SCIENTIA VOL. 5 NO. 1, FEBRUARI 2015
DETEKSI GEN VIRULEN BAKTERI Vibrio parahaemolyticus DARI SAMPEL PENSI (Corbicula moltkiana. Prime) DENGAN METODA POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Lola Azyenela1, Marlina2 Sekolah Tinggi Farmasi Indonesia Perintis Padang 2 Fakultas Farmasi Universitas Andalas
1
ABSTRACT The isolation and detection of toxR, tdh and trh gene Vibrio parahaemolyticus bacteria had been done to samples of pensi , wich were taken from Singkarak lake and some of traditional market at Padang city. The isolation were using selective media CHROMAgarTM Vibrio, and confirmation testing were done by detecting the existed of gene toxR by using Polymerase Chain Reaction ( PCR ) methode with vilurence factor tdh and trh gene detection. The result were pensi samples containing V. parahaemolyticus bacterias which were showed by the appearing of bacteria’s colonies in violet color. The fourty pure culture of pensi which were detected, gave us results of 10 culture toxR gene positive, 7 culture tdh gene positive, and none of trh gene positive. Keywords : Vibrio parahaemolyticus, Corbicula moltkiana. Prime, Polymerase Chain Reaction (PCR)
PENDAHULUAN Bakteri Vibrio parahaemolyticus adalah bakteri yang banyak hidup dan berkembang di laut, sungai dan danau. Beberapa strain bakteri V. parahaemolyticus dapat menyebabkan gastroenteritis pada manusia yang mengkonsumsi makanan terutama yang dimakan mentah, dimasak tidak sempurna, atau terkontaminasi oleh bakteri ini. (Su, 2007; Eugenia, 2004 ; Marlina, 2008) V. parahaemolyticus merupakan bakteri Gram-negatif, berbentuk batang pendek bengkok dan mempunyai flagel. V. parahaemolyticus tumbuh optimum pada kadar NaCl 3%, suhu 35-43 oC, pH 4,8-11, bakteri anaerob fakultatif dan bersifat halofilik. (Bonang, 1979). Kerang-kerangan adalah kelompok hewan bertubuh lunak yang mempunyai kandungan protein yang tinggi. Karena kandungan protein yang tinggi ini bakteri V. parahaemolyticus dapat hidup bersimbiosis dengannya. Kerangkerangan yang banyak dikonsumsi masyarakat adalah pensi (Corbicula moltkiana. Prime) terutama masyarakat di pinggir danau dan sungai. Pengolahan pensi yang tidak sempurna akan menyebabkan diare, dan dalam kondisi parah dapat menyebabkan infeksi ISSN : 2087-5045
gastrointestinal. Penyakit ini salah satunya disebabkan oleh bakteri V. parahaemolyticus. (Bhuiyan, 2002 ; Pennak, 1978) V. parahaemolyticus dapat diidentifikasi dengan beberapa cara, salah satunya dengan menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction). Dengan metode ini dapat dideteksi gen-gen spesifik dari V. parahaemolyticus yaitu gen regulator yang disebut toxR dan gen-gen spesifik lain yaitu thermostable direct hemolysin (tdh) dan thermostable related hemolysin (trh). (Gopal, 2005 ; Yuwono, 2006). Pada penelitian sebelumnya telah dilakukan isolasi V. parahaemolyticus dari sampel pensi (Corbicula moltkiana. Prime), tetapi tidak dilakukan deteksi gen yang bersifat patogen pada V. parahaemolyticus tersebut. Pada penelitian kali ini akan dilakukan deteksi lebih lanjut terhadap gen-gen yang menyebabkan bakteri ini bersifat patogen, yaitu gen tdh dan trh. (Rinanda, 2008; Yuherman, 2000) Melalui penelitian ini, maka dapat dideteksi keberadaan kedua gen virulen V. parahaemolyticus di dalam spesies tersebut, dan hasil akhir penelitian ini diharapkan dapat menjadi masukan untuk mengurangi resiko kontaminasi V. parahaemolyticus pada bahan makanan dan resiko keracunan bakteri ini. 42
SCIENTIA VOL. 5 NO. 1, FEBRUARI 2015
Selain itu juga diharapkan peneliti selanjutnya untuk melakukan identifikasi jenis vibrio lain seperti Vibrio alginotycus, Vibrio fulminycus dan Vibrio cholera dengan metode PCR pada sampel Corbicula moltkiana. Prime.
