Jurnal Matematika dan Sains Vol. 10 No. 1, Maret 2005, hal 31-36
Purifikasi Protein Fusi MBP-Mga Streptococcus pyogenes Hasil Ekspresi Heterolog di Escherichia coli Muhaimin1), Oei Ban Liang2,4), Enny Ratnaningsih2,4), Endang Purwantini3,4) dan Debbie Sofie Retnoningrum3,4) 1) Staf PengajarJurusan Kimia-FKIP Universitas Jambi 2) Staf PengajarJurusan Kimia-FMIPA Institut Teknologi Bandung 3) Staf PengajarJurusan Farmasi-FMIPA Institut Teknologi Bandung 4) Staf Peneliti Pusat Penelitian Antar Universitas Bioteknologi ITB Diterima Nopember 2004, disetujui untuk dipublikasikan Pebruari 2005 Abstrak Telah dilakukan optimasi proses pemurnian protein fusi MBP-Mga Streptococcus pyogenes dari Escherichia coli pMALMga rekombinan yang mengandung gen mga49. Pemurnian dilakukan menggunakan kolom kromatografi afinitas dengan ligan amilosa. Analisis SDS-PAGE menghasilkan pita tunggal pada ukuran 104 kDa menunjukkan protein fusi MBP-Mga murni. Kata kunci : Streptococcus pyogenes, gen mga49, protein fusi MBP-Mga Abstract Optimization of purification process of Streptococcus pyogenes’s MBP-Mga fusion protein from Escherichia coli pMALMga carrying mga49 gene had been carried out. The purification was conducted by using affinity chromatography column with amylose ligands. SDS-PAGE analysis gave a band at 104 kDa showing a pure MBPMga fusion protein. Key words : Streptococcus pyogenes, mga49 gene, MBP-Mga fusion protein pemurnian tidak efisien. Protein Mga merupakan biomolekul yang dapat dimurnikan dengan kromatografi afinitas, sebab teknik ini dapat digunakan untuk secara spesifik memisahkan biomolekul tertentu dari bahan biologis yang merupakan campuran kompleks, yang biasanya tidak mudah untuk dipisahkan dengan menggunakan metode-metode lain3). Pemurnian protein Mga menggunakan teknik kromatografi afinitas secara langsung tidak dapat dilakukan karena protein Mga ini tidak mempunyai ligan spesifik yang dapat mengikatnya. Dengan teknologi fusi protein dibuat protein fusi MBP-Mga yang terdiri dari protein Mga dan protein MBP yang diketahui dapat berikatan spesifik dengan maltosa4,5). Pembuatan protein fusi dilakukan pada tingkat DNA, dengan menggabungkan gen mga49 dan malE6,7). Tulisan ini melaporkan tentang cara memurnikan protein fusi MBP-Mga dengan teknik kromatografi afinitas. Tahap-tahap yang dilakukan meliputi tahap overproduksi protein MBP-Mga S. pyogenes dari E. coli pMALMga rekombinan, pemurnian protein fusi MBP-Mga dengan kromatografi afinitas, dan dilanjutkan karakterisasi dengan SDS-PAGE.
1. Pendahuluan Pemurnian enzim atau protein menggunakan teknik kromatografi afinitas pada saat ini sangat populer dan menjadi pilihan utama. Pemurnian ini dilakukan berdasarkan afinitas enzim atau protein terhadap biomolekul lain (ligan), misalnya enzim terhadap inhibitor, substrat atau produknya, afinitas antibodi terhadap antigennya, atau afinitas hormon terhadap reseptornya1,2,3). Pemurnian dengan teknik kromatografi afinitas disebut pemurnian satu tahap (one step purification). Prinsip kromatografi afinitas adalah pengikatan spesifik ligan dengan reseptor. Jadi, dalam kromatografi afinitas minimum harus ada dua senyawa yang berikatan spesifik2). Dalam proses pemurnian satu tahap menggunakan kromatografi afinitas diperlukan interaksi spesifik antara protein rekombinan dengan suatu ligan. Keterbatasan metode ini adalah protein rekombinan yang akan dimurnikan harus berinteraksi secara spesifik dengan suatu ligan. Jadi, jika tidak diketahui ligan yang dapat berinteraksi secara spesifik maka tidak dapat dilakukan pemurnian satu tahap. Keterbatasan ini sekarang dapat diatasi dengan adanya teknologi fusi protein3). Idenya adalah membuat suatu protein fusi yang terdiri dari protein yang akan dimurnikan dengan protein yang diketahui dapat berikatan spesifik dengan ligan tertentu. Pemurnian protein Mga yang dilakukan selama ini melalui banyak tahap, sehingga proses
