DETEKSI Escherichia coli 0157:H7 DARI SUSU DAN DAGING MENGGUNAKAN SERUM KEBAL MONOSPESIFIK DETECTION Escherichia coli 0157:H7 FROM MILK AND MEAT USING MONOSPECIFTC IMMUNE SERUM
Widodo Suwito' IBalai Pengkajian Teknologi Pertanian Yogyakarta E-mail:
[email protected]. ABSTRACT Escherichia coli 0] 57:H7 is one of the bacterial causing borne food disease in human. Monospecific immune serum against somatic (0) and t1agella(H) antigens have been used to detect E.co]i 0157:H7. The aim of this study was to detecti of E.coli 0157:H7 using'immune serum monospecifik by absorption and coagg]utinationtests. Monospecific immune serum was obtained by injecting E.coli a 157:H7intoNew Zealand White rabbits. Serum was harvested and absorbed with somatic E.coli heterologous antigen until no agglutination was observed. The result shows that immune serum monospecific can be used to detecti of E.coli 0157 :H7 inmilk and meat. Key words: immune serum, mono specific, E.coli a 157:H7.
ABSTRAK Escherichia coli 0157:H7 merupakan salah satu bakteri patogen penyebab food borne disease pada manusia. Deteksi E.coli 0157:H7 pada serum keba] monospesifik berdasarkan somatik antigen (0) dan flagella (H). Tujuan dari penelitian ini untuk mendeteksi E.coli 0157:H7 menggunakan serum kebal monospesifik dengan cara absorbsi dan uji koaglutinasi. Serum kebal monospesifik diperoleh dengan cara menyuntikkan antigen E.coli 0] 57:H7 pada kelinci jenis New Zealand White. Serum dikoleksi dan diabsorbsi menggunakan antigen somatik E.coli heterolog sampai tidak terjadi reaksi agglutinasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dengan serumkeba1monospesifik dapat digunakan untuk menedeteksiE.coli 0 157:H7da1amsusu dan daging. Kata kunci: serum keba1, monospesifik, E.coli 0 157:H7
.
PENDAHULUAN
.
Chinyu dan Brandt, ]995). Pada tahun 1997 di Amerika Serikat dilaporkan
Escherichia coli 0157 :H7 menipakan strain
Escherichia coli 0157 :H7 merupakan penyebab
patogenik yang dapat mengkontaminasi pangan
penyakit asal makanan yang ke dua setelah
terutama asa1ternak. Pada manusia, Escherichi .coli
Salmonella sp dengan jumlah 3260 kasus dan 8
0157:H7 menyebabkan hemorrhagic colitis (He),
orang meninggal dunia (CDC, 1997). Pada tahun
hemolytic
dan
]996 di Skotlandia di1aporkansebanyak 496 wabah
thrombocytopeniapurpura (TPP) (AAPHV, 2000 ;
dari 7500 kasus dan 21 orang meningga1 dunia,
uremic
syndrome
(HUS)
63
J. Sain Vet. Vol,28 No, 2 Th. 2010
sedangkan di Inggris sebanyak 30 wabah dari 656
ATCC 43894, sedangkan penyiapan antigen 0157
kasus dengan 11 orang meninggal dunia (SCIEH,
dan H7 mengikuti petunjuk (SupaI',1985). Kelinei dibagi menjadi 4 kelompok yaitu: 2 ekor
2001). Penyakit asal makanan sering terjadi di
diinjeksi dengan antigen 0157 isolat lokal, 2 ekor
Indonesia. Pada bulan September 2004 terjadi
diinjeksi dengan antigen H7 isolat lokal, 2 ekor
keraeunan pada 72 siswa Sekolah Dasar (SD) di
~iinjeksi dengan antigen 0157 ATCC 43894 dan 2
Tulung Agung Jawa Timur setelah minum susu, 300
ekor diinjeksi dengan antigen H7 ATCC 43894.
siswa SD di Bandung dan'73 karyawan Carefour di
Tiap-tiap kelinei diinjeksi seeara intra vena dengan
Surabaya. Menumt Badan Pemeriksaan Obat dan
dosis bertingkat 0,25 ml, 0,5 ml, 1,5 ml dan 2 ml
Makanan (BPOM) kasus tersebut disebabkan oleh
dengan kepekatan antigen masing-masing setara
Escherichia
depgan larutan Mac Farland no 1,2, 3 dan 5. Satu
coli dan Staphylococcus
aureus
. minggu setelah injeksi terakhir kelinci diambil
(KOMPAS,4 September 2004). Escherichia coli 0157 :H7 mempakan salah satu penyebab keraeunan pangan asal ternak. Salah satu upaya untuk mendeteksi Escherichia coli 0157:H7
darahnya, kemudian semm dipisahkan dan disimpan pada suhu -20°Csampai uji lebih lanjut. Pembuatan semm kebal monospesifik 0 157dan
dapat menggunakan semm kebal monospesifik.
