TECHNIKY PCR PCR - polymerase chain reaction -polymerázová řetězová reakce
Komponenty nukleových kyselin
Nukleotid DNA deoxyguanosid monofosfát (dGMP)
“Koncept párování bazí je striktně konzervativní“
Cytosine
Guanine
Deoxyribosa a fosfát dávají DNA řetězci směr 5’ end
jednotlivé řetězce duplexu jsou k sobě komplementární
5
HO
konce dsDNA nejsou stejné
3’ end T
4
A
1 3
2
DNA rětězce duplexu mohou být denaturována a znovu spojena p j
G
C
T
A
G
C
OH
3’ end
5’ end
Tm (melting temperature) je teplota při které je dsDNA z poloviny denaturována Tm je závislá na: ¾ složení bazí ¾ rozpouštědle iontové síle pH ¾ délce DNA
DNA replikace in vivo vyžaduje několik enzymů separace řetězců syntéza krátkých RNA primerů syntéza dvou nových DNA helixů podílí se enzymy: DNA primasa p helikasa DNA polymerasa DNA ligasa SSB-proteiny
Vlastnosti DNA polymerasy 1. polymerasová aktivita Replikace probíhá vždy ve směru od 5´na 3´konec Nový N ý nukleotid kl tid jje přidáván řidá á tedy vždy na 3´OH konec. 2. 3' 3'--5' exonukle exonukleas asová ová aktivita -opravná funkce “proofreading” 3. 5´exonukle 3 exonukleas asová ová aktivita - odštěpuje RNA primer
DNA replikace in vitro vyžaduje pouze jeden enzym DNA Polymerasa 1957 Arthur Kornberg g dokázal existenci DNA polymerasy - DNA polymerase I
in vitro polymerasa vyžaduje pouze: 4 deoxynukleotidy trifosfáty dsDNA templát primer - ssDNA nebo RNA s volnou 3'-OH FUNKCE OSTATNÍCH PROTEINů JE in vitro NAHRAZENA ZMĚNOU TEPLOT
Syntéza obou řetězců specifické dsDNA in vitro
5’
3’
TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG
3’
5’ Forward primer
5’
dNTPs
3’
TTGAGAAAGGAATAAGC DNA POL AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG
3’
5’
5’
3’
TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG
3’
5’
Syntéza obou řetězců specifické dsDNA in vitro
5’
3’
TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG
3’
5’
5’
3’
TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC DNA POL TCTTTAGCTCATATACG
3’
5’ Reverse primer
dNTPs
55’
33’
GCATATACTCGATTTCT
5’
3’
TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG
3’
5’
PCR: Co to je? Polymerase Chain Reaction: znamená amplifikace (mnohonásobná replikace) relativně krátkých úseků specifické DNA Základní nástroj molekulární biologie se vzrůstájícím významem i v dalších oborech (botanika, kriminalistika) The idea ¾ Ghobind Khorana 1971 ¾ Kary Mullis 1983 Nobelova cena 1993
poprvé provedená mnohonásobná in vitro replikace ve zkumavce
Jak funguje PCR Řetězová reakce vychází z DNA replikace Spočívá v opakování cyklů denaturace (separace dsDNA), navázání primerů a elongace primerů (syntéza nového vlákna DNA) pomocí změn teploty ¾ potřeba silného enzymu (polymerasy) který je schopen pracovat při vysokých teplotách
g y ¾ termofilní organismy objeveny začátkem 70tých let
Jak funguje PCR ¾ Polymerasa izolovaná z termofilní baktérie (Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus) zkr. TAQ, PFU Polymerasa
až s objevem a použitím TERMOSTABILNÍ POLYMERASY získala PCR na významu
Praktické provedení PCR
Počáteční denaturace 94oC 3-5 min denaturace 94oC 30 sec annealing ~55oC 30 sec prodlužování 72oC 1min/kilobáze počet cyklů 25-35 x
Praktické provedení PCR
agarozová elektroforéza
PCR komponenty Templátová DNA ¾ vzorek k amplifikaci
Primery ¾ krátké specifické úseky DNA zaručující specifitu amplifikace
dATP, dTTP, dCTP, dGTP ¾ volné stavební jednotky DNA
Thermostabilní DNA polymerasa (e.g., Taq, Pfu) Pufr a soli (KCl, MgCl2)
Proces PCR Velký nadbytek primeru, dNTPs a Taq POL k DNA templátu
Problémy: PCR je velmi citlivá na kontaminace Častý problém - nespecifická amplifikace ¾ Polymerasa pracuje i při nízkých teplotách (e.g., během nastavování reakce) ¾ “Hot start” PCR je řešení (protilátka proti Taq) Amplifikace je často možná i pro ne zcela známou sekvenci primerů např. DNA jiného biologického druhu ¾ “Degenerované primery” (multiple verze s různými bázemi v klíčové pozici (tryptofan + methionin): P R E T T Y F L Y CCA CGA GAA ACA ACA TAC TTC CTA TAC G G G G G T T G T prettyfly protein má kód degenerovaný na 11 pozicích C C C C C tzn. (4)(2)(4)(2)(4)(4)(2)(2)(2)(4)(2) = 65.536 krát T T T T T A T
stupeň degenerace:
¾ “Touchdown PCR” s vyšší přesností v prvních cyklech Maximální velikost produktu +/-5000 bazí pro standardní PCR: Long PCR kits mohou amplifikovat až 35 kbazí
Navrhování primerů Primery by měly být 20-25 bazí dlouhé Nutná znalost alespoň části sekvence amplifikované DNA 3’ konec primeru je důležitý: vhodné aby zde byla G nebo C báze Procentuální zastoupení G + C by mělo být 50-60% - ovlivňuje Tm (teplota kdy se váže primer na templát) Primery v jedné reakci by měly mít srovnatelné Tm Vyvarovat se repetitivním sekvencím
Tm = (G+C)x4 + (A+T)x2
Vyvarovat se komplementaritě uvnitř či mezi primery degenerované primery max. max 20 bp ideální do degenerace 250x
Navrhování primerů
Příklad navržení primerů: Konvence: DNA se vždy zapisuje ve směru od 5 5´ku ku 3´konci Cílová sekvence: (priming místo podtrženo): 5’TATAAGCCATAACGATATTGCTGAGTCAAGTCCACATATCATATGGATGAG
AAATGCTTGTGGAGCTGATGTTGATTTGGAGAGACTCTCTCTCTCTCTCTCT CTCTCTCTCTCTCTCTCTCAAACCAGTTAAAGAGTGTGCCAGTAGAG 3’ Forward Primer: 5’ATG GAT GAG AAA TGC TTG TG3’ Reverse Primer: 5’ACT GGC ACA CTC TTT AAC TGG3’
Praktické provedení PCR objem v mikrozkumavce: 25-100 ųL složení: •
Templátová DNA 1-1000ng 1 1000ng
•
Primery 10 -20 pmols
•
10mM Tris-CL pH 9.0, 50 mM KCl
•
MgCl2 0.5 -3.0 mM
•
50 ųM každého nukleotidu dATP, dATP dGTP, dGTP dTTP, dTTP dCTP
•
2 jednotky Taq polymerasy
Praktické provedení PCR PCR se provádí v termocyklerech
kovový blok z ušlechtilého kovu snadné programování vyhřívané víko
PCR Optimalizace Složka
specifická amplifikace
AnnealingTeplota - Tm
nespecifická amplifikace
nízká
vysoká
MgCl2
vysoká
nízká
KCl
vysoká
nízká
Enzym, Primer
vysoká
nízká
pH
nespecificky
Formamid
nízká
vysoká
látky ovlivňující kvalitu PCR: formamid, DMSO, betain atd. pro GC-rich templáty
Nespecifická amplifikace
Základní typy PCR
RT PCR (reverse transcriptase PCR) vlastní PCR předchází syntéza cDNA z mRNA pomocí RT jako primer slouží
GSP (gene specific primer) oligo dT random hexamer primer
hledání nových genů tvorba cDNA knihoven hledání mutací zjišťování síly exprese různých genů
RACE PCR (rapid amplification of cDNA ends) vychází z RT-PCR používá se k hledání celé sekvence nového genu nutná alespoň částečná znalost sekvence hledaného genu vhodné pro klonování genů a jeho následnou funkční expresi (GMO)
inverzní PCR Amplifikace neznámých segmentů DNA
asymetrická PCR sekvenace DNA, příprava hybridizačních sond amplifikuje pouze jeden řetězec dsDNA SEKVENCOVÁNÍ DNA automatické sekvenátory využívající asymetrické PCR •jednozkumavková reakce •PCR s jedním primerem a dideoxyribonukleotidy (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) •dideoxyribonukleotidy dideoxyribonukleotidy značené 4 fluorescenčními markery •velice citlivé elektroforetické rozdělení v kapiláře •fluorometr s automatickým vyhodnocením
multiplex PCR více amplifikací v jedné zkumavce lékařská diagnostika
nested PCR 2 po sobě jdoucí PCR zvyšování specificity PCR
LA-PCR (long and accurate) amplifikace dlouhých úseků, polymerasové kokteily – např. Taq + Pfu polymerasa (180:1) Pwo polymerasa z Pyroccocus woesei DeepVent® polymerasa z Termococcus litoralis (hlubokomořská baktérie) DNA polymeráza Taq Pfu Pwo DeepVent® long PCR koktejl
5´-3´exonukleázová 3´-5´exonukleázová aktivita aktivita + + + + + +
délka produktu 3 kb 3 kb 3 kb 12 kb 20 kb
frekvence chyby 10-4 1.3 x 10-6 3 3 x 10-6 3.3 3.0 x 10-5 2.0 x 10-6
PROCESIVITA: jak dlouho se enzym udrží na vlákně STABILITA: kolik minut při denaturační teplotě např Taq 9 min při 97.5 °C Pwo 2 hod při 100 °C DeepVent® 8hod při 100 °C
in situ RT PCR lokalizace translace a exprese genů
real time PCR slouží k přesné kvantifikaci amplifikovaného produktu využití fluorescence interkalačních barviv (etBr) fluorimetr fl i jje součástí čá í termocykleru kl
Real-time PCR monitoruje fluorescenci uvolňovanou jako odezvu na každý uskutečněný cyklus v PCR (v reálném čase). + d daleko l k přesnější př ější oproti p ti end-point d p i t barvení b í EtBr EtB při konvenční PCR - náročné na optimalizaci a vybavení
aplikace REAL-TIME PCR 1) absolutní kvantifikace množství DNA ve vzorku k externímu standardu, detekce virální či bakteriální DNA, forenzní chemie 2) koncová detekce SNP genotypizace, detekce mutací a polymorfismů 3) relativní kvantifikace
princip měření vznikající fluorescence po každém cyklu PCR, stanovení křivek tání
chemismus 1) interkalační barviva SYBRgreen interkalace barviva na dvoušroubovici vznikající (amplifikované) DNA precizní výběr primerů – nesmí vytvářet dimery nutná kontrola amplifikovaného produktu na křivku denaturačních teplot
chemismus 2) hybridizační sondy (TAQman) uvolňování fluorescence po degradaci sondy nutná 5´-3´exonukleasová aktivita Taq polymerasy fluorescenční značka: VIC, FAM (fluorescein) zhášeč: Tamra (Tetramethyl-6-Carboxyrhodamine)
FRET = Förster/fluorescence resonance energy transfer
srovnání TaqMan
SybrGreen
specifita
primery proba PCR podmínky
primery PCR podmínky
flexibilita
singleplex multiplex (max.4) (max 4)
singleplex
aplikace
kvantifikace SNP detekce
kvantifikace
cena
vysoká
nízká
kontaminace • největší problém PCR • aerosol, pipety, staré amplikony • částečné řešení URACIL N-GLYKOSYLASA
štěpí ss a dsDNA s inkorporovaným deoxyuracilem (dUTP) termolabilní, 0% aktivita nad 55◦C nereaguje s templátem (dTTP) dUTP v qPCR mixu místo dTTP pracuje během nastavení PCR reakce
chyby v pipetování • templát (cDNA) • p premix (p (primery, y, proba, p , polymerasa, p y , dNTP,, pufr, p , srovnávací fluorescenční barvivo) částečné řešení
- ROX
fluorescence se nemění během PCR cyklů a vzrůstající fluorescence v každé zkumavce vzorku je extrapolována na srovnávací
AMOUNT OF DNA
lineární vynesení 1600000000 1400000000 AMOUNT OF DNA A
1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1,024 2,048 4,096 8,192 16,384 32,768 65,536 131,072 262,144 524,288 1,048,576 2,097,152 4,194,304 8,388,608 16,777,216 33,554,432 67,108,864 134,217,728 268,435,456 536,870,912 1,073,741,824 1,400,000,000 1,500,000,000 1,550,000,000 1,580,000,000
1200000000 1000000000 800000000 600000000 400000000 200000000 0 0
5
10
15
20
25
30
35
PCR CYCLE NUMBER
logaritmické vynesení AMOU N T OF D N A
CYCLE NUMBER 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
10000000000 1000000000 100000000 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 1 0
5
10
15
20
25
PCR CYCLE NUMBER
30
35
lineární ~20 do ~1500
CT hodnoty threshold
treshold je třeba nastavit tak aby u každého vzorku procházel lineární části křivky CT počet cyklů při kterém fluorescence vzorku překročí threshold (prahovou hodnotu)
před každou kvantifikací je třeba vždy udělat standardní křivku – absolutní kvantifikace templát: 10x ředění threshold
přímo cDNA, nebo p plasmid s buď p naklonovaným genem, který stanovujeme
CT koncentrace templátu
PARAMETRY STANDARDNÍ KŘIVKY • směrnice: ideální -3,32 = 100% efektivita reakce • %EFF – kolik kopii templátu je zkopírováno v každém cyklu • R2 korelační koeficient (tolerovat se dá ještě 0,995)
%EFF 100% 90% 80% 70%
= 2.00x = 1.90x = 1.80x = 1.70x
10,000,000,000 100% EFF
1,000,000,000
90% EFF
100,000,000 AM MOUNT OF DNA
CYCLE AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA 100% EFFICIENCY 90% EFFICIENCY 80% EFFICIENCY 70% EFFICIENCY 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 4 4 3 3 3 8 7 6 5 4 16 13 10 8 5 32 25 19 14 6 64 47 34 24 7 128 89 61 41 8 256 170 110 70 9 512 323 198 119 10 1,024 613 357 202 11 2,048 1,165 643 343 12 4,096 2,213 1,157 583 13 8,192 4,205 2,082 990 14 16,384 7,990 3,748 1,684 15 32,768 15,181 6,747 2,862 16 65,536 28,844 12,144 4,866 17 131,072 54,804 21,859 8,272 18 262,144 104,127 39,346 14,063 19 524,288 197,842 70,824 23,907 20 1,048,576 375,900 127,482 40,642 21 2,097,152 714,209 229,468 69,092 22 4,194,304 1,356,998 413,043 117,456 23 8,388,608 2,578,296 743,477 199,676 24 16 777 216 16,777,216 4 898 763 4,898,763 1 338 259 1,338,259 339 449 339,449 25 33,554,432 9,307,650 2,408,866 577,063 26 67,108,864 17,684,534 4,335,959 981,007 27 134,217,728 33,600,615 7,804,726 1,667,711 28 268,435,456 63,841,168 14,048,506 2,835,109 29 536,870,912 121,298,220 25,287,311 4,819,686 30 1,073,741,824 230,466,618 45,517,160 8,193,466
80% EFF
10,000,000
70% EFF
1,000,000 100,000 10,000 1,000 , 100 10 1 0
10
20
30
PCR CYCLE NUMBER
relativní kvantifikace je možná pouze pokud sledovaný gen a referenční gen má srovnatelnou a vysokou efektivitu > 90% ± 3%
REFERENČNÍ GEN relativní kvantifikace
• musí mít stabilní expresi ve všech studovaných t d ý h vzorcích í h • nejčastěji provozní geny (house-keeping) • actin, GAPDH, cyklofilin, 18S RNA
TaqMan Human Endogenous Control Plate
ΔCT
ΔCT = 2
čtyřnásobný rozdíl v expresi
změna v jednom cyklu při 100% efektivitě je rovna dvounásobné změně ve výchozí koncentraci cDNA
18S ribosomální RNA • přepisována jinou RNA polymerasou než mRNA • byly popsány výkyvy mezi množstvím rRNA a mRNA • nelze použít pokud se vychází z mRNA
vyhodnocení kalibrátor
sample 1
sample 2
izolace celkové RNA (mRNA) přepis do cDNA navržení primerů a sond pro referenční gen a studovaný (GOI) určení č í standardních t d d í h křivek kři k pro oba b geny a stanovení t í efektivity f kti it
GAPDH
GAPDH
GAPDH
GOI
GOI
GOI
vyhodnocení
kalibrátor sample A sample A sample B kalibrátor sample B
GAPDH GOI
1
vyhodnocení
metoda „delta delta cé té“
změny exprese pro sample 1
1 určíme CT pro všechny křivky 1. 2. určíme CT 3. 4.
GOI
určíme CT
- CT
GOI
GAPDH
- CT
pro kalibrátor
ΔCT kalibrátor
pro sample 1
ΔCT sample 1
GAPDH
ΔCTsample 1 - ΔCTkalibrátor
ΔΔCT
výsledek (kolikrát je gen více či méně exprimován)
2-ΔΔCT
2
vyhodnocení počítá se i s efektivitou
Sample A - kalibrátor Sample B - vzorek
3
vyhodnocení
pomocí standardů o známe koncentraci se spočítají počty kopií ve vzorcích
příklad linie živočišných buněk byla podstoupena umlčení (silencing) genu pkg2 s linie transfekované a netransfekované (kalibrátor) byla izolována RNA, přepsana do cDNA a provedeno qPCR s primery a probou na gen pkg2 a GAPDH (referenční gen). Snížila se exprese genu pkg2 po umlčení? pkg2 Eff 86% cDNA cDNA
kalibrator silencing
CT 22,48 CT 22,3
cDNA cDNA
pkg2
2-ΔΔCT 2
–(5,33-2,43)
0,134 7,5x
GAPDH Eff 77% CT 20,05 kalibrator CT 16,97 silencing
cDNA cDNA DNA
kalibrator
cDNA cDNA
kalibrator
1,1x104 kopií 1 23 104 kopií 1,23x10 k ií
silencing
GAPDH
(1+0,86)0,18/(1+0,77)3,08
0,192 Gen snížil expresi 5,2x
silencing
1,55x104 kopií 8,92x104 kopií
0,194 5,2x
navrhování primerů velikost amplikonu
50-150 bp
délk primerů délka i ů
20 bp b
primery se nesmí překrývat s próbou
Tm 58-60◦C optimální teplota pro degradaci proby exonukleasovou aktivitou
GC obsah 50-70% žádné vlásenky žádné dimery (self-dimery, cross-dimery)
navrhování proby délka proby
13-25 bp
primery p e y se nesmí es překrývat p e ý at s p próbou óbou
Tm 68-70◦C o 10◦C vyšší než Tm primerů
GC obsah 50-70% žádné G na 5´konci zháší fluorescenci FAM barvy
navrhování primerů a proby
kontaminace genomickou DNA 1) ošetření vzorků před RT DNasou 2) navržení primerů do dvou exonů mezi nimiž je dlouhý intron 3) navržení primeru nebo proby na přechod intron/exon
MGB PROBY •
minor groove binding
•
stabilizuje vazbu proby na ssDNA
•
výrazně zvyšuje Tm
•
můžeme navrhovat krátké proby při zachování vysoké Tm
MGB PROBY využití pro alelické diskriminace
kolik replikací a kdy replikovat? sample
extrakce RNA
přepis do cDNA
qPCR
3X
6X
kolik replikací a kdy replikovat? ideální 3x sample
extrakce RNA
přepis do cDNA
qPCR
27X
instrumentace 7500 Real Time PCR System
7900HT Real Time PCR System
StepONE Real Time PCR System
zesilovač halogenová lampa
emisní filtry
excitační filtry zkumavky se vzorky v peltierovém bloku
ccd kamera
instrumentace
http://www.youtube.com/watch?v=k16WgEU1kVM
Využití REAL TIME PCR pro detekci jednobodové mutace (lékařská diagnostika)
HRM ANALYSA (HIGH RESOLUTION MELT) • detekce SNP bez specifických sond • díky kvalitní instrumentaci Corbett (±0.02◦C) a nové generaci interkalačních barviv (LCGreenPlus)
HRM ANALYSA
pro amplikony do 200bp
Aplikace PCR a využití v praxi
Aplikace PCR a využití v praxi DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ detekce virových a bakteriálních onemocnění
Aplikace PCR a využití v praxi DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ detekce geneticky vrozených chorob (mutace DNA) AS PCR alelicky specifická PCR primer navržen tak, že mutace odpovídá konci primeru fragmenty DNA s nespárovanými konci se pohybují v elektrickém poli pomaleji Real time PCR pomocí fluorescenční sondy odpovídající mutaci
Např. detekce cystické fibrózy, choroba je podmíněná třínukleotidovou delecí v genu CFTR cystic fibrosis transmembrane regulator
Aplikace PCR a využití v praxi
NEZÁVADNOST POTRAVIN
Aplikace PCR a využití v praxi KRIMINALISTIKA
VNRT – variable number of tandem repeat – vyskytují se na různých lokusech chromozomů a v populací kolísají mezi j di i v počtu jedinci čt opakování k á í mezi m i 4-40x 4 40 např. ř GTGTGTGT
Aplikace PCR a využití v praxi ANALÝZA POTRAVIN • molekulárně-genetické zhodnocení surovin ži čiš éh živočišného a rostlinného tli éh původu, ů d kt é byly které b l vyprodukovány klasickým pěstováním (chovem) nebo s použitím genového inženýrství • průkaz falšování potravin druhovou (rostlinného i živočišného původu)
záměnou
• identifikace mikroorganismů kontaminující potraviny EVOLUČNÍ BIOLOGIE nebo geneticky změněných mikroorganismů ORNITOLOGIE používaných jako startovací nebo ochranné kultury v produkci potravin. skot ovce prase koza TEST
