AMPLIFIKASI GEN PENYANDI ENDO-1,4-β-XILANASE ASAL ISOLAT 7 BAKTERI XILANOLITIK SISTEM ABDOMINAL RAYAP TANAH SKRIPSI

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

AMPLIFIKASI GEN PENYANDI ENDO-1,4-β-XILANASE ASAL ISOLAT 7 BAKTERI XILANOLITIK SISTEM ABDOMINAL RAYAP TANAH

SKRIPSI

AMALIAH LABIQAH

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA 2012

Skripsi

Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase Asal Isolat 7 Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah.

Amaliah Labiqah


AMPLIFIKASI GEN PENYANDI ENDO-1,4-β-XILANASE ASAL ISOLAT 7 BAKTERI XILANOLITIK SISTEM ABDOMINAL RAYAP TANAH

SKRIPSI

AMALIAH LABIQAH

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA 2012

Skripsi


Amaliah Labiqah


LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI

Judul

: Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase Asal Isolat 7 Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah

Penyusun

: Amaliah Labiqah

NIM

: 080810521

Pembimbing I

: Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si

Pembimbing II

: Dr. Sri Sumarsih, M.Si

Tanggal seminar : 16 Juli 2012

Disetujui oleh : Pembimbing I,

Pembimbing II,

Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si NIP. 19630615 198701 2 001

Dr. Sri Sumarsih, M.Si NIP. 19600110 198810 2 001

Mengetahui, Ketua Departemen Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga

Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA NIP 19671115 199102 2 001

iii Skripsi


Amaliah Labiqah


PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI

Skripsi ini tidak dipublikasikan, namun tersedia di perpustakaan dalam lingkungan Universitas Airlangga. Diperkenankan untuk dipakai sebagai referensi kepustakaan, tetapi pengutipan seijin penulis dan harus menyebutkan sumbernya sesuai kebiasaan ilmiah.

Dokumen skripsi ini merupakan hak milik Universitas Airlangga

iv Skripsi


Amaliah Labiqah


KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala limpahan rahmat serta karunia yang telah diberikan sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase Asal Isolat 7 Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap” dengan tepat waktu. Skripsi ini disusun dengan dukungan dan bantuan berbagai pihak. Oleh karena itu dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada : 1. Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si selaku dosen pembimbing I dan Dr. Sri Sumarsih, M.Si selaku dosen pembimbing II yang telah dengan sabar meluangkan waktu dan pikiran untuk memberikan bimbingan kepada penulis hingga skripsi ini dapat terselesaikan. 2. Drs. Ali Rohman selaku penguji proposal, Dr. Purkan, M.Si selaku dosen penguji skripsi dan Drs. Handoko Darmokoesoemo, DEA selaku dosen penguji skripsi sekaligus dosen wali yang telah memberikan masukan dan pengarahan kepada penulis. 3. A. A. Istri Ratnadewi S.Si, M.Si yang telah memberikan projek penelitian. 4. Seluruh staf pengajar program studi S1 Departemen Kimia Fakultas Sains dan Teknologi yang telah memberikan bekal ilmu yang semoga memberikan manfaat di kemudian hari. 5. Kedua orang penulis yang selalu memberikan kasih sayang, semangat dan do’a sehingga penulis mampu sampai pada tahap ini.

v Skripsi


Amaliah Labiqah


6. Kelompok peneliti Laboratorium Proteomik yang telah memberikan ilmu dan bimbingan di Laboratorium. 7. Teman-teman kelompok penelitian Biokimia dan teman-teman S1, S2 dan S3 Kimia Universitas Airlangga yang saling memberikan semangat, dukungan dan saran dalam proses penyusunan skripsi. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu kritik dan saran yang sifatnya membangun untuk menyempurnakan sangat diperlukan oleh penulis. Semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi penulis dan pembaca.

Surabaya, 30 Juli 2012 Penulis

Amaliah Labiqah

vi Skripsi


Amaliah Labiqah


Amaliah Labiqah, 2012, Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase Asal Isolat 7 Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah. Skripsi ini di bawah bimbingan Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si dan Dr. Sri Sumarsih, M.Si, Departemen Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya.

ABSTRAK

Enzim-enzim xilanolitik berperan penting dalam mengolah limbah-limbah pertanian yang sebagian besar mengandung hemiselulosa dengan xilan sebagai komponen utamanya. Salah satu enzim xilanolitik yang mampu mendegradasi xilan adalah enzim endo-1,4-β-xilanase. Pada penelitian ini dilakukan amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat 7 bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah. Amplifikasi dilakukan dengan metode PCR menggunakan sepasang primer forward dan primer reverse yang didesain masing-masing dengan nama endoF dan endoR. Hasil elektroforesis produk PCR menunjukkan gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dapat teramplifikasi dengan ukuran sekitar 0,5bp.

