Lokakarva Fungsional Non Penehii 1999
TEKNIK DETEKSI ESCHERICHIA COLI VEROTOKSIK DARI ANAK SAN DESENTRI NINA KURNIASIH Balai Penelitian Veteriner, Jl . R.E. Martadinata No . 30, P.O . Box 151
RINGKASAN Anak-anak sapi yang menderita diare fesesnya bercampur darah atau" lendir, banyak terjadi di peternakan sapi perah . Sampel ulas rektal dari lapangan di tanam pada media agar Mac Conkey dan agar darah, diinkubasikan pada suhu 37 0 C selama saw malam . Koloni yang twnbuh pada media agar Mac Conkey dan agar darah di subkultur pada media agar miring nutrient, diinkubasikan pada suhu 37 0 C selama saw malam, untuk diuji sifat toksiknya pada biakan jaringan sel vero monolayer atau satu lapis . E . co/i yang memproduksi verotoksin akan menyebabkan perubahan niorfologi sel vero monolayer menjadi membulat dan agak mengecil .
PENDAHULUAN Escherichia coli merupakan salah satu spesies bakteri penghuni normal pada saluran pencernaan hewan atau manusia, akan tetapi ada beberapa galur E . coli, serotype tertentu dapat menyebabkan diare dan menimbulkan kematian . Di Indonesia kejadian diare dan kematian anak sapi dapat mencapai 20% (Supar dkk, 1989) . E . coli yang menyebabkan diare dapat dikelompokan dalam E . coli enteropatogenik dan E . coli enterotoksigenik . E . coli enteropatogenik (EPEC) tidak menghasilkan entcrotoksin tetapi memproduksi toksin yang mirip dengan toksin Shigella dysenteriae clan disebut Shiga-like toksin/SLT (Pai, dkk .,1986 ; Obrien dan Holmes, 1987) . E . coli yang memproduksi Verotoksin (VTEC) sudah lama diketahui dan terbukti mempunyai efek toksik pada sel vero (Konowal Chuk, dkk .,1977) . VTEC dapat diisolasi dari anak sapi diare, daging dan susu sapi yang tidak dipasteurisasi (Karmali, 1989) . Isolat VTEC dari anak sapi kebanyakan bersifat enteroinvasive, berupa dengan sifat E . coli yang diisolasi dari manusia penderita kolitis hemoragik (Levine, 1987) . Isolat ini tergolong dalam serotipe 0 157 ; 117 . Pada kesempatan ini akan dikemukakan teknik deteksi VTEC dengan cara biakan jaringan sel vero satu lapis pada cawan mikro .
BAHAN DAN CARA KERJA Isolasi Sampel ulas rektal dari anak sapi yang menderita diare, (fesesnya bercampur darah atau lendir ) yang diperoleh dari lapangan (dalam media transport), ditanam pada media agar Mac Conkey dan agar darah, kemudian diinkubasikan pada sulu .u 37° C selama satu malam . Koloni yang tumbuh pada media agar Mac Conkcy dipilih 4-6
204
Lokukcuya Fungsional Non Peneliri 1999
koloni yang bersifat laktose fermentatif koloni yang tumbuh pada media agar darah dipilih 4-6 koloni yang bersifat haemolitik disubkultur pada media agar miring nutrient dan disimpan sampai uji toksin dilakukan . Cara Mempersiapkan Supernatan dari Isolat yang akan diu,ji Verotoksin Setiap isolat yang akan diuji verotoksin ditanam pada media cair Tryptic Soy Broth (TSB) sebanyak 10 ml, diinkubasikan pada suhu 37° C selama satu malam . Sel diendapkan dengan cara sentrifugasi 6000 rpm selama 20 menit . Supernatan disaring dengan saringan 0,22 milimikron . Hasil saringan disimpan dalam botol steril clan siap untuk diinokulasikan pada jaringan sel vero monolayer (satu lapis) . Cara Mempersiapkan Kultur Jaringan sel Vero dalam Kultur Mini Sel vero ditumbuhkan dalam media DMEM (Dulbeco Multified Eagle Medium) high glucose yang ditambah dengan foetal calf serum 10% . Media disiapkan dalam cawan mikro yang dasarnya datar (flat bottom) microcultur plate, Limbro PT LTd, sebanyak 200 mikroliter . Kultur jaringan yang monolayer dapat diperoleh setelah diinkubasi pada suhu 37° C 24-48 jam . Cawan mikrocultur ditutup dengan adhesive polythene tipe, diletakkan dalam candle jar dan sel yang tumbuh dalam kondisi ini mendapat tambahan C02 kira-kira 5% . Selanjutnya candle jar di masukkan kedalam inkubator 37°C . Kultur jaringan yang tumbuh menjadi monolayer siap diinokulasi dengan supernatan yang akan diuji . Uji Verotoksin dengan cara Inokulasi Supernatan E . COLI pada jaringan scl vero Pengujian dilakukan mengikuti prosedur yang ditulis oleh Janke, dkk .,1990 dan Dor, dkk ., 1993, Metode ini disesuaikan dengan fasilitas dan kondisi laboratorium . Medium kultur jaringan sel vero yang tumbuh monolayer (disiapkan diatas) dibuang dengan menggunakan alat pengisap cairan secara hati-hati supaya sel tidak rusak . Sampel supernatan diencerkan 1 :2 s/d 1 :20 . Sebanvak 50 mikroliter sampel supernatan yang akan diuji (asli dan encerannya) dimasukkan kedalam kultur jaringan sel vero . Tiap sampel dan encerannya dilakukan secara duplikat (dua lubang) . Didiamkan selama 5-10 menit . Supaya sel jaringan ticlak kekeringan sebaiknya dilakukan dengan cara bertahap (sebagian cawan, setelah selesai, sebagian berikutnya) . Supernatan yang diinokulasikan dibuang dengan alat pengisap cairan seperti sebelumnya, kemudian jaringan dicuci dengan PBS steril . Cara membuang larutan PBS sama dengan menggunakan alat penghisap cairan . Setelah kultur jaringan scl dicuci, sebanyak 200 mikroliter media DMEM yang sudah ditambah foetal calf serum 10% dimasukkan kedalam tiap-tiap lubang . Cawan mikro cultur ditutup dengan adhesive polythene tape dan diinkubasikan seperti sebelumnya . Pengamatan perubahan bentuk jaringan sel vero dilakukan setelah inkubasi 18 jam dan dilanjutkan sampai inkubasi 72 jam dengan menggunakan mikroskop dengan lensa terbalik (Sonverted mycro cope) . Setiap kali melakukan pengujian sampel, kontrol E . coli positif verotoksin, negatif verotoksin, dan media jaringan scl vero tanpa
205
Lokakarca Funisional Non Penelilt 1999
diinokulasi supernatan pembanding .
diikutsertakan
dalam
setiap
cavan
mikrocultur,
sebagai
HASIL DAN PEMBAHASAN Supernatan dari 80 isolat E. coli haemolitik yang diuji pada kultur jarin!can sel vero ditcmukan scbanyak 50 isolat yang menunjukkan perubahan bentuk jaringan sel vero dari monolayer menjadi membulat dan agak mengecil (Gambar 1) . Pcrubahan bentuk jaringan sel vero tersebut dianiati setelah inkubasi sclaina 18 jam dan dilanjutkan sampai inkubasi 72 jam . Dari 50 yang bersifat verotoksik dengan enceran supernatan 1 :2 (5), 1 :4 (16), 1 : 8 (13), 1 :16 (3), 1 :32 (3), 1 :64 (2), 1 :128 (4), 1 :256 (3) dan 1 :1024 (1 sampel) . Sedangkan jaringan pada supernatan yang tidak bersifat verotoksik tidak terjadi perubahan bentuk morfologi sampai pengamatan dihentikan 72 jam . Reaksi pada kelompok yang bersifat verotoksik negatif serupa :m den(-, kontrol negatif atau sel vero tanpa perlakuan . Sel jaringan masih terlihat monolayer pada akhir pengamatan 72 jam (Gambar 2) . Pada pengamatan ini isolat yang hanya memberikan perubahan morfologi sel vero dari titer 1 :2 s/d 1 :8 tidak menyebabkan perubahan niorlologi lcbih lanjut sampai pada pengobatan 72 jam, dinyatakan verotoksik negatif . sebaliknya bila terjadi perubahan morfologi yang jelas dilakukan uji ulang dengan pc :igcnceran .
Gambar 1 . Biakanjaringan sel vero yang diinokulasi dengan supernatan E. coli
206
Lokukur
r /L ;i'siouul V'on I'r, ;rliN
/999
Gambar 2 . Biakan jaringan sel vero yang ti d ak diiim ulasi hcnlliknv a sama dengan kontrol neeatit- verotol:,in
Ni :SINIPULAN Teknik jaringan sel vero diaplikasikan Untuk deteksi E_ coli hacmoliiik dari anak sapi diare, yang faceesnya bercampur darah atau lcndir . Dari 80 isolat yang diuji 50 diantaranya bersifat verotoksik dengan titer supernatan \a110 hervariasi . Dengan teknik tersebut diatas maka E. coli penvebab diare pada anak sapi dapat segera dikctaliui dan pengendalian diare dapat o,cgera dilakukan agar an`,ka k,-ntatian anak sapi dapat diatasi .
DAFTAR BACAAN DORN, C .R, D .H . FRANCIS, E .J . ANGRICIK . .I .A . WIL! GOI- IS . R .A . WILSON, J .E . COLLINS, B .11 . JANKE and ST SHAWD . 1993 . Characteristics of vero cytotoxin producing Escherichia coli associated with intestinal colonization and diarrhea in calves . Vet . Microb . 36 : 149-159 . JANKE, B .H ., D .H . FRANCIS, J .E . COLLINS, MI .C . LIBAL, D .D . JAHNSON and R .D . NEIGER . 1990 . Attaching and clTacing Ischerichia coli infection as a cause of diarrhea in young calves . JA I'11; 1 196 : 597-901 .
:07
Lokakatva Fungsianal Non Peneliti 1999
KARMALI, M .A . 1989 . Infection by verotoxin producing Escheria coli . Clinic . Microbiol Rev . 2 : 15-38 . KONOWALCHUK, J ., J .I . SPEIRS and S . STAVRIC . 1977 . Vero response to a cytotoxia of Escherihia coli . Infect . Immun . 18 : 775-779 . LEVINE, M .M . . 1987 . Escherichia coli that cause diarrhoea enteropathogenic enteroinvasive, enterohemorrhagic and enteroaddherent . J . Inject . Dis . 155 : 377-389 . O'BRIEN, A .D . and R .K . HOLMES, 1987 . Shiga and shige-like toxins . Microb . Rev . 51 : PAI, C .H ., J .K . KELLEY and G .L . EYERS . 1986 . Experimental infection of infant rabbits with verotoxin producing escherichia coli . Infer . Immun . 51 : 16-23 . . SUPAR, R .G . HIRST and B .E . PATTEN . 1989 . Studies on the epidemiology of neonatal calibacillosis in food producing animal in Indonesia . Proceeding of the first Seminar on Veterinary Epidemiology . Desember, 6"' 1989 . Yogyakarta Indonesia : 103-132 .
208