METODE PENELITIAN Alat dan Bahan Mesin PCR (Eppendorf Mastercyclergradient®), tabung eppendorf, cawan petri, erlenmeyer, gelas piala, gelas ukur, batang pengaduk, jarum ose, pipet mikro (Eppendorf®), lampu spritus, hot plate, vortex (Mixer® VM-1000), timbangan digital, lampu UV (Gel Doc), sentrifugator (Eppendorf Minispin®), inkubator (Gallenkamp®), lemari pendingin, rotary shaker incubator (Bigger Bill Digital®), laminar air flow (ESCO®), autoklaf, botol universal, perangkat elektroforesa, alumunium foil, film polaroid. Sampel pensi (C. moltkiana. Prime), media CHROMAgarTM Vibrio, media Salt Polymixin Broth (SPB), Luria Burtani (LB) Broth, aquadest steril, primer, Taq polimerase, gel agarose, 10x buffer PCR, 25 mM MgCl 2, 10 mM dNTP’s, ethidium bromida, 1x buffer TBE, 100 bp DNA ladder, blue dyes, Kontrol positif V. parahaemolyticus yaitu : VP Strain No.AQ 3815 dan AQ 4037 untuk gen toxR, VP Strain No.AQ 3815 dan VP 81 untuk gen tdh, dan VP Strain No. AQ 4037 dan AT 4 untuk gen trh.
kemudian dilakukan pengenceran mulai dari 10-1 sampai 10-5 dengan cara memipet 0,1 ml sampel induk dimasukkan ke dalam 0,9 ml media SPB dalam tabung eppendorf untuk pengenceran 10-1 selanjutnya 0,1 ml dari pengenceran10-1 dimasukkan kedalam 0,9 ml media SPB dalam tabung eppendorf untuk pengenceran 10-2, demikian seterusnya sampai pengenceran 10-5. Setelah itu masing – masing pengenceran ditanam pada media CHROMAgarTM Vibrio dalam cawan petri. Lalu diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Biakan dalam cawan petri akan terlihat koloni ungu tunggal yang menandakan adanya bakteri V . parahaemolyticus. Pemurnian kultur V. parahaemolyticus Koloni warna ungu pada media CHROMAgarTM Vibrio diambil hati-hati dengan jarum Ose dan dimasukkan ke dalam botol universal berisi Luria Burtani (LB) Broth, kemudian diinkubasi pada inkubator shaker 37 o C dengan kecepatan 160 rpm selama 24 jam. Biakan tersebut dipindahkan kedalam LBA (Luria Butani Agar) dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam dan disimpan untuk stok.
Prosedur Penelitian Pengambilan sampel Sampel diambil langsung dari daerah danau Singkarak dan dari beberapa pasar tradisional di kota Padang Sumatra Barat, kemudian diidentifikasi di Laboratorium Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Andalas.
Deteksi gen V. Parahaemolyticus Ekstraksi genom DNA Ekstraksi genom DNA dilakukan dengan metode Boil Cell Extraction (BCE). Kultur media yang terdapat dalam tabung eppendorf sebanyak 1 ml disentrifus pada 12.000 rpm selama 2 menit, supernatan dibuang, endapan disuspensikan dalam 1 ml NaCl 0,75% steril lalu divortex. Dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit. Selanjutnya didiamkan 5 menit dalam lemari pendingin dengan suhu -20º C, kemudian disentrifus pada 12.000 rpm selama 2 menit, supernatan dipindahkan ke dalam tabung eppendorf baru dan siap untuk deteksi gen menggunakan mesin PCR.