Kata kunci :bakteri xilanolitik, rayap tanah,endo-1,4-β-xilanase, amplifikasi, PCR

vii Skripsi


Amaliah Labiqah


Amaliah Labiqah, 2012, Amplification Gene Encoding Endo-1,4-β-xylanase From Xylanolytic Bacterial Isolate 7 of Soil Termite Abdominal System. Script is under the guidance of Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si and Dr. Sri Sumarsih, M.Si, Department of Chemistry, Faculty of Science and Technology, Airlangga University, Surabaya.

ABSTRACT

Xylanolytic enzymes play an important role in the processing of agricultural wastes which contain most of the hemicelluloses with xylan as its mainc omponent. Oneof enzyme that is able to degrade xylan is endo-1 ,4-β-xylanas enzyme. In this research the amplification of the gene encoding endo-1 ,4-βxylanase was isolated from xylanolytic bacterial isolates 7 of soil termite abdominal system. Performed by PCR amplification using the primer pair of forward and reverse primers designe drespectively by name endoF and EndoR. PCR product electrophoresis showed genes encoding endo-1,4-β-xylanase can be amplified in size about 0,5 bp.

Keywords : xilanolitic bacteria, soil termite, endo-1,4-β-xilanase, amplification, PCR

viii Skripsi


Amaliah Labiqah


DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL ....................................................................................... LEMBAR PERNYATAAN ............................................................................. LEMBAR PENGESAHAN ............................................................................. LEMBAR PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI ...................................... KATA PENGANTAR ...................................................................................... ABSTRAK................................................................................................ ........ ABSTRACT................................................................................................ ...... DAFTAR ISI ..................................................................................................... DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ DAFTAR LAMPIRAN............................................................................. ....... DAFTAR SINGKATAN ..................................................................................

i ii iii iv v vii viii ix xi xii xiii

BAB I PENDAHULUAN ................................................................................ 1.1 Latar Belakang Masalah .................................................................. 1.2 Rumusan Masalah ........................................................................... 1.3 Tujuan Penelitian............................................................................. 1.4 Manfaat Penelitian ...........................................................................

1 1 3 4 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................... 2.1 Rayap ............................................................................................... 2.2 Xilan ................................................................................................ 2.3 Enzim-enzim xilanase ..................................................................... 2.3.1 Enzim Ekso-xilanase ............................................................ 2.3.2 Enzim Endo-1,4-β-xilanase .................................................. 2.3.3 Enzim β-xilosidase ............................................................... 2.3.4 Enzim α-L-arabinofuranosidase ........................................... 2.4 Polimeration Chain Reaction ........................................................... 2.4.1 Langkah dan Komponen PCR ....................................... ..... 2.4.2 Desain Primer PCR .............................................................. 2.5 Analisis DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa ......................... 2.6 Sekuensing DNA .............................................................................. 2.7 Sequence Aligment dan Program BLAST ........................................

5 5 8 9 9 9 11 11 12 12 14 18 19 20

BAB III METODE PENELITIAN ................................................................. 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ......................................................... 3.2 Sampel, Bahan dan Alat Penelitian ................................................. 3.2.1 Sampel Penelitian ............................................................... 3.2.2 Bahan Penelitian .................................................................. 3.2.3 Alat Penelitian ..................................................................... 3.3 Prosedur Penelitian ......................................................................... 3.3.1 Pembuatan Media ................................................................ 3.3.1.1 Pembuatan LB cair .................................................. 3.3.1.2 Pembuatan LB padat ..............................................

22 22 22 22 22 23 23 23 23 23

ix Skripsi


Amaliah Labiqah


3.3.2 Peremajaan Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah Isolat 7 ...................................................................... 3.3.3 Isolasi DNA Kromosom ...................................................... 3.3.4 Analisis DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa ............. 3.3.5 Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase dengan Teknik PCR ......................................................................... 3.3.6 Purifikasi Produk PCR ....................................................... 3.3.7 Sekuensing Amplikon dengan Metode Sanger ................... 3.4 Skema Kerja .................................................................................... BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Isolasi DNA Kromosom Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah Isolat 7 ....................................................................... 4.2 Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase dengan Metode PCR ................................................................................................. 4.3 Purifikasi atau Pemurnian DNA Produk PCR................................. 4.4 Analisis Urutan Basa Nukleotida Gen Penyandi Endo-1,4-βxilanase Asal Isolat 7 Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah....................................................................................

24 24 25 26 27 27 28

29 31 41 42

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan....................................................................................... 44 5.2 Saran ................................................................................................. 44 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................. 45

x Skripsi


Amaliah Labiqah


DAFTAR GAMBAR

Nomor

Judul Gambar

Halaman

2.1

Rayap ..........................................................................................

6

2.2

Sistem enzimatis dan aspek metabolisme rayap .........................

