KO-156
0041: Wien Kusharyoto dkk.
EKSPRESI PROTEIN FUSI TRIVALENSI YANG TERBENTUK DARI FAKTOR VIRULENSI ESPA, INTIMIN DAN TIR DARI BAKTERI Escherichia coli O157:H7 Wien Kusharyoto*, Asrul Muhamad Fuad, Dian Andriani, Ira Handayani Pusat Penelitian Bioteknologi – Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Jl. Raya Bogor KM. 46, Cibinong-Bogor 16911 Telepon (021) 8754587 *e-Mail:
[email protected] Disajikan 29-30 Nop 2012
ABSTRAK Bakteri Escherichia coli enterohaemorajik (EHEC: enterohaemorhagic E. coli) merupakan salah satu dari bakteri pathogen umum yang ditularkan melalui makanan. E. coli serotipe O157:H7 adalah serotipe E. coli utama untuk jenis infeksi tersebut, dan merupakan penyebab utama infeksi dari diare berdarah yang dapat berakibat pada gagal ginjal pada anak-anak yang mengalami hemolytic uremic syndrom (HUS). Vaksinasi dapat mengurangi tingkat kolonisasi dan pembuangan E. coli O157:H7 sehingga berpotensi pula dalam menurunkan insiden penyakit pada manusia yang disebabkan oleh E. coli O157:H7. Intimin, EspA dan Tir merupakan faktor virulensi dari E. coli EHEC dan dianggap sebagai kandidat potential dalam pembentukan vaksin untuk mencegah kolonisasi dan transmisi dari E. coli O157:H7. Dalam kegiatan penelitian ini dikembangkan protein fusi rekombinan yang terdiri dari kombinasi antara fragmen immunogenik dari Intimin, EspA dan Tir untuk digunakan sebagai kandidat antigen untuk vaksinasi. Pertimbangan utama dari pembentukan protein fusi tersebut adalah untuk meningkatkan sifat immunogenik dari antigen/vaksin dalam menginduksi respon kekebalan. Fragmen immunogenik dari Intimin (Intimin282), EspA (EspA128) serta Tir (Tir103) masing-masing dihubungkan dengan rantai peptida penghubung (linker) LA(EAAAK)4AAA yang membentuk empat rantai α-heliks, sehingga diperoleh pemisahan spasial yang efisien antara tiap fragmen protein. Pada ujung karboksi (Cterminal) dari protein fusi tersebut ditambahkan enam asam amino histidin (His6) yang memungkinkan purifikasi protein dengan kromatografi affinitas pada ion logam terimmobilisasi (IMAC). Gen penyandi protein fusi tersebut kemudian disintesis dan diklon ke dalam vektor pJExpress, dan vektor ekspresi yang diperoleh kemudian ditransformasikan ke dalam bakteri E. coli JM109. Produksi protein rekombinan dilakukan melalui fermentasi dalam SB (super-broth)-medium pada suhu 37°C dan diinduksi dengan IPTG. Protein rekombinan diisolasi dari sel bakteri dan dipurifikasi dengan IMAC pada TALON™ matriks. Hasil ekspresi dan purifikasi diverifikasi dengan SDS-PAGE dan Western blot yang menunjukkan ukuran protein fusi rekombinan EspA128/Intimin282/Tir103 sebesar 63 kDa yang sesuai dengan ukuran protein berdasarkan sekuen asam aminonya. Kata Kunci: E. coli O157:H7, EspA, Intimin, Tir, protein fusi rekombinan
I. PENDAHULUAN Meskipun E. coli EHEC O157:H7 merupakan salah satu penyebab utama penyakit diare berdarah, namun sampai saat ini belum tersedia vaksin di pasaran untuk mencegah infeksi dan penularan oleh bakteri tersebut. E. coli serotipe O157:H7 adalah serotipe E. coli utama untuk jenis infeksi tersebut, dan merupakan penyebab utama infeksi dari diare berdarah yang dapat berakibat pada gagal ginjal pada anakanak yang mengalami hemolytic uremic syndrom (HUS) [1]. Jenis bakteri tersebut terutama ditularkan melalui binatang
ternak sapi yang terinfeksi, baik secara langsung maupun tidak langsung ke manusia. Kasus-kasus infeksi oleh E. coli O157:H7 in Amerika Serilat terutama berasal dari konsumsi hamburger terkontaminasi yang tidak dimasak sempurna atau produk-produk lainnya yang bersentuhan dengan kotoran sapi. Baik sapi potong maupun sapi perah dapat secara sporadis mengalami kolonisasi oleh E. coli O157:H7 yang mampu menghuni sistem pencernaan sapi, dan membuang bakteri tersebut ke lingkungan melalui kotoran mereka [2]. Dengan demikian, vaksinasi pada sapi atau perlakuan pada mereka yang bekerja dengannya dapat