Isolasi bakteri V. parahaemolyticus Sampel berupa pensi (C. moltkiana. Prime) yang telah dihaluskan terlebih dahulu, masing-masing sebanyak 10 gram dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer steril kemudian ditambah Salt Polymixin Broth (SPB) ad 100 ml, diaduk homogen. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Setelah diinkubasi
Elektroforesa Elektroforesa dilakukan dengan menggunakan gel agarose 1 % menggunakan TBE 1 x pada tegangan 100 Volt selama 20 menit. Selanjutnya gel diwarnai dengan 0,5 g/ml larutan ethidium bromida selama 5-10 menit dan dilihat gambarannya di bawah alat pengamat DNA (lampu UV). Gel tersebut difoto
ISSN : 2087-5045
43
SCIENTIA VOL. 5 NO. 1, FEBRUARI 2015
dengan menggunakan film polaroid. Pada foto dapat dilihat pola pemisahan pita-pita DNA yang ukurannya diketahui melalui perbandingan dengan ukuran pita-pita standar 100 bp DNA ladder, dimana ukuran pita-pita DNA V. parahaemolyticus untuk gen toxR 368 bp, gen tdh 251 bp sedangkan gen trh 250 bp.
HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi bakteri V. parahaemolyticus dari spesies pensi (C. moltkiana. Prime) yang diperoleh langsung dari Danau Singkarak dan dari beberapa pasar tradisional di Kota Padang Sumatera Barat dilakukan dengan menggunakan media pengaya Salt Polymixin Broth (SPB). SPB mengandung antibiotika Polymixin B, dimana bakteri V. parahaemolyticus telah resisten terhadap antibiotika ini, dan masih memiliki aktivitas terhadap spesies Vibrio lainnya, sehingga pertumbuhan V. parahaemolyticus akan tetap berlangsung, sedangkan spesies Vibrio yang lainnya akan terhambat. Pada media SPB ini harus ditambahkan NaCl 3% karena V. parahaemolyticus bersifat halofilik yaitu bakteri yang tumbuh optimum dalam kondisi garam yang tinggi, kondisi garam yang optimum adalah 3 %. (United State of America food and Drug Administration, 2001.) Isolasi ini dilakukan dengan 5 variasi pengenceran yaitu 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, dan 10-5, masing-masing pengenceran ditanam pada media CHROM AgarTM Vibrio, dengan cara mencampurkan 100 µl pengenceran dengan 15 ml media tersebut. CHROMAgarTM Vibrio adalah media selektif yang mengandung campuran kromogenik yang memberikan warna ungu untuk spesies V. parahaemolyticus dan warna putih untuk spesies Vibrio alginolyticus, serta warna biru untuk Vibrio fulmynicus. (http:/chromagar.com/products Vibrio, 2003; Schlegel, 1994.) Gen toxR atau toxin Regulator pertama kali ditemukan pada bakteri Vibrio cholera, tetapi kemudian ditemukan juga pada jenis V. parahaemolyticus, dengan susunan basa nukleotida yang berbeda. Gen toxR ini merupakan gen spesifik yang terdapat pada bakteri V. parahaemolyticus, gen ini mengaktifkan gen-gen lainnya untuk ISSN : 2087-5045
menghasilkan produk toksin berupa hemolysin seperti Thermostable Direct Hemolysin (TDH) dan TDH-Related Hemolysin(TRH). (Provenzano, 1999) Proses ekstraksi genom DNA dapat dilakukan dengan beberapa cara di antaranya dengan metoda Boil Cell Extraction (BCE). Pada proses BCE ini akan terjadi proses lisisnya dinding sel bakteri karena perubahan suhu yang terlalu ekstrim yaitu dari 100 oC menjadi -20 oC, sehingga protein pada dinding sel bakteri terdenaturasi dan mengkerut, kemudian sitoplasma dan komponen-komponen dalam sel akan keluar. (Marlina, 2008) Pada penggunaan mesin PCR dilakukan terlebih dahulu optimasi untuk pemakaian yang lebih ekonomis. Optimasi ini dilakukan dengan memperkecil jumlah enzim Taq DNA polymerase dan primer yang digunakan. Berbeda dengan penelitian