7

2.3

Struktur xilan tumbuhan dan lokasi kerja enzim xilanolitik .......

9

2.4

Siklus PCR ..................................................................................

14

2.5

Peta plasmid pYES2 ....................................................................

18

4.1

Hasil elektroforesis DNA kromosom ...........................................

30

4.2

Hasil alignment Bacillus subtilis...............................................

32

4.3

Analisis primer forward (endoF) .................................................

34

4.4

Analisis primer reverse (endoR) ..................................................

35

4.5

Hasil alignment gen endo-1,4-β-xilanase GH 11 dari Bacillus subtillis dengan primer endoF dan primer endoR ................................. 36

4.6

Hasil elektroforesis PCR menggunakan primer endoF dan endoR.

38

4.7

Analisis primer forward dan primer reverse desain 2..................

39

4.8

Desain primer 2......................................................................

40

4.9

Hasil elektroforesis PCR menggunakan desain primer 2.............

41

4.10 Hasil elektroforesis amplikon PCR yang telah dimurnikan..........

42

xi Skripsi


Amaliah Labiqah


DAFTAR LAMPIRAN

Nomor

Judul Lampiran

Halaman

1

Pembuatan Larutan TE...............................................................

49

2

Pembuatan Larutan Lisosim .........................................................

49

3

Pembuatan Larutan STEP ............................................................

50

4

Pembuatan Na-Asetat 3 M ...........................................................

50

5

Electropherogram hasil sekuensing .............................................

50

xii Skripsi


Amaliah Labiqah


DAFTAR SINGKATAN

bp

: base pair

ddH2O

: double destilateH2O

DNA

: Deoxyribo Nucleic Acid

dNTP

: deoksiribonukleotida

EtBr

: Etidium Bromide

GH

:Glikosida Hidrolase

STEP

: SDS-TrisCl-EDTA-Proteinase K

LB

: Luria Bertani

TAE

: Tris base-Asam Asetat-EDTA

TE

: Tris Cl, EDTA

Tm

: Melting Temperature

PCR

: Polimeration Chain Reaction

RNA

: Ribo Nucleic Acid

xiii Skripsi


Amaliah Labiqah


1

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Negara Indonesia memiliki kekayaan alam yang berlimpah, termasuk sektor agroindustri. Produk dari sektor agroindustri menghasilkan limbah-limbah pertanian yang diakumulasikan kurang baik di lingkungan dan terbuang sebagai sampah. Limbah-limbah tersebut diantaranya adalah tongkol jagung, ampas tebu, dedak padi dan jerami yang memiliki kandungan hemiselulosa. Komponen penyusun hemiselulosa berdasarkan monomer penyusun gulanya terbagi menjadi xilan, arabinan, manan dan arabinogalaktan (Beg et al, 2001). Jika dihidrolisis, hemiselulosa memiliki potensi untuk menghasilkan produk yang bermanfaat. Xilan merupakan komponen utama penyusun hemiselulosa yang bisa dihidrolisis menjadi xilosa dan xilooligosakarida. Hidrolisis xilan dilakukan dengan bantuan biokatalis enzim yaitu enzim xilanase. Kelompok utama enzim xilanase yang memutus ikatan glikosidik pada xilan terbagi menjadi endo-1,4-β-xilanase dan βxilosidase (Girio et al, 2010). Endo-1,4-β-xilanase berfungsi untuk memutus ikatan β-1,4 pada rantai utama xilan menjadi xilooligosakarida. Sedangkan βxilosidase menghidrolisis xilooligosakarida menjadi xilosa. Pemanfaatan enzim endo-xilanase dalam dunia industri diantaranya adalah untuk industri makanan, farmasi, kertas, prebiotik serta bahan bakar yang dapat diperbaharui (Sriyapai et al, 2010).