KO-157
0041: Wien Kusharyoto dkk. mengurangi tingkat kolonisasi dan pembuangan E. coli O157:H7 dapat pula berpotensi dalam menurunkan insiden dari penyakit-penyakit pada manusia yang disebabkan oleh E. coli O157:H7. Intimin merupakan salah satu protein membran dari sel E. coli O157:H7; sebuah protein adhesin, yang diperlukan untuk proses pelekatan dan pemisahan, maupun dalam pengikatan sel bakteri pada sel mamalia dan mucosa usus dari ternak [3]. Intimin merupakan produk dari gen eae (E. coli attaching and effacing) yang terkandung dalam sebuah pulau pathogenisitas (pathogenicity island) yang disebut sebagai locus of enterocyte effacement (LEE) [4]. Bagian Cterminal dari intimin berikatan dengan protein reseptor yang berasal dari bakteri tersebut, yaitu Tir (translocated intimin receptor), sehingga menciptakan pengikatan yang erat antara sel bakteri dengan permukaan sel mamalia. Dengan demikian, intimin dianggap sebagai salah satu kandidat potential dalam pembentukan vaksin untuk mencegah transmisi dari E. coli O157:H7. Telah ditunjukkan oleh beberapa studi bahwa antibodi yang spesifik terhadap intimin berperan penting dalam mencegah pengikatan bakteri pada sel inang dan melindungi sel inang dari penyakit yang ditularkan oleh E. coli O157:H7. EspA (E. coli secreted protein A), faktor virulensi lainnya dari EHEC, merupakan protein yang disekresikan oleh E. coli dan membentuk struktur filamen pada permukaan sel EHEC. EspA adalah salah satu dari sistem sekresi tipe III (type III secretion system atau TTSS) dan mentrans-lokasikan Tir ke sel epithel dari inang. Protein EspA juga dianggap sebagai kandidat potensial dalam pengem-bangan vaksin terhadap EHEC [5]. Melalui TTSS, Tir ditranslokasikan ke dalam plasma membran dari sel inang, dan kemudian berfungsi sebagai sebuah reseptor bagi intimin. Interaksi intimin-Tir menyebabkan akumulasi skeletal di bawah area pengikatan bakteri dengan sel inang. Dalam serum dari hewan yang terinfeksi oleh EHEC terkandung antibodi yang spesifik terhadap Tir. Dengan demikian pengenalan Tir oleh antibodi dapat pula berperan penting dalam mencegah pengikatan bakteri pada sel inang melalui pencegahan interaksi antara Tir dengan intimin [6]. Sebelumnya, vaksinasi untuk mencegah kolonisasi EHEC terutama dikembangkan dengan menggunakan protein intimin atau fragmennya sebagai komponen utama vaksin. Intimin digunakan sebagai protein tunggal dalam vaksinasi [2,7] atau dikombinasikan dengan protein lain yang disekresikan oleh E. coli ( E. coli secreted proteins atau Esp) ]8]. Percobaan terakhir dalam vaksinasi terhadap EHEC telah menggunakan protein rekombinan trivalensi yang terdiri dari EspA, intimin and Stx2 [9]. Respon kekebalan humoral yang kuat pada mencit menunjukkan bahwa vaksin multivalensi dapat lebih efektif digunakan sebagai vaksin terhadap EHEC daripada vaksin yang hanya terdiri dari
protein tunggal. Protein trivalensi tersebut diekspresikan di E. coli sebagai inang. Dalam kegiatan penelitian ini dikembangkan protein fusi rekombinan yang tersusun dari fragmen immunogenik EspA, Intimin dan Tir untuk digunakan sebagai antigen untuk vaksinasi. Pertimbangan utama dari pembentukan protein fusi trivalensi tersebut adalah untuk meningkatkan sifat immunogenik dari antigen/vaksin dalam menginduksi respon kekebalan pada hewan model, di samping untuk menghindari pembentukan protein antigen secara terpisah agar dapat menghemat biaya dan mempermudah proses produksi.