sebelumnya yang menggunakan Perkin-Elmer, Cetus, USA dengan jumlah enzim Taq DNA polymerase yang digunakan sebanyak 1,0 µl dan primer masing-masing 2,0 µl, pada penelitian ini digunakan Mastercycler Gradient PCR (Eppendorf®) memakai enzim Taq DNA polymerase dan primer masing-masing 0,1 µl dan 1,0 µl. Hasil optimasi dapat dilihat pada pita DNA gel agarose dimana dengan pemakaian pereaksi yang lebih sedikit masih memperlihatkan penampakan pita yang jelas dan terang ( Marlina, 2008). Dalam proses elektroforesa di lakukan pada gel agarose 1 % dengan menggunakan TBE (Tris Base Acid EDTA) 1X pada tegangan 100 volt selama 20 menit. Selanjutnya dilakukan pewarnaan gel agarose yang telah dielektroforesa di dalam 0,5µl/ml larutan ethidium bromide selama 5-10 menit. Ethidium bromide adalah senyawa yang dapat berflouresensi di bawah sinar UV, sehingga dengan perendaman dengan ethidium bromide ini pita-pita DNA dapat terlihat di bawah alat pengamat DNA dan bisa difoto. Pada gambar 2 dan 3 dapat dilihat foto yang menggambarkan pita-pita DNA, dimana ukurannya dapat diketahui melalui perbandingan dengan ukuran pita-pita DNA standar yaitu “100 bp DNA ladder”. Ukuran pita DNA gen toxR V. parahaemolyticus adalah 368 bp, tdh 251 bp dan trh 250 bp.
44
SCIENTIA VOL. 5 NO. 1, FEBRUARI 2015
Kultur yang telah positif dan membentuk koloni berwarna ungu pada CHROMAgarTM Vibrio kadang tidak dapat dideteksi gen toxR nya, hal ini terjadi karena kemungkinan kultur tersebut telah terkontaminasi oleh spesies Vibrio lainnya. Hal ini sangat berpengaruh karena primer yang digunakan hanya bereaksi spesifik dengan DNA dari kultur V. parahaemolyticus saja atau karena DNA template yang digunakan sudah lama. Pada deteksi gen virulen didapatkan perbedaan antara sampel yang diperoleh langsung dari danau Singkarak dan yang diperoleh dari beberapa pasar tradisional di kota Padang, dimana sampel Singkarak, dari 20 kultur V. parahaemolyticus yang diamplifikasi PCR, diperoleh hasil tidak satupun kultur yang memiliki gen toxR, berbeda dengan yang diperoleh dari beberapa pasar tradisional di kota Padang, dari 20 kultur yang diuji didapatkan 10 kultur positif gen tox R, 7 kultur positif memiliki gen tdh dan tidak satupun positif gen trh. Hal ini dapat disebabkan karena kontaminasi dari lingkungan pasar, sehingga jumlah bakteri yang terdapat pada sampel menjadi bertambah.
Gambar 1. V. parahaemolyticus sampel C .moltkiana. Prime pada CHROMAgarTM Vibrio.
gen tdh memberikan reaksi hemolisis pada -hemolisis pada agar darah. Sedangkan gen trh memberikan reaksi yang negatif terhadap media blood agar yang dikenal dengan fenomena Kanagawa negatif.
Gambar 2. Gel agarose 1 % gen toxR hasil elektroforesa DNA (C. moltkiana. Prime). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa spesies pensi (C. moltkiana. Prime) mengandung 17,5 % gen tdh. Hal ini membuktikan bahwa pada sampel uji) mengandung gen virulen bakteri V. parahaemolyticus. Dari hasil yang diperoleh ini dapat dikatakan bahwa pensi (C. moltkiana. Prime) cukup memiliki resiko untuk dikonsumsi, apalagi dikonsumsi dalam jumlah yang banyak dan dalam keadaan tidak dimasak sempurna. Tetapi, kelompok kerang-kerangan ini aman dikonsumsi bila telah dimasak dengan sempurna. Karena pemanasan makanan pada suhu 100 oC dalam waktu singkat, atau pada suhu 60 oC selama 15 menit dapat membunuh bakteri V. parahaemolyticus. Hasil penelitian yang diperoleh ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada masyarakat untuk mengurangi resiko keracunan karena bakteri V. parahaemolyticus ini.