1 Skripsi


Amaliah Labiqah


2

Enzim endo-xilanase telah diisolasi dan dikarakterisasi dari bermacam mikroorganisme termasuk bakteri, ragi dan jamur berfilamen (Zhang et al, 2009). Salah satu jenis organisme di alam yang melakukan aktivitas pendegradasi endoxilanase adalah rayap yang mendegradasi hemiselulosa dengan enzim xilanolitik dari tubuh rayap itu sendiri atau oleh mikroorganisme yang bersimbiosis dengan rayap (Purwadaria et al, 2004; Faulet et al, 2006). Tarumingkeng (1971), menyebutkan bahwa protozoa flagellata atau bakteri dalam intestin rayap menghasilkan enzim-enzim untuk membantu rayap memanfaatkan selulosa dalam sistem pencernaannya. Protozoa flagellata dalam intestin bagian belakang dari berbagai jenis rayap (terutama rayap tingkat rendah seperti Mastotermitidae, Kalotermitidae, dan Rhinotermitidae) berperan sebagai simbion untuk memecah selulosa sehingga dapat dicerna dan diserap oleh rayap. Ratnadewi dkk. (2007), telah melakukan penelitian tentang isolasi, purifikasi serta karakterisasi untuk mendapatkan enzim endo-xilanase dari bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah yang disebut sebagai isolat 7 dan telah diidentifikasi secara mikrobiologis memiliki homologi dengan Bacillus subtillis. Bacillus subtillis merupakan bakteri penghasil enzim endo-xilanase GH11. Pokok riset saat ini telah mengarah pada kebutuhan akan suatu isolat dan identifikasi organisme yang merupakan penghasil utama (hyper-producer) sebagai produsen enzim xilanolitik baru. Berhubungan dengan hal tersebut penelitian yang banyak dikembangkan diantaranya amplifikasi gen, kloning, karakterisasi dan ekspresi. Amplifikasi merupakan proses pengambilan gen tertentu dari suatu DNA kromosom yang dilakukan secara in vitro melalui teknik PCR (Brown, 2001).

Skripsi


Amaliah Labiqah


3

Amplifikasi gen, dapat memperkaya sekuens fragmen gen DNA secara berlimpah dan dapat digunakan untuk memperkuat gen spesifik sebelum diklon. Cara kerja dari amplifikasi menggunakan teknologi PCR sangat spesifik. PCR membutuhkan suatu primer spesifik yang akan membantu DNA polimerase menambahkan basa nukleotida pada DNA cetakan sehingga fragmen DNA dapat diperbanyak dengan proses yang sangat cepat. Pada penelitian ini dilakukan amplifikasi gen penyandi endo-1,4-βxilanase yang berasal dari bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah isolat 7. Gen endo-1,4-β-xilanase diamplifikasi dengan metode PCR menggunakan sepasang primer yang akan didesain berdasarkan urutan basa nukleotida gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal Bacillus subtilis GH 11 dari Genbank. Primer untuk mengamplifikasi gen penyandi enzim endoxilanase yaitu endoF untuk primer forward dan endoR untuk primer reverse. Hasil amplifikasi PCR ini kemudian dianalisis urutan basa nukleotida penyusunnya dengan melakukan sekuensing.

1.2 RumusanMasalah Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan maka dapat dirumuskan masalah penelitian : apakah gen penyandi endo-xilanase dari bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah isolat 7 dapat diamplifikasi dengan metode PCR?

Skripsi


Amaliah Labiqah


4

1.3 Tujuan Penelitian Berdasarkan latar belakang masalah dan rumusan masalah yang telah dikemukakan, maka tujuan dari penelitian ini adalah mengamplifikasi gen penyandi endo-xilanase dari bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah isolat 7 dengan metode PCR.

1.4 Manfaat Penelitian Manfaat penelitian ini yaitu memberikan informasi ilmiah mengenai proses amplifikasi dan urutan sekuens gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dari bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah isolat 7. Untuk selanjutnya dapat dikembangakan penelitian yang bebabasis kloning dan ekspresi gen penyandi enzim endo-xilanase.

Skripsi


Amaliah Labiqah


5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Rayap Rayap merupakan serangga pemakan selulosa yang berukuran sedang, merupakan ordo Isoptera yang terdiri dari kira-kira 1900 jenis di dunia.Rayap hidup dalam kelompok-kelompok yang terpadu.Walaupun rayap secara populer disebut sebagai semut putih, rayap bukanlah semut.Rayap paling erat kekerabatannya dengan kecoak. Rayap bertubuh lunak dan berwarna putih, sayap depan dan belakang sama ukurannya dan diletakkan datar di atas abdomen saat tidur.Rayap seringkali membersihkan satu sama lain dengan bagian mulut mereka sebagai satu akibat dari daya tarik sekresi yang biasanya dapat diperoleh pada tubuhnya. Makanan rayap terdiri dari kupasan kulit dan tinja individu-individu lain, tumbuhan, kayu-kayuan dan bahan-bahan lain yang mengandung selulosa.Semula agak mengherankan para pakar bahwa rayap mampu mencerna selulosa karena manusia sendiri tidak mampu mencernakan selulosa, sedangkan rayap mampu melumatkan dan menyerapnya sehingga sebagian besar hanya tinggal lignin saja. Keadaan menjadi jelas setelah ditemukan berbagai protozoa flagellata dalam usus bagian belakang dari berbagai jenis rayap (terutama rayap tingkat rendah: Mastotermitidae, Kalotermitidae dan Rhinotermitidae), yang ternyata berperan sebagai simbion untuk melumatkan selulosa sehingga rayap mampu mencernakan dan menyerap selulosa. Bagi yang tak memiliki protozoa seperti famili Termitidae, bukan protozoa yang berperan tetapi bakteri dan bahkan