H7 mengikuti
petunjuk
(SupaI', 1985) yang
Semm kebal monospesifik yaitu antisemm yang
dimodifikasi dari metode Sokja (1965). Escherichia
tidak bereaksi silang dengan tipe antigen lainnya
coli yang digunakan untuk absoJbsi ditumbuhkan
atau hanya mengenal antigen homolognya. Semm
pada Nutrient Agar (NA) (Oxoid) dalam botol Raux
kebal monospesifik dapat diperoleh dengan eara
kemudian diinkubasikan pada suhu 37°Cselama 48
absorbsi (Pasaribu, 1985; Wibawan dan Pasaribu,
jam. Sel di inaktifkan menggunakan formalin 0,1%
1993). Tujuan dari penelitian ini untuk mendeteksi
dan dipanen dengan Ose sterii. Suspensi sel
Escherichia coli 0157:H7 dalam susu dan daging
disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 30
dengan menggunakan semm kebal monospesifik.
menit, kemudian endapan dieuei 3 kali dengan NaCl fisiologis. Setiap eampuran sel dari 3 botol Raux
MATER! DAN METODE
dimasukkan 5 ml antisemm 0157 yang akan diabsorbsi, dikoeok dengan vortex mixer selama 1-5
Penelitian
ini menggunakan
8 ekor kelinei
-
,
-
menit, kemudian di simpa~ pada suhu 4°Cselama 24 ,. 'f t ~
.~.
,-
jantanjenis New Zealand White umur kurang lebih 1
jam. Campuran antisemm "dan sel yang dipakai
tahun. Kelinei dipelihara
dalam
untuk mengabsorbsi disentrifus dengan kecepatan
kandang ukuran 30 em x 60 em. Sebelum perlakuan
3500 rpm selama 30 menit. Supernatan (antisemm
semua kelinci diadaptasikan selama 1 minggu diberi
0157) diuji dengan antigen somatik 0 heterolog
pakan wortel, kangkung dan mmput serta minum ad
sampai menimbulkan reaksi aglutinasi negatif.
seeara terpisah
Ubidum.
Antisemm H7 yang telah dipanen diabsorbsi
Antigen yang digunakan adalah Escherichia coli
dengan antigen whole cell Escherichia coli 0 157:H7
0.157:H7 isolat lokal dan Escherichia coli 0157 :H7
yang diautoc/ave pada suhu 121°Cselama satujam.
64
...
WidodoSuwito, Deteksi Escherichia coli 0157 : H7 dari Susu dan Daging Menggunakan Serum Kabel Monospesifik
Cara absorbsi untuk mendapatkan antiserum H7
coli diperbanyak dalam media Plate NA (Oxoid)
monospesifik sarna seperti pada proses absorbsi
kemudian diinkubasikan pada suhu 37°C selama 24
untuk mendapatkan antiserum 0157 monospesifik,
jam, kemudian dipanen menggunakan Ose steril dan
yang berbeda hanya cara menyiapkan antigen untuk absorbsi.
dimasukan dalam 5 ml NaCl fisiologis selanjutnya diautoc/ave pada suhu 121°C selama 1 jam,
Uji koaglutinasi dilakukan mengikuti petunjuk
sedangkan untuk H serotyping tidak dilakukan
(Honda dkk., 1983 dan Murray 1987). Secara
autoclave. Sebanyak 5 III antigen dicampur 8 III
singkat S.allreus Cowan I ditumbuhkan pada media
serum kebal monospesifik di atas obyek gelas, bila
NA dalam botol Roux kemudian diinkubasikan pada
terjadi
suhu 37°C selama 48 ja~. Ke dalam botol Roux
menunjukkan serotipe yang sarna.
aglutinasi
dalam
waktu
1-3 menit
dimasukkan 10 ml Pospat Bufer Saline (PBS) yang HASIL DAN PEMBAHASAN
mengandung 0,5% formalin, didiamkan selama 5-7 menit kemudian sel bakteri dipanen dengan Ose steril. Sel disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm
Penyiapan antigen 0157 dan H7 adalah tahapan
selama 10-15 menit. Endapan: sel dicuci 3 kali
awal yang sangat penting dalam pembuatan serum
dengan PBS dan disentrifus seperti sebelumnya.
kebal monospesifik. Pada tahapan ini dilakukan
Endapan sel dari pencucian terakhir disuspensikan dalam PBS dan didiamkan selama 3 jam pada suhu
dengan menyiapkan antigen 0157 yang berasal dari Escherichia coli 0157:H7 isolat~lokal dan ATCC
kamar sambil setiap kali dikocok dengan hati-hati.