2. Metode Penelitian 2.1. Overekspresi gen mga49 (pMALMga) 31
dalam E. coli
32
Bakteri E. coli yang mengandung plasmid pMALMga ditanam dalam medium LB (tripton 1% b/v, ekstrak ragi 0,5% b/v, NaCl 1% b/v dalam aquades) cair yang mengandung glukosa 0,2% b/v. Untuk overproduksi protein fusi MBP-Mga rekombinan, maka dilakukan induksi dengan penambahan 0,3 mM IPTG (Isopropil-β-Dtiogalaktosida) selama 2 jam. Sel dipanen dengan cara sentrifugasi, kemudian ditambah bufer sodiumtris-etilendiamintetraasetat (NaCl 5 M, EDTA 0,5 M, Tris-HCl 1 M), diresuspensi dan disentrifugasi kembali sebanyak dua kali. Pelet sel dilisis dengan sonikator, dan protein dipisahkan dari debris sel dengan cara sentrifugasi pada kecepatan tinggi. Protein yang diambil adalah protein yang berada dalam supernatan. 2.2. Pemurnian Protein Fusi MBP-Mga Pemurnian protein fusi MBP-Mga dilakukan dengan kromatografi afinitas menggunakan kolom resin amilosa. Protein Mga yang dihasilkan sebagai protein fusi dengan pengikat maltosa dimasukkan ke dalam kolom amilosa dan diinkubasi selama 1-2 jam. Hal ini bertujuan agar protein fusi dapat menempel pada ligan. Kolom kemudian dicuci dengan bufer (Tris.Cl 20 mM pH 7,4, NaCl 0,2 M, 2merkaptoetanol 10 mM, dan EDTA 1 mM) sebanyak 50 X volume kolom dan 100 X volume kolom, untuk menghilangkan kontaminan. Selanjutnya protein dilepaskan dari ligan dengan mengalirkan bufer elusi (Tris.Cl 20 mM pH 7,4, NaCl 0,2 M, 2merkaptoetanol 10 mM, EDTA 1 mM, dan maltosa 10 mM) ke dalam kolom. Setiap 1,5 ml hasil elusi ditampung sebagai fraksi-fraksi yang diamati dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 280 nm. 2.3. Karakterisasi protein dengan elektroforesis SDS-PAGE SDS PAGE yang digunakan adalah didasarkan atas sistem Laemmli3). SDS PAGE sistem Laemmli dilakukan dengan memakai empat komponen utama yaitu bufer elektroforesis, bufer sampel, separating gel dan stacking gel3). Pada penelitian ini yang digunakan adalah separating gel 12% (b/v), komposisinya adalah 2,5 ml Tris-HCl 1,5 M pH 8,8, 100 µl SDS 10% (b/v), 4 ml larutan akrilamid/bis-akrilamid stock 30% b/v, 50 µl amonium persulfat 10% (b/v), 5 µl TEMED, dan 3,35 ml akuades. Stacking gel 4,0% (b/v), komposisinya adalah 2,5 ml Tris-HCl 0,5 M pH 6,8, 100 µl SDS 10% (b/v), 1,33 ml larutan akrilamid/bis-akrilamid stock 30% b/v, 50 µl amonium persulfat 10% (b/v), 10 µl TEMED, dan 6,1 ml akuades. Separating gel 12% (b/v) sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam alat pencetak lempengan gel dari Mini Protean II Bio Rad pada bagian bawah, setelah separating gel mengeras dimasukkan stacking gel 4,0% (b/v) sebanyak 2 ml di atas separating gel, lalu pada stacking gel yang masih cair dimasukkan
JMS Vol. 10 No. 1, Maret 2005
sisir untuk membuat sumur. Sumur-sumur ini digunakan untuk memasukkan sampel protein yang akan dikarakterisasi pada gel. Gel yang telah dipersiapkan dimasukkan ke dalam alat elektroforesis. Kemudian bufer elektroforesis di masukkan dalam tangki. Larutan sampel dengan jumlah protein MBP-Mga sekitar 20 µg dicampur dengan 10 µl bufer sampel, dididihkan selama 5 menit untuk mendenaturasi protein dan didinginkan pada suhu kamar. Campuran ini dan protein penanda ukuran dimasukkan ke sumur-sumur gel pada alat elektroforesis sebanyak maksimum 20 µl. Elektroforesis dilakukan pada tegangan konstan 200 Volt selama 60 menit. Gel hasil elektroforesis diwarnai dengan larutan pewarna (staining). Gel hasil elektroforesis yang telah diwarnai dimasukkan ke dalam larutan destaining untuk menghilangkan warna pada gel yang tidak mengandung pita protein. Pita pada gel hasil elektroforesis tersebut didokumentasikan. 