5 Skripsi


Amaliah Labiqah


6

pada beberapa jenis rayap seperti Macrotermes, Odontotermes dan Microtermes memerlukan bantuan jamur perombak kayu (Tarumingkeng, 2001). Klasifikasi dari rayap adalah sebagai berikut

Gambar 2.1 Rayap (Wikipedia, 2011) Domain

: Eukariota

Kerajaan

: Animalia

Sub Kerajaan : Metazoan Filum

: Artropoda

Kelas

: Serangga

Ordo

: Isoptera

Famili

: Mastotermitidae Kalotermitidae Termopsidae Hodotermitidae Rhinotermitidae Serritermitidae Termitid

Skripsi


Amaliah Labiqah


7

Adapun sistem enzimatis dan aspek metabolisme dalam tubuh rayap ditunjukkan pada Gambar2.2 berikut. Perut bagian utama

Hidrogenosom

Perut bagian tengah (endoglukanase, sellobiase)

Bakteri metanogeni k

CO2, H2, asetil Piruvat Ko-A Glukosa

Selulosa native

Kelenjar saliva (endoglukanase, sellobiase) Selulosa

Bakteri pereduksi CO2 asetogenik

Asetat Asetat

As. Org. asetat Lingkungan anaerobik

Selulase Mono-,di-, & oligosakarida

Bakteri fermentatif

Asam amino

Bakteri fiksasi N2 heterotrofik

Pakan prectodeal Bakteri fakultatif & obligat anaerob

Flagellata anaerob

Gambar 2.2. Sistem enzimatis dan aspek metabolisme rayap (Radek, 1999) Berdasarkan lokasi sarang utamanya, rayap digolongkan menjadi sebagai berikut (Tarumingkeng, 2001) : a. Rayap pohon, yaitu jenis-jenis rayap yang menyerang pohon yang masih hidup, bersarang dalam pohon dan tak berhubungan dengan tanah, misalnya Neotermes tectonae (Kalotermitidae) yang merupakan hama pohon jati. b. Rayap kayu lembab, yaitu rayap yang menyerang kayu mati dan lembab, bersarang dalam kayu, tak berhubungan dengan tanah, misalnya jenis-jenis rayap genus Glyptotermes spp. (Kalotermitidae). c. Rayap subterranean, yaitu rayap yang umumnya hidup di dalam tanah yang mengandung banyak bahan kayu yang telah mati atau membusuk, serta tunggak pohon baik yang telah mati maupun masih hidup.

Skripsi


Amaliah Labiqah


8

d. Rayap kayu kering, yaitu rayap yang hidup dalam kayu mati yang telah mengering dengan sarang yang tidak berhubungan dengan tanah karena habitatnya yang kering, misalnya Cryptotermes sp (Kalotermitidae). e. Rayap tanah, yaitu rayap yang bersarang dalam tanah terutama dekat bahanorganik yang mengandung selulosa seperti kayu, serasah, dan humus, misalnya yang terdapat di Indonesia adalah famili Termitidae.

2.2 Xilan Xilan merupakan komponen utama dari hemiselulosa pada dinding sel tanaman yang terikat kovalen dan non-kovalen pada selulosa, lignin, pektin dan polisakarida lainnya untuk membentuk dinding sel (Zhou et al.,2008). Xilan adalah suatu polimer dengan rantai tulang punggung homopolimer unit-unit residu β-1,4 D-xilopiranosa yang disubtitusi oleh O-asetil, α-L-arabinofuranosil, dan kelompok glukoronosil (Cheng et al,2008). Keberadaan xilan yang bersifat dapat diperbaharui ini sangat berlimpah, terutama pada limbah pertanian, sehingga mempunyai potensi yang sangat besar untuk diuraikan menjadi produk akhir yang berguna (Puspaningsih, 2005).Untuk menghasilkan produk yang berguna, diperlukan hidrolisis xilan.Hidrolisis xilan dengan enzim membutuhkan enzimenzim pendegradasi xilan.Enzim-enzim pendegradasi xilan disebut enzimxilanase. Berikut struktur xilan pada tumbuhan beserta lokasi kerja enzim-enzim xilanolitik yang membantu hidrolisis xilan

Skripsi


Amaliah Labiqah


9

Gambar 2.3 Struktur xilan tumbuhan dan lokasi kerja enzim xilanase(Beg et al, 2001) 2.3 Enzim-enzim Xilanase 2.3.1

Enzim Ekso-xilanase Eksoxilanase adalah enzim yang mengkatalisis hidrolisis ikatan β-1,4-D-

xilosa pada kerangka utama xilan untuk menghasilkan xilobiosa pada heteroarabinoxilan (Saha, 2003). Enzim ini mampu memutus rantai polimer xilosa pada ujung non pereduksi, sehingga menghasilkan xilan sebagai produk utama dan sejumlah oligosakarida rantai pendek (Richana, 2002). 2.3.2

