TECHNIKY PCR PCR - polymerase chain reaction -polymerázová řetězová reakce
Přehled
Molekulárně-biologický úvod, DNA struktura, replikace, DNA polymerasa Princip procesu PCR Optimalizace PCR Typy PCR Aplikace PCR a využití v praxi
Komponenty nukleových kyselin
Nukleotid DNA deoxyguanosid monofosfát (dGMP)
http://ntri.tamuk.edu/cell/nucleic.html
“Koncept párování bazí je striktně konzervativní“
Cytosine
Guanine
From Dr. John C. Perez, Professor and Director of the Natural Toxins Research Initiative, Texas A&M http://ntri.tamuk.edu/cell/dna.html
Deoxyribosa a fosfát dávají DNA řetězci směr 5’ end
jednotlivé řetězce duplexu jsou k sobě komplementární
5
HO
konce dsDNA nejsou stejné
3’ end T
4
A
1 3
2
DNA rětězce duplexu mohou být denaturována a znovu spojena
G
C
T
A
G
C
OH
3’ end
5’ end
Tm (melting temperature) je teplota při které je dsDNA z poloviny denaturována Tm je závislá na: ¾ složení bazí ¾ rozpouštědle iontové síle pH ¾ délce DNA
Singer, M., and P. Berg. 1991. Genes and Genomes. University Science Books, Mill Valley, CA. p. 49
DNA replikace in vivo vyžaduje několik enzymů separace řetězců syntéza krátkých RNA primerů syntéza dvou nových DNA helixů podílí se enzymy: DNA primasa helikasa DNA polymerasa DNA ligasa SSB-proteiny http://www.accessexcellence.org/AB/GG/collaboration.html
Vlastnosti DNA polymerasy 1. POLYMERASOVÁ AKTIVITA Replikace probíhá vždy ve směru od 5´na 3´konec Nový nukleotid je přidáván tedy vždy na 3´OH konec. 2. 3'-5' exonukleasová aktivita -opravná funkce “proofreading” 3. 5´exonukleasová aktivita - odštěpuje RNA primer
DNA replikace in vitro vyžaduje pouze jeden enzym DNA Polymerasa 1957 Arthur Kornberg dokázal existenci DNA polymerasy - DNA polymerase I
in vitro polymerasa vyžaduje pouze: 4 deoxynukleotidy trifosfáty dsDNA templát primer - ssDNA nebo RNA s volnou 3'-OH
Syntéza obou řetězců specifické dsDNA in vitro
5’
3’
TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG
3’
5’ Forward primer
5’
dNTPs
3’
TTGAGAAAGGAATAAGC DNA POL AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG
3’
5’
5’
3’
TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG
3’
5’
Syntéza obou řetězců specifické dsDNA in vitro
5’
3’
TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG
3’
5’
5’
3’
TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC DNA POL TCTTTAGCTCATATACG
3’
5’ Reverse primer
dNTPs
5’
3’
GCATATACTCGATTTCT
5’
3’
TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG
3’
5’
PCR: Co to je? Polymerase Chain Reaction: znamená amplifikace (mnohonásobná replikace) relativně krátkých úseků specifické DNA Základní nástroj molekulární biologie se vzrůstájícím významem i v dalších oborech (botanika, kriminalistika) The idea ¾ Ghobind Khorana 1971 ¾ Kary Mullis 1983 Nobelova cena 1993
poprvé provedená mnohonásobná in vitro replikace ve zkumavce
Jak funguje PCR Řetězová reakce vychází z DNA replikace Spočívá v opakování cyklů denaturace (separace dsDNA), navázání primerů a elongace primerů (syntéza nového vlákna DNA) pomocí změn teploty ¾ potřeba silného enzymu (polymerasy) který je schopen pracovat při vysokých teplotách
¾ termofilní organismy objeveny začátkem 70tých let