II. METODOLOGI A. Konstruksi vektor ekspresi pJE-IncentA Sekuen gen yang menyandi protein Intimin, EspA dan Tir diperoleh dari GenBank berdasarkan pada sekuen genom E. coli O157:H7 galur Sakai dengan nomor akses NC_002695.1. Sekuen asam amino dari fragmen immunogenik Intimin (Intimin282), EspA (EspA128) dan Tir (Tir103) ditentukan berdasarkan data yang terdapat di literatur [3]. Gen penyandi ketiga fragmen tersebut dioptimisasi penggunaan codonnya untuk ekspresi di E. coli dengan perangkat lunak GeneDesigner (DNA2.0). Gen penyandi EspA128 dan Intimin282 digunakan untuk mengkonstruksi gen penyandi protein divalensi EspA128/Intimin282 dengan rantai peptida penghubung (linker) LA(EAAAK)4AAA di antaranya [10]. Gen penyandi protein EspA128/ Intimin282 disintesis oleh DNA2.0 (Menlo Park, CA) dan diklon ke dalam vektor ekspresi pJExpress404, sehingga diperoleh vektor pJE-IncentA. Gen penyandi protein Tir103 yang telah dioptimisasi penggunaan codonnya untuk ekspresi di E. coli disintesis oleh ShineGene (Shanghai, China). Gen penyandi Tir103 kemudian diklon ke dalam vektor pJE-IncentA dengan menggunakan situs restriksi NotI dan XhoI yang tersedia, sehingga diperoleh vektor pJEIncentA yang mengandung gen EspA128/Intimin282/ Tir103. Di ujung 5’ dari gen tersebut terdapat sekuen penyandi peptida sinyal pelB dari Erwinia carotovora, sedangkan pada ujung 3’ terdapat sekuen penyandi His6-tag. Hasil kloning tersebut diverifikasi dengan sekuensing DNA serta pemotongan secara enzimatik yang dilanjutkan dengan agarose-elektroforesis. B. Ekspresi protein fusi EspA128/ Intimin282/Tir103 di E. coli Vektor ekspresi pJE-IncentA yang mengandung gen penyandi EspA128/ Intimin282/Tir103 ditransformasikan ke dalam E. coli JM109 dengan kejut panas (heat-shock). Satu koloni bakteri yang mengandung pJE-IncentA diinokulasikan ke dalam 3 mL SB (Super-Broth)-medium (dengan 100 μg/ml ampicillin), lalu diinkubasi selama 18 jam pada suhu 37°C dan 200 rpm. Komposisi SB-Medium adalah
KO-158
0041: Wien Kusharyoto dkk.
sebagai berikut (dalam g/l): 20 g Trypton; 10 g ekstrak ragi; 10 g NaCl; 33 ml 1,5 M K2HPO4; 5 ml 1 M MgSO4 dan 10 ml glukosa 50%. Sebanyak 2 ml kultur bakteri tersebut diinokulasikan ke dalam 100 ml SB- medium yang mengandung 100 μg/ml ampicillin, lalu diinkubasi pada suhu 37°C dan 200 rpm selama 3 jam (OD600nm = 0,5–0,7). Ekspresi protein EspA128/Intimin282/Tir103 dalam sel E.coli JM109 diinduksi dengan penambahan 100 μl IPTG, dan kultur sel diinkubasi lebih lanjut selama 4 jam. Setelah sentrifugasi pada 5000×g selama 15 menit, pellet sel yang diperoleh disimpan pada suhu –35°C. C. Purifikasi protein fusi EspA128/ Intimin282/Tir103 Setelah penyimpanan selama semalam pada suhu −35ºC, sel beku tersebut dicairkan pada suhu 4°C, lalu disuspensikan ke dalam 10 ml larutan natriumfosfat (50 mM, 300 mM NaCl, pH 7,2). Ke dalam suspensi sel tersebut kemudian ditambahkan larutan lysozyme (konsentrasi akhir 0,2 mg/ml) dan diinkubasi pada suhu ruang selama 20 menit. Setelah itu suspensi sel disonifikasi 4 × 30 detik pada suhu 0ºC (dalam es). Dengan kondisi tersebut membran terluar E. coli dapat terbuka untuk membebaskan protein EspA128/Intimin282/Tir103 dan komponen protein lainnya dari periplasma E. coli. Suspensi tersebut disentrifugasi pada suhu 4°C dan 10.000×g selama 15 menit. Kolom kromatografi untuk purifikasi protein disiapkan dengan memasukkan 2 ml resin TALON™ (Clontech) ke dalam kolom PD-10 (GE-Bioscience). Resin TALON™ dalam kolom PD-10 tersebut mampu mengikat sekitar 4 mg protein yang mengandung His6-tag. Resin tersebut diekuilibrasi dengan 12 ml larutan ekulibrasi (50 mM, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 7,2). Sebanyak 10 ml ekstrak sel E. coli diaplikasikan ke dalam IMAC dan kemudian dicuci dengan 2 x 12 ml larutan ekuilibrasi yang mengandung 40 mM imidazole. Protein EspA128/ Intimin282 yang terikat pada matriks TALON™ dielusi dengan larutan elusi (50 mM, 300 mM NaCl dan 150 mM imidazole, pH 7,2). Fraksi elusi ditampung setiap 1 (satu) ml. D. SDS-PAGE dan Western blot Ekspresi dan purifikasi protein EspA128/Intimin282/Tir103 diverifikasi dengan SDS-PAGE [11]. Protein yang telah dipurifikasi kemudian dianalisis lebih lanjut dengan Western blot dengan menggunakan HisDetector™ Western Blot Kit, HRP Colorimetric (KPL, Gaithersburg, MD) berdasarkan instruksi yang diberikan.