Enzim Endo-1,4-β-xilanase Endo-1,4-β-xilanase pada awalnya telah dilaporkan sebagai pentosanase

yang selanjutnya diperkenalkan oleh International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) pada tahun 1961 dengan kode EC 3.2.1.8. Endo-1,4-

Skripsi


Amaliah Labiqah


10

β-D-xilanase sering disebut sebagai xilanase, endoxilanase, 1,4-β-D-xilanxilanohidrolase, β-1,4-xilanase dan β-xilanase (Ratnadewi,2007).Endo-1,4-βxilanase dapat dihasilkan oleh bakteri, fungi, actinomycetes dan beberapa lainnya dihasilkan oleh tumbuhan dan hewan. Berdasarkan homologi asam amino sekuens dan analisis ikatan hidrofobik endo-1,4-β-xilanase digolongkan ke dalam 2 famili glikosil hidrolase (GHF) yaitu GH 10 dan GH 11. GHF 10 dapat ditemukan pada tanaman, fungi, dan bakterial enzim.GHF 11dapat ditemukan pada fungi dan bacterial enzim (Zhou et al,2008). Berdasarkan massa molekul dan titik isoelektrik (pI), famili 10 memiliki massa molekul yang tinggi (>30 kDa) dan pI yang rendah, sedangkan famili 11 memiliki massa molekul yang rendah (<30 kDa) dan pI yang tinggi (Sriyapai et al,2011). Perbedaan sifat katalitik dari kedua famili tersebut adalah famili 10 mampu menyerang ikatan glikosidik di sebelah titik cabang dan mengarah ke ujung non-pereduksi dengan menggunakan dua residu xilopiranosil non-substitusi antara cabang-cabang, sedangkan famili 11 menggunakan tiga residu xilopiranosil non-substitusi (Puspaningsih, 2005). Enzim xilanase merupakan kompleks enzim yang memiliki kemampuan menghidrolisis xilan atau polimer dari xilosa dan xilooligosakarida. Oleh karena fungsinya tersebut, enzim xilanase dimasukkan dalam golongan hidrolase. Potensi dari aplikasi xilanase saat ini menjadi perhatian utama bagi para peneliti. Pada pembuatan kertas dan pulp, xilanase digunakan untuk proses bleaching. Xilanase membuat pulp kertas dengan menghidrolisis xilan dan melepaskan lignin sehingga mengurangi

penggunaan

Klorin

sebagai

agen

bleaching

(Mishra

and

Thakur,2011).Jika xilanase dikombinasikan dengan pektinase, bisa menjadi

Skripsi


Amaliah Labiqah


11

alternatifideal untuk mengurangi polusi degradasi alkalin di alam untuk memproduksi serat dengan kualitas yang baik (Huang et al., 2006).Xilanase dalam industri makanan banyak digunakan untuk pengembang roti, penjernihan jus, ekstraksi kopi, minyak nabati dan pati. Industrilain yang banyak memanfaatkan penggunaan xilanase yaitu industri farmasi, pakan ternak dan pasta gigi. 2.3.3 Enzim β-xilosidase Enzim ini diproduksi oleh bermacam-macam bakteri dan fungi, dan mungkin juga ditemukan di kulturfluid (Coughlan et al., 1992).Berdasarkan persamaan runtunan N-terminalnya, maka enzim β-xilosidase dapat digolongkan ke dalam famili glikosida hidrolase 10, 3, 39, 43, 52, dan 54 (Henrisat et al., 2003). Enzim ini berfungsi untuk menghidrolisis 1,4- β-D-xilooligosakarida dari ujung non-pereduksi dan melepaskan xilosa. Selain itu enzim β-xilosidase juga mempunyai aktivitas transferase, sebagai tambahan terhadap proses hidrolisis secara langsungdan menunjukkan kekhususan untuk gula dan ikatan. 2.3.4 Enzim α-L-arabinofuranosidase Corral

et

al

(2006)

menyebutkan

ada

dua

tipe

enzim

α-L-

arabinofuranosidaseyaitu : a. α-L-arabinofuranosidase tipe ekso (EC 3.2.1.55) yang menunjukkan aktivitas hidrolisisnya terhadap p-nitrofenil- α-L-arabinofuranosida dan arabinan yang bercabang. b. α-L-arabinofuranosidase tipe endo (EC 3.2.1.99) yang hanya dapat menghidrolisis arabinan yang linear dan tidak menunjukkan aktivitasnya terhadap p-nitrofenil- α-L-arabinofuranosida.