Jak funguje PCR ¾ Polymerasa izolovaná z termofilní baktérie (Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus) zkr. TAQ, PFU Polymerasa
až s objevem a použitím TERMOSTABILNÍ POLYMERASY získala PCR na významu
PCR komponenty Templátová DNA ¾ vzorek k amplifikaci
Primery ¾ krátké specifické úseky DNA zaručující specifitu amplifikace
dATP, dTTP, dCTP, dGTP ¾ volné stavební jednotky DNA
Thermostabilní DNA polymerasa (e.g., Taq, Pfu) Pufr a soli (KCl, MgCl2)
Proces PCR Velký nadbytek primeru, dNTPs a Taq POL k DNA templátu
http://www.molbio.princeton.edu/courses/mol214/schedule.htm http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/PCRmov.html
Problémy: PCR je velmi citlivá na kontaminace Častý problém - nespecifická amplifikace ¾ Polymerasa pracuje i při nízkých teplotách (e.g., během nastavování reakce) ¾ “Hot start” PCR je řešení (protilátka proti Taq) Amplifikace je často možná i pro ne zcela známou sekvenci primerů např. DNA jiného biologického druhu ¾ “Degenerované primery” (multiple verze s různými bázemi v klíčové pozici (tryptofan + methionin): P R E T T Y F L Y CCA CGA GAA ACA ACA TAC TTC CTA TAC G G G G G T T G T prettyfly protein má kód degenerovaný na 11 pozicích C C C C C tzn. (4)(2)(4)(2)(4)(4)(2)(2)(2)(4)(2) = 65.536 krát T T T T T A T
stupeň degenerace:
¾ “Touchdown PCR” s vyšší přesností v prvních cyklech Maximální velikost produktu +/-5000 bazí pro standardní PCR: Long PCR kits mohou amplifikovat až 35 kbazí
Navrhování primerů Primery by měly být 20-25 bazí dlouhé Nutná znalost alespoň části sekvence amplifikované DNA 3’ konec primeru je důležitý: vhodné aby zde byla G nebo C báze Procentuální zastoupení G + C by mělo být 50-60% - ovlivňuje Tm (teplota kdy se váže primer na templát) Primery v jedné reakci by měli mít srovnatelné Tm Vyvarovat se repetitivním sekvencím
Tm = (G+C)x4 + (A+T)x2
Vyvarovat se komplementaritě uvnitř či mezi primery
degenerované primery max. 20 bp ideální do degenerace 250x
Navrhování primerů
Příklad navržení primerů: Konvence: DNA se vždy zapisuje ve směru od 5´ku 3´konci Cílová sekvence: (priming místo podtrženo): 5’TATAAGCCATAACGATATTGCTGAGTCAAGTCCACATATC
ATATGGATGAGAAATGCTTGTGGAGCTGATGTTGATTTGG AGAGACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC AAACCAGTTAAAGAGTGTGCCAGTAGAG 3’ Forward Primer: 5’ATG GAT GAG AAA TGC TTG TG3’ Reverse Primer: 5’ACT GGC ACA CTC TTT AAC TGG3’
Praktické provedení PCR objem v mikrozkumavce: 25-100 ųL složení: •
Templátová DNA 1-1000ng
•
Primery 10 -20 pmols
•
10mM Tris-CL pH 9.0, 50 mM KCl
•
MgCl2 0.5 -3.0 mM
•
50 ųM každého nukleotidu dATP, dGTP, dTTP, dCTP
•
2 jednotky Taq polymerasy
Praktické provedení PCR
Počáteční denaturace 94oC 3-5 min denaturace 94oC 30 sec annealing ~55oC 30 sec prodlužování 72oC 1min/kilobáze počet cyklů 25-35 x
Praktické provedení PCR
agarozová elektroforéza
Praktické provedení PCR
PCR se provádí v termocyklerech
kovový blok z ušlechtilého kovu snadné programování vyhřívané víko
PCR Optimalizace Složka
Nízká specificita
Vysoká specificita
AnnealingTeplota - Tm
MgCl2 KCl Enzym, Primer pH Formamid
látky ovlivňující kvalitu PCR: formamid, DMSO, betain atd.
Nespecifická amplifikace
nespecificky
Základní typy PCR
RT PCR
(reverse transcriptase PCR)
vlastní PCR předchází syntéza cDNA z mRNA pomocí RT jako primer slouží
GSP (gene specific primer) oligo dT random hexamer primer
hledání nových genů tvorba cDNA knihoven hledání mutací zjišťování síly exprese různých genů
RACE PCR (rapid amplification of cDNA ends) vychází z RT-PCR používá se k hledání celé sekvence nového genu nutná alespoň částečná znalost sekvence hledaného genu vhodné pro klonování genů a jeho následnou funkční expresi (GMO)
inverzní PCR Amplifikace neznámých segmentů DNA
asymetrická PCR sekvenace DNA, příprava hybridizačních sond amplifikuje pouze jeden řetězec dsDNA SEKVENCOVÁNÍ DNA automatické sekvenátory využívající asymetrické PCR •jednozkumavková reakce •PCR s jedním primerem a dideoxyribonukleotidy (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) •dideoxyribonukleotidy značené 4 fluorescenčními markery •velice citlivé elektroforetické rozdělení v kapiláře •fluorometr s automatickým vyhodnocením
multiplex PCR více amplifikací v jedné zkumavce lékařská diagnostika
nested PCR 2 po sobě jdoucí PCR zvyšování specificity PCR
LA-PCR (long and accurate) amplifikace dlouhých úseků, polymerasové kokteily – např. Taq + Pfu polymerasa (180:1) Pwo polymerasa z Pyroccocus woesei DeepVent® polymerasa z Termococcus litoralis (hlubokomořská baktérie) DNA polymeráza Taq Pfu Pwo DeepVent® long PCR koktejl
5´-3´exonukleázová 3´-5´exonukleázová aktivita aktivita + + + + + +
délka produktu 3 kb 3 kb 3 kb 12 kb 20 kb
frekvence chyby 10-4 1.3 x 10-6 3.3 x 10-6 3.0 x 10-5 2.0 x 10-6
PROCESIVITA: jak dlouho se enzym udrží na vlákně STABILITA: kolik minut při denaturační teplotě např Taq 9 min při 97.5 °C Pwo 2 hod při 100 °C DeepVent® 8hod při 100 °C
in situ RT PCR lokalizace translace a exprese genů
real time PCR slouží k přesné kvantifikaci amplifikovaného produktu využití fluorescence interkalačních barviv (etBr) fluorimetr je součástí termocykleru
http://pathology2.jhu.edu/MOLEC/techniques main.cfm##
Využití REAL TIME PCR pro detekci jednobodové mutace (lékařská diagnostika)
Aplikace PCR a využití v praxi
Aplikace PCR a využití v praxi DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ 1. detekce virových a bakteriálních onemocnění
Aplikace PCR a využití v praxi DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ 2. detekce geneticky vrozených chorob (mutace DNA) -
AS PCR alelicky specifická PCR
primer navržen tak, že mutace odpovídá konci primeru fragmenty DNA s nespárovanými konci se pohybují v elektrickém poli pomaleji
-
Real time PCR
pomocí fluorescenční sondy odpovídající mutaci
Např. detekce cystické fibrózy, choroba je podmíněná třínukleotidovou delecí v genu CFTR cystic fibrosis transmembrane regulator
Aplikace PCR a využití v praxi KRIMINALISTIKA VNRT – variable number of tandem repeat – vyskytují se na různých lokusech chromozomů a v populací kolísají mezi jedinci v počtu opakování mezi 4-40x např. GTGTGTGT
Aplikace PCR a využití v praxi ANALÝZA POTRAVIN molekulárně-genetické zhodnocení surovin živočišného a rostlinného původu, které byly vyprodukovány klasickým pěstováním (chovem) nebo s použitím genového inženýrství průkaz falšování potravin druhovou záměnou (rostlinného i živočišného původu) identifikace mikroorganismů kontaminující potraviny nebo geneticky změněných mikroorganismů používaných jako startovací nebo ochranné kultury v produkci potravin.
EVOLUČNÍ BIOLOGIE ORNITOLOGIE skot
ovce
prase
koza
TEST