3. Hasil dan Diskusi Pemurnian protein ekstrak kasar dari E. coli pMALMga yang mengandung protein fusi MBP-Mga dilakukan beberapa kali untuk menentukan kondisi optimum dalam mendapatkan protein murni. Protein fusi MBP-Mga hasil overekspresi dimurnikan menggunakan teknik kromatografi afinitas dengan kolom resin amilosa. Penggunaan amilosa sebagai ligan dimungkinkan karena maltose binding protein (MBP) mampu berikatan secara spesifik dengan maltosa sebagai dimer pada amilosa. Pemurnian ini dilakukan pada kondisi pH 7,4, dengan bufer pencuci (Tris.Cl 20 mM pH 7,4, NaCl 0,2 M, 2merkaptoetanol 10 mM, dan EDTA 1 mM) dan bufer pengelusi (Tris.Cl 20 mM pH 7,4, NaCl 0,2 M, 2merkaptoetanol 10 mM, EDTA 1 mM, dan maltosa 10 mM). Pemurnian terhadap protein ekstrak kasar E. coli pMALMga hasil overekspresi dilakukan masingmasing 4 kali pengulangan untuk yang dicuci dengan bufer pencuci 100X volume kolom dan 4 kali pengulangan untuk yang dicuci dengan bufer pencuci 50X volume kolom. Dalam setiap proses pemurnian, setelah dicuci dengan bufer pencuci dilanjutkan dengan elusi menggunakan bufer pengelusi untuk mendapatkan protein fusi MBP-Mga murni. Pada penelitian ini bufer pengelusi mengandung maltosa. Maltosa ini berfungsi untuk memutuskan ikatan antara protein fusi MBP-Mga dengan amilosa. Jadi, maltosa ini dapat berkompetisi tempat dengan ligan terikat (amilosa), sehingga protein fusi MBP-Mga lepas dan selanjutnya keluar bersama eluen. Eluen hasil elusi ini ditampung sebagai fraksi-fraksi. Fraksi yang diambil setiap kali pemurnian adalah 10 fraksi, dengan volume tiap fraksi adalah 1,5 ml. Fraksi hasil elusi dimonitor dengan pengamatan absorbansi pada panjang gelombang 280 nm3). Hasil pengukuran serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dengan kolom resin amilosa yang
JMS Vol. 10 No. 1, Maret 2005
33
sebelumnya dicuci dengan bufer pencuci 100X volume kolom untuk 4 kali pengulangan ditunjukkan pada Gambar 1. Gambar 1.a adalah serapan fraksifraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,897 µg/ml); Gambar 1.b adalah serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein 0,285
0,3 0,25
0 ,45
0,39 5
0,4
0,231
Serapan (λ = 280 nm)
Serapan (λ = 280 nm)
ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,890 µg/ml); Gambar 1.c adalah serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,901 µg/ml); dan Gambar 1.d adalah serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,898 µg/ml).
0,217
0,2 0,15 0,1 0,05
0 ,35 0,3 0,231
0 ,25
0,217
0,2 0 ,15 0,1 0 ,05
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
1
2
3
4
Fr ak s i
(a)
8
9 10
0 ,3 0,21 3
0,22 1
0 ,2
0,385
0,4
0,35
Serapan (λ = 280 nm)
Serapan (λ = 280 nm)
7
0,45
0,381
0,25
6
(b)
0,45 0 ,4
5
Fr ak s i
0,15 0 ,1 0,05
0,35 0,3
0,276
0,25 0,223
0,2 0,15 0,1 0,05
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
Fr ak s i
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Fraksi
(c) (d) Gambar 1. Pengukuran serapan fraksi-fraksi protein fusi MBP-Mga pada panjang gelombang 280 nm, hasil pemurnian dengan kolom resin amilosa (dicuci dengan bufer pencuci 100X volume kolom) (a) Serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,897 µg/ml); (b) Serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,890 µg/ml); (c) Serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,901 µg/ml); dan (d) Serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,898 µg/ml). Hasil pengukuran serapan fraksi-fraksi protein MBPMga hasil pemurnian dengan kolom resin amilosa yang sebelumnya dicuci dengan bufer pencuci 50X volume kolom untuk 4 kali pengulangan ditunjukkan pada Gambar 2. Gambar 2.a adalah serapan fraksifraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,897 µg/ml); Gambar 2.b adalah serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein
ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,890 µg/ml); Gambar 2.c adalah serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,901 µg/ml); dan Gambar 2.d adalah serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,898 µg/ml).