Skripsi


Amaliah Labiqah


12

Enzim α-L-arabinofuranosidase mempunyai fungsi untuk menghidrolisis ujung non-pereduksi

antara

ikatan

α-L-arabinofuranosidase

dengan

berbagai

polisakarida yang mengandung arabinofuranosidase(Debche et al., 2002). Polisakarida yang mengandung arabinofuranosidase yaitu seperti arabinoxilan, arabinogalaktan, dan L-arabinan. Aktivitas enzim endo-xilanase dan β-xilosidase dapat dihambat oleh adanya subtituen α-L-arabinofuranosidase karena struktur αL-arabinofuranosidase yang cukup besar yang menyebabkan halangan ruang bagi aktivitas enzim endo-xilanase dan β-xilosidase (Debche et al., 2002; Shallom et al.,

2002).

α-L-arabinofuranosidaseyang

belum

melalui

proses

pemurniandiketahui mempunyai berat molekul yang berkisar antara 53-495 kDa dan nilai pI beravariasi antara 3,6 sampai 9,3 serta pH optimum sekitar 2,5 sampai 6,9 (Corral et al, 2006).

2.4 Polimeration Chain Reaction (PCR) 2.4.1 Langkah dan Komponen PCR PCR adalah suatu metode untuk melipatgandakan suatu pita DNA secara in vitro.Metode PCR dikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1986. Yuwono (2006) mengemukakanempat komponen utama pada proses PCR yaitu : (1) DNA cetakan yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan, (2) oligonukleotida primer yang digunakan untuk mengawali sintesis DNA, (3) deoksiribonukleotida (dNTP), dan (4) enzim polimerase yang melakukan katalis. Reaksi pelipatgandaan DNA dimulai dengan denaturasi DNA cetakan sehingga

Skripsi

rantai

DNA

untai

gandaakan

terpisah

menjadi


DNA

untai

Amaliah Labiqah


13

tunggal.DNAuntai ganda didenaturasi oleh pemanasan pada reaksi dengan suhu 90°-95˚C selama 5 menit (Irawan, 2008). Untuk proses pengkopian DNA, reaksi campuran diturunkan ke dalam suhu 50-60 °C yang disebut sebagaiproses penempelan atau annealing. Pada proses annealing, primer akan membentuk jembatan hidrogen dengan cetakan pada daerah sekuens yang komplementer dengan sekuens primer. Dalam proses annealing, pemilihan suhu yang tepat adalah hal yang kritis. Setiap sistem PCR harus dilakukan secara optimal. Jika tidak demikian bisa jadi mengangkat DNA lain ke dalam DNA spesifik atau bisa jadi tidak memproduksi produk amplifikasi secara keseluruhan (Walker and Rapley,2009). Amplifikasi gen pada dasarnya akan lebih efisien jika dilakukan pada suhu yang rendah, tetapi biasanya akan terjadi mispriming yaitu penempelan primer pada cetakan yang salah (Yuwono,2006). Pada suhu yang lebih tinggi, spesifitas reaksi amplifikasi akan meningkat, tetapi secara keseluruhan efisiensinya akan menurun. Setelah dilakukan annealing,suhu dinaikkan 72°C.Pada suhu ini DNA polimerase akan melakukan polimerasi rantai DNA yang baru berdasarkan informasi pada DNA cetakan.Setelah terjadi polimerasi, rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan hidrogen dengan DNA cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk dengan adanya ikatan rantai hidrogen antara rantai DNA cetakan dengan rantai DNA baru hasil polimerasi selanjutnya akan didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu inkubasi menjadi 95°C, rantai DNA yang baru selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerasi selanjutnya. Reaksi diulang 30-40 siklus sehingga pada akhir siklus akan didapatkan molekul DNA rantai ganda baru hasil polimerasi dalam jumlah yang

Skripsi


Amaliah Labiqah


14

jauh lebih banyak dibandingkan jumlah cetakanyang digunakan.Yuwono (2006) menyebutkan beberapa aplikasi PCR dalam kehidupan yaitu untuk amplifikasi DNA genom, menghitung jumlah mRNA, analisis sidik jari DNA, probe DNA.

Gambar 2.4 Siklus PCR (Brown,2010) 2.4.2

Desain Primer PCR Kunci dari PCR terletak pada desain dua oligonukleotida primer. Fungsi

dari primer yaitu mengapit atau membatasi sekuens DNA yang akan diamplifikasi. Tanpa adanya primer, reaksi polimerasi DNA tidak akan terjadi