III.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Berbagai tipe vaksin untuk mencegah kolonisasi dan pelepasan bakteri penyebab diare berdarah E. coli O157:H7 sebelumnya telah diproduksi dan dievaluasi pada mencit maupun hewan ternak sebagai kandidat vaksin. Vaksinvaksin yang terbentuk terutama berbasis pada protein-
protein yang disandi oleh gen yang terdapat dalam locus spesifik yang disebut sebagai LEE yang memegang peran kunci dalam kolonisasi oleh E. coli O157:H7 di usus hewan ternak [12]. Sebelumnya telah ditunjukkan, bahwa immunisasi dengan kombinasi dari protein tunggal EspA, Intimin dan Tir mampu membentuk respon kekebalan terhadap E. coli O157:H7 [13]. Dalam penelitian ini dibentuk protein fusi rekombinan trivalensi EspA128/ Intimin282/Tir103 yang dapat dimanfaatkan sebagai kandidat vaksin untuk pencegahan. Berdasarkan penjajaran sekuen asam amino penyusun protein EspA, Intimin dan Tir, dengan ClustalX (data tidak ditampilkan), terdapat derajat konservasi sekuen yang tinggi dari berbagai galur E. coli O157:H7, sehingga dipilih sekuen asam amino penyusun ketiga protein tersebut dari E. coli O157:H7 galur Sakai sebagai acuan untuk mengkonstruksi sekuen protein fusi. Dalam mendisain gen sintetik penyandi protein fusi, fragmen pertama dari protein fusi adalah fragmen dari EspA yang terdiri atas 128 asam amino C-terminal dari EspA, dan disebut sebagai EspA128. EspA128 tersebut terletak di bagian luar dari permukaan sel bakteri serta menunjukkan respon immunogenik yang tinggi [14]. Dalam mendisain fragmen kedua, hanya 282 asam amino C-terminal dari Intimin yang digunakan (Tir282), karena 282 asam amino tersebut terlibat langsung dalam pengikatan oleh reseptor intimin Tir (translocated intimin receptor) [15]. Bagian dari Tir yang terlibat dalam pengikatan intimin juga telah dipetakan, yaitu asam amino 258 sampai dengan 361 dan disebut sebagai Tir103 [16]. Berdasarkan karakteristik struktur dari ketiga fragmen protein tersebut, diputuskan bahwa Intimin282 akan dikonjugasikan dengan C-terminal dari EspA128, sedangkan Tir103 dihubungkan dengan Cterminal dari Intimin282. Agar fragmen EspA128 Intimin282 dan Tir103 dalam konstruksi protein fusi tetap terpisah satu sama lain secara efektif sehingga fungsi immunogenik masing-masing tetap terjaga, maka di antara ketiga fragmen tersebut ditambahkan rantai peptida penghubung (peptide linker) yang membentuk rangkaian struktur α-Helix, seperti ditunjukkan oleh rantai A(EAAAK)nA [17]. Sebelumnya telah ditunjukkan bahwa rantai peptida penghubung LA(EAAAK)nAAA dapat secara efektif memisahkan protein fusi antara EGFP (enhanced green fluorescent protein) dan EBFP (enhanced blue fluorescent protein) [10]. Oleh karena itu, rantai peptida LA(EAAAK)4AAA dipilih sebagai rantai penghubung antara EspA128, Intimin282 dan Tir103.