34
JMS Vol. 10 No. 1, Maret 2005
0,4
0,4
0,357
0,35
0,316
0,3 0,246
0,25 0,2 0,15 0,1 0,05
Serapan (λ = 280 nm)
Serapan (λ = 280 nm)
0,35
0,376
0,3 0,244
0,25
0,217
0,2 0,15 0,1 0,05
0
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1
1
2
3
Frak s i
0,4 0,385
7
8
9 10
0,35 0,3 0,224
0,217
0,2
0,366
0,35
0,15 0,1 0,05
Serapan (λ = 280 nm)
Serapan (λ = 280 nm)
6
(b)
0,45
0,25
5
Frak s i
(a)
0,4
4
0,3 0,25
0,25 0,204
0,2 0,15 0,1 0,05 0
0 1 2
3 4 5
6 7
8 9 1
Frak s i
(c)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Frak s i
(d)
Gambar 2. Pengukuran serapan fraksi-fraksi protein fusi MBP-Mga pada panjang gelombang 280 nm, hasil pemurnian dengan kolom resin amilosa (dicuci dengan bufer pencuci 50X volume kolom) (a) Serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,897 µg/ml); (b) Serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,890 µg/ml); (c) Serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,901 µg/ml); dan (d) Serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,898 µg/ml). Protein fusi MBP-Mga hasil pemurnian yang dicuci dengan bufer pencuci 100X volume kolom terdapat pada fraksi ketiga sampai kelima, sedangkan protein fusi MBP-Mga hasil pemurnian yang dicuci dengan bufer pencuci 50X volume kolom terdapat pada fraksi ketiga sampai ketujuh. Munculnya puncak pada grafik serapan fraksi-fraksi protein fusi MBP-Mga hasil pemurnian tergantung pada bufer pengelusi. Jika bufer pengelusi kurang kuat untuk memutuskan ikatan antara ligan (amilosa) dengan protein fusi MBP-Mga, maka akan terjadi tailing, yaitu puncak yang melebar5. Selain itu, volume matriks juga mempengaruhi lebarnya puncak, karena ligan yang ada semakin banyak. Jadi, semakin besar volume matriks semakin lebar puncak serapan, sehingga protein MBP-Mga yang dihasilkan lebih banyak. Dari data hasil penelitian, diketahui bahwa
pemurnian protein fusi MBP-Mga dengan teknik kromatografi afinitas menggunakan kolom resin amilosa memberikan hasil yang reprodusibel. Analisis SDS-PAGE dilakukan untuk melihat hasil pemurnian dengan kolom resin amilosa. Protein yang digunakan sebagai pembanding terhadap protein MBP-Mga murni hasil pemurnian adalah protein marker, dan protein ekstrak kasar E. coli pMALMga yang diinduksi selama 2 jam dengan IPTG 0,3 mM dalam medium LB yang mengandung 0,2% glukosa. Elektroforegram sampel protein fusi MBP-Mga hasil pemurnian memberikan satu pita dengan massa molekul relatif sekitar 104 kDa, untuk yang dicuci dengan bufer pencuci 100X volume kolom (Gambar 3.b jalur 3). Sedangkan untuk yang dicuci dengan bufer pencuci 50X volume kolom masih ada sedikit kontaminan (Gambar 3.a jalur 1).
JMS Vol. 10 No. 1, Maret 2005
35
Gambar 3.b jalur 3 menunjukkan bahwa protein fusi MBP-Mga yang diperoleh melalui pemurnian dengan 1
2
teknik kromatografi afinitas cukup murni, karena memberikan satu pita pada 104 kDa.