Gen tdh dan trh adalah gen yang bersifat virulen pada bakteri V. parahaemolyticus yang menyebabkan bakteri ini bersifat patogen. Gen tdh juga dapat diidentifikasi dengan menggunakan reaksi biokimia yaitu dengan test Kanagawa yang lebih dikenal dengan fenomena Kanagawa positif. Reaksi biokimia ini menggunakan media blood agar (Wagatsuma Agar) yang diperoleh dari eritrosit manusia yang bergolongan darah O atau darah kelinci, dimana ISSN : 2087-5045
45
SCIENTIA VOL. 5 NO. 1, FEBRUARI 2015
Gambar 3. Gel agarose 1 % gen tdh hasil elektroforesa DNA (C. moltkiana. Prime)
KESIMPULAN C. moltkiana. Prime yang diperoleh dari danau singkarak dan beberapa pasar tradisional di kota Padang, Sumatera Barat terdapat bakteri V. parahaemolyticus yang ditandai dengan adanya gen toxR. Empat puluh kultur murni pensi yang dideteksi memberikan hasil 10 kultur positif gen toxR, 7 kultur positif gen tdh dan tidak satupun kultur yang positif gen trh.
DAFTAR PUSTAKA Bhuiyan, N, Januari 2002. ”Prevalence of Pendemic Genotype of Vibrio parahaemolyticus in Dhaka, Bangladesh, and Significantce of its distribution across Different Serotype” Journal of Clinical Microbiology, Vol 40, P 284-286. Bonang, G., dan E.S. Koeswardono, 1979. Mikrobiologi Kedokteran untuk Laboratorium dan Klinik, Gramedia: Jakarta. CHROMAgarTM, 2003 “CHROMAgarTM Vibrio”, http:/chromagar.com/products Vibrio. Eugenia, M., V. Carlos, I. Elsa. 2004 “ Serologic and Molecular Characterization of Vibrio parahaemolyticus Strains Isolated from Seawater and Fish Product of the Gulf of Mexico”. Applied and Enviromental Microbiology, 70, 6401-6406.
ISSN : 2087-5045
Gopal, S., Otta, S., 2005 “The Occurrence of Vibrio Species in Tropical Shrimp Culture Enviroment ; Implication for Food Safety”. International Journal of Food Microbiology, 102, 151-159. Marlina, 2008. “ Identifikasi Bakteri Vibrio parahaemolyticus Dengan Metode Biolog dan Deteksi Gen ToxRnya secara PCR ”. Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi, 13 (1) : 349-354. Pennak, R. W., 1978. Freshwater Invertebrates of United States, 12nd ed, A Willey Intercine Publication: United State of America. Provenzano,D., DA. Scuhmacher, J.L Barker, and K.E Klose , 1999, ”The Virulence Regulatory Protein toxR Mediates Enhanced Bile Resistence in Vibrio Cholerae and other Pathogenic vibrio spesies”, Journal of Clinical Microbiology,12 ,758 – 763. Rinanda, Y. , 2008, “Penggunaan Metode MPNPCR(Most Probable Number-Polymerase Chain Reaction) Untuk Identifikasi Bakteri Vibrio parahaemolyticus dan Uji Sensitivitasnya Terhadap Beberapa Antibakteri”, Skripsi Sarjana Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Andalas, Padang. Schlegel, H.G., 1994. Mikrobiologi Umum, Edisi ke-6, diterjemahkan oleh Tedjo Baskoro,UGM Press : Yogyakarta. Su, Y, C. & Liu, C., 2007 “ Vibrio parahaemolyticus : A Concern of Seafood Safety”. International Journal of Food Microbiology, 24, 549-558. United State of America food and Drug Administration, 2001. Foorborne Phatogenic Microorganism and Natural toxins Handbook, center for foodsafety and Applied nutrition. Yuherman, 2000 “ Moleculer Characterization of Vibrio Species Isolated From Water Sea, Faculty of Food and Biotechnology“, University Putra Malaysa, Selangor, Malaysia. Yuwono, T., 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction, Andi: Yokyakarta,.
46