43894
Setelah pencucian terakhir sel disuspensikan dalam
pembanding. Konsentrasi antigen yang dipersiapkan
PBS dan konsentrasi sel dibuat 10% (volume
dilakukan
endapan seVvolumePBS).
menyamakan kekeruhannya dengan standar larutan
sehingga
dapat
digunakan
sebagai
dengan cara semikuantitatif
yaitu
Suspensi sel kemudian dipanaskan dalam
Mac Farland no 1, 2, 3 dan 5. Tujuan penyiapan
waterbath suhu 80°C selama I jam. Setelah dingin
antigen 0157 dilakukan autoclave pada suhu 121°C
endapan sel dicuci 3 kali dan endapan dari pencucian
selama 1 jam untuk menghilangkan flagella
terakhir dilarutkan dalam PBS dengan konsentrasi
sehingga yang tersisa hanya somatik antigen (0),
dibuat 10%. Sebanyak 1 ml suspensi sel 10% 0,1 ml serum kebal
sedangkan penyiapan antigen H7 tidak dilakukan I autoclave.
monospesifik 0157 dan H7 selanjutnya dikocok
Setiap kelinci diinjeksi secara intra vena dengan
pelan-pelan, kemudian didiamkan pada suhu kamar
dosis bertingkat 0,25 ml, 0,5 ml, 1,5 ml dan 2 ml
kamar selama 3 jam dan setiap jam dikocok pelan-
dengan kepekatan antigen masing-masing setara
pelan dan reagen siap digunakan (Honda dkk, 1983
dengan larutan Mac Farland no 1, 2, 3 dan 5.
dan Murray 1987).
Suntikkan antigen diberikan secara intra vena
(protein
A) ditambah
Pada penelitian
ini telah tersedia
.
isolat
dengan tujuan antigen cepat diabsorbsi sehingga
Escherichia coli dari koleksi pribadi terdiri dari 351
kelinci cepat dirangsang untuk menghasilkan
isolat dari susudan 30 isolat dari daging. Escherichia
antibodi terhadap antigen tersebut.
65
J. S(t;n Vet. Vol.28 No.2 Tit. 2010
Pemberian suntik
0138 dan 0149. Serum yang telah diabsorbsi
bertingkat akan menyebabkan sel limfosit B
dicampur dengan somatik antigen yang homolog
dirangsang sehingga antibodi yang dihasilkan makin
terjadi agglutinasi, sedangkan dengan antigen yang
lama makin meningkat. Tubuh kelinci terdapat sel
heterolog tidak terjadi agglutinasi, maka serum
limfosit B yang menghasilkan protein spesifik yang
tersebut dikatakan telah monospesifik 0157.
beredar didalam tubuh dan disebut dengan antibodi
Antiserum H7 monospesifik diabsorbsi dengan
atau imunoglobulin (Ig) (Tizard, 1998). Bila zat
antigen Escherichia coli heterolog seperti : 08,09,
asing yang bermolekul besar seperti protein dan
020, 064, 0101, 0138 dan 0149 tetapi dalam
polisakarida masuk ke dalam tubuh, maka akan
penyiapan antigen tidak dilakukan proses autoclave.
dihasilkan antibodi terhadap antigen tersebut.
Serum yang telah diabsorbsi dicampur dengan
Imunoglobulin (Ig) mempunyai daerah pengikatan
flagella antigen yang homolog terjadi agglutinasi,
atau binding site yang spesifik terhadap suatu
sedangkan dengan antigen flagella heterolog tidak
dererminan pada antigen. Sumber antibodi yang
terjadi agg1utinasi, maka serum tersebut telah
paling umum adalah serum. Kelinci jenis New
monospesifik
Zealand White sering digunakan dalam pembuatan
spesifitas monospesifik dengan cara mengabsorbsi
serum kebal monospesifik karena serum yang
serum yang belum monospesifik dengan sel bakteri
diambil dari kelinci telah menjadi standar prosedur
utuh (whole cell) yang menunjukkan reaksi silang
khususnya di laboratorium (Herbst dkk, 1983).
non spesifik dengan serum yang bersangkutan
Disamping itu darah kelinci sangat intensif untuk
(Wibawan dkk., 1993).
produksi antiserum (Malole dan Pramono, 1989).
H7. Serum dapat mempunyai
Uji koaglutinasi berdasarkan komponen protein
Satu minggu setelah suntikan antigen terakhir
A (yang dimiliki oleh S.aureus Cowan I) yang
semua kelinci dibunuh dan dipanen serumnya,
berikatan dengan reseptor suatu antibodi. Suspensi
kemudian diuji dengan antigen Escherichia coli 0157:H7 di autoclave dan tidak di autoclave. Dari
S.aureus Cowan I yang ditambahkan antiserum yang
uji coba tersebut semuanya menunjukkan reaksi
koaglutinasi. Adanya agglutinasi antara serum
positip. Hal ini menunjukkan bahwa serum yang
kelinci dengan antigen Escherichia coli 0157:H7
dihasilkan belum murni, karena antigen yang paling
menunjukkan bahwa antibodi telah terbentuk.
murni sekalipun masih mengandung lebih dari satu
Sensitifitas dan spesifi&ifas.ntetode .koaglutinasi
determinan (Dewi, 1984). Suntikan antigen yang
pernah dilaporkan setara dengan uji ELISA (Supar,
telah murni pada kelinci masih dihasilkan antibodi
1996, Murray, 1987). Reagen koaglutinasi dapat
poliklonal yang terdiri dari berbagai macam antibodi
disimpan dalam lemari es selama beberapa minggu
yang mempunyai
atau beberapa bulan untuk digunakan dalam
binding site berbeda-beda
(Sofyan, 1992).
telah monospesifik sehingga dapat untuk uji
menentukan serotipe Escherichia coli 0157:H7.
Antiserum yang belum monospesifik dilakukan
Serum monospesifik dapat disimpan dalam lemari es
absorbsi menggunakan antigen somatik Escherichia
atau penyimpanan yang lebih lama pada suhu -20°C,
coli heterolog seperti : 08, 09, 020, 064, 0101,
akan tetapi pembekuan
66
dan pencairan yang
Widodo Suwito, Deteksi Escherichia coli 0157: H7 dari Susu dan Daging Menggunakan Serum Kabel Monospesifik
berulang-ulang perlu dihindari karena mengurangi
kontaminasi pangan ~sal temak (CDC, 2001). Kasus keracunan pangan asal temak di Indonesia yang disebabkan karena Escherichia
sensitifitas (Supar, 1996).
Hasil serotyping terhadap somatik antigen (0) dan flagella (H) dari 351 isolat Escherichia
coli 0157:H7 jarang dilaporkan, karena belum diterapkan standar analisa untuk Escherichiacoli
coli asal susu dan 30 isolat asal daging dapat dilihat pada (Tabel 1). Tabel 1 menunjukkan bahwa dari 351 isolat Escherichiacoli asal susu
0157:H7 (Haryadi danNurailyasti, 1999). Prevalensi E.coli 0157:H7 dari susu di
terdapat dua sampel yang bereaksi positif agglutinasi terhadap antigen 0157 dan H7, sedangkan dari 30 isolat Escherichiacoli asal
Belanda dilaporkan antara 0-10% (Heuvelink
daging tidak terjadi reaksi aglutinasi. Hal ini menunjukkan bahwa dari 351 isolat Escherichia
dkk, 1998) sedangkan pada susu sapi dari petemakan di Bogor, Cianjur dan Sukabumi . dilaporkan 0,5% (Suwito, 2005). Kasus infeksi E.coli 0 157:H7pada manusia di Indonesia telah
coli asal susu tidak semuanya memiliki seroytpe 0157 dan H7. Escherichiacoli 0157:H7 banyak
dilaporkan
dari
Rumah
Sakit
Ciptomangunkusumo Jakarta dan empat dari sembilan kasus tersebut meninggal dunia (Tambunandkk., 2001).
diisolasi dari susu yang belum dipasteurisasi dan temak sapi merupakan karier pada kasus Tabel ]. Hasil 0 dan H serotyping Asal Iso]at
Jumlah Isolat E.coli
Susu Daging lumlah
Reaksi Agg]utinasi Positif Serum H7
Serum 0157
Serum H7
35] 30
2
2
-
-
349 30
349 30
381
2
2
379
379
Serum kebal monospesifik E.coli 0157:H7 dengan cara absorbsi dan koagglutinasi dapat digunakan untuk deteksi E.coli 0157:H7 dari pangan asal ternak.
.
f
",
teknisi
Besar Penelitian
[CDC]. Center of Disease Control and Prevention.
Belanja Negara (APBN) tahun 2004. Ucapan terima disampaikan
Bakteriologi
kegiatan penelitian berlangsung.
[AAPHV]. 2000. American Association of Public Health Veterinarians. Position statement on raw (unpasteurized) milk produk. Public Health Veterinarian Coalition Committee. http:/www.avma.org/aaphv/year2000.htm [27 Juni 2000].
Penelitian ini dibiayai oleh Angaran Pendapatan
Bagian
Veteriner Bogor yang telah membantu selama
DAFTAR PUSTAKA
UCAPAN TERIMA KASIH
kasih juga
Reaksi Agg]utinasi Negatif
Serum 0157
kepada
di Balai
semua
67
...
J. Sain Vet. Vol.28 No.2 Th. 2010
coagglutination test of heat labile enterotoxin producing Escherichia coli. J Clinic.Microbiol. 17:592-595.
i Serum kebal- monospesifik E.coli 0157:H7 dengan cara absorbsi dan kdagglutinasi dajJat digunakan untuk deteksi E.coli 0157:H7 dari pangan asal ternak. /
)
UCAPAN TERIMA KASIH
.
Penelitian ini dibiayai oleh Angaran Pendapatan Belanja Negara (APBN) tahun 2004. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada semua teknisi Bagian Bakteriologi di Balai Besar Penelitian Veteriner Bogor yang telah membantu selama kegiatan penelitian berlangsung. ...
DAFTAR PUSTAKA
[AAPHV]. 2000. American Association of Public Health Veterinarians. Position statement on raw (unpasteurized) milk produk. Public Health Veterinarian Coa 1i tion Commi ttee. http:/www.avma.org/aaphv/year2000.htm [27 Juni 2000]. [CDC]. Center of Disease Control and Prevention. 1997. Human Pathogens on the Farm. Morb Mortal WklyRep (42): 258-263. Chinyu, S.U., Brandt, LJ. 1995. Review E.coli 0157:H7 Infection in Humans. Annals of Internal Medicine 123 (9):698-707. Dewi, S. 1994. Pembuatan serum kebal monospesifik dari tipe antigen Streptococcus agalactiae. Skripsi SI' Institute Pertanian Bogor; 30-33. Herbst, HJ., Lavanchy, D., Braun, D.G. 1983. Grouping of Haemolytic Streptococci by Monoclonal antibodies:determinant Specificity, Cross Reactivity. Ann. Imunol. (Inst. Pasteur). 134D: 349-371. Honda, T., Samakoses, R., Sornchaj, C., Takeda, Y., Miwatani, T. 1983. Detection by Staphylococcal
68
Heuvelink,A.E., Bleumink, B., Biggelaar, F.L.A.M., Giffel, M.C., Beumer, R.R., Boer, E.D. 1998. Occurrence and SurVival of verocytotoxin producing E.coli 0157 in Raw Cow's milk in the Netherland. J food Prot 61 (12): 1597-1601.
Haryadi, R.D., Nurailyasti. 1999. Skrining Escherichia coli 0157:H7 pada isolat E.coli lokal dengan menggunakan uji aglutinasi. Proceding Seminar Nasional Teknologi Pangan. Jakarta, 12-13 Oktober: 364-376. ,
Malole, M.B.M, Pramono, C.S.U. 1989. Penggunaan hewan-hewan Percobaan di Laboratorium.' Departemen Pendidikan Dan kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Bioteknologi. Institut Pertanian Bogor. Munay, CJ. 1987. Detection ofK88, K99 fimbrial antigens on Escherichia coli by coagglutination. Aust. Vet.J 64:39-40 Pasaribu, F.H., Lammler, C.H., Blobel, H. 1985. Serotyping of Bovine and human Group B Streptococci by Coagglutination. IRCS. Med. Sci.13:24-25. [SCIEH]. Scottish Center For Infection and Environmental Health. 2001. Task Force on E.coli 0157. http://www.foodtandards.gov.ukl multimedia/pdfs/ecolitaskfinreport. [27 Juni 2004]. Sokja, WJ. 1965. Escherichia coli in domestic animal and poultry common wealth agricultural bureau of animal ~~alth. Weybridge. .E.d.rer
seriesno7:205-212."
.
.
Supar. 1985. Detection E.coli K88 dan K99 dengan cara koaglutinasi. Petunjuk laboratorium Balitvet. Bogor.
Sofyan, R. 1992. Produksi Antibodi klon Tunggal Aplikasinya dalam bidang Kedokteran Nuklir. Cermin Dunia Kedokteran. PT. Kalbe Farma. Jakarta. Supar. 1996. Studi kolibasilosis pada anak sapi perah