3
1
2
200 kDa 116,3 kDa 97,4 kDa
104 kDa
3 104 kDa
66,3 kDa 55,4 kDa
36,3 kDa
31,0 kDa
(a)
(b)
Gambar 3. Elektroforegram protein fusi MBP-Mga yang dicuci dengan bufer pencuci 50X volume kolom (a), Elektro foregram protein fusi MBP-Mga yang dicuci dengan bufer pencuci 100X volume kolom (b). (a) 1 = Protein fusi MBP-Mga hasil pemurnian; 2 = Protein ekstrak kasar E. coli pMALMga yang diinduksi selama 2 jam dengan IPTG dalam medium LB + 0,2 % Glukosa; 3 = Protein marker, dan (b) 1 = Protein marker; 2 = Protein ekstrak kasar E. coli pMALMga yang diinduksi selama 2 jam dengan IPTG dalam medium LB + 0,2 % Glukosa; 3 = Protein fusi MBP-Mga hasil pemurnian. Perbandingan kadar protein ekstrak kasar E. coli pMALMga dan protein MBP-Mga murni hasil pemurnian yang menggunakan bufer pencuci 100X dan 50X volume kolom, dapat dilihat pada Tabel 1. Ternyata hasil pemurnian protein fusi MBP-Mga yang dicuci dengan bufer pencuci 100X dan 50X volume kolom memberikan kadar yang hampir sama, tetapi pemurnian protein fusi MBP-Mga yang dicuci dengan bufer pencuci 100X volume kolom memberikan hasil yang lebih murni, karena pada elektroforegram memberikan satu pita dengan massa molekul relatif sekitar 104 kDa (Gambar 3.b jalur 3). Protein Mga yang difusikan dengan protein MBP terdiri dari 533 asam amino dan pI 5,88 8). Tabel 1. Protein MBP-Mga hasil pemurnian setelah dicuci dengan bufer pencuci 100X dan 50X volume kolom Protein Kasar E. coli pMALMga (µg/ml)
1.897 1.890 1.901 1.898
Protein MBPMga murni [bufer pencuci 100X volume kolom] (µg/ml)
Protein MBPMga murni [bufer pencuci 50X volume kolom] (µg/ml)
232 286 273 306
322 283 277 274
Kesimpulan Protein fusi MBP-Mga telah berhasil dimurnikan menggunakan kromatografi afinitas dengan kolom resin amilosa pada kondisi pH 7,4 dengan bufer pencuci (Tris.Cl 20 mM pH 7,4, NaCl 0,2 M, 2-merkaptoetanol 10 mM, dan EDTA 1 mM) dan bufer pengelusi (Tris.Cl 20 mM pH 7,4, NaCl 0,2 M, 2-merkaptoetanol 10 mM, EDTA 1 mM, dan maltosa 10 mM). Proses pemurnian untuk protein fusi MBP-Mga yang dicuci dengan bufer pencuci 100X volume kolom memberikan hasil terbaik, hal ini dibuktikan oleh data analisis SDS-PAGE terhadap protein fusi MBP-Mga menunjukkan adanya pita tunggal dengan massa molekul relatif sekitar 104 kDa. Daftar Pustaka 1.
2.
3.
4.
5.
Simmonds, R.J., “Chemistry of Biomoleculer : An Introduction”, Royal Society of Chemistry, Cambridge, (1992). Hermanson, G.T., Mallia, A.K., & Smith, P.K., “Immobilized Affinity Ligand Techniques”, Academic Press, San Diego, (1992). Deutscher, M.P., “Method of Enzymology, Guide to Protein Purification”, Academic Press, Inc., San Diego, (1990). Kellerman, O.K., & Ferenci, T., “Maltose Binding Protein from E. coli”, Methods Enzymol., 90:1, 459 (1982). Duplay, P., Bedouelle, H., & Fowler, A., “Sequences of The malE Gene and of Its Product, The Maltose Binding Protein of
36
6.
7.
JMS Vol. 10 No. 1, Maret 2005
Escherichia coli”, J. Biol. Chem., 259:1, 10606 (1984). Guan, C., “Vectors that Facilitate the Expression and Purification of Foreign Peptides in E. coli by Fusion to Maltose Binding Protein”, Gene, 67:1, 21 (1987), Rhicharme, G., “Associative Properties of The Escherichia coli Galactose Binding Protein and
8.
Maltose Binding Protein”, Biochem. Biophys. Res. Comm., 105:1, 476 (1982). McIver, K.S., Thurman, A.S., & Scott, J.R., “Regulation of mga Transcription in the Group A Streptococcus: Spesific Binding of Mga within Its Own Promoter and Evidence for a Negative Regulator”, J. Bacteriol., 181:17, 5373 (1999).
