36 g KH2PO4 dengan akuades lalu ditera sampai 50 ml. Sementara larutan K2HPO4 0.2 M dibuat dengan cara melarutkan 2.28 g K2HPO4 dengan aquades lalu ditera sampai 50 ml. Pembuatan larutan standar kasein Sebanyak 2 g kasein ditambah 10 ml akuades dan 1 ml NaOH 2%, kemudian diaduk, lalu ditepatkan dengan HCl sampai pH-nya mencapai 7.5. Pembuatan pereaksi akrilamida Dilarutkan masing-masing 14.6 g akrilamida dan 0.4 g N’N’-bismetilena-akrilamida dengan 15 ml akuades, lalu keduanya dicampur dan ditera sampai volumenya 50 ml. Kemudian larutan tersebut disaring dengan kertas saring. (Larutan disimpan pada suhu 4 oC dan kondisi gelap). Pembuatan pereaksi SDS-dense 30 g sukrosa, 2 g SDS, dan 5 ml 2-merkaptoetanol dilarutkan dengan tris-HCl pH 8.0 sampai 100 ml Pembuatan bufer tris-HCl pH 7.8 1.5 M Sebanyak 9.08 g tris dilarutkan dalam 25 ml akuades, lalu diatur pH-nya sehingga mencapai pH 7.8 dengan HCl. Setelah pH tercapai, ditera dengan akuades sampai 50 ml. Pembuatan SDS 10% Sebanyak 10 g SDS dilarutkan dengan 100 ml akuades. Komposisi bufer loading Pereaksi Tris-HCl 0.5 M pH 6.8 Gliserol SDS 10% 2-Merkaptoetanol Bromfenol 0.05% Akuades
Volume (ml) 1.0 0.8 1.6 0.4 0.2 4.0
Prosedur kultur E. coli hasil transformasi E. coli yang disimpan dalam stok gliserol dikultur ke dalam 250 ml media LB cair yang ditambahkan 200 ml ampisilin dan 6.25 ml kasein 2%, lalu diinkubasi selama 3 hari dengan suhu 18 oC.
14
Lampiran 3 Penentuan
maksimum pada pengukuran kadar protein
Transmitans (%)
Serapan
(nm)
700 690 680 670 660 650
79.97 76.66 72.65 68.18 63.15 57.52
0.0971 0.1154 0.1388 0.1663 0.1996 0.2402
640 630 620 610 600
51.64 46.54 42.80 39.58 38.02
599 598 597 596 595
(nm)
Transmitans (%)
Serapan
594 593 592 591 590 589
37.49 37.45 37.40 37.40 37.40 37.42
0.4261 0.4265 0.4271 0.4271 0.4271 0.4269
0.2870 0.3322 0.3686 0.4025 0.4200
588 587 586 585 580
37.42 37.46 37.50 37.57 38.24
0.4269 0.4264 0.4260 0.4252 0.4175
37.88 37.78
0.4216 0.4227
570 560
41.32 48.37
0.3838 0.3154
37.66 37.56 37.49
0.4241 0.4253 0.4261
550 540 530
59.66 74.96 92.92
0.2243 0.1252 0.0319
Gambar kurva hubungan antara serapan dan panjang gelombang
15
Lampiran 4 Hasil pengukuran kadar protein
1. Data lengkap hasil pengukuran kadar protein pada ekstrak protein ekstraselular dan intraselular Contoh
Ulangan
Transmitans (%)
Serapan
Kadar protein ( g/ml)
Protein Ekstraselular Biji
1 2 3 4 5
51.68 52.18 51.68 51.69 51.67
0.2867 0.2825 0.2867 0.2866 0.2868
602.9437 592.4898 602.9437 602.7337 603.1538
Protein Ekstraselular Ary
1 2 3 4 5
54.21 54.73 54.91 57.69 56.96
0.2659 0.2618 0.2603 0.2389 0.2444
551.0515 540.6864 537.1214 483.4987 497.3250
1 2
58.60 56.32
0.2321 0.2493
466.5060 509.5934
3 4 5
56.94 56.53 58.41
0.2446 0.2477 0.2335
497.7063 505.5525 470.0320
1 2 3 4
62.10 60.08 59.82 60.53
0.2069 0.2213 0.2232 0.2180
21.2379 23.1276 23.3755 22.7012
5 6
63.77 62.70
0.1954 0.2027
19.7215 20.6885
1 2 3 4
49.95 50.53 49.63 49.40 50.03
0.3015 0.2965 0.3043 0.3063 0.3008
33.6795 33.0198 34.0468 34.3122 33.5881
49.40
0.3063
34.3122
1 2 3 4 5
42.26 41.51 42.13 41.75 41.55
0.3741 0.3818 0.3754 0.3793 0.3814
43.2330 44.2562 43.4090 43.9268 44.2012
6
41.69
0.3800
44.0090
Protein Ekstraselular Bal
Protein Ekstraselular Biji
Protein Ekstraselular Ary
5 6 Protein Ekstraselular Bal
16
Lanjutan lampiran 4 2. Standar BSA ( = 592 nm) Konsentrasi ( g/ml)
Transmitans (%)
Serapan
5.07 10.13 20.26 40.52 70.91 101.30
88.26 76.79 65.29 39.61 22.85 16.84
0.0542 0.1147 0.1852 0.4022 0.6411 0.7737
Y = 0.0077x + 0.0431 R2 = 0.9808
Konsentrasi ( g/ml) Gambar kurva hubungan antara serapan dengan konsentrasi BSA 3. Rerata kadar protein sampel protein ekspresi dari E. coli yang membawa gen TcPINa Contoh Ulangan
Ekstraselular
Biji
Ary
Bal
Biji
Ary
Bal
1
602.7337
483.4987
466.5060
19.7215
33.0198
43.2330
2 3 4 5 6
602.9437 602.9437 603.1538 -
497.3250 537.1214 540.6864 551.0515 -
470.0320 497.7063 505.5525 509.5934 -
20.6885 21.2379 22.7012 23.1276 23.3755
33.5881 33.6795 34.0468 34.3122 34.3122
43.4090 43.9268 44.0090 44.2012 44.2562
603.0138
521.9366
489.8780
21.8087
33.8265
43.8392
0.1715
29.6353
20.2224
1.4784
0.4999
0.4228
Rerata Stdv a
Intraselular
Konsentrasi seluruhnya dalam g/ml.
17
Lampiran 5 Hasil pengukuran aktivitas tripsin dengan penambahan protein ekspresi intraselular 1.
Standar tirosina ( 578 nm) Konsentrasi ( g/ml) 0.0000 0.0459 0.0918 0.1836 0.3672 0.5610 0.7445 0.9281 1.1219
Transmitans (%) 100.00 91.50 83.53 70.01 49.65 37.36 25.43 20.39 15.74
Y = 0.07213x + 0.0218 R2 = 0.9953
Gambar kurva hubungan antara serapan dan konsentrasi tirosina
Serapan 0.0000 0.0386 0.0782 0.1548 0.3041 0.4276 0.5947 0.6906 0.8030
18
Lanjutan lampiran 5 3. Aktivitas tripsin (U/mg) T 0' (%) 69.06 69.09 69.41 69.67 69.89 70.55 72.68
T 15' (%) 39.55 39.86 40.37 40.52 42.16 42.48 42.96
A15' − A0' 0.2421 0.2389 0.2354 0.2354 0.2195 0.2203 0.2284
Aktivitas (U/mg) 0.4639 0.4577 0.4510 0.4510 0.4206 0.4222 0.4376
Ary
52.28 55.22 58.27 58.49 58.61 59.06 60.2
31.29 33.70 34.60 34.93 34.99 35.38 36.58
0.2229 0.2145 0.2264 0.2239 0.2240 0.2225 0.2164
0.4272 0.4110 0.4338 0.4290 0.4293 0.4264 0.4146
Biji
59.25 60.90 61.18 61.27 62.08 62.09
28.64 29.27 31.65 32.30 32.65 33.39
0.3157 0.3182 0.2862 0.2780 0.2791 0.2694
0.6050 0.6097 0.5485 0.5328 0.5348 0.5162
62.40
33.69
0.2677
0.5129
56.90 59.22 60.10 60.78 61.05 62.58
35.19 36.42 36.55 36.65 36.77 37.44
0.2087 0.2111 0.2160 0.2197 0.2202 0.2231
0.3999 0.4046 0.4139 0.4210 0.4219 0.4275
63.61
37.95
0.2243
0.4298
Penambahan contoh Blangko
Bal
Keterangan: %T 0’ %T 15’ A15' − A0'
: transmitans pada saat inkubasi 0 menit : transmitans pada saat inkubasi 15 menit : selisih serapan pada inkubasi 0−15 menit
Perhitungan : Aktivitas (U/mg)
=
fp
=
Kadar tripsin (mg/ml)
=
((A15' – A0' − 0.0218)/0.7213) × fp Waktu inkubasi (menit) x kadar tripsin (mg/ml) 550 25 51.9 mg 50 ml
(Perhitungan aktivitas tripsin mengacu pada metode yang digunakan Welter 1984)
19
Lampiran 6 Hasil pengukuran aktivitas tripsin dengan penambahan protein ekstraselular 1.
Standar tirosina ( Konsentrasi ( g/ml) 0.0000 0.0894 0.1788 0.3576 0.5464 0.7252 0.9040 1.0928
578 nm) Transmitans (%) 100.00 86.01 76.79 61.23 51.93 47.05 41.08 38.82
Y = 0.07378x + 0.0231 R2 = 0.9956
Gambar kurva hubungan antara serapan dan konsentrasi tirosina
Serapan 0.0000 0.0655 0.1147 0.2130 0.2846 0.3274 0.3864 0.4109
20
Lanjutan lampiran 6 3. Aktivitas tripsin (U/mg) Penambahan Contoh Blangko
T 0' (%) 96.73 97.11 97.17 97.43 97.49 97.50 97.64
T 15' (%) 70.77 71.01 71.32 72.24 72.31 72.34 73.82
A15' − A0' 0.1357 0.1359 0.1343 0.1299 0.1298 0.1296 0.1215
Aktivitas (U/mg) 0.1944 0.1863 0.1836 0.1888 0.1872 0.1893 0.1752
82.78 83.55 83.97 84.12 84.47 84.54
58.71 59.85 60.14 60.43 61.54 62.27
0.1492 0.1449 0.1450 0.1436 0.1375 0.1328
0.3431 0.3184 0.3017 0.2802 0.2759 0.2655
84.68
64.97
0.1151
0.2683
88.10 88.39 88.55 88.90 88.94 89.66
63.27 63.89 64.47 64.80 65.35 65.37
0.1438 0.1410 0.1378 0.1373 0.1339 0.1372
0.2082 0.2060 0.2082 0.2065 0.1988 0.1912
90.16
67.07
0.1285
0.1817
83.50 83.83 84.28 84.62 85.32 85.60
60.14 60.42 61.13 61.19 61.20 62.60
0.1425 0.1422 0.1395 0.1408 0.1443 0.1359
0.2253 0.2238 0.2213 0.2251 0.2075 0.1997
-
-
-
-
Ary
Biji
Bal
Keterangan: %T 0’ %T 15’ A15' − A0'
: transmitans pada saat inkubasi 0 menit : transmitans pada saat inkubasi 15 menit : selisih serapan pada inkubasi 0−15 menit
Perhitungan : Aktivitas (U/mg)
=
fp
=
Kadar tripsin (mg/ml)
=
((A15' – A0' − 0.0231)/0.7378) × fp Waktu inkubasi (menit) x kadar tripsin (mg/ml) 550 25 51.9 mg 50 ml
(Perhitungan aktivitas tripsin mengacu pada metode yang digunakan Welter 1984)