Gambar 1: Diagram vektor ekspresi pJE-IncentA untuk ekspresi protein fusi EspA128/Intimin282/Tir103 di E. coli Gen penyandi protein fusi tersebut dioptimisasi penggunaan codonnya untuk ekspresi di E. coli, disintesis dan diklon ke dalam vektor pJExpress404 untuk
0041: Wien Kusharyoto dkk. memperoleh vektor ekspresi pJE-IncentA (Gambar 1). Pengujian keberadaan gen EspA128/Intimin282/ Tir103 di dalam vektor ekspresi pJE-IncentA dilakukan melalui sekuensing. Di samping itu, dilakukan pula uji pemotongan (digestion) dengan menggunakan dua enzim restriksi yaitu NdeI dan XhoI serta verifikasinya dengan agarose gelelektroforesis. Hasil agarose-elektroforesis (Gambar 2) menunjukkan adanya fragmen DNA linear dari vektor ekspresi pJE-IncentA dengan ukuran sekitar 5800 bp setelah pemotongan dengan NdeI atau XhoI, dan fragmen DNA linear untuk gen penyandi EspA128/Intimin282/Tir103 dengan ukuran sekitar 1900 bps setelah pemotongan dengan NdeI dan XhoI.
KO-159 dengan prakiraan ukuran protein tersebut berdasarkan sekuen asam aminonya.
Gambar 3: Verifikasi ekspresi dan purifikasi protein EspA128/Intimin282/ Tir103 dengan SDS-PAGE CE: ekstrak sel, FT: ”flow-through”, W: pencucian, E: Elusi
Gambar 2: Agarose-elektroforesis dari vektor ekspresi pJE-IncentA setelah pemotongan enzimatik dengan NdeI dan XhoI Untuk memproduksi protein EspA128/Intimin282/Tir103, E. coli JM109 yang telah mengandung pJE-IncentA ditumbuhkan dalam SB-Medium pada suhu 37°C. Penggunaan SB-medium memungkinkan perolehan kepadatan sel yang lebih tinggi, OD600 = 2,1 dibandingkan OD600 = 1,4 dengan LB-medium serta jangka waktu ekspresi yang lebih lama (data tidak ditampilkan). Isolasi secara selektif terhadap protein yang diekspresikan dalam periplasma dilakukan dengan penambahan lysozyme ke dalam suspensi sel tersebut serta sonikasi. Ekstrak sel yang diperoleh kemudian dipurifikasi dengan menggunakan IMAC pada resin TALON™ dalam kolom PD-10 [18]. Hasil ekspresi dan purifikasi protein kemudian diverifikasi dengan SDS-PAGE (Gambar 3). Hasil SDS-PAGE menunjukkan adanya pita untuk protein EspA128/ Intimin282/Tir103, yang terdapat pada sekitar 63 kDa, baik pada tahap ekspresi (lajur untuk CE atau FT) maupun pada tahap elusi protein (lajur E2), sesuai
Purifikasi protein fusi EspA128/ Intimin282/Tir103 tersebut kemudian diverifikasi lebih lanjut dengan Western blot menggunakan HisDetector™ Western Blot Kit yang menunjukkan keberadaan pita dengan ukuran sekitar 63 kDa (Gambar 4). Dengan demikian protein fusi EspA128/Intimin282/Tir103 dapat dipurifikasi melalui satu tahap pemurnian dengan TALON™-matriks. Pemisahan imidazol yang digunakan dalam tahap elusi serta penggantian larutan penyangga dari protein EspA128/Intimin282/Tir103 dilakukan dengan menggunakan kolom PD-10 yang berisi Sephadex G-25 (data tidak ditampilkan).
Gambar 4: Verifikasi purifikasi protein EspA128/Intimin282/ Tir103 dengan Western blot
KO-160
0041: Wien Kusharyoto dkk.
Protein fusi rekombinan EspA128/ Intimin282/Tir103 yang diperoleh selanjutnya dapat digunakan sebagai antigen dalam immunisasi untuk mencegah kolonisasi dan penyebaran bakteri E. coli O157:H7 pada hewan uji.
IV.
[10]
KESIMPULAN
Melalui disain gen penyandi yang diikuti dengan sintesis gen dan ekspresi protein di periplasma bakteri E. coli telah dapat dibentuk protein fusi rekombinan trivalensi EspA128/ Intimin282/Tir103 yang akan diman-faatkan sebagai protein antigen dalam vaksinasi terhadap hewan uji untuk mencegah kolonisasi dan penyebaran E. coli O157:H7. Protein fusi trivalensi serupa saat ini sedang diupayakan pula untuk diekspresikan pada tanaman agar dapat digunakan sebagai kandidat vaksin oral.
[11]
[12]
[13]
DAFTAR PUSTAKA [1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
Girard, M.P., Steele, D., Chaignat, C.L., Kieny, M.P. (2006) A review of vaccine research and development: human enteric infections. Vaccine 24: 2732–2750 Judge, N.A., Mason, H.S., O'Brien, A.D. (2004) Plant cell-based intimin vaccine given orally to mice primed with intimin reduces time of Escherichia coli O157:H7 shedding in feces. Infect. Immun. 72: 168–175. Kühne, S.A., Hawes, W.S., La Ragione, R.M., et al. (2004) Isolation of recombinant antibodies against EspA and intimin of Escherichia coli O157:H7. J. Clin. Microbiol. 42: 2966–2976. Dean-Nystrom, E.A., Bosworth, B.T., Moon, H.W., O’Brien, A.D. (1998) Escherichia coli O157:H7 requires intimin for entero-pathogenicity in calves. Infect. Immun. 66: 4560–4563. La Ragione, R.M., Patel, S., Maddison, B., Woodward, M.J. et al. (2006) Recombinant anti-EspA antibodies block Escherichia coli O157:H7-induced attaching and effacing lesions in vitro. Microbes Infect. 8: 426–433 DeVinney, R., Stein, M., Rein-scheid, D., Abe, A. et al. (1999) Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 produces Tir, which is translocated to the host cell membrane but is not tyrosine phosphorylated. Infect. Immun. 67: 2389–2398 Agin, T.S., Zhu, C., Johnson, L.A. et al. (2005) Protection against hemorrhagic colitis in an animal model by oral immunization with isogeneic rabbit enteropathogenic Escherichia coli attenuated by truncating intimin. Infect. Immun. 73: 6608–6619 Cataldi, A., Yevsa, T, Vilte, D.A. et al. (2008) Efficient immune res-ponses against Intimin and EspB of enterohaemorragic Escherichia coli after intranasal vaccination using the TLR2/6 agonist MALP-2 as adjuvant. Vaccine 26: 5662–5667 Gu, J., Liu, Y., Yu, S. et al. (2009) Enterohemorrhagic Escherichia coli trivalent recombinant vaccine containing
[14]
[15]
[16]
[17]
[18]
EspA, intimin and Stx2 induces strong humoral immune response and confers protection in mice. Microbes. Infect. 11: 835–41 Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. (2001) Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein. Prot. Eng. 14: 529–532 Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680–685 Batchelor, M., Prasannan, S., Daniell, S., Reece, S., et al. (2000) Structural basis for recognition of the translocated intimin receptor (Tir) by intimin from enteropathogenic Escherichia coli. EMBO J. 19: 2452– 2464 McNeilly, T.N., Mitchell, M.C., Rosser, T. et al. (2010) Immunization of cattle with a combination of purified intimin-531 EspA and Tir significantly reduces shedding of Escherichia coli O157:H7 following oral challenge. Vaccine 28: 1422–1428 Potter, A.A., Klashinsky, S., Li, Y. et al. (2004) Decreased shedding of Escherichia coli O157:H7 by cattle following vaccination with type III secreted proteins. Vaccine 22: 362e–369e. Frankel, G,, Candy, D.C., Everest, P., Dougan, G. (1994) Charac-terization of the C-terminal domains of intiminlike proteins of enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli, Citrobacter freundii, and Hafnia alvei. Infect. Immun. 62: 1835–1842. Hartland, E.L., Batchelor, M., Delahay, R.M. et al. (1999) Binding of intimin from enteropathogenic Escherichia coli to Tir and to host cells. Mol. Microbiol. 32: 151–158. Marqusee, S., Baldwin, R.L. (1987) Helix stabilization by Glu-...Lys+ salt bridges in short peptides of de novo design. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 84: 8898–8902 Kusharyoto, W. (2005) Subcloning, expression and characterisation of recombinant antibody Fab fragment specific towards 2,4-D. Annales Bogorienses 10: 23−3