Skripsi


Amaliah Labiqah


15

meskipun enzim dan komponen DNA lainnya sudah tersedia. Primer yang digunakan dalam amplifikasi umumnya terdiri dari dua jenis primer, yaitu primer forward dan primer reverse. Kualitas primer sangat mempengaruhi keberhasilan pada saat PCR, untuk itu dalam mendesain primer ada beberapa parameter yang digunakan. Berikut beberapa hal yang perlu diperhatikan dalammendesain primer: 1) Panjang Primer Panjang primer optimum antara 20-30 bp, Jika primer terlalu pendek primer

dapat

melekat

pada

banyak

tempat

sepanjang

DNA

cetakan.Sebaliknya, jika primer terlalu panjang, dapat menyebabkan kegagalan replikasi. 2) Melting Temperature (Tm) Suhu annealing dari PCR didasarkan pada Melting Temperatur (Tm) dari primer.Suhu leleh atau melting temperature (Tm) adalah temperatur dimana setengah dari duplex DNA akan terpisah menjadi utas tunggal. Agar primer dapat menempel ke dalam cetakan, temperatur annealing harus memenuhi Tm primer.Hasil terbaik biasanya diperoleh jika primer memiliki 60-70 °C (White, 1997).Primer dengan nilai Tm tinggi, bisa jadi primer tidak menempel ke dalam DNA target. Sedangkan jika terlalu rendah, primer akan mengalami mis-annealke sekuens yang tidak komplemen. Nilai Tm primer bisa dihitung dengan formula Tm = 2(A+T) + 4(G+C).Sepasang

Skripsi

primer

harus

memiliki

Tm

yang


nilainya

Amaliah Labiqah


16

berdekatan.Jika selisihnya lebih dari 5 °C maka bisa menyebabkan tidak terjadinya amplifikasi. 3) GC Content GC content (prosentase jumlah G dan C terhadap jumlah basa total pada primer) harus berkisar antara 50% G/C dan 50% A/T 4) GC Clamp Ketika mendesain primer biasanya kita memilih primer yang memiliki G atau C pada posisi terakhir ujung 3′, karena bisa meningkatkan ikatan spesifik pada ujung 3′ karena seperti kita tahu ikatan G atau C lebih kuat. Namun perlu dihindari lebih dari 3 basa G atau C pada 5 basa terakhir ujung 3′ karena ujung 3′-nya bisa melipat membentuk GC clamp yang mengakibatkan ujung 3′ primer tidak terikat pada cetakan. 5) Struktur Sekunder Primer Struktur sekunder primer dapat disebabkan oleh interaksi intra dan intermolekuler primer. Hal ini juga amat mempengaruhi kualitas dan kuantitas produk PCR, karena akan mengurangi kemampuan primer menempel pada cetakan. Berikut ini beberapa jenis struktur sekunder primer: i)

Hairpin Hairpins terbentuk akibat interaksi intramolekuler primer sehingga membentuk semacam lipatan

Skripsi


Amaliah Labiqah


17

Self Dimer

ii)

Self dimer terbentuk oleh interaksi intermolekuler antara dua molekul primer yang sama, dimana primer homolog terhadap dirinya sendiri. Biasanya kita menambahkan primer dalam jumlah besar dibanding jumlah DNA cetakan, dan ketika primer lebih suka membentuk dimer intermolekuler ketimbang berhibridisasi dengan DNA cetakan, maka yield produk tentu akan berkurang. iii)

Cross Dimer

Primer cross dimer terbentuk karena interaksi intermolekuler antara primer sense dan antisense, dimana keduanya memiliki homologi. 6) Runs Runsmerupakanpengulangan satu jenis basa. Runs juga harus dihindari karena dapat menyebabkan mispriming. Jumlah maksimum run yang dapat diterima adalah 4 basa. Pada desain primer basa nukleotida yang diambil juga bisa ditambahkan sisi restriksi sehingga produk PCR yang dihasilkan bisa dimasukkan atau diinsersikan ke dalam suatu plasmid. Urutan sisi pengenal enzim restriksi yang ditambahkan

Skripsi


Amaliah Labiqah


18

adalah sisi pengenal enzim restriksi yang terdapat pada multiple cloning side (MCS) pada vektor plasmid yang diinginkan dan tidak terdapat pada hasil aligment daerah lestari yang diambil primernya. Pada penelitian ini akan ditambahkan urutan sisi pengenal enzim restriksi yang terdapat pada plasmid pYES2. Berikut peta plasmid pYES2 pada Gambar 2.5

Gambar 2.5 Peta Plamid pYES2

2.5 Analisis DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa Elektroforesismerupakan

suatu

metode

yang

digunakan

untuk

menganalisis DNA.Gel yang digunakan tersusun atas agarosa atau poliakrilamida. Agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA yang ukurannya

Skripsi


Amaliah Labiqah


19

mempunyai rentang beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa.Sedangkan poliakrilamida digunakan untuk fragmen-fragmen DNA yang lebih kecil.Gel agarosa merupakan jaring-jaring kompleks molekul polimer. Molekul DNA yang bermuatan negatif bergerak melalui gel dengan kecepatan yang berbeda sesuai ukuran. Elektroforesis gel agarosa seringkali dilaksanakan dengan menggunakan fragmen-fragmen DNA penanda yang ukurannya sudah diketahui sehingga memungkinkