5. IDENTIFIKASI BAKTERI ASAM LAKTAT INDIGENUS ASAL DAGING SAPI DENGAN MENGGUNAKAN PCR ( POLYMERASE CHAIN REACTION

79

5. IDENTIFIKASI BAKTERI ASAM LAKTAT INDIGENUS ASAL DAGING SAPI DENGAN MENGGUNAKAN PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) DAN ANALISIS URUTAN BASA GEN 16S rRNA ABSTRAK FAO/WHO (2002) mensyaratkan identifikasi yang akurat pada tingkatan genus, spesies bahkan galur bakteri asam laktat yang diklaim sebagai probiotik. Selain identifikasi secara fenotipik atau biokimiawi, sangat diperlukan identifikasi secara molekuler yang secara akurat mampu menentukan spesies dan galur BAL probiotik. Gen 16S rRNA paling akurat untuk menentukan taksonomi suatu bakteri. Tujuan penelitian ini adalah untuk menentukan genus, spesies dan galur BAL asal daging sapi lokal melalui identifikasi secara molekuler dengan PCR (Polymerase Chain Reaction) dan analisis urutan basa gen 16S rRNA. Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA adalah primer universal 9F (5’-gagtttgatcctggctcag -3’) dan 1541R (5’-aaggaggtgatccagcc -3’), sedangkan untuk analisis urutan basa gen 16S rRNA digunakan 5 primer yaitu 2 primer universal 785F (5’-ggattagataccctggtagtc-3’) dan 802R (5’-taccagggtatctaatcc-3’), dan 3 primer yang didesain sendiri yaitu Primer 1R (5’-gggcatgatgatttgacgtc-3’), primer 2F (5’-gtgagactgccggtgacaaa-3’) dan primer 3R (5’-atcagacttaaaaaaccgcc3’). Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen 16S rRNA dapat diisolasi secara spesifik (pita tunggal) dengan PCR menggunakan primer dan kondisi yang dioptimasi. Urutan basa gen 16S rRNA dapat dibaca dengan baik pada daerah V6V9 (600 pasang basa). Sebelas isolat yaitu 1C3, 1B1, 2D1, 1D1, 1A1, 1C1, 2C12, 1A5, 1C4, 2B1 dan 2B2 merupakan spesies Lactobacillus plantarum. Isolat 2A2 dan 1A6 termasuk dalam spesies Pediococcus pentosaceous. Isolat 2D2 adalah Enterococcus faecium. Enam isolat BAL lainnya yaitu 1C6, 2C2, 1A2, 2B3, 2B4 dan 1A32 sangat dekat kekerabatannya dengan Lactobacillus acidophilus.

PENDAHULUAN

Identifikasi bakteri asam laktat (BAL) sangat diperlukan untuk mengetahui genus, spesies bahkan galurnya. Menurut FAO/WHO (2002), untuk dapat dikatakan sebagai probiotik, maka BAL harus diketahui spesies bahkan sampai galur untuk klaim sifat fungsional tertentu. Identifikasi BAL semula didasarkan pada metode fenotipik yaitu morfologi sel, analisis produk fermentasi, aktivitas enzim yang dimiliki serta kemampuan memfermentasi beberapa substrat karbohidrat. Metode tersebut mempunyai kelemahan utama yaitu terkadang salah

80

atau tidak dapat membedakan spesies dan galur bakteri. Selain itu juga reprodusibilitasnya rendah karena sangat tergantung pada kondisi kultur di laboratorium yang berbeda. Analisis asam nukleat digunakan untuk mengatasi kelemahan metode fenotipik. Pendekatan genotipik mampu memberikan informasi identifikasi BAL yang akurat dengan reprodusibilitas tinggi (Tannock 1999; Salminen et al. 2005; Lee 2009). Pada tahun 1980-an, standar baru identifikasi bakteri mulai dikembangkan oleh Woose. Hubungan kekerabatan filogenetik diantara bakteri dapat ditentukan oleh kode genetik pada daerah gen yang disebut dengan unit 5S, 16S dan 23S rRNA dan daerah diantaranya. Gen 16S rRNA paling akurat untuk menentukan taksonomi suatu bakteri dibandingkan dengan gen 5S dan 23S. Panjang urutan basa gen 16S rRNA adalah 1500-1550 pasang basa. Adanya mutasi ataupun perbedaan basa pada urutan basa tersebut dijadikan sebagai penentu identifikasi suatu bakteri pada tingkat genus, spesies bahkan sampai galur (Tannock 1999, Klein et al. 1998, Clarridge 2004). Perbandingan urutan basa gen 16S rRNA diantara genus Lactobacillus menunjukkan bahwa urutan basa tersebut mengandung informasi spesifik spesies. Untuk tujuan identifikasi, diperlukan amplifikasi dengan menggunakan PCR dan analisis urutan basa sedikitnya 500 pasang basa (Petrosino et al 2009).

Urutan basa antar isolat Lactobacillus

dinyatakan homolog jika nilai kemiripannya (similaritasnya) minimal 94% (Weisburg et al. 1991, Tannock 1999). Gen 16S rRNA terbagi menjadi sembilan bagian yang disebut dengan daerah V1 sampai V9. Disamping daerah V1-V3, daerah V6-V9 merupakan daerah divergen yang yang menentukan heterogenitas atau adanya mutasi gen yang mengarah pada perbedaan spesies suatu bakteri (Cai et al. 2003; Petrosino et al. 2009). Identifikasi BAL berdasarkan analisis urutan basa (sequencing) gen 16S rRNA merupakan metode utama untuk menentukan spesies dan galur baru. Balcazar et al (2007) melakukan identifikasi BAL yang diisolasi dari isi pencernaan ikan salmon menggunakan analisis urutan basa gen 16S rRNA. Hasilnya menunjukkan bahwa dengan mengamplifikasi dan melakukan analisis urutan basa terhadap 500 pasang basa yang menyandi gen 16S rRNA dapat diketahui spesies dan galur BAL yang diisolasi dengan tepat. Falsen et al (1999)

81

menemukan spesies BAL baru yaitu Lactobacillus iners sp.nov. yang diisolasi dari spesimen manusia dengan menggunakan metode analisis urutan basa gen 16S rRNA. Identifikasi Lactobacillus salivarius juga berhasil dilakukan dengan menggunakan analisis urutan basa gen 16S rRNA oleh Woo et al. (2002). Diversitas Lactobacillus spp dan genus BAL lainnya yang diisolasi dari usus manusia juga berhasil diketahui dengan amplifikasi gen 16S rRNA oleh Heilig et al. (2002). Spesies baru Lactobacillus tucceti sp. nov berhasil diisolasi dari sosis dan diidentifikasi dengan analisis urutan basa 16S rRNA (Chenoll et al. 2006). Beberapa peneliti lainnya yang menggunakan metode analisis urutan basa gen 16S rRNA untuk mengidentifikasi BAL yang diisolasi dari alam antara lain Matamoros et al (2010), Tamang et al. (2008), Lee et al. (2007), Moreira et al. (2005), Dickson et al. (2005), serta Anukam et al. (2005). Isolat indigenus BAL yang diisolasi dari daging sapi lokal (Arief et al. 2007) telah diidentifikasi secara morfologi dan biokimiawi. Karakteristik awal BAL tersebut secara morfologi berbeda diantaranya berbentuk koki (bulat), basil (batang) dalam rantai pendek-pendek, koloni melengkung sebagian tunggal dan ada yang berkelompok, Gram (+), katalase negatif dan non motil. Selain itu sifat biokimiawinya juga telah diketahui di antaranya pertumbuhan pada suhu berbeda, pola homo atau heterofermentatif serta kemampuan fermentasi terhadap 12 jenis gula sederhana. Namun demikian identifikasi tersebut belum cukup untuk menentukan spesies dari isolat-isolat tersebut. Oleh karenanya sangat diperlukan identifikasi secara molekuler terutama analisis urutan basa gen 16S rRNA yang merupakan daerah kunci penentu identifikasi BAL. Tujuan penelitian ini adalah untuk menentukan genus, spesies dan galur BAL asal daging sapi lokal melalui identifikasi secara molekuler dengan PCR (Polymerase Chain Reaction) dan analisis urutan basa (sequencing) gen 16S rRNA. Selain itu juga disusun pohon filogenetik yang menggambarkan hubungan kekerabatan diantara isolat tersebut dengan isolat BAL internasional yang terdeposit di GenBank.

82

BAHAN DAN METODE Pemilihan Isolat Isolat BAL yang digunakan pada penelitian ini adalah 20 isolat, dalam kondisi freeze dried selama perjalanan Indonesia – Jepang, karena penelitian ini dilakukan di Laboratory of Applied Microbiology, International Center for Biotechnology, Osaka University, Jepang. Penyegaran kultur dilakukan dengan menggunakan media MRS broth (Oxoid). Dua puluh isolat tersebut telah diketahui morfologi dan identifikasi sederhana secara biokimiawi (Tabel 5.1 dan 5.2). Tabel 5.1 Morfologi 20 isolat BAL asal daging sapi lokal (Arief et al. 2007) No

Kode isolat

Bentuk

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

1A2 1A5 2B1 2A2 1A32 1B1 1A1 1A6 2B2 2B3 2B4 1C1 1C3 1C4 1C6 2C2 2C12 1D1 2D1 2D2

Batang Batang Batang Coccus Batang Batang Batang Coccus Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Coccus

Pertumbuhan di suhu 10°C 45°C + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Pertumbuhan di NaCl 6.5% + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Menghasilkan NH3 dari arginin +

Menghasilkan gas dari glukosa -

(+) = dapat tumbuh baik, (-) = tidak dapat tumbuh baik atau tidak menghasilkan NH3 atau gas

Pemilihan 20 isolat berdasarkan pertimbangan bahwa 10 isolat terpilih adalah galur BAL mempunyai sifat sebagai kandidat probiotik berdasarkan penelitian sebelumnya (2B4, 1B1, 1A5, 2C2, 2D1, 2B2, 1C4, 2B1, 1A32 dan 2C12). Sepuluh isolat lainnya dipilih sesuai kemiripannya dengan 10 isolat terseleksi awal berdasarkan kemampuan fermentasi terhadap gula sederhana (12

83

jenis gula). Jika kemampuan fermentasinya sama dengan 10 isolat tersebut, maka tidak terpilih untuk dilakukan identifikasi secara molekuler berdasarkan dugaan bahwa selain isolat tersebut bukan isolat unggul probiotik juga kemungkinan satu spesies dengan 10 isolat terpilih awal (Tabel 5.2). Tabel 5.2 Pemilihan isolat 20 BAL dari 28 isolat BAL untuk identifikasi molekuler berdasarkan kemampuan fermentasi 12 jenis gula No

Kode Kemampuan memfermentasi gula Pemilihan Isolat ara gal glu lak mal man raf rham tre sorb suk xyl 1 1B2 + + + + + + + + 2 2B4 + + + + + + + + Dipilih 2B4 3 1A2 + + + + + + 4 1A32 + + + + + + + 5 1A4 + + + + + + 6 1A5 + + + + + + Dipilih 1A5 7 1A6 + + + + + + + Dipilih 1A6 8 2A3 + + + + + + + 9 1D2 + + + + + + + 10 2A1 + + + + + + + + + + 11 2C12 + + + + + + + + + + Dipilih 2C12 12 2A2 + + + + + + 13 1B1 + + + + + + d + + d + d 14 1A1 + d + d + + d + d + d 15 2B1 + + + + + + + + 16 2B2 + + + + + + + Dipilih 2B2 17 1D3 + + + + + + + 18 2B3 + + + + + + 19 1C1 + + + + + + 20 1C3 + + + + + + + 21 1C4 + + + + + + + 22 1C6 + + + + + + 23 2C2 + + + + + d d d + d 24 2D1 + + + + + + + 25 2D2 d d 26 1D1 + + + + + + + Dipilih 1D1 27 2D41 + + + + + + + 28 2D42 + + + + + + + (+) = dapat memfermentasi ; (-) = tidak dapat memfermentasi, (d) = dubius ara = arabinosa, gal = galaktosa, glu= glukosa, lak = laktosa, mal = maltosa, man = manitol, raf = rafinosa, rham = rhamnosa, tre = trehalosa, sorb = sorbitol, suk = sukrosa, xyl = xilosa Sumber : Arief et al. (2007)

84

Metode Ekstrasi genom Ekstraksi genom dilakukan dengan menggunakan kit dari Promega yaitu Wizard ® SV Genomic Purification System no katalog A2360. Prosedur ekstraksinya dilakukan sesuai protokol perusahaan sebagai berikut : Kultur disegarkan pada media broth (cair) dan diinkubasikan pada suhu 37°C selama 24 jam. Setelah itu, dilakukan sentrifugasi 13.000 x g selama 1 menit, selanjutnya supernatan dibuang. Sel sebanyak minimal 1 x 104 sel, maksimal 5 x 106 sel atau sekitar 200 mg diambil untuk sekali purifikasi/ekstraksi. Sel dicuci dengan menggunakan PBS (Phosphat Buffer Saline) 1x, kemudian ditambahkan 150 µl Wizard ® SV lysis buffer untuk mencuci sel dan dihasilkan lysate. Lalu lysate dicampur dengan memipet secara perlahan. Jika lysate tidak segera digunakan maka dapat disimpan pada suhu -70°C. Tahapan ekstraksi genom dilakukan dengan teknik mikrosentrifus. Pada setiap lysat untuk purifikasi, disiapkan seperangkat Wizard ® SV minicoloumn yang terdiri dari Wizard ® SV minicoloumn dan tabung koleksi (collection tube). Sebelumnya, diberikan label pada collection tube dan seperangkat Wizard ® SV minicolom diletakkan pada rak tabung mikrosentrifuse. Semua sampel lysate dipindahkan ke Wizard SV minicolom. Lalu Wizard SV minicolom yang berisi sampel disentrifus dengan kecepatan 13.000 x g selama 3 menit. Supernatan yang tertinggal di tabung koleksi dibuang. Jika masih ada lysate yang tertinggal di kolom, disentrifus kembali dengan kecepatan 13.000 x g selama 1 menit. Selanjutnya dipindahkan Wizard SV minicolom dari tabung koleksi dan cairan dalam tabung koleksi dibuang dan ditempatkan lagi Wizard SV minicolom pada tabung koleksi. Setelah itu ditambahkan 650 µl Wizard SV wash solution (yang sudah ditambah dengan etanol 95%) ke Wizard SV minicolom, dan disentrifus 13.000 x g selama 1 menit. Setelah itu cairan di tabung koleksi dibuang dan ditempatkan lagi Wizard SV minicolom ke dalam tabung koleksi kosong. Tahapan penambahan dengan Wizard SV wash solution dilakukan sebanyak empat kali. Setelah pencucian terakhir, cairan dalam tabung koleksi dibuang dan disentrifus kembali Wizard SV minicolom 13.000 x g selama 2 menit untuk

85

mengeringkan matriks yang terikat.

Wizard SV minicolom dipindahkan dan

ditempatkan ke tabung 1.5 ml mikrosentrifuse steril, dan ditambahkan 250 µl Nuclease free water ke dalam Wizard SV minicolom. Lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit sebelum disentrifus pada kecepatan 13.000 x g selama 1 menit. Tabung mikrosentrifus 1.5 ml diambil, total elusi yang diperoleh adalah sebanyak 250 µl.

Setelah itu dilakukan pengukuran nilai konsentrasi genom

dengan menggunakan spektrofotometer DNA (GeneQuant) pada absorbansi 260 dan 280 untuk mengecek kemurnian DNA. Tabung mikrosentrifuse yang berisi elusi atau ekstrak genom disimpan pada suhu -20°C atau -70°C sebelum digunakan untuk proses PCR. Amplifikasi gen 16S rRNA dengan PCR (Polymerase Chain Reaction) Prosedur amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan sesuai metode Islam et al. (2008). Reaksi amplifikasi sampel DNA dilakukan dalam 0.2 ml tabung PCR. Pada setiap tabung reaksi PCR, bahan yang digunakan adalah TaKara Eq Taq (5 unit/µl) sebanyak 0.25 µl, 10 x Ex Taq Buffer (yang mengandung Mg2+ 2.5 mM) sebanyak 5 µl, dNTP mixture (2.5 mM) sebanyak 4 µl, Primer universal 9F (5GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)

dan

primer

universal

1541R

(5’-

AAGGAGGTGATCCAGCC-3’) (Matsuyama et al. 2008; Yamahira et al. 2008) sebanyak masing-masing 2.5 µl 20 µM, ekstrak genom sebanyak 1 µg dan air destilasi ditambahkan sampai volume menjadi 50 µl. Primer dibeli dari perusahaan Gene Design, Inc Jepang. Alat PCR yang digunakan adalah PCR merk Applied Biosystem (Gambar 5.2.a). Amplifikasi PCR dilakukan sampai mendapatkan pita tunggal yang merupakan amplifikasi gen 16 S rRNA. Pada penelitian ini terdapat 3 kondisi reaksi PCR yaitu sebagai berikut : (1) Sebanyak 15 isolat (1C6, 1D1, 1A6, 2C12, 2B2, 2B4, 1A5, 1A32, 1B1, 2B1, 1C4, 2D1, 2B3, 1C3 dan 1C1) diberi perlakuan dengan kondisi PCR sebagai berikut : denaturasi awal 95°C 5 menit, 30 siklus penempelan primer pada suhu 95°C 1 menit dan perpanjangan pada suhu 50°C 1 menit, 72 °C 2 menit dan tahap akhir 72°C 7 menit. (2) Tiga isolat (2D2, 1A1, 2A2) dengan kondisi PCR denaturasi awal 95°C 5 menit, dilanjutkan dengan 30 siklus 95°C 1 menit, 51°C 45 detik, 72°C 2 menit, dan tahap akhir 72°C 7 menit.

86

(3) Dua isolat (2C2 dan 1A2) dengan kondisi PCR denaturasi awal 95°C 5 menit, 30 siklus 95°C 1 menit, 52°C 45 detik, 72°C 2 menit dan tahap akhir 72°C 7 menit. Produk PCR diambil dan disimpan pada suhu 4°C untuk selanjutnya diperiksa dengan menggunakan elektroforesis agarosa 1%.

Elektroforesis agarosa Konsentrasi agarosa (Wako) yang digunakan adalah 1%.

Agarosa

sebanyak 1% (b/v) dipanaskan sampai mendidih dengan pelarut buffer TAE (tris asetat) 1x. Setelah mendidih, didinginkan dan diputar dengan magnetik stirer pada kecepatan putar perlahan, lalu setelah hangat dituangkan pada tray elektroforesis dan ditunggu sampai dingin dan menjadi padat selama 1 jam, lalu sisir diangkat. Setelah itu, pada alat elektroforesis dituangkan buffer TAE 1x lalu tray yang berisi agarosa yang sudah padat ditempatkan di alat elektroforesis sampai terendam oleh buffer. Loading dye 1 µl dipersiapkan di atas parafilm kemudian dicampur dengan produk PCR sebanyak 4 µl, lalu dituangkan dengan menggunakan mikropipet ke dalam sumur (well) agarosa, dan juga dituang marker sebanyak 3 µl. Setelah itu alat elektroforesis (Gambar 5.2.b) ditutup dan dijalankan pada voltase 100 Volt selama 30 menit.

Agarosa padat hasil elektroforesis direndam pada larutan

pewarna etidium bromida selama 10 menit.

Setelah itu difoto dengan

menggunakan Kamera UV dan hasilnya dicetak pada kertas film polaroid. Kemudian dilakukan pengamatan apakah diperoleh pita yang diinginkan.

Analisis urutan basa gen 16S rRNA Primer

yang

digunakan

adalah

primer

universal

785F

(5’-

GGATTAGATACCCTGGTAGTC-3’) dengan amplikon pada basa ke-800 sampai 1400 dan 802R (5’-TACCAGGGTATCTAATCC-3’) dengan amplikon basa ke 1-800 (Nakagawa & Kawasaki 2001; Matsuyama et al. 2008), dan ditambah dengan Primer 1R (5’-GGGCATGATGATTTGACGTC-3’) yang mengamplifikasi basa ke 600-1200, primer 2F (5’-GTGAGACTGCCGGTGA CAAA-3’) untuk amplikon basa ke 1150-1500 dan primer 3R (5’-ATCA

87

GACTTAAAAAACCGCC-3’) untuk mengamplifikasi basa ke 1-600 (Gambar 5.1). Primer 1R, 2F dan 3R didesain pada penelitian ini berdasarkan hasil alignment dari susunan basa yang diperoleh hasil analisis urutan basa dengan menggunakan primer universal 785F dan 802R. Hasil analisis urutan basa dari primer universal universal 785F dan 802R tidak dapat sejajar (multialignment) atau terdapat gap di antaranya, sehingga disusun primer 1R, 2F dan 3R untuk mendapatkan urutan basa gen 16S rRNA (Penyusunan primer dapat dilihat pada Lampiran 18).

Gambar 5.1 Lokasi amplikon analisis urutan basa Purifikasi DNA produk PCR dilakukan menggunakan MonoFas DNA Purification Kit I (GL Sciences) dengan protokol sesuai petunjuk perusahaan. Sampel produk PCR dicampur buffer A untuk mengikat DNA dengan volume 10 kali dari volume produk PCR pada kolom spin (yang mempunyai struktur silika monolitik), disentrifus pada kecepatan 9000 x g selama 30 detik. Kemudian dilakukan pencucian dengan buffer B sebanyak 500 µl dan disentrifus pada kecepatan 9000 x g selama 1 menit. Tahap berikutnya adalah elusi dengan menggunakan buffer C sebanyak 50 µl dan disentrifus pada kecepatan 9000 x g selama 1 menit. Hasil sentrifus merupakan fragmen DNA murni. Proses selanjutnya adalah siklus analisis urutan basa (thermal cycle of sequencing) yang mirip dengan PCR untuk amplifikasi gen, namun pada siklus analisis urutan basa hanya 1 primer yang digunakan pada setiap sumur/tabung PCR dengan menggunakan alat PCR. Pereaksi siklus analisis urutan basa adalah Bigdye terminator v31 cycle sequencing kit (Applied biosystem) dengan protokol

88

sesuai petunjuk perusahaan. Pereaksinya adalah Big dye 1 µl, 5 x buffer 3.5 µl, Primer (785F atau 802R atau Primer 1 atau primer 2 atau primer 3) (3.2 µM) 1 µl, ekstrak DNA 2 µl, H2O 14.5 µl sehingga total volume menjadi 20 µl. Kondisi PCR yang digunakan adalah denaturasi awal 96°C 2 menit, proses denaturasi 96°C 10 detik, annealing pada suhu 50°C 5 detik sebanyak 25 siklus, serta tahap akhir 60°C 1 menit 15 detik, kemudian disimpan pada suhu 4°C. Setelah tahap purifikasi DNA produk PCR dengan menggunakan PCR selesai, dilakukan analisis urutan basa dengan persiapan sebagai berikut : ditambahkan ke masing-masing tabung produk PCR 1 mg/ml glikogen sebanyak 3 µl, 3 N CH3COONa sebanyak 2.5 µl dan 100% EtOH sebanyak 60 µl, lalu didiamkan selama 10 menit di suhu ruang, kemudian disentrifus 14.000 rpm 25°C selama 10 menit. Cairan campuran pereaksi dibuang, lalu ditambah 70% EtOH 100 µl dan disentrifus kembali 14.000 rpm 25°C selama 5 menit, didiamkan (dry up) pada suhu 55°C selama 20 menit atau di suhu ruang sampai tidak ada alkohol ataupun cairan lainnya yang masih menempel. H.D. Formamida ditambahkan sebanyak 15 µl dan dipindahkan ke 96 sumur (dengan terlebih ditulis dahulu kode pada kertas format analisis urutan basa) untuk dioperasikan di mesin sequencer selama 2 jam.

Sequencer yang digunakan adalah ABI Prism 3100 genetic

analyzer (Applied Biosystem) (Gambar 5.2.c). Data yang diperoleh disimpan dalam file (compact disc) untuk dianalisis lebih lanjut.

(a)

(b)

(c)

Gambar 5.2 Peralatan utama yang digunakan (a) PCR Applied Biosystem, (b) Elektroforesis agarosa Muphid, (c) Sequencer ABI Prism 3100 genetic analyzer (Applied Biosystem)

89

Setelah diperoleh urutan basa maka dilakukan alignment dengan menggunakan program Clustal W dan selanjutnya dibuat pohon filogenetik dengan menggunakan program MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) versi 4 dengan dipilih metode Bootstrap Neighbor Joining 1000x (Tamura et al. 2004).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Ekstraksi Genom Isolat BAL Proses ekstraksi genom menghasilkan produk ekstrak genom yang derajat kemurnian dan konsentrasinya berbeda-beda. Kemurnian ekstrak DNA genom dapat diamati dengan melihat rasio absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm, batas minimal kemurnian DNA adalah 1.8 (Sambrook et al. 1989). Pada panjang gelombang 260 nm, yang terdetaksi adalah material genetik DNA, sedangkan protein terdeteksi pada panjang gelombang 280 nm.

Nilai

perbandingan absorbansi di bawah 1.8 menunjukkan adanya kontaminan yang masih terbawa dalam ekstrak genom diantaranya asam humat, protein dan fenol (Devereux & Wilkonson 2004). Nilai kemurnian dan konsentrasi ekstrak genom 20 isolat BAL dapat dilihat pada Tabel 5.3. Semua ekstrak genom isolat BAL pada penelitian ini mempunyai nilai perbandingan absorbansi 260/280 di atas 1.8 sehingga dinyatakan mengandung DNA cukup murni dari kontaminan protein (Tabel 5.3). Hal ini menunjukkan bahwa DNA semua isolat BAL mampu diekstraksi dengan baik menggunakan kit Wizard ® SV Genomic Purification System no katalog A2360 (Promega). Bahan ekstraksi DNA sangat mempengaruhi tingkat kemurnian ekstrak genom yang dihasilkan, karena tingkat akurasi dan efektivitas bahan pereaksi yang berbeda. Selain itu juga hal ini menunjukkan bahwa ekstraksi genom dilakukan dengan tepat baik pada tahapan ultrasentrifugasi dan penambahan bahan pereaksi serta terjaganya kondisi steril baik steril dari kontaminan mikroba maupun DNAse yang ada pada tangan pekerja.

Pada saat eksperimen ini dilakukan,

selalu

digunakan sarung tangan steril dan sterilisasi meja kerja dengan menggunakan

90

alkohol. Selain itu juga dilakukan sterilisasi semua peralatan yang digunakan dengan menggunakan otoklaf pada suhu 121°C selama 20 menit. Tabel 5.3 Nilai konsentrasi dan kemurnian ekstrak genom 20 isolat BAL No

Isolat

Konsentrasi (µg/ml)

Nilai 260/280 (Kemurnian DNA)

1. 2. 3. 4. 5. 6 7 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19 20.

1A6 2C12 1A1 1C4 2D1 2B2 1D1 2B3 1C3 2B1 1A2 2B4 1B1 2D2 1C1 2C2 1A32 1A5 1C6 2A2

270 415 130 555 425 85 130 420 55 310 570 860 195 485 455 105 255 200 639 250

1.847 2.089 2.020 1.918 1.851 1.801 2.080 2.042 2.316 2.033 2.162 2.205 2.197 1.935 2.187 2.278 2.172 1.951 2.107 2.138

Banyaknya esktrak yang digunakan untuk proses PCR per reaksi (µl) 3.70 2.41 7.69 1.81 2.35 11.77 7.69 2.38 18.18 3.23 1.75 1.16 5.13 2.06 2.20 9.52 3.92 5.00 1.57 4.00

Amplifikasi Gen 16S rRNA Isolat BAL dengan Menggunakan PCR Suhu annealing PCR yang digunakan untuk memperoleh pita tunggal tidak sama untuk semua bakteri. Terdapat tiga suhu annealing yang berbeda yang digunakan untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA.

Optimasi suhu annealing

dilakukan dengan berpedoman pada suhu didih (melting temperature/ Tm) yang ditentukan berdasarkan primer yang digunakan sesuai petunjuk perusahaan produsen primer GeneDesign. Tm untuk primer 9F adalah 55.2°C, sedangkan Tm pada primer 1510F adalah 49.2°C. Suhu Tm 55°C dan 49°C digunakan untuk

91

proses annealing PCR yang pertama dan kedua, namun ternyata tidak semua ekstrak genom BAL dapat diamplifikasi sempurna dan didapatkan pita tunggal dengan suhu annealing tersebut. Contoh hasil PCR yang menunjukkan bahwa tidak semua ekstrak genom dari semua isolat dapat diamplifikasi dengan kondisi PCR yang sama dapat dilihat pada Gambar 5.3. M

sampel DNA

(a)

M sampel DNA

(b)

Gambar 5.3 Hasil pita elektroforesis agarosa gen 16S rRNA pada kondisi (a). PCR dengan suhu annealing 49○C selama 15 detik dan (b). PCR dengan suhu annealing 55○C selama 15 detik. (M= marker λEcoT141) Kondisi PCR yang tidak tepat akan menyebabkan tidak teramplifikasinya gen 16S rRNA dengan baik sehingga diperoleh pita yang tidak tunggal (Gambar 5.3.a) dan bahkan tidak terdeteksi pada gel elektroforesis (Gambar 5.3.b). Kondisi suhu annealing yang tidak tepat akan menurunkan kepekaan primer dan dapat menyebabkan salah penempelan pada DNA template. Akibatnya, proses amplifikasi DNA menjadi tidak tepat yang ditunjukkan dengan pita yang tidak tunggal ataupun bahkan tidak dapat teramplifikasi dengan baik. Optimasi suhu annealing terhadap semua ekstrak genom dilakukan dengan jalan mengatur lama dan suhu proses annealing pada proses PCR. Amplifikasi gen melalui PCR dan elektroforesis agarosa 1% berhasil memperoleh pita tunggal yang menunjukkan bahwa gen 16S rRNA secara spesifik berhasil diamplifikasi dengan primer 9F dan 1541R (Gambar 5.3).

Gen 16S rRNA

mempunyai ukuran 1500-1550 pasang basa (pb). Melalui optimasi kondisi PCR

92

untuk setiap isolat BAL, maka didapatkan tiga kondisi PCR dengan suhu annealing berbeda untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA hingga mendapatkan pita tunggal. Sebanyak 15 isolat (1C6, 1D1, 1A6, 2C12, 2B2, 2B4, 1A5, 1A32, 1B1, 2B1, 1C4, 2D1, 2B3, 1C3 dan 1C1) diberikan suhu annealing 50°C selama 1 menit. Tiga isolat (2D2, 1A1, 2A2) dapat diamplifikasi dengan baik pada suhu annealing 51°C selama 45 detik. Dua

isolat (2C2 dan 1A2) diberikan suhu

annealing 52°C selama 45 detik. Suhu annealing dapat berbeda untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA hingga mendapatkan pita tunggal pada proses PCR karena kandungan basa nukleotida adenosin (A), timin (T), guanin (G) dan sitosin (C) yang berbeda pada setiap galur bakteri (Tabel 5.4). Pada tahap perpanjangan basa atau annealing, diperlukan suhu didih yang tepat supaya basa dapat melakukan penggandaan dengan menggunakan dNTP yang ditambahkan pada pereaksi dengan tepat. Pada akhirnya susunan basa gen 16S rRNA dapat diamplifikasi dengan sempurna dan diperoleh pita tunggal.

93

M

a

b

c

d

M

e

f

g

1882pb 1489pb

1882pb 1489pb

1000pb 1000pb

M h i

j

k l m n o

M

p

q

1882pb 1489pb

1882pb 1489pb

1000pb

1000pb

M

r

s

t

u

1882pb 1489pb 1000pb

Gambar 5.4 Hasil PCR gen 16S rRNA, produk sebelum dipurifikasi pada elektroforesis agarosa 1% (M = marker λEcoT141, a=1C6, b= 1D1, c= Sa28K, d=1A6, e=2D2, f= 2A2; g =1B1 , h = 2B2, i =2D1, j =1A32 , k=2C12, l=2B4, m =1A1, n=1C4, o = 2C2, p = 2C2, q= 1A2, r=2B1, s=2B3, t=1C3, u=1C1)

94

Analisis Urutan Basa Gen 16S rRNA Isolat BAL Pendekatan filogenetik merupakan sistem terbaru taksonomi bakteri. Kekerabatan antar bakteri diketahui dengan membandingkan secara molekuler urutan basa terutama gen 16S rRNA. Hal ini didasarkan pada : (1) gen rRNA merupakan gen yang memiliki ketetapan yang tinggi (highly conserved) karena merupakan jalur utama di ribosom untuk biosintesis protein yang merupakan awal perkembangan evolusi organisme, (2) fenomena transfer gen secara horizontal diantara organisme tidak melibatkan gen rRNA, serta (3) tingkat kemiripan urutan basa diantara individu yang berbeda mewakili variasi genomnya (Weisburg et al. 1991; Felis & Dellaglio 2008; Klein et al. 1998). Setelah diperoleh produk PCR yang merupakan amplifikasi gen 16S rRNA dengan ditunjukkan oleh pita tunggal pada ukuran 1500 pasang basa, dilakukan pemurnian produk PCR untuk menghilangkan kelebihan primer dan nukleotida yang masih terdapat pada produk PCR. Pada penelitian ini digunakan kit bahan pereaksi komersial MonoFas DNA Purification Kit I (GL Sciences). Proses selanjutnya disebut dengan siklus analisis urutan basa (thermal cycle of sequencing) yang mirip dengan PCR namun menggunakan produk PCR awal yang telah dipurifikasi sebagai DNA template. Pada proses siklus analisis urutan basa, digunakan masing-masing primer untuk satu template, berbeda dengan PCR yang memasukkan kedua primer forward dan reverse dalam satu tabung pereaksi. Pada proses siklus analisis urutan basa ini digunakan basa yang dilabel secara spesifik yang dinamakan Bigdye terminator, yang terinkorporasi pada tahapan siklus berlangsung dan menghentikan (terminasi) sequencing. Basa terminator terdiri dari empat basa yang mempunyai warna fluoresent berbeda dan mempunyai absorbansi panjang gelombang berbeda. Basa diterminasi pada setiap fragment DNA yang ditentukan dengan fluorometer (Clarridge 2004). Produk dipurifikasi kembali untuk menghilangkan terminator warna yang tidak terinkorporasi dan setiap panjang urutan basa ditentukan menggunakan sequencer elektroforesis kapiler. Pada penelitian ini digunakan alat ABI Prism 3100 genetic analyzer (Applied Biosystem). Alat ini mempunyai 16 kapiler sehingga setiap proses berlangsung dapat dilakukan analisis urutan basa sebanyak 16 sampel/produk. Hasil analisis urutan basa adalah berupa elektroferogram yang

95

berupa urutan basa A,T,G,C yang menyusun urutan basa gen sesuai dengan primer yang digunakan. Terkadang ditemukan notasi N pada urutan basa hasil analisis urutan basa yang berarti tidak dikenal, yang disebabkan oleh elektroferogram basa saling menumpuk (misalnya antara G dan C tertumpuk) sehingga alat ABI Prism analyzer tidak bisa membacanya dengan tepat. Hal ini dapat diatasi dengan melakukan koreksi secara manual pada elektroferogramnya. Salah satu contoh sebagian hasil elektroferogram urutan basa gen 16S rRNA hasil dari amplifikasi primer 802R (5’-TACCAGGGTATCTAATCC-3’) dapat dilihat pada Gambar 5.5.

Pada Gambar tersebut, dapat dilihat bahwa background

signal/noise, puncaknya lebih kecil dibanding sinyal dari basa sesungguhnya, dengan demikian urutan basa dapat dibaca dengan hasil meyakinkan.

Puncak urutan basa

noise

Gambar 5.5 Elektroferogram (ABI-chromatogram pada program Bioedit) sebagian urutan basa gen 16S rRNA isolat 2B4 dengan primer 802R Produk PCR untuk semua isolat BAL dapat di urutan basa dengan baik menggunakan lima primer. Urutan basa gen 16S rRNA untuk satu isolat berasal dari gabungan basa yang berhasil diperoleh dari sequencing dengan lima primer. Untuk memperoleh susunan gen 16S rRNA masing-masing isolat maka dilakukan multialignment dengan menggunakan program perangkat lunak Genetyx 7. Hasilnya diperoleh urutan basa yang menyusun gen 16S rRNA untuk setiap isolat. Proses selanjutnya adalah melakukan alignment atau pensejajaran urutan basa gen 16S rRNA untuk 20 isolat BAL. Pengolahan data ini dilakukan dengan

96

menggunakan program perangkat lunak Clustal W. Proses ini bertujuan untuk mengetahui perbedaan urutan basa yang menyandi gen 16S rRNA untuk semua isolat. Adanya perbedaan basa menyebabkan adanya variasi genetik yang menentukan galur, spesies, dan genus dari isolat BAL. Hasil sebagian alignment 20 isolat BAL yang terdapat conserved region (daerah yang mempunyai susunan nukleotida yang tetap/sama) dan divergen region yang menunjukkan variasi perbedaan urutan basa gen 16S rRNA yaitu pada susunan basa ke-900 sampai 1540 dan merupakan daerah V6-V9 dapat dilihat pada Gambar 5.6. Lodmell et al. (1995) menyatakan bahwa daerah 900-1500 dari urutan basa gen 16S rRNA urutan posisi urutan basa Escherichia coli merupakan daerah yang menunjukkan adanya variasi gen yang merujuk pada perbedaan spesies dan galur dari bakteri. Petrosino (2009) juga menyatakan bahwa daerah V6 – V9 merupakan daerah yang efektif untuk mengidentifikasi taksonomi suatu bakteri. Beberapa peneliti menggunakan daerah V6 – V9 dari urutan basa gen 16S rRNA untuk menentukan taksonomi bakteri termasuk BAL di antaranya Cai et al. (2003) untuk mengidentifikasi bakteri Streptococcus dari hewan, serta Sakamoto et al. (2011) untuk mengidentifikasi Lactobacillus dari sampel nukadoko (beras fermentasi Jepang).

1C3 2C12 1A5 1B1 1D1 1A6 1C1 2D1 1A1 2D2 2B1 1C4 2A2 2B2 1A2 2C2 2B4 1A32 2B3 1C6 Clustal Co

....|....| 900 TAAACGAT-G TAAACGAT-G TAAACGATCG KWAACGAT-G TAAACGAT-G KAAACGAT-G TAAAMKRY-K TAA-CGAT-G TAAACGAT-G TAAACGAN-G GNAACKWT----CCGGT-A TAAACGAT-G CCAGCGTT-AATTAAACCA AATTAAACCA AATTAAACCA AATTAAACCA AATTAAACCA AATTAAACCA

....|....| 910 AATN-TA-AG AATGCTA-AG AATGCTA-AG AATGCTA-AG AATGSYA-AG ATTACTA-AG AATGYKA-AG AATS-TA-AG AATGYTA-AG AGTGCTA-AG CATSCTA-MG AATGCTA-AG ATTACTA-AG CGTCCTR-AG CATGCTCCAC CATGCTCCAC CATGCTCCAC CATGCTCCAC CATGCTCCAC CATGCTCCAC *

....|....| 920 TGTTGGA--G TGTTGGATNG TGTTGGA--G TGTTGGA--G TGTTGGA-GN TGTTGGA-NG TGWKGGA--G TGTTGGA--G TGTTGGA--G TGTTGGA--G TGWTGGAGAT TGTTGGA--N TGTTGGA-GN YSTTGRW-CA CGCTTGTGCG CGCTTGTGCG CGCTTGTGCG CGCTTGTGCG CGCTTGTGCG CGCTTGTGCG

....|....| 930 GGTTTCCGCC SGTTTCCGCC GGTTTCCGNN GGTTTCCGCC GGTTTCCGNN GGTTTCCGCC GGTTTCCGCC GGTTYCCGCC GGTTTCCGCC GGTTTCCGCC AATTYSGSTT NNNTTCCNNN GGTTTCCGCC AACTTCCGNT GGCCCCCGTC GGCCCCCGTC GGCCCCCGTC GGCCCCCGTC GGCCCCCGTC GGCCCCCGTC

....|....| 940 CT----TCAN CT----TCAG NNCCCTTCAG CT----TCAG NCCC-TTCAG CT----TCAG CT----TCAG CT----TCAG CT----TCAG CT----TCAG TC----NCCC ANNA--NANG CT----TCAG NNG---GGTN AATTCCTTTG AATTCCTTTG AATTCCTTTG AATTCCTTTG AATTCCTTTG AATTCCTTTG

97

1C3 2C12 1A5 1B1 1D1 1A6 1C1 2D1 1A1 2D2 2B1 1C4 2A2 2B2 1A2 2C2 2B4 1A32 2B3 1C6 Clustal Co

....|....| 950 NNCTGCAGCTGCTGCAGCTGCTGCAGCTGCTGCAGCTGCTGCAGCTGCTGCAGCNGCTGCAGCTGCTGCAGCTGCTGCAGCTGCTGCAGCTGCTGSAGCTGCTGCAGCTGCTGCAGCTGCTKCAGCAGTTTCAGCC AGTTTCAGCC AGTTTCAGCC AGTTTCAGCC AGTTTCAGCC AGTTTCAGCC * ***

....|....| 960 TAACG---CA TAACG---CA TAACNTNSCA TAACG---CA TAACNNG-CA TAACG---CA TAACG---CA TAACG---CA TAACG---CA TAACG---CA TAACG---MA TAACG---NN TAACG---CA KMAYG---CA TTGCG----G TTGCG----G TTGCG----G TTGCG----G TTGCG----G TTGCG----G

....|....| 970 TTAAGCATTC TTAAGCATTC TTAAGCATTC TTAAGCATTC TTAAGCATTC TTAAGTAATC TTAAGCATTC TTAAGCATTC TTAAGCATTC TTAAGCACTC NTAAGCATTC NNAAGCATTC TTAAGTAATC TTAAGCATTC CCGTACTCCC CCGTACTCCC CCGTACTCCC CCGTACTCCC CCGTACTCCC CCGTACTCCC *

....|....| 980 CGCNNGGGGA CGCCTGGGGA CGCCTGGGGA CGCCTGGGGA CGCCTGGGGA CGCCTGGGGA CGCCTGGGGA CGCCTGGGGA CGCCTGGGGA CGCCTGGGGA CGCCTGGGGW CGCCTGGGGA CGCCTGGGGA CGCCTGGGGA CAGGCGGAAT CAGGCGGAAT CAGGCGGAAT CAGGCGGAAT CAGGCGGAAT CAGGCGGAAT * **

....|....| 990 GTACGGC--GTACGGC--GTACGGC--GTACGGC--GTACGGC--GTACGAC--GTACGGC--GTACGGM--GTACGGC--GTACGAC--RWAYRGC--GTACGRC--GTACGAC--GTACGRM--GCTTAAW--G GCTTANNATG GCTTAAT--G GCTTAAT--G GCTTAAT--G GCTTAAT--G

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1000 1010 1020 1030 1040 1C3 CGCAAGGNNT AA-ACTCAAA GGA--TGNCG GGGGSSCSCA CMASCGGTSG 2C12 CGCAAGGCTG AA-ACTCAAA GGAATTGACG GGGGCCCGCA CAAGCGGTGG 1A5 CGCAAGGCTG AA-ACTCAAA GGAATTGACG GGGGCCCGCA CAAGCGGTGG 1B1 CGCAAGGCTG AA-ACTCAAA GGAATTGACG GGGGCCCGCA CAAGCGGTGG 1D1 CGCAAGGCTG AA-ACTCAAA GGAATTGACG GGGGCCCGCA CAAGCGGTGG 1A6 CGCAAGGTTG AA-ACTCAAA AGAATTGACG GGGGCCCGCA CAAGCGGTGG 1C1 CGCAAGGCTG AA-ACTCAAA GGAATTGACG GGGGCCCGCA CAAGCGGTGG 2D1 MGCAAGGCTG AA-ACTCAAA GGAATTGACG GGGGCCCGCA CAAGCGGTGG 1A1 CGCAAGGCTG AA-ACTCAAA GGAATTGACG GGGGCCCGCA CAAGCGGTGG 2D2 CGCAAGGTTG AA-ACTCAAA GGAATTGACG GGGGCCCGCA CAAGCGGTGG 2B1 CGCAAGGCTK WA-AYTCAAA KGAATTGAYK RKKKCCCGCA CMARCGGTGG 1C4 CGCAAGGCTG RA-ACTYAAA GRAATTGACG GGGSCCCGCA CAAGCGGTGG 2A2 CGCAAGGTTG AA-ACTCAAA AGAATTGACG GGGGCCCGCA CAAGCGGTGG 2B2 CGCAAGGCTG AA-ACTCAAA GGAATTGACG GGGGCCCGCA CAAGCGGTGG 1A2 CGTTAGCTGC AGCACTGAA- -----GGGCG GAAACCC-TC CAACACTTAG 2C2 CGTTAGCTGC AGCANNNNNC NTGAAGGGCG GAAACCC-TC CAACACTTAG 2B4 CGTTAGCTGC AGCACTGNNN A---AGGGCG GAAANCCCTC CAACACTTAG 1A32 CGTTAGCTGC AGCACTGAA- -----GGGCG GAAACCC-TC CAACACTTAG 2B3 CGTTAGCTGC AGCACTGAA- -----GGGCG GAAACCC-TC CAACACTTAG 1C6 CGTTAGCTGC AGCACTGAA- -----GGGCG GAAACCC-TC CAACACTTAG Clustal Co * ** * * * * * * *

1C3 2C12 1A5 1B1 1D1 1A6 1C1 2D1 1A1

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1050 1060 1070 1080 1090 AGCATGTGGK TTA-ATTCGA ARCTACRCGA ATAACCTTAC CAGSTCTTGA AGCATGTGGT TTA-ATTCGA AGCTACGCGA AGAACCTTAC CAGGTCTTGA AGCATGTGGT TTA-ATTCGA AGCTACGCGA AGAACCTTAC CAGGTCTTGA AGCATGTGGT TTA-ATTCGA AGCTACGCGA AGAACCTTAC CAGGTCTTGA AGCATGTGGT TTA-ATTCGA AGCTACGCGA AGAACCTTAC CAGGTCTTGA AGCATGTGGT TTA-ATTCGA AGCTACGCGA AGAACCTTAC CAGGTCTTGA AGCATGTGGT TTA-ATTCGA AGCTACGCGA AGAACCTTAC CAGGTCTTGA AGCATGTGGT TTA-ATTCGA AGCTACGCGA AGAACCTTAC CAGGTCTTGA AGCATGTGGT TTA-ATTCGA AGCTACGCGA AGAACCTTAC CAGGTCTTGA

98

2D2 2B1 1C4 2A2 2B2 1A2 2C2 2B4 1A32 2B3 1C6 Clustal Co

1C3 2C12 1A5 1B1 1D1 1A6 1C1 2D1 1A1 2D2 2B1 1C4 2A2 2B2 1A2 2C2 2B4 1A32 2B3 1C6 Clustal Co

1C3 2C12 1A5 1B1 1D1 1A6 1C1 2D1 1A1 2D2 2B1 1C4 2A2 2B2 1A2 2C2 2B4 1A32 2B3 1C6 Clustal Co

AGCATGTGGY AGCATGTGGT AGCATGTGGT AGCATGTGGT AGCATGTGGT CATTCATCGT CATTCRTMGT CATTCATCGK CATTCATCGT CATTCATCGN CATTCATCGT * *

TTA-ATTCGA TTA-ATTCGA TTA-ATTYGA TTA-ATTCGA TTA-ATTCGA TTACGGTATG TKWCGGTATG TTACGGKATG TTACGGTATG NNACGGTATG TTACGGTATG

AGCAACGCGA AGCTACGCGA AGCTACGCGA AGCTACGCGA ARCTACGCGA GACTAC-CAG GACTAC-CAG GACTAC-CAG GACTAC-CAG GACTAC-CAG GACTAC-CAG * ** *

AGAACCTTAC AGAACCTTAC AGAACCTTAC AGAACCTTAC AGAACCTTAC GGTATCTAAT GGTATCTAAT GGTATCTAAT GGTATCTAAT GGTATCTAAT GGTATCTAAT * ** *

CAGGTCTTGA CAGGTCTTGA CAGGTCTTGA CAGGTCTTGA CAGGTCTTGA CCTGTTT--CCTGTTT--CCTGTTT--CCTGTTT--CCTGTTK--CCTGTTT--* *

....|....| 1100 CATACTATGC CATACTATGC CATACTATGC CATACTATGC CATACTATGC CATCTTCTGA CATACTATGC CATACTATGC CATACTATGC CATCCTTTGA CATACTATGC CATACTATGC CATCTTCTGA CATACTATGC ---GCTACCC ---GCTACCC ---KCTACCC ---GSTWCCC ---GYTRCCC ---GSTACCC * ....|....| 1150 CAGGTGGTGCAGGTGGTGCAGGTGGTGCAGGTGGTGCAGGTGGTGCAGGTGGTGCAGGTGGTGCAGGTGGTGCAGGTGGTGCAGGTGGTGCAGGTGGTGCAGGTGGTGCAGGTGGTGCAGGTGGTGG CCGCCTTCGC CCGCCTTCGC CCGCCTTCGC CCGCCTTCGC CCGCCTTCGC CCGCCTTCGC * * *

....|....| 1110 AAATYTAAGA AAATCTAAGA AAATCTAAGA AAATCTAAGA AAATCTAAGA CAGTCTAAGA AAATCTAAGA AAATCTAAGA AAATCTAAGA CCACTCTAGA AAATCTAAGA AAATCTAAGA CAGTCTAAGA AAATCTAAGA ATACTTTCGA ATACTTTCGA ATACTTTCGA ATACTTYCGA ATACTTTCGA ATACTTTCGA ** ....|....| 1160 CATGGTTGTS CATGGTTGTC CATGGTTGTC CATGGTTGTC CATGGTTGTC CATGGTTGTC CATGGTTGTC CATGGTTGTC CATGGTTGTC CATGGTTGTC CATGGTTGTS CATGGTTGTC CATGGTTGTC CATGGTTGTC CACTGGTGTT CACTGGTGTT CACTGGTGTT CACTGGTGTT CACTGGTGTT CACTGGTGTT ** * ***

....|....| 1120 GATTAGACGT GATTAGACGT GATTAGACGT GATTAGACGT GATTAGACGT GATTAGAGGT GATTAGACGT GATTAGACGT GATTAGACGT GATAGAGCTT GATTAGACGT GATTAGACGT GATTAGAGGT GATTAGACGT GCCTCAGCGT GCCTCAGCGT GCCTCAGCGT GCCTCAGCGT GCCTCAGCGT GCCTCAGCGT * * ....|....| 1170 GTCAKCTCGT GTCAGCTCGT GTCAGCTCGT GTCAGCTCGT GTCAGCTCGT GTCAGCTCGT GTCAGCTCGT GTCAGCTCGT GTCAGCTCGT GTCAGCTCGT GTCAGCTCGT GTCAGCTCGT GTCAGCTCGT GTCAGCTCGT CTTC-CATAT CTTC-CATAT CTTC-CATAT CTTC-CATAT CTTC-CATAT CTTC-CATAT * * *

....|....| 1130 TCCCTTCGGK TCCCTTCGGG TCCCTTCGGG TCCCTTCGGG TCCCTTCGGG TCCCTTCGGG TCCCTTCGGG TCCCTTCGGG TCCCTTCGGG CCCCTTCGGG TCCCTTCGGG TCCCTTCGGG TCCCTTCGGG TCCCTTCGGG CAGTTACAGA CAGTTACAGA CAGTTACAGA CAGTTACAGA CAGTTACAGA CAGTTACAGA * * * ....|....| 1180 GTCGTGAGTA GTCGTGAG-A GTCGTGAG-A GTCGTGAG-A GTCGTGAG-A GTCGTGAG-A GTCGTGAG-A GTCGTGAG-A GTCGTGAG-A GTCGTGAG-A GTCGTGAG-A GTCGTGAG-A GTCGTGAG-A GTCGTGAG-A ATC-TACGCA ATC-TACGCA ATC-TACGCA ATC-TACGCA ATC-TACGCA ATC-TACGCA ** * * *

....|....| 1140 KACATGGATA GACATGGATA GACATGGATA GACATGGATA GACATGGATA GACAGAATGA GACATGGATA GACATGGATA GACATGGATA GGCAAAGTGA GACATGGATA GACATGGATA GACAGAATGA GACATGGATA C-CAGAC-AG CACAGAC-AG C-CAGAC-AG C-CAGANCAG M-CAGAC-AG C-CAGACAGA ** ....|....| 1190 TGTNTGGGTT TGTT-GGGTT TGTT-GGGTT TGTT-GGGTT TGTT-GGGTT TGTT-GGGTT TGTT-GGGTT TGTT-GGGTT TGTT-GGGTT TGTT-GGGTT TGTT-GGGTT TGTT-GGGTT TGTT-GGGTT TGTK-GGGTT TTTCACCGCT TTTCACCGCT TTTCACCGCT TTTCACCGCT TTTCACCGCT TTTCACCGCT * * * *

99

1C3 2C12 1A5 1B1 1D1 1A6 1C1 2D1 1A1 2D2 2B1 1C4 2A2 2B2 1A2 2C2 2B4 1A32 2B3 1C6 Clustal Co

1C3 2C12 1A5 1B1 1D1 1A6 1C1 2D1 1A1 2D2 2B1 1C4 2A2 2B2 1A2 2C2 2B4 1A32 2B3 1C6 Clustal Co

1C3 2C12 1A5 1B1 1D1 1A6 1C1 2D1 1A1

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1200 1210 1220 1230 1240 AAGTCCCGCA AC-GAGCGCA ACMCGTTATT ATNNC--AAT TGCCAGCATA AAGTCCCGCA AC-GAGCGCA ACCC-TTATT ATCA----GT TGCCAGCATT AAGTCCCGCA AC-GAGCGCA ACCC-TTATT ATCN---AGT TGCCAGCATT AAGTCCCGCA AC-GAGCGCA ACCC-TTATT ATCA----GT TGCCAGCATT AAGTCCCGCA AC-GAGCGCA ACCNCTTATT ATCA---GTA WGCCAGCATT AAGTCCCGCA AC-GAGCGCA ACCC-TTATT ACTA----GT TGCCAGCATT AAGTCCCGCA AC-GAGCGCA ACCC-TTATT ATNNC--RGT TGCCAGCATT AAGTCCCGCA AC-GAGCGCA ACCC-TTATT ATNNNCAGNT TGCCAGCATT AAGTCCCGCA AC-GAGCGCA ACCC-TTATT ATCN---AGT TGCCAGCATT AAGTCCCGCA AC-GAGCGCA ACCC-TTATT GTTA----GT TGCCATCATY AAGTCCCGCA AC-GAGCGCA ACCC-TTATT ATCA----GT TGCCAGCATT AAGTCCCGCA AC-GAGCGCA ACCC-TTATT ATCA----GT TGCCAGCATT AAGTCCCGCA ACTGAGCGCA ACCC-TTATT ACTA----GT TGCCAGCATT AAGTCCCGCA AC-GAGCGCA ACTCCTTATT ATCA----GK YSMCAKCATT ACACATGGAG TTCCACTGTC CTCTTCTGCA CTCAA--GTT TCCCAGTTTC ACACATGGAG TTCCACTGTC CTCTTCTGCA CTCAA--GTT TCCCAGTTTC ACACATGGAG TTCCACTGTC CTCTTCTGCA CTCAA--GTT TCCCAGTTTC ACACATGGAG TTCCACTGTC CTCTTCTGCA CTCAA--GTT TCCCAGTTTC ACACATGGAG TTCCACTGTC CTCTTCTGCA CTCAA--GTT TCCCAGTTTC ACACATGGAG TTCCACTGTC CTCTTCTGCA CTCAA--GTT TCCCAGTTTC * * * * * ** * ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1250 1260 1270 1280 1290 W-----TWTT TKGGACTCT- -KGTGA-GAC TGCSGTGACA AA--CGGAGG A-----AGTT GGGCACTYT- -KSTGA-GAC TGCCGGKRMM AWACCGGAGG AATGTTNNNN GGGCACWCTC -KGTRA-GAC TGCCGGTGAC AAACCGGAGG A-----AGTT GGGCACTCT- -GGTGA-RRM YGCCGGTGAC AAACCGGAGG AA-GNNNNTT GGGCACTCT- -GGTGA-GAC TGCCGGTGAC AAACCGGAGG AA---GTTNN GGGCACTCTA GTGANA-GAC TGCCGGTGAC AAACCGGARG A-----AGTT GGGCACTCT- -SKKGA-GAC TGCCGGTGAC AAACCGGAGG AA--GTTGGG CTNNMCTCTC -KGTGA-GAC TGCCGGTGAC AAACCGGAGG AA-GTTNNNN GGSCACTCTG -GNTGA-GAC TGCCGGTGAC AAACCGGARG M-----RGTT GGGCACTCTA --GCAA-GAC TGCCGGTGAC AAACCGGAGG A-----AGTT GGGCACTYT- -GGTGA-GAC TGCCGGTGAC AAACSGGAGG A-----AGTT GGGCACTCT- -GGTGA-GAC TGCCGGTGAC AAACCGGAGG AT----AKTT GGGCACTCTA --GTGATGAC TGCCGGTGAC AAACCGGAGG A-----AGTT GGGCACTCT- -GGTGA-GAC TGCCGGTGAC AAACCGGAGG CGATGCACTT CTTCGGTTGA -GCCGAAGGC TTTCACATCA GACTTAAAAA CGATGCACTT CTTCGGTTGA -GCCGAAGGC TTTCACATCA GACTTAAAAA CGATGCACTT CTTCGGTTGA -RCCGAAGGY TYWCAYATCA GACTTAAAAA CGATGCACTT CTTCGGTTGA -GCCGAAGGC TTTCACATCA GACTTAAAAA CGATGCACTT CTTCGGTTGA -GCCGAAGGC TTTCACATCA GACTTAAAAA CGATGCACTT CTTCGGTTGA -GCCGAAGGC TTTCACATCA GACTTAAAAA * * ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1300 1310 1320 1330 1340 AGGT--GGG- ATGACGTCAA -TCATCATGC CCCTTATG-A C-TGGGCTAC AAGGTGGGG- ATGACGTCAA -TCATCATGC CCCTTATG-A CCTGGGCTAC AAGGTGGGG- AKSACGTCAA ATCATCATGC CCCTTATG-A CCTGGGCTAC AARGKGGGG- RKGACSKYMA ATCATCATKC CCCTTATNGA CCTGGGCTAC AAGGTGGGG- WTGACGTCAA WYMWYCWTGC CCCTTATG-A CCTGGGCTAC AAGGTGGGG- ACGACGTCAA ATCATCATGC CCCTTATG-A MCTGGGCTAC AGGGTGGGG- ATG--TTCAA ---ATCATGG GGCTTATGAC ACTGGGCTAC AMGGTGGRG- RTGVCGTCAA MKCATCATKC CCCTTATR-A CCTGGGCTAM AADGKGGGG- ADGRMCKYMA ATCATCATGC CCCTTATG-A CCTGGGCTAC

