,.
Risafah Pertemuan
Ilmiah P~elilian
dan Pengembangan
Teknologi
ISOlop dan RadiaSl; 2(XJ()
DETEKSI CEPAT BAKTERI Escherichia coli ENTEROHEMORAGIK (EHEK) DENGAN METODE PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) Dadang Sudrnjat, Maria Lina R, dan F. Suhadi
I
~.~
Teknol~otop danRadiasi, BATAN,Jakarta ABSTRAK
DETEKSI CEPAT BAKTERI &cherichia coli ENTEROHEMORAGIK (EHEK) DENGAN .METODE PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION). Telah dilakukan uji Reaksi polimerisasi berantai (PCR) untuk mendeteksiadanyabakteri Escherichiacoli enterohemoragikOI57:H7. DNA dari sel bakteri dengan metode CTAB-fenol-kloroform clan diendapkandenganisopropanol.Untuk menguji sensitivitas dari reaksi amplifikasi PCR, dibuat seri pengencerandari larutan DNA E.coli O157:H7 antara I ~ -I pg/~I. Pasanganoligonukleotida primer yang digunakanuntuk reaksi amplifikasi adalahshiga like toxin 1-forward (SLTI-F) & shiga like toxin 1- reverse (SLTI-R) yang diperolehdari gen Shiga-Like-Toxin.Hasil penelitian menunjukkanbahwaDNA E.coli padakonsentrasi1ng/~1masihbisa dideteksimenggunakanprimer SLn-F & SLn -R denganfragmenDNA padaposisi 140bp.
ABSTRACT RAPill DETECTION OF &cherichia coli ENTEROHEMORRAGIC (EHEC) BACTERIA BY PCR (POLYMERASE L'HAIN RE4CTION) METHODs. A PolymeraseChain Reaction(PCR) assays for detect presenceof enterohemmoragicEscherichiacoli O157:H7 was calTiedout. DNA was extmcted from bacterial cells \\ith CTAB-phenol-chlorotonnand precipitated \\ith isopropallol.To test sensitivity of PCR amplified reaction,serialdilutions of E.coli DNA solutionwere preparedbetween I Ilg-l ngllll. A single pair oligonucleotide primer SLll-F & SLn-R derived from Shiga-like-Toxin genes was used in amplification method.The results shows that I ngllll of E.coli DNA could be detectedusing the primers SLll-F & SLTI-R with the position of 140 bp DNA fragment.
PENDAHULUAN Escherichia coli enterohemoragik (EHEK) adalah salah satu bakteri usus patogen yang dapat menyebabkan diare hemoragik colitis (HC), hemolitic-uremic syndrome (HUS) (1). Menurut Meng daD Doyle (2), EHEK 0157:H7 menyebabkan diare berdarall dan HUS. Mengingat masih rendahnya tingkat sanitasi lingkungan di negara berkembang, penyakit diare yang disebabkan oleh bakteri E.coli patogen menjadi masalah penting apabila terjadi wabah. Makanan yang terkontaminasi bakteri E.coli khususnya EHEK menyebabkan diare yang disertai pendaraltan, karena toksin SL T (Shiga like toxin) yang dihasilkannya. Penyakit ini biasanya dikaitkan dengan daging sapi daD susu yang terkontaminasi. Infeksi ini dapat dicegah dengan mengidentifikasi sumbernya antara lain nlakanan yang terkontaminasi (2). Selama ini ada beberapa metode konvensional yang digunakan untuk menentukan adanya E.coli 0157:7 enterohemoragik dari sampel lnakanan antara lain metode biakan (kultur), uji biokimiawi, daD uji serologis (2). Cara-cara tersebut mempunyai kelelnahan dan keterbatasan, selain memerlukan waktu lama juga tidak spesifik. Cara biakan yaitu dengan mengisolasi bakteri dalam media selektif seperti yang dikembangkan oleh Doyle daD Schoeni (3). Metode ini tidak sensitif kerena sampel harus mengandung !03 -104 sel/graln, selain itu juga memerlukan waktu lama dan lnahal karena harus dilakukan uji tallap selanjutnya meliputi uji biokilnia, serologis, daD verotoksisitas. Metode serologis dengan
teknik ELISA sangat cepat dan sensitif serta praktis penggunaanyadalam klinik. Cara ini didasarkanpada reaksi antara antibodi monoklonal spesifik E. coli dengan antigen E.coli O157:H7 (4). Dengan cara ini dapat dideteksi 1,5 seUgram.Kelemahan cara ELISA adalahkurangspesifikkarenaakanterjadi reaksisilang dengan antibodi dari bakteri lain sepeti E.hermanii. Brucella sp dan beberapabakteri enterik lainnya. Untuk itu perlu dikembangkancara deteksi yang cepat dan sensitif antara lain dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) berlabel isotop32p.Metode PCR dapat mendeteksisecaratepat genyang menyanditoksin SLT (.S'higa-Like-Toxin) dari bakteri E.coli O157:H7 yang terdapatdalammakanan,susurnaupunrasespenderita(5. 6).
Tujuanpenelitianini adalallmengembangkan cara deteksi bakteri E.coli patogen (EHEK) dalam sampel makananyang terkontaminasiberdasarkanteknik diatas. Pada tal1ap awal akan dilakukan ekstrnksi DNA dari beberapa isolat E.coli enterohemoragik. DNA basil isolasi diencerkan pada beberapa konsentrasi dan selanjutnyadilakukan proses amplifikasi DNA dengan PCRmenggunakan oligonukleotidaprimer yang spesifik. Deteksibasil amplifikasi dilakukandenganelektroforesis gel agarose. BAHAN DAN METODE Bahan. Isolat bakteriE.co/i EHEK yang digunakan dalam penelitian ini adalah strain E.coli OI57:H7 basil 75
Risalah Pertemuan
Ilmiah Pene!J1ian dan Pengembangan
r eknologi
IsOIOp dan Radiasi, l{xx}
isolasi dari daging ayam yaitu isolat dengan no kode 719, 741, 743, 745, HCW, dan HC1-lyang diperolch dari Balitvet, Bogor. Sebagai pembanding digunakan strain standar E. coli 0157:H7 Adelaidc. Isolat-isolat tcrscbut ditwnbullkan dalmn media Mac.Coltkey Agar (DIFCO). Untuk keperluan isolasi DNA, bakteri ditwnbultkan dalam media Luria-Bertani (LB) dan diinkubasi pacta suhu 37° C selmna 211ari. lsolasi DNA. Isolasi DNA bakteri E.coli O:157:H7 dilakukan dengan menggunakan metode Ausubel (6). Kultur bakteri yang telah tumbuh dalam media LB selama 2 hari , diambil sebanyak 15 mi. Pallen sel dilakukan dengan cara sentrifugasi pacta 7000 rpm selama 10 menit. Pelet sel disuspensikan dalmn 5,6 ml larut:w bufer 0,0 I M Tris -EDT A pH 8 (TE), tambahkan larutanlO% sodium dodec;:vlsulfate (SDS) scbanyak 300 f.l.1,clan 30 f.l.llarutan proteinase K (20 mg/ml). Campuran diinkubasi selama 1 jam pada SullU37°C dalam inkubator goyang. Tamballkall I mllarutan NaCI 5 M kocok secara sempuma. Kemudian ditambal1kaIl 800 I1llarutan CT AB, selanjutnya campuran diinkubasi selama 20 menit pada suhu 65°C. Ekstraksi DNA dilakukan dengan menambahkan volume SalTh1 larutan kloroform/ isoamilalkohol (24: I). C1mpuran disentrifugasi selama 10 mcnit pacta 10.000 rpm smnpai terbentuk 2 rase. Pindahkan rase air kedalmll tabung barn kemudian tmllbaltkan volwne sarna larutan fenol/klorofonn/isoal1ul alkohol dan disentrifugasi kcmbali selama 15 menit pacta 10.000 rpm. Fase atas yang terbcntuk dipindaltkan dalam tabung barn kemudian ditmnbal1kc1ll0,6 VOIWllC larutan isopropanol dingin Imtuk mengendapkan DNA. Endapan DNA dipisal1kaIl dengml cara sentrifugasi pacta 12.000 rpm selalna 15 menit, kemudian dicuci dengan larutan 70% etllc1llo1 dingin. Pelet DNA murni dikeringkan dalmll desikator vakwn untuk selanjutnya dilarutkan dalmll larutan bufer TE. Konsentrasi DNA diukur dengan alat spektrofotometer pacta panjang gelombang 260 Oln daD 280 Oln. Konsentrasi DNA hasil isolasi kemudian dibuat pengenceran dengan larutan TE sampc1i I pg/ml untltk pcngujian amplifikasi DNA. Ampliflkasi DNA. Amplifikasi DNA dengan teknik PCR dari E.coli EHEK menggunakml metode Garmon et at. (7). Rcaksi PCR dikerjakc1ll dcngan total volwne campuran yang mengandung 2 ug DNA target (10 111);10 InM tris-HCI (pH 8,3); 50 InM KCI; 2 InM MgCI2, lnasing-masing 0,2 111MdATP, dCfP, dGTP, dTTP., daD 2,5 Unit cnzim Taq DNA polimerase (Perkin Elmer Cetus). Primer yang digunakan adalah pasangan oligonukleotida SLTI-F (5'-ACACTGGATGATCfCAGTGG-3') clan SLTI-R (5'CTGAATCCCCCTCCATTATG-3') yang diperoleh daTi sekucns spesifik EHEK sebanyak 2 InM. Pennukaan campuran reaksi dilapisi dengan mineral oil. Reaksi PCR dilakukan dengan alat DNA Themlal Cycler (Perkin Elmer) menggunakan 40 siklus, yang tiap siklus terdiri dari : (I) Dcnaturasi pada suhu 94°C selarna I OlCnit, (2) Annealing pacta suhu 60°C selama I menit, (3) Extension pada SullU72°C sclalna 2 menit. Sesudall amplifikasi campuran disentrifugasi 12.0000 rpm. Analisis Amplifikasi DNA. Hasil mnplifikasi DNA E.coli EHEK dianalisis mcnggunakan elektroforesis gel agarose. Lempeng gel agarose dibuat
76
dengan menggunakan 1% (b/v) agarose yang dilarutkan dengan larutan biller 0,09 M Tris-Borate-0,2mM EDT A (TBE). Sejumlah 20 ~l larutan DNA dimasukkan kedalam sumuran yang terdapat dalam lempeng agarose. Sebagai gel loading bufer dipakai larutan yang terdiri daTi 50% gliserol daD 0.025% brornfenolblue. Marker DNA yang digunakan adalall 4> 174 Hae III (BRL). Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan tegangan listrik 100 volt selama 60 memt. Selanjutnya lempeng agar diwamai dengan ethidium bromide. Pengambilan gambar dilakukan dengan kamera Polaroid MP-4, dibawah penyinaran sinar ultraviolet diatas Transilluminator.
BASIL DAN PEMBAHASAN Konsentrasi DNA E.coli EHEK basil isolasi dari 7 isolat dapat di1ibat pactaTabel 1. Hasil rata-rata dari 3 kali percobaan isolasi DNA, mempunyai konsentrasi berkisar antara 577,00 ~glml 1039,5 ~glInl denganrasio A26o/A28o = 1,76 -1,83. Nilai perbandingan basil pembacaan pactapanjang gelombang A2rd A28o adalah untuk mengetahui tingkat kemurnian DNA. Menurut Maniatis (9) nilai rasio yang paling baik antara 1,8 -2,0. Secara umum tingkat kemurnian DNA E. coli EHEK basil isolasi dalarn penelitian ini cukup baik. Hasil ini juga sesuai dari gambaran pola elektrogran1 genornik DNA E.coli EHEK pacta basil analisis dengan elektroforesis gel agarose yang memperlibatkan 1 pita DNA (Gambar 1). Pacta percobaan deteksi DNA E.coli EHEK dengan reaksi PCR digunakan konsentrasi DNA dari Imsil pengenceran sebesar 10 ngl~ dengan bantuan pasangan primer SLTI-F dan SLTI-R, menunjukkan reaksi positif untuk semua isolat yang diuji yaitu isolat 719, 741, 743, 745, HCW 157 , HCI, dan strain 0 157:H7 Adelaide dengan produk amplifIkasi terletak pacta posisi 140 bp pacta lempeng elektroforesis gel agarose (Gambar 2). Pita DNA produk PCR pacta isolat 719 kurang terlibat nyata, sedangkan padac isolat 741, 745, dan strain O157:H7 Adelaide pita DNA terlilmt jelas. Hasil amplifikasi DNA E.coli EHEK dengan konsentrasi 1 nglul dengan menggunakan pasangan primer SLTIR dan SL TIF, masih memberikan basil positif, untuk 6 isolat yang diuji, kecuali untuk isolat 719 sudah tidak menunjukkan adanya amplifikasi DNA (tidak terdeteksi). Hasil percobaan yang dilakukan oleh Garmon et at. (8) menggunakan pasangan primer yang sarna untuk amplifikasi DNA E.coli 0157:H7 yang diisolasi dari daging sapi menunjukkan basil positif dengan fragmen PCR terletak pacta posisi 600 bp pacta lempeng elektroforesis agarose. Perbedaan posisi produk PCR dengan penelitian ini kemungkinan disebabkan adanya perbedaan lokasi sekwens sasaran dalam gen Shiga Toxin untuk primer SLTI. Posisi fragmen DNA produk PCR pada penelitian ini sesuai dengan percobaan penelitian yang dilakukan Polard dkk (10) menggunakan primer yang diperoleh dari gen SLTI yaitu pacta posisi 140 bp. Sensitivitas dari percobaan tersebut adalah 20 pgl~l. Sensitivitas pada penelitian ini lebih rendah yaitu sekitar 1 ngl~l.
9.
Risalah Pel1emuan Ilmiah Penelilian
Perbedaan sensirivitas PCR ini kemungkinan juga disebabkan oleh perbedaanbanyaknya kopi sekwens DNA spesifik yang terdapatsecaraalami dalam DNA isolat bakteri. Selain itu sensitivitas PCR juga dipengarulliolehadanyakontanlinandalamprosesisolasi DNA sampel, dan juga kondisi reaksi PCR seperti banyaknyasiklus yang digunakan(9). Penggunaanpasanganprimer SLTI-F dan SLTI-R mempunyaiprospekhila digunakandalmn deteksi dini E.coli O157:H7 enterohemoragik untllk galur lokal (Indonesia) karena mempunyaispesifisitasyang cukup tinggi.
KESIMPULAN I. Amplifikasi DNA dari 7 isolat E.coli O157:H7 dengan teknik PCR, semua isolat menunjukkan reaksi positif dengan menggunakc'lDpasangan primer SLTIF daD SL T I-R dengan produk PCR terletak pada posisi 140 bp. Sensitifitas dari pasangan primer ini adalah dapat mengamplifikasi DNA E.coli O157:H7 dengan konsentrasi 1 ngiul. 2. Waktu deteksi lebih cepat hila dibandingkan dengan metode konvensional yaitu 13jam.
dan Pengembangan
Teknologi
lsalop dan Radias~ ,,(XX)
4. PADHYE, N.V., and DOYLE, M.P., Rapid procedure for detecting enterohemomgic E.\'cherichia coli 0157:H7 in food. Appl.
Environ.Microbiol ~ (1991)2693-2698. 5.
BRIAN, M.J., FROSOLONO,M., MURA Y, H.E., MIRANDA, A., LOPEZ, E.L., GOMEZ, HF., and CLEARLY, T.G., Polymerase chain reaction for diagnosis of enterohemoragic Escherichiacoli infection and hemolytic uremic syndrome.J. Clin. Microbio/. JQ (1992) 18011806.
6. BEGUM., STROCBINE,N.A., SOWERS,E.G., and JACKSON., M.P., Evaluation of techniquefor identification of shiga like toxin producing Escherichia coli by using polymerase chain reactionanddigoxigenin-labelIedprobes.J. Clin. Microbiol.ll (1993)3153-3156. 7. AUSUBEL, F.M., R.BRENT, R.E. KINGSTON, 0,0. MOORE, J.G. SEOMAN, J.A., and K. STRUHL. Current protocols in molecular biology, p.2.4.1.-2.4.2. John Wiley & Sons, Inc., New York (1987).
8. GANNON, P.J., KING, R.K., KIM, J.Y, and UCAPAN TERIMA KASIH Penulis menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar-besamya kepada Ny. Suheni Sulaeman, Ny. Almaida, daD Sdri. Rika Heryani yang telah banyak membantu dalam penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA DOYLE, M.P., E.~cherichiacoli O157:H7 and its significancein foods. Int. J. Food.Microbiol. n (1991)289-302. 2.
MENG, J., DOYLE, M.P., ZHAO, T., and ZHAO, S., Detection and control of Escherichia coli 0157:H7 in foods. Trend in Food .Science & Technology:! (1994) 179-184.
GOLSTEYN THOMAS, E.J. Rapid and sensitive method for detection of shiga-like toxin-producingEsherichia coli in ground beef using tIle polymerase chain reaction. Applied and Enviromental Microbiology ~ (1992) 3809-3815. MANIATIS, T., FRITSCH, E.F., and SAMBROOK, J., Molecular cloning, Laboratory Manual Book, 3A, 2 nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
10. POLLARD, D.R., JOHNSON, W.M., LIOR, H., TYLER, S.D., and ROZEE, K.R.. Differentiationof shiga toxin and vero cytotoxin type 1 genes by
polymerase chain reaction.
Journal ofInfectiousDiseases162(1990) 11951199
DOYLE, M.P., and SCHOEN!, J.L., Isolation of Escherichia coli O157:H7 from retail fresh meats and poultry. Appl. Environ.Microbiol. .21
(1987)2394-2396.
77
1
Risa/ah Pel1emuan //miah Penelitian dan Pengembangan Tetn%gi /sotop dan RadiaSl; 2{){)()
Tabcl
Hasil allalisis konsentrasi dan nilai kemumian .DNA isolat
E.coli EHEK O157:H7
~~
t
;~
"*
$
6
1
Kb
2Jx J:J,;()
Gambar
78
Pola elektrogram genomik DNA E.coli EHEK deng.m elektroforesis gel agarose. (1). DNA Marker A Hind III, (2). Isolat 719, (3). Isolat 741, (4) Isolat 743, (5). Isolat 745, (6) Isolat HCW 157, (7) Isolat HCI-I, (8) Isolat Adelaide 157.
Risalah Peltemuan Ilmiah Penelilian dan Pengembangan [elrnologi Isolop dan RadlaS/;",(XX)
M
1
2
3
..
5
M
1 6
7 8
1353,,-
1078._.
871--
.603 --
310
281~ bp 271-
234'194-140 118-
1)1'
140
M~~,¥jg~.L : M: Marker DNA
17-1IJ~le ill (BRL) 1 : Koilirol negntif 2: IF:ol:JI 719 3 : .If;oll1( 7~ 1 4 : Isola! 7113
5 : 1801~11 7.15 6 : rsol~,t fJCW 1.57 7:180111IT1(:.'I-1
8 : Isol~ltAdeJ(ljde 157
79
Risalah Pel1emuan Ilmiah Penelitian don Pengembangan leknologi lsotop dan RadiaSl; cfX)()
M 1 2 3
..
5
bp
GWllbw' 3. AJnl)JifiknfJi JJNJ\ igoJnt bJ1l<.tl~l'i E. coli EI-IEK Ol~7:r17 cJl"I)~1lI1 kollsrrlll'nsi 1 ngimJ mrllggllllru
RgnrORe.
_Y~_r~Jg~-: M: Mru'kcr DNA 4I17~ Tille ill (ilRL' 1 : Kollb'ol negatif 2:
Tsolnt719
3 : IAolllt 7~ I " : If;ol:lt 743 .5 : IRolnt 74.5
6 : IRo!~lt JJ(;W 1.S7 7 : IRoiltl
..fC J -J
8 : Isolrlt Adelaide
1.'57
DISKUSI BASRIL
SUDRADJAT ISKANDAR
Dari beberapametodeyang disebutkanterdahulu (kultur. ELISA danPCR). manayang palingekonomis?
1. Untuk mendeteksi DNA E. coli pada konsentrasi rendall 1 mg/ml, apakah ada cara lain yang lebih sederhanadan murall ? 2. Kalau ada, apa perbedaan dengan yang diteliti (metode PCR) ?
DADANG Metode PCR yang lebih ekonomis. dibandingkan dengan metode konvensiorull (kurslls. ELISA) k.1rerul selain cepat. sensitip dan spesefik.
DADANG 1. Tidak ada, hanya dengan metode PCR yang dapat mendeteksi adanya E. coli, dengan menguji DNA yang pada konsentrnsi dibawah 1 mg. 2. Tidak ada.
80