100

2D2 2B1 1C4 2A2 2B2 1A2 2C2 2B4 1A32 2B3 1C6 Clustal Co

1C3 2C12 1A5 1B1 1D1 1A6 1C1 2D1 1A1 2D2 2B1 1C4 2A2 2B2 1A2 2C2 2B4 1A32 2B3 1C6 Clustal Co

1C3 2C12 1A5 1B1 1D1 1A6 1C1 2D1 1A1 2D2 2B1 1C4 2A2 2B2 1A2 2C2 2B4 1A32 2B3 1C6 Clustal Co

AAGGTGGGKAAKGTGGGGAAGGTGGGGAAGGTGGGGT AAGGTGGGGACCGCCTGCG ACCGCCTGCG ACCGCCTGCG ACCGCCTGCG ACCGCCTGCG ACCGCCTGCG *

AKGACSTCAA AYGACGTCAA GYGACGTCMA ACGRCGTCAA ATGACGTCAA CTCGCTTTAC CTCGCTTTAC CTCGCTTTAC CTCGCTTTAC CTCGCTTTAC CTCGCTTTAC

ATCWTCATGC ATCATCWTGC ATCATCATRM ATCATCATGC ATCATCATGC GCCCAATAAA GCCCAATAAA GCCCAATAAA GCCCAATAAA GCCCAATAAA GCCCAATAAA

CCCTTATG-A CCCTTATG-A CSCTTATG-A CCCTTATG-A CCCTTATG-A TCCGGACA-A TCCGGACA-A TCCGGACA-M TCCGGACA-A TCCGGACA-A TCCGGACA-A * *

CCTGGGCTAC CCTGGGCTAC CCTGGGCTAC CCTGGGCTAC CCTGGGCTAC CGCTTGCCAC CGCTTGCCAC SGYTTGCCAC CGCTTGCCAC CGCTKGCCAC CGCTTGCCAC ** *

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1350 1360 1370 1380 1390 CC---TGCTC --ATGATGGA CA-CAG--TG CAACTCGCAG AGNNNTAATC ACACGTGCT- --ACAATGGA TGGTAC--AA CGAGTTGCGA ACTCGCGAGA ACACGTGCT- --ACAATGGA TGGTAC--AA CGAGTTGCGA ACTCGCGAGA ACACGTNGCT --ACAATGGA TGGTAC--AA CGAGTTGCGA ACTNCGCGAG ACACGTGCT- --ACAATGGA TGGTAC--AA CGAGTTGCGA ACTCGCGAGA ACACGTGCT- --ACAATGGA TGGTAC--AA CGAGTCGCGA AACCGCGAGG ACACGTGTCT --MCAATGGA TGGTAC--AA CGAGTTGCGA ACTCGCGAGA ACACGTGCT- --ACMATGGA TGGTAM--AA CGAGTTGCGA ACTCGCGAGA ACACGTGCT- --ACAATGGA TGGTAC--AA CGAGTTGCGA ACTCGCGAGA ACMCGTGCNT --ACAATGGG AAGTAC--AA CGAGTTGCGA AGTCGCGAGG ACACGTGCT- --ACAATGGA TGGTAC--AA CGAGTTGCGA ACTCGCGAGA ACACGTGCT- --ACAATGGA TGGTAC--AA CGAGTTGCGA ACTCGCGAGA ACACGTGCT- --ACAATGGA TGGTAC--AA CGAGTCGCGA AACCGCGAGG ACACGTGCT- --ACAATGGA TGGTAC--AA CGAGTTGCGA ACTCGCGAGA CTACGTATTA CCGCGGCTGC TGGCACGTAR TTAGCCGTGG CTTTCTGGTT CTACGTATTA CCGCGGCTGC TGGCACGTAG TTAGCCGTGG CTTTCTGGTT CTACGTATTA CCGCGGCTGC TGGCACGTAG TTAGCCGTGG CTTTCTGGTT CTACGTATTA CCGCGGCTGC TGGCACGTAG TTAGCCGTGG CTTTCTGGTT CTACGTWTTA CCGCGGCKGC TGGSASGTAG TTAGCMKWGG CWWWMWRGTT CTACGTATTA CCGCGGCTGC TGGCACGTAG TTAGCCGTGG CTTTCTGGTT * * * * ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1400 1410 1420 1430 1440 TCTTA--AGC NTTCNNNTTC G--ATTG-AN GNGCACTCCC ACNGANTC-G GCTAA--GCY AATMKCTTAM A--GYCR-KW YYSAGYKCRS WTTGTAG--G G-TAA--GCT AATCTCTTAA A--GCCA-TT CTCAGTTCGG ATTGTAG--G AGTAA--GCT AATCTCTTAA A--GCCA-TT CTCAGTTCGG ATTGTAG--G G-TAA--GCT AATCTCTTAA A--GCCA-TT CTCAGTTCGG ATTGTAG--G T-TAA--GCT AATCTCTTAA A--ACCA-TT CTCAGTTCGG ACTGTAG--G G-KAA--GCT AATCTCTTAA A--GCCA-TT CTCAGTTCGG ATTGTAGGCT G-TAA--GCT AATCTCTTAA A--GYCA-TT CYCAGTTCGG ATTGTAG--G G-TAA--GCT AATCTCTTAA A--GCCA-TT CTCAGTTCGG ATTGTAG--G N-TAA--GCT AATCTCTTAA A--GYTTCNT CTCAGTTCGG ATTGCAR--G G-TAA--GCT AATCWCTTAA A--GCCA-TT CTCAGTTCGG ATTGTAG--G G-TAA--GCT AATCTCTTAA A--GCCA-TT CTCAGTTCGG ATTGTAG--G T-TAA--GCT AATCTCTTAA A--ACCA-TT CTCAGTTCGG ACTGTAG--G G-TAA--GCT AATCTCTTAA A--GCCA-TT CTCAGTTCGG ATTGTAG--G AAATACCGYC AATACC-TGA ACAGTTA-CT CTCAGATATG TTCTTCT--T AAATACCGKC AATACC-TGA ACAGTTA-CT CTCAGATATG TTCTTCT--T AAATACCGTC AATACC-TGA ACAGTTA-CT CTCAGATATG TTCTTCT--T AAATACCGTC AATACC-TGA ACAGTTA-CT CTCAGATATG TTCTTCT--T AAATACCGTC AATACC-TGA ACAGTTA-CT CTCAGATATG TTCTTCT--T AAATACCGTC AATACCCTGA ACAGTTA-CT CTCAGATATG TTCTTCT--T * * *

101

1C3 2C12 1A5 1B1 1D1 1A6 1C1 2D1 1A1 2D2 2B1 1C4 2A2 2B2 1A2 2C2 2B4 1A32 2B3 1C6 Clustal Co

1C3 2C12 1A5 1B1 1D1 1A6 1C1 2D1 1A1 2D2 2B1 1C4 2A2 2B2 1A2 2C2 2B4 1A32 2B3 1C6 Clustal Co

....|....| 1450 ATACNNNCCG MTSCRACTCS CTGCAACTCG CTGCAACTCG CTGCAACTCG CTGCAACTCG NAGCAACTMG CTGCAACTCG CTGCARCTCG CTGCAACTCG CTGCAACTCG CTGCAACTCG CTGCAACTCG CTGCAACTCG TAACAACAGA TAACAACAAA TAACAACAGA TAACAACAGA TAACANCAGA TWACAACWGA *

....|....| 1460 ATCNCATGNN CYTAMATGAA CCTACATGAA CCTACATGAA CCTACATGAA CCTACACGAA CCTNANTGAA CCTACATGAA CCTACATGAA CCTGCATGAA CCTACATGAA CCTACATGAA CCTACACGAA CCTACATGAA GTTTTACGAG KTTTWA-GAG GTTTTACGAG GTTTTACGAG GTTTTACGAG GYTTTAYGAR *

....|....| 1470 NNANCTTCCG RTCGGWRYCG GTCGGAATCG GTCGGAATCG GTCGGAATCG GTCGGAATCG GTCGGAATCG GTCGGAATCG GTCGGAATCG GCCGGAATCG RTCGGARTCG GTCGGAATCG GTCGGAATCG GTCGGAATCG CCGAAACCCT CCGAAACCCT CCGAAACCCT CCGAAACCCT CCGAAACCCT SYSRRAMYCB *

....|....| 1480 ----GCTGTC YTAAGYAATC CTA-GTAATC CTA-GTAATC CTA-GTAATC CTA-GTAATC CTA-GTAATC CTA-GTAATC CTA-GTAATC CTA-GTAATC CTW-GTAATC CTA-GTAATC CTA-GTAATC CTA-GTAATC TCT-TCACTC YCT-TCACTC TCT-TCACTC TCT-TCACTC TCT-TCACTC YYW-KYAMTC **

....|....| 1490 CCNNNCNNNC SSGGATYRKC GCGGATCAGC GCGGATCAGC GCGGATCAGC GCGGATCAGC GCGGATCATC GCGGATCAGC GCGGATCAGC GCGGATCAGC GCGGAWCAGC GCGGATCAGC GCGGATCAGC GCGGATCAGC ACGCGGCGTT ANGCGGCGTT ACGCGGCGTT ACGCGGCGTT ACNCNGCGNC ACGCGGCGTD

....|....| 1500 CTA------ATGCC----G ATGCC----G ATGCC----G ATGCC----G ATGCC----G ATGCC----G ATGCC----G ATGCC----G ACGCC----G ATGCS----S ATGCC----G ATGCC----G ATGCC----G GCTCCATCAG GCTCCATCNN GCTCCATCAG GCTCCATCAG NCNCN-TCAG GCTCCATCMG

....|....| 1510 -AGTTGACCC CGGTGAATAC CGGTGAATAC CGGTGAATAC CGGTGAATAC CGGTGAATAC CGGTGAATAC CGGTGAATAC CGGTGAATAC CGGTGAATAC CGGTRAATAC CGGTGAATAC CGGTGAATAC CGGTGAATAC ACTTTCGTCC -CTTTCGTCC ACTTTCGTCC ACTTTCGTCC ANTTTCGTCC MSKTTCGTMC * *

....|....| 1520 AATCGGGGAC GTTCCCGGGC GTTCCCGGGC GTTCCCGGGC GTTCCCGGGC GTTCCCGGGC GTTCCCGGGC GTTCCCGGGC GTTCCCGGGC GTTCCCGGGC KTTCCSSSSY GTTCCCGGGC GTTCCCGGGC GTTCCCGGGC ATTGTGGAAG ATTGTGGAAN ATTGTGGAAG ATTGTGGAAG ATTGNGGAAN RTTGYGGAAG *

....|....| 1530 CTTNACCNCCTTGTACACCTTGTACACCTTGTACACCTTGTACACCTTGTACACCTTGTACACCTTGTACACCTTGTACACCTTGTACACCWWSWMCACCTTGTACACCTTGTACACCTTGTACACATTCCCTACT ATTCCCTACT ATTCCCTACT ATTCCCTACT ATTCCCTACT AYTCCCTACW *

....|....| 1540 ---GCTANGG ---ACCGCCC ---ACCGCCC ---ACCGCCC ---ACCGCCC ---ACCGCCC ---ACCGCCC ---ACCGCCC ---ACCGCCC ---ACCGCCC ---ACCGCCC ---ACCGCCC ---ACCGCCC ---ACCGCCC GCTGCCTCCC GCTGCCTCCC GCTGCCTCCC GCTGCCTCCC GCTGCCTNCC G-TGCCTCCC *

Gambar 5.6 Alignment urutan basa ke-900 sampai 1540 gen 16S rRNA dari 20 isolat BAL. Clustal Co= conserved region yang diperoleh pada Clustal W

Hasil alignment menunjukkan bahwa urutan basa gen 16S rRNA dari semua isolat BAL mampu disejajarkan dengan baik dan mempunyai susunan basa

102

tetap atau sama sesuai analisis dengan menggunakan ClustalW.

Hasil

elektroferogram masing-masing primer sequencing menunjukkan basa yang terdeteksi dan dilakukan alignment untuk menyusun gen 16S rRNA pada isolat tersebut. Selanjutnya dilakukan multialignment untuk dapat mensejajarkan urutan basa gen 16S rRNA yang diperoleh pada 20 isolat BAL (Gambar 5.6). Terdapat basa yang rancu (ambigu) sehingga dinyatakan dengan notasi N, W, R, Y, M, S dan K. N dapat berarti A atau T atau C atau G (Gambar 5.6). W artinya weak antara A atau T, R artinya purin antara A atau G, Y berarti pimiridin antara C atau T; M adalah A atau C, S artinya strong antara C atau G dan K berarti G atau T (Tamura et al. 2007). Hal ini disebabkan oleh tidak terbacanya basa nukleotida akibat grafik elektroferogram yang tertumpuk. Clarridge (2004) menyatakan bahwa pada proses sequencing seringkali terjadi kerancuan pembacaan basa. Perbedaan urutan basa 16S rRNA dapat terlihat melalui pensejajaran urutan basa gen 16S rRNA pada semua isolat. Terdapat dua kelompok isolat yang susunan basanya berbeda. Kelompok isolat 1A2, 2C2, 2B4, 1A32, 2B3 dan 1C6 mempunyai urutan basa yang berbeda dengan isolat lainnya (Gambar 4.6). Urutan basa gen 16S rRNA di antara 20 isolat BAL memiliki kesamaan dan perbedaan daerah yang tersusun oleh basa nukleotida, yaitu daerah antara urutan basa ke 900 sampai 1400 (Gambar 5.6).

Melalui analisis Clustal W, basa gen

16S rRNA yang sama dan beda pada 20 isolat BAL dapat diketahui. Hal ini menunjukkan bahwa daerah tersebut merupakan conserved region juga sekaligus divergen region. Persentase komposisi basa gen 16S rRNA setiap isolat BAL dapat ditentukan dengan menghitung jumlah basa setiap basa T, C, A dan G. Program MEGA 4 menyediakan hitungan statistik komposisi nukleotida/basa. Hasil analisis perhitungan komposisi basa dengan menggunakan program MEGA 4 dapat dilihat pada Tabel 5.4. Komposisi basa penyusun gen 16S rRNA setiap isolat BAL berbeda (Tabel 5.4). Hal inilah yang menyebabkan suhu annealing pada saat proses PCR untuk amplifikasi gen16S rRNA dapat berbeda untuk isolat BAL. Perbandingan rataan persentase komposisi basa isolat 20 isolat BAL adalah T:C:A:G = 24% : 25.1% : 25% : 26%. Komposisi G+C khusus untuk gen 16S rRNA pada 20 isolat BAL berkisar 50.4 – 53.3%. Fellis dan Dellaglio (2008) menyatakan bahwa

103

perkembangan ilmu taksonomi dewasa ini mengarah pada identifikasi diferensiasi kandungan G+C genom suatu bakteri. Bakteri asam laktat selain golongan Bifidobacterium, mempunyai kandungan G+C total genom dengan kisaran sebesar 32 -54% (Falsen et al. 1999, Fellis & Dellaglio 2008; Singh et al. 2009).

Tabel 5.4 Komposisi nukleotida/basa gen penyandi 16S rRNA isolat BAL No 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20.

Kode Isolat 1C3 2C12 1A5 1B1 1D1 1A6 1C1 2D1 1A1 2D2 2B1 1C4 2A2 2B2 1A2 2C2 2B4 1A32 2B3 1C6 Rata-rata

T 23.1 22.3 22.2 22.2 22.4 22.2 23.0 23.2 22.6 22.0 22.2 22.3 25.5 25.5 26.4 26.2 25.6 25.5 25.3 26.5 24.0

Komposisi basa (%) C A 22.1 26.3 21.7 26.6 22.1 26.6 21.9 26.3 23.2 25.9 21.6 26.9 21.9 26.0 22.6 25.1 24.4 25.3 24.2 24.8 22.8 27.4 24.2 27.3 26.1 23.9 27.4 23.3 29.3 22.4 29.4 22.8 27.5 23.7 28.8 23.4 30.2 23.4 28.9 23.1 25.0 25.0

G 28.5 29.4 29.0 29.5 28.5 29.2 29.1 29.0 27.7 29.1 27.7 26.2 24.5 23.8 21.8 21.6 23.2 22.2 21.1 21.5 26.0

Persentase G+C (%) 50.6 51.1 51.1 51.4 51.8 50.8 51.0 51.6 52.1 53.3 50.5 50.4 50.6 51.2 51.1 51.0 50.7 51.0 51.3 50.4 51.0

Perbedaan komposisi basa tersebut menyebabkan terjadinya perbedaan genetik isolat, yang menunjukkan adanya variasi genetik sampai ke tingkat galur. Perbedaan urutan basa pada satu spesies bakteri menyebabkan terjadinya variasi pada tingkat galur. Hal ini juga ditunjang oleh adanya perbedaan jarak genetik diantara isolat. Jarak genetik atau perbedaan nukleotida/basa antar dua isolat dapat dianalisis dengan menggunakan perhitungan pairwise distance (p-distance) pada program MEGA 4. Perhitungan p-distance tersebut merupakan proporsi (p) dari nukleotida diantara dua urutan basa berbeda yang dibandingkan. Nilai jarak tersebut diperoleh dengan cara membagi jumlah basa yang berbeda dengan jumlah basa yang dibandingkan (Tamura et al. 2008). Hasil analisis jarak genetik antara dua isolat pada 20 isolat BAL dapat dilihat pada Tabel 5.5.

104

Proporsi jarak genetik menunjukkan perbedaan urutan basa gen 16S rRNA diantara dua isolat (Tabel 5.5). Semakin tinggi proporsi jarak genetik, maka semakin jauh pula kedekatan kekerabatan kedua isolat tersebut berdasarkan gen 16S rRNA. Berdasarkan jarak genetik (p-distance) antara dua isolat, maka dapat ditentukan similaritas kedua isolat tersebut (Tabel 5.6) Berdasarkan jarak genetik dan similaritasnya, maka 20 isolat BAL dapat dikelompokkan menjadi dua klaster. Klaster pertama adalah isolat 1C3, 2C12, 1A5, 1B1, 1D1, 1A6, 1C1, 2D1, 1A1, 2D2, 2B1, 1C4, 2A2 dan 2B2 dengan nilai p-distance yang menunjukkan jarak genetik antara 0.00 sampai 0.18 dan similaritas antara 82100%. Isolat 1C3 mempunyai jarak genetik lebih besar daripada 0.1 (0.12-0.18) dan similaritas yang lebih rendah dari 94% yaitu 82-88% terhadap isolat 2C12, 1A5, 1B1, 1D1, 1A6, 1C1, 2D1, 1A1, 2D2, 2B1,1C4, 2A2 dan 2B2 pada klaster yang sama. Jarak genetik dengan nilai p-distance 0.00 - 0.09 dan similaritas 91100% ditunjukkan diantara isolat 2C12, 1A5, 1B1, 1D1, 1A6, 1C1, 2D1, 1A1, 2D2, 2B1,1C4, 2A2, dan 2B2 yang menandakan bahwa isolat-isolat tersebut mempunyai kedekatan genetik yang tinggi. Klaster kedua yang diperoleh berdasarkan analisis jarak genetik adalah klaster untuk isolat 1A2, 2C2, 2B4, 1A32, 2B3 dan 1C6. Semua isolat yang tergabung pada klaster 2 mempunyai jarak genetik dengan nilai p-distance di atas 0.5 (0.55-0.61) dan similaritas sebesar 39-45% dibandingkan dengan semua isolat yang tergabung pada klaster pertama. Hal ini menunjukkan bahwa hubungan kekerabatan diantara isolat klaster pertama agak jauh dengan isolat klaster kedua. Jarak genetik yang rendah ditunjukkan diantara isolat yang tergabung pada klaster kedua dengan nilai p-distance 0.0 – 0.01, dengan similaritas yang tinggi yaitu 99100%. Dengan demikian hubungan kekerabatan di antara isolat pada klaster kedua adalah tinggi.

105

Tabel 5.5 Jarak nukleotida (p-distance) yang merupakan proporsi perbedaan diantara dua isolat yang dibandingkan pada 20 isolat BAL 1C3 [ 1C3]

2C12

1A5

1B1

1D1

1A6

1C1

2D1

1A1

2D2

2B1

1C4 2A2 2B2

1A2

2C2 2B4 1A32 2B3 1C6

-

[ 2C12] 0.12

-

[ 1A5]

0.12

0.00

-

[ 1B1]

0.13

0.01

0.01

-

[ 1D1] 0.12

0.00

0.00

0.01

-

[ 1A6] 0.15

0.05

0.05

0.06

0.05

-

[ 1C1] 0.13

0.01

0.01

0.02

0.01

0.06

-

[ 2D1] 0.12

0.00

0.00

0.02

0.00

0.05

0.01

-

[ 1A1] 0.12

0.00

0.00

0.01

0.00

0.05

0.01

0.00

-

[2D2]

0.18

0.09

0.09

0.09

0.09

0.09

0.10

0.09

0.09

-

[2B1]

0.13

0.01

0.01

0.02

0.01

0.06

0.02

0.01

0.01

0.09

-

[1C4]

0.12

0.00

0.00

0.02

0.00

0.05

0.01

0.01

0.00

0.09

0.01 -

[2A2]

0.15

0.05

0.05

0.06

0.05

0.00

0.06

0.05

0.05

0.09

0.06 0.05

-

[2B2]

0.13

0.01

0.01

0.02

0.01

0.06

0.02

0.01

0.01

0.09

0.01 0.01

0.06

-

[1A2]

0.61

0.55

0.55

0.55

0.55

0.58

0.54

0.55

0.55

0.56

0.55 0.55

0.58

0.55

-

[2C2]

0.61

0.55

0.55

0.55

0.55

0.58

0.54

0.55

0.55

0.56

0.55 0.55

0.58

0.55

0.00 -

[2B4]

0.61

0.55

0.55

0.55

0.55

0.58

0.54

0.55

0.55

0.56

0.55 0.55

0.58

0.55

0.00 0.00

[1A32] 0.61

0.55

0.55

0.55

0.55

0.58

0.54

0.55

0.55

0.56

0.55 0.55

0.58

0.55

0.00 0.00 0.00

[2B3]

0.61

0.55

0.55

0.55

0.55

0.58

0.54

0.55

0.55

0.56

0.55 0.55

0.58

0.55

0.00 0.00 0.00 0.00 -

[1C6]

0.61

0.55

0.55

0.54

0.55

0.57

0.54

0.54

0.55

0.55

0.55 0.55

0.57

0.55

0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 -

Klaster 1

-

Klaster 2 -

106

Tabel 5.6 Similaritas (%) di antara dua isolat BAL ( X versus Y), rumus : 100 –[(p-distance)x100], berdasarkan Tamura et al. (2008) 1C3

2C12

1A5

1B1

1D1

1A6

1C1

2D1

1A1

2D2

2B1

1C4 2A2 2B2

1A2

2C2 2B4 1A32 2B3 1C6

[ 1C3]

100

[ 2C12]

88

100

[ 1A5]

88

100

100

[ 1B1]

87

99

99

100

[ 1D1]

88

100

100

100

100

[ 1A6]

85

95

95

94

95

100

[ 1C1]

87

99

100

98

99

94

100

[ 2D1]

88

100

100

98

100

95

99

100

[ 1A1]

88

100

100

99

100

95

99

100

100

[2D2]

82

91

91

91

91

91

90

99

99

100

[2B1]

87

99

99

98

99

94

98

99

99

91

100

[1C4]

88

100

100

98

100

95

99

99

99

91

99

100

[2A2]

85

95

95

94

95

100

94

95

95

91

94

95

100

[2B2]

87

99

99

98

99

94

98

99

99

91

99

99

94

100

[1A2]

39

45

45

45

45

42

46

45

45

44

45

45

42

45

100

[2C2]

39

45

45

45

45

42

46

45

45

44

45

45

42

45

100 100

[2B4]

39

45

45

45

45

42

46

45

45

44

45

45

42

45

100 100 100

[1A32] 39

45

45

45

45

42

46

45

45

44

45

45

42

45

100 100 100 100

[2B3]

39

45

45

45

45

42

46

45

45

46

45

45

42

45

100 100 100 100 100

[1C6]

39

45

45

46

45

43

46

46

45

45

45

45

43

45

99

Klaster 1

99

99

Klaster 2

99

99 100

107

Pohon Filogenetik Isolat BAL Analisis kekerabatan dilakukan dengan menggunakan program BLAST (BLASTN) NCBI (secara online), sedangkan penyusunan pohon filogenetik dilakukan dengan menggunakan program perangkat lunak MEGA 4. Homologi suatu bakteri yang belum diketahui dengan isolat yang terdeposit pada GenBank dapat diketahui melalui analisis menggunakan program BLAST. Blast melakukan alignment untuk urutan basa basa secara lokal atau hanya pada daerah tertentu dari keseluruhan urutan basa, namun MEGA 4 melakukan alignment secara global alignment atau seluruh urutan basa yang dimasukkan sebagai data untuk dianalisis. Clarridge (2004) menyatakan bahwa similaritas sebesar ≥ 94% masuk dalam satu spesies. Hasil analisis dengan menggunakan program BLAST dapat dilihat pada Tabel 5.7 dan Tabel 5.8, sedangkan contoh urutan lebih lengkap dapat dilihat pada Lampiran 19-22. Salah satu contoh tampilan analisis hubungan kekerabatannya dapat dilihat pada Gambar 5.7. Berdasarkan analisis BLAST (Tabel 5.7), 20 isolat BAL mempunyai kedekatan dengan isolat internasional Firmicutes, yaitu Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceous dan Enterococcus faecium, yang ditunjukkan pada hasil analisis sebagai urutan pertama. Namun demikian, terdapat hasil yang menunjukkan bahwa pada sebagian isolat mempunyai nilai homologi maksimal yang beda pada urutan hasil BLAST. Terdapat enam isolat yang urutan pertama hasil BLAST mempunyai homologi dengan L. plantarum, namun di urutan bawah terdapat hasil homologi maksimal sebesar 100% dengan Lactobacillus acidophilus NCFM (Tabel 5.8).

108

Tabel 5.7 Urutan pertama identitas isolat BAL dengan isolat internasional yang terdaftar pada Genbank, berdasarkan pencarian BLAST No 1

Kode isolat BAL 1C4

Homologi dengan isolat pada GenBank Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ATCC 14917

Identitas maksimal 98 %

Kode akses isolat homolog di Genbank ACGZ02000033.1

2

2B1

Lactobacillus plantarum JDM1

99 %

NC 012984.1

3

1C3

Lactobacillus plantarum subsp. plantarum JDM1

94 %

NC 014554.1

4

1C1

Lactobacillus plantarum subsp. plantarum JDM 1

94 %

NC 012984.1

5

1A5

Lactobacillus plantarum JDM1

97 %

NC 012984.1

6

2B2

Lactobacillus plantarum JDM1

99 %

NC 012984.1

7

1A1

Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ATCC 14917

97 %

ACGZ02000033.1

8

2C12

Lactobacillus plantarum JDM1

97 %

NC 012984.1

9

2D1

Lactobacillus plantarum JDM1

97 %

NC 012984.1

10

1D1

Lactobacillus plantarum JDM1

98 %

NC 012984.1

11

2B4

Lactobacillus plantarum JDM1

97 %

NC 012984.1

12

2B3

Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ATCC 14917

94 %

ACGZ02000033.1

13

1B1

Lactobacillus plantarum JDM1

98 %

NC 012984.1

14

2C2

Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ATCC 14917

96 %

ACGZ02000033.1

15

1A2

Lactobacillus plantarum JDM1

98 %

NC 012984.1

16

1A32

Lactobacillus plantarum JDM1

97 %

NC 012984.1

109

No 17

Kode isolat BAL 1C6

Homologi dengan isolat pada GenBank Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ATCC 14917

Identitas maksimal 94%

Kode akses isolat homolog di Genbank ACGZ02000033.1

18

2A2

Pediococcus pentosaceus ATCC 25745

98 %

NC 008525.1

19

1A6

Pediococcus pentosaceus ATCC 25745

97 %

NC 008525.1

20

2D2

Enterococcus faecium E980

96 %

ABQA1000099.1

Tabel 5.8 Hasil analisis BLAST yang menunjukkan bahwa terdapat identitas maksimal 100% pada enam isolat BAL dengan L. acidophilus NCFM No 1

Kode isolat BAL 2B4

Homologi dengan isolat pada GenBank Lactobacillus acidophilus NCFM

Identitas maksimal 100 %

Kode akses isolat homolog di Genbank NC 006814.3

2

2B3

Lactobacillus acidophilus NCFM

100 %

NC 006814.3

3

2C2

Lactobacillus acidophilus NCFM

100 %

NC 006814.3

4

1A2

Lactobacillus acidophilus NCFM

100 %

NC 006814.3

5

1A32

Lactobacillus acidophilus NCFM

100 %

NC 006814.3

6

1C6

Lactobacillus acidophilus NCFM

100 %

NC 006814.3

Analisis multialignment (Gambar 5.6) dan p-distance (Tabel 5.5) yang akhirnya menghasilkan similaritas antara dua isolat (Tabel 5.6) menunjukkan bahwa 20 BAL indigenus terbagi menjadi dua klaster.

Klaster pertama

ditunjukkan oleh 14 isolat dan klaster kedua ditunjukkan oleh enam isolat. Keenam isolat tersebut juga menunjukkan hasil yang serupa dengan hasil BLAST (Tabel 5.7 dan Tabel 5.8).

Walaupun pada urutan pertama hasil BLAST

menunjukkan bahwa keenam isolat mempunyai homologi dengan L. plantarum sebesar 94-98%, namun terdapat homologi sebesar 100% dengan L. acidophilus

110

NCFM. Untuk memastikan klaster tersebut, maka dilakukan analisis kekerabatan dengan penyusunan pohon filogenetik.

Gambar 5.7 Contoh tampilan hasil analisis BLASTN untuk isolat 2C12

Pohon filogenetik kekerabatan dibuat dengan tiga tahapan penyusunan yaitu tahap pertama adalah dendogram 20 isolat tanpa disejajarkan dan dibandingkan dengan isolat internasional, tahap kedua adalah dendogram 20 isolat BAL disejajarkan dan dibandingkan dengan L. acidophilus NCFM (Gambar 5.8), serta tahap ketiga adalah dendogram 20 isolat BAL disejajarkan dengan isolat yang terdaftar pada GenBank lainnya (Gambar 5.9).

111

1A6 2A2 1C3 2D1 1A5 2C12 1D1 1A1 1C4 2B1 2B2 1B1 1C1 2D2 1C6 1A2 2C2 2B4 1A32 2B3 0.1

(a) 92 52

1A6 2A2 1C3

5 43

2D2 2D1 1B1

1 2C12 1A5 6 35 100

1D1 2B2 1C4 2B1 1A1 1C1 L.acidophilus NCFM

1C6 1A2 1A32

95 84

2B3 2B4 2C2

0.1

(b)

Gambar 5.8 Dendogram pohon filogenetik isolat BAL (a) tanpa disejajarkan dengan isolat internasional (GenBank), (b) dengan bootstrap dan disejajarkan dengan L.acidophilus NCFM

112

1C3 Lactobacillus plantarum JDM1 1B1 2D1 59

Lactobacillus plantarum ATCC14917 1D1 1A1 1C1

49

2C12 71

1A5 1C4

40 30

2B1 43

2B2

48

Lactobacillus fermentum ATCC4796

100 88

77

2A2 1A6 Pediococcus pentosaceous ATCC25745

2D2 Enterococcus faecium1 141 733c Enterococcus faeciumDOcontig00 Lactobacillus acidophilus NCFM 1C6 2C2 100

1A2

60

2B3 49 2B4 1A32

0.1

Gambar 5.9 Dendogram pohon filogenetik isolat BAL dengan bootstrap dan disejajarkan dengan isolat Genbank Didasarkan pada hasil analisis menggunakan BLAST (Tabel 5.7 dan Tabel 5.8), serta menggunakan analisis pohon filogenetik (Gambar 5.8 dan 5.9), maka 20 isolat BAL teridentifikasikan menjadi empat spesies yaitu Lactobacillus plantarum,

Lactobacillus

acidophilus,

Pediococcus

pentosaceous

dan

Enterococcus faecium. Sebanyak 11 isolat yaitu 1C3, 1B1, 2D1, 1D1, 1A1, 1C1, 2C12, 1A5, 1C4, 2B1 dan 2B2, sangat dekat hubungan kekerabatannya dengan Lactobacillus plantarum (94-99%). Isolat 2A2 dan 1A6 diidentifikasi sebagai Pediococcus pentosaceous ATCC 25745 (kode akses NC 008525.1) dengan hubungan kedekatannya berdasarkan BLAST NCBI sebesar 97% dan 98%. Sebanyak satu isolat yaitu 2D2 termasuk dalam Enterococcus faecium dan mempunyai hubungan kedekatan dengan E. faecium E980 (kode akses ABQA1000099.1) sebesar 96%. Enam isolat BAL lainnya yaitu 1C6, 2C2, 1A2, 2B3, 2B4 dan 1A32 termasuk dalam satu klaster dengan L. acidophilus NCFM (kode akses NC 006814.3) (Gambar 5.8b dan 5.9).

Peneliti lainnya juga

menyatakan bahwa L. plantarum dan L. acidophilus terletak dalam klaster

113

berbeda pada pohon filogenetik BAL (de Vries et al. 2006; Fellis & Dellaglio 2008; Makarova & Koonin 2007). Nilai bootstrap pada percabangan menunjukkan nilai keakuratan percabangan pada pohon filogenetik, dengan perhitungan sebanyak 1000 kali pengacakan (Tamura et al. 2007).

Nilai bootstrap 95% atau lebih mempunyai

arti bahwa topologi percabangan tersebut sangat akurat, konsisten atau tidak akan berubah walaupun dilakukan dengan metode penyusunan pohon filogenetik lainnya (Horiike et al. 2009). Terdapat empat metode penyusunan pohon filogenetik yang tersedia pada program MEGA 4 yaitu metode NJ (neighbor joining), UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean), Maximum Parsimory dan Minimum Evolution. Coenye dan Vandamme (2003) menyatakan bahwa nilai bootstrap >70% menunjukkan bahwa percabangannya bersifat cukup signifikan dan tetap. Nilai bootstrap yang rendah menunjukkan bahwa percabangan akan sangat mungkin berubah (Tamura et al. 2008). Pada penyusunan pohon filogenetik gen 16S rRNA dari 20 BAL yang disejajarkan dengan isolat internasional yang terdapat pada GenBank terbentuk dua cabang pokok yang mempunyai nilai bootstrap 100% yaitu cabang klaster Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus, Enterococcus faecium dan Lactobacillus fermentum serta cabang klaster yang mendekati Lactobacillus acidophilus. Selain itu, percabangan antara isolat 1C6 dengan kumpulan isolat 2C2, 1A2, 2B3, 2B4 dan 1A32, juga memiliki nilai bootstrap 100%. Hal ini menunjukkan bahwa kedua percabangan tersebut bersifat konsisten (Gambar 5.9) dan merupakan dua klaster yang memiliki perbedaan sangat signifikan. Nilai bootsrap >70% ditunjukkan oleh 2 klaster pada spesies yang berbeda yaitu 77% untuk isolat 2D2 disejajarkan dengan isolat E. faecium dan 88% untuk isolat 1A6 dan 2A2 yang sejajar dengan isolat P. pentosaceus ATCC 25745. Berdasarkan pendapat Coenye dan Vandamme (2003), nilai bootstrap spesies E. faecium dan P. pentosaceus yang di atas 70% menunjukkan bahwa percabangan kedua spesies tersebut dengan spesies L. plantarum juga bersifat signifikan dan tetap. Hal yang menarik adalah klaster isolat 1C6, 2C2, 1A2, 2B3,2B4 dan 1A32 yang homolog dengan L. acidophilus NCFM berdasarkan analisis BLAST, namun terlihat adanya percabangan pohon filogenetik yang cukup jauh. Hal ini sejalan

114

dengan hasil perhitungan gap pada analisis BLAST sebesar 2-4%. Adanya gap ini sangat memungkinkan bahwa kelompok isolat tersebut memiliki perbedaan yang mengarah sampai tingkat spesies. Selain itu pula, perbedaan ini juga ditunjukkan oleh jarak genetik dengan p-distance diantara dua kelompok isolat dalam dua klaster yang cukup tinggi yaitu lebih besar dari 0.55. Dengan demikian, kelompok isolat 1C6, 2C2, 1A2, 2B3, 2B4 dan 1A32 dipastikan merupakan galur baru berdasarkan analisis perbedaan gen 16S rRNA, dan sangat dimungkinkan sebagai spesies baru yang mempunyai homologi sangat dekat dengan L. acidophilus namun mempunyai gap atau perbedaan urutan basa gen.

Analisa molekuler

lainnya seperti analisis urutan basa gen 23S rRNA, hibidrisasi DNA-DNA, daerah antara gen 16-23S rRNA (atau daerah ITS) serta analisis protein yang menyusun dinding sel perlu dilakukan untuk memastikan spesies kelompok isolat tersebut. Ahli taksonomi mensyaratkan jika terdapat hasil identifikasi yang masih belum jelas dengan analisis urutan basa gen 16S rRNA maka perlu dilakukan analisis molekuler lainnya untuk memastikan identifikasi spesies baru.

Analisis

molekuler asam nukleat lainnya yang dapat digunakan untuk identifikasi adalah dot-blot hybridization dan whole-cell in situ hybridization (Amor et al. 2007). BAL

termasuk

dalam

filum

Firmicutes,

kelas

Bacilli,

order

Lactobacillales, family Lactobacillaceae (Fellis & Dellaglio 2008) dan terdiri atas sembilan genus yaitu Lactobacillus, Aerococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Weisella, Carnobacterium, Tetragenoccoccus dan Bifidobacterium (Klein et al. 1998). Identifikasi biokimiawi yang membedakan genus BAL diantaranya pembentukan gas CO2 dari glukosa, pertumbuhan pada suhu 10°C dan 45°C, pertumbuhan pada kondisi NaCl 6.5% serta pembentukan jenis isomer asam laktat (Axelsson 1993). Pada penelitian ini, telah diketahui beberapa sifat biokimiawi 20 BAL. Jika digabungkan antara hasil identifikasi secara biokimiawi dan secara molekuler berdasarkan urutan basa gen 16S rRNA maka terdapat kesamaan yang memperkuat hasil identifikasi genus dan spesies yang diperoleh. Isolat yang tergabung dalam spesies L. plantarum berdasarkan kedekatan homologi gen 16S rRNA dengan L. plantarum yang terdeposit pada GenBank mempunyai sifat biokimiawi yang memperkuat identifikasi tersebut. Isolat-isolat tersebut bersifat homofermentatif karena tidak menghasilkan gas CO2 dari

115

glukosa, dapat tumbuh pada suhu 10°C dan 45°C serta dapat tumbuh pada kondisi NaCl 6.5% (Tabel 5.1). Sifat fermentasi terhadap beberapa jenis gula sederhana diantara L. plantarum sedikit bervariasi (Tabel 5.2) karena sangat dimungkinkan adanya perbedaan gen yang memunculkan sifat fenotip yang berbeda. Dengan demikian dapat dipastikan bahwa kesebelas isolat BAL 1C3, 1B1, 2D1, 1D1, 1A1, 1C1, 2C12, 1A5, 1C4, 2B1 dan 2B2 merupakan spesies L. plantarum. Isolat yang tergabung dalam spesies Pediococcus pentosaceus yaitu 1A6 dan 2A2 juga memiliki sifat bikomiawi yang mendukung ciri Pediococcus. Kedua isolat tersebut bersifat homofermentatif, dapat tumbuh pada suhu 10°C dan 45°C serta tidak menghasilkan NH3 dari arginin (Tabel 5.1). Selain itu juga secara morfologi ditunjukkan oleh koloni yang membentuk formasi tetrad. Hal ini sesuai dengan ciri Pediococcus yang dinyatakan oleh Axelsson (1993).

Isolat yang

sangat dekat homologinya dengan Enterococcus faecium yaitu isolat 2D2 juga memenuhi ciri biokimiawi yang memperkuat hasil identifikasi secara molekuler. Isolat 2D2 bersifat homofermentatif, dapat tumbuh pada suhu 10°C dan 45°C serta kondisi NaCl 6.5%, selain itu juga menghasilkan NH3 dari arginin (Tabel 5.1). Berdasarkan hal tersebut maka dapat dipastikan bahwa isolat 1A6 dan 2A2 termasuk dalam spesies P. pentosaceus, sedangkan isolat 2D2 merupakan spesies E. faecium. Berdasarkan identifikasi gen 16S rRNA terdapat keunikan baik pada hasil analisis BLAST maupun pohon filogenetik pada enam isolat (1C6, 2C2, 1A2, 2B3, 2B4 dan 1A32) yang menunjukkan kedekatannya dengan spesies L.acidophilus pada pohon filogenetik walaupun urutan pertama hasil BLAST adalah L. plantarum. Hal ini dimungkinkan karena analisis BLAST berdasarkan local alignment, sedangkan analisis pohon filogenetik program MEGA 4 menggunakan global alignment. Jika ditemukan adanya perbedaan tersebut, maka penentuan identitas lebih direkomendasikan berdasarkan global alignment. Keenam isolat tersebut memiliki ciri biokimiawi yang sama dengan L. acidophilus. Isolat-isolat tersebut bersifat homofermentatif, dapat tumbuh pada suhu 10°C dan 45°C serta kondisi NaCl 6.5% serta tidak menghasilkan NH3 dari arginin (Tabel 5.1) dengan sifat fermentasinya terhadap beberapa jenis gula sederhana agak bervariasi (Tabel 5.2). Sifat fermentasi gula dapat berbeda yang

116

sangat dimungkinkan oleh variasi susunan gen yang tergabung dalam satu spesies yang mampu memunculkan sifat fenotipik yang berbeda. Menurut Johnson dan Case (2007), L. acidophilus dapat dicirikan khusus tidak dapat memfermentasi manitol.

Keenam isolat tersebut juga tidak dapat memfermentasi manitol.

Berdasarkan beberapa sifat biokimiawi serta hubungan terdekat susunan gen 16S rRNA dengan spesies L. acidophilus, maka keenam isolat tersebut dinyatakan sebagai L. acidophilus. Sebanyak lima isolat (1B1, 1A5, 2C12, 2B4 dan 2C2) juga diidentifikasi dengan menggunakan API CHL. Hasil analisis tersebut menunjukkan bahwa isolat 1B1, 1A5 dan 2C12 adalah L. plantarum (similaritas >99%), dan mempunyai kesamaan hasil dengan identifikasi menggunakan analisis urutan basa gen 16S rRNA. Dua isolat lainnya yaitu 2B4 diidentifikasi sebagai L. fermentum (99.7%) dan 2C2 diidentifikasi sebagai L. rhamnosus (67%). Identifikasi API CHL yang mendasarkan pada pola fermentasi gula sebanyak 48 jenis gula menunjukkan hasil yang berbeda dengan identifikasi molekuler berdasarkan analisis urutan basa 16S rRNA untuk isolat 2B4 dan 2C2. Hasil analisis urutan basa gen 16S rRNA menunjukkan bahwa isolat 2B4 dan 2C2 merupakan L.acidophilus. Berdasarkan hal tersebut, untuk mendapatkan keakuratan identitas spesies BAL, maka diperlukan analisis secara molekuler.

Hasil identifikasi

dengan API-test memerlukan konfirmasi identifikasi secara molekuler. Hal ini sesuai dengan pendapat Counter et al (2005) yang melaporkan bahwa identifikasi API CHL kurang akurat dan masih terdapat kesalahan identitas BAL. Contoh tampilan hasil identifikasi dengan menggunakan API CHL ditunjukkan pada Lampiran 23. Identifikasi lanjut secara molekuler lainnya sangat diperlukan untuk memastikan spesies yang tepat dari keenam isolat tersebut misalnya dengan mengidentifikasi gen 23S rRNA, susunan protein dinding sel dan hibidrisasi DNA-DNA. Jika menemui kekurangjelasan hasil identifikasi, direkomendasikan untuk melakukan analisis molekuler lainnya untuk memastikan galur dan spesies BAL. Krockel et al. (2003) melakukan hibridisasi DNA-DNA untuk memastikan spesies BAL baru yang diisolasi dari sosis fermentasi yang diidentifikasi sebagai Lactobacillus versmoldensis sp. nov. Daerah gen 23S rRNA dan daerah antara

117

16S dengan 23S rRNA juga merupakan daerah yang dapat memastikan identifikasi suatu spesies dan galur baru dari BAL dan bakteri lainnya (Ruiz et al. 2000; Barrangaou et al. 2002; Islam et al. 2008).

Selain itu, teknik RAPD

(randomly amplified polymorphic DNA) PCR yang dapat menganalisis diferensiasi spesies dan galur BAL dilakukan oleh Bonomo et al. (2008) dan Mohammed et al. (2009) dan dapat mengidentifikasikan spesies dan galur BAL yang diisolasi dari sosis fermentasi dan susu sapi. Plengvidhya et al. (2007) mengidentifikasi BAL yang diisolasi dari sauerkraut dengan menggunakan metode DNA fingerprinting dan berhasil menemukan spesies baru yaitu Leuconostoc fallax.

SIMPULAN

Sebanyak 20 isolat BAL asal daging sapi lokal berhasil diidentifikasi secara molekuler dengan menggunakan PCR dan analisis urutan basa gen 16S rRNA sampai tingkat spesies dan galur. Gen 16S rRNA dapat diisolasi secara spesifik (pita tunggal) dengan PCR menggunakan primer dan kondisi yang dioptimasi. Urutan basa gen 16S rRNA dapat dibaca dengan baik pada daerah V6V9 (600 pasang basa) dengan primer yang dirancang sendiri. Pohon filogenetik BAL menunjukkan terdapat dua klaster dari 20 isolat BAL yaitu kelompok klaster pertama terdiri atas isolat yang termasuk dalam L. plantarum, P. pentosaceus dan E. faecium, sedangkan klaster kedua terdiri atas isolat yang dekat dengan L. acidophilus. Sebelas isolat yaitu 1C3, 1B1, 2D1, 1D1, 1A1, 1C1, 2C12, 1A5, 1C4, 2B1 dan 2B2 sangat dekat hubungan kekerabatannya dengan L. plantarum dengan nilai homologi 94-99% sehingga dimasukkan dalam spesies L. plantarum. Isolat 2A2 dan 1A6 termasuk dalam 1 klaster dengan P. pentosaceus dengan hubungan sebesar 97% dan dinyatakan sebagai P. pentosaceus. Isolat 2D2 termasuk dalam klaster E. faecium (hubungan homologi 97%). Enam isolat BAL lainnya yaitu 1C6, 2C2, 1A2, 2B3, 2B4 dan 1A32 termasuk dalam 1 klaster dengan L. acidophilus.

118

DAFTAR PUSTAKA

Anukam KC, Osazuwa EO, Ahonkhai I, Reid G. 2005. 16S rRNA gene sequence and phylogenetic tree of Lactobacillus species from the vagina of healthy Nigerian women. Afr J Biotechnol 4 : 1222-1227. Amor KB, Vaughan EE, de Vos WM. 2007. Advanced molecular tools for the identification of lactic acid bacteria. J Nutr 137: 741s-747S. Arief II, Maheswari RRA, Suryati T. 2007. Karakteristik dan Nilai Gizi Protein Daging Sapi Dark Firm Dry (DFD) yang Difermentasi oleh Lactobacillus plantarum yang Diisolasi dari Daging Sapi. Laporan Penelitian Hibah Bersaing XIII. LPPM-IPB. Axelsson L. 1993. Lactid Acid Bacteria : classification and physiology. Di dalam: Lactid Acid Bacteria: Microbiology and Functional Aspects. 2nd Edition, Revised and Expanded. Salminen, S., and von Wright, A. (Editors.). New York : Marcell Dekker Inc. Balcazar JL et al. 2007. Sequencing of variable regions of the 16S rRNA gene for identification of lactic acid bacteria isolated from the intestinal microbiota of healthy salmonids. Comp Immun Microbiol Infect Dis 30: 111-118. Barrangou R, Yoon SS, Breidt JrF, Fleming HP, Klaenhammer TR. 2002. Identification and characterization of Leuconostoc fallax strains isolated from an industrial sauerkraut fermentation. Appl Environ Microbiol 68: 2877-2884. Bonomo MG, Ricciardi A, Zotta T, Parente E, Salzano G. 2008. Molecular and technological characterization of lactic acid bacteria from fermented sausages of Basilicata region (Southern Italy). Meat Sci 80 : 1238-1248. Cai H, Archambault M, Prescott J. 2003. 16S ribosomal RNA sequence-based identification of veterinary clinical bacteria. J Vet Diagn Invest 15:465469. Chenoll E, Macian MC, Aznar R. 2006. Lactobacillus tucceti sp.nov., a new lactic acid bacterium isolated from sausage. Systematic and Appl Microbiol 29: 389-395. Clarridge JE. 2004. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacterial on clinical microbiology and infectious diseases. Clin Microbiol Rev 17: 840-862.

119

Coenye T, Vandamme P. 2003. Extracting phylogenetic information from wholegenome sequencing projects : the lactic acid bacteria as a test case. Microbiology 149 : 3507-3517. Devereux R, Wilkinson SS. 2004. Amplification of ribosomal RNA sequences. Molecular Microbial Ecology Manual 3.01: 509-522. de Vries MC, Vaughan EE, Kleerebezem M, de Vos WM. 2006. Lactobacillus plantarum-survival, functional and potential probiotic properties in the human intestinal tract. Int Dairy Journal 16 : 1018-1028. Dickson EM, Riggio MP, Macpherson L. 2005. A novel species-spesific PCR assay for identifying Lactobacillus fermentum. J Med Microbiol 54: 299303. Falsen E, Pascual C, Sjoden B, Collins MD. 1999. Phenotypic and phylogenetic characterization of a novel Lactobacillus species from human sources : description of Lactobacillus iners sp.nov. Int. J of Systematic Bacteriology 49: 217-221. FAO/ WHO. 2002. Guidelines for the evaluation of probiotics in food. Report of Joint FAO/WHO Working Group on drafting Guidelines for the evaluation of probiotics in food. London Ontario, Canada. Felis GE, Dellaglio F. 2008. Taxonomy of Lactobacilli and Bifidobacteria. Curr Issues Intestinal Microbiol 8: 44-61 Heilig HGJ et al. 2002. Molecular diversity of Lactobacillus spp and other lactic acid bacteria in human intestine as determined by specific amplification of 16S ribosomal DNA. Appl and Environ Microbiol 8 : 114-123. Horiike T et al. 2009. Phylogenetic construction of 17 bacterial phyla by new method and carefully selected orthologs. Gene 429 : 59-64. Islam MS, Kawasaki H, Muramatsu Y, Nakagawa Y, Seki T. 2008. Bradyrhizobium iriomotense sp.nv., isolated from a tumor-like root of the legume Entada koshunensis from Iriomote island in Japan. Biosci Biotechnol Biochem 72 : 1416-1429. Johnson TR, Case CL. 2007. Laboratory Experiment in Microbiology. 8th edition. Pearson Benjamin Cummings. Lee YK. 2009. Probiotic Microorganisms. Di dalam : Handbook of Probiotic and Prebiotics. 2nd edition. Yuan Kun Lee and Seppo Salminen (editor). John Wiley & Sons, Inc.

120

Lee CM, Sieo CC, Abdullah N, Ho YW. 2008. Estimation of 16S rRNA gene copy number in several probiotic Lactobacillus strains isolated from the gastrointestinal tract of chicken. FEMS Microbiol Lett 287: 136-141. Lodmell JS, Gutell RR, Dahlberg AE. 1995. Genetic and comparative analysis reveal an alternative secondary structure in the region of nt 912 of Escherichia coli 16S rRNA. Genetic 92: 10555-10559. Klein G, Pack A, Bonaparte C, Reuter G. 1998. Taxonomy and physiology of probiotic lactic acid bacteria. Int J Food Microbiol 41: 103-125. Krockel L, Schillinger U, Franz CMA, Bantleon A, Ludwig W. 2003. Lactobacillus versmoldensis sp.nov., isolated from raw fermented sausage. Int J Sys Evol Microbiol 53 : 513-517. Makarova KS, Koonin EV. 2007. Evolutionary Genomic of Lactic Acid Bacteria. J Bact 189 : 1199-1208. Matamaros S, Andre S, Hue I, Prevost H, Pilet MF. 2010. Identification of lactic acid bacteria involved in the spoilage of pasteurized “foie gras” products. Meat Sci 85 : 467-471. Matsuyama H et al. 2008. Sphingobacterium kitahiroshimense sp.npv., isolated from soil. Int J Sys Evol Microbiol 58 : 1576-1679. Mohammed M et al. 2009. Rep-PCR characterization and biochemical selection of lactic acid bacteria isolated from the Delta area of Egypt. International J of Food Microbiol 128 : 417-423. Moreira JLS et al. 2005. Identification to the species level of Lactobacillus isolated in probiotic prospecting studies of human, animal or food origin by 16S-23S rRNA restriction profiling. BMC Microbiology 5:15. Nakagawa K, Kawasaki H. 2001. Determination method of 16S rRNA gene sequence in isolation and characterization of Actinomycetes pp. 88-117. Edited by The Society for Actinomycetes Japan : Business Center for Academic Societies. Ruiz A, Poblet M, Mas A, Guillamon JM. 2000. Identification of acetic acid bacteria by RFLP of PCR-amplified 16S rDNA and 16S-23S rDNA intergenic spacer. Int J Sys Evol Microbiol 50 : 1981-1987. Petrosino JF, Highlander S, Luna RA, Gibbs RA, Versalovic J. 2009. Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clinical Chemistry 55 : 856-866.

121

Plengvidhya V, Breidt JrF, Lu Z, Fleming HP. 2007. DNA fingerprinting of lactic acid bacteria in sauerkraut fermentation. Appl Environ Microbiol 73: 7697-7702. Sakamoto N, Tanaka S, Sonomoto K, Nakayama J. 2011. 16s rRNA pyrosequencing-based investigation of the bacterial community in nukadoko, a pickling bed of fermented rice bran. Int J Food Microbiol 144 : 352-359. Salminen S, Nurmi J, Gueimonde M. 2005. The genomics of probiotic intestinal microorganisms. Genome Biology 6: 225. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning : a laboratory manual. Second Edition. CSH Centennial. Singh S, Goswami P, Singh R, Heller KJ. 2009. Application of molecular identification tools for Lactobacillus, with a focus on discrimination between closely related species : a review. LWT- Food Sci and Technol 42 : 448-457. Tamang B et al. 2008. Phenotytpic and genotypic identification of lactic acid bacteria isolated from ethnic bamboo tender shoots of North East India. Int J Food Microbiol 121 : 35-40. Tamura K, Nei M, Kumar S. 2004. Prospect for inferring very large phylogenies by using the neighbor joining method. PNAS 101: 11030-11035. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2008. MEGA 4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) version 4.0 (manual). Center of Evolutionary Funtional Genomics Biodesign Institute Arizona State University. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007. MEGA 4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol 24: 15961599. Tannock GW. 1999. Identification of Lactobacilli and Bifidobacteria. Current Issues Molec Biol 1: 53-64. Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ. 1991. 16S Ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J Bacteriol 173: 697-703. Woo PCY, Fung AMY, Lau SKP, Yuen KY. 2002. Identification by 16S rRNA gene sequencing of Lactobacillus salivarius bacteremic cholecystitis. J Clin Microbiol 40 : 265-267. Yamahira K. et al. 2008. Acinetobacter sp. strain Ths, a novel psychrotolerant and alkalitolerant bacterium that utilizes hydrocarbon. Extremophiles 12:729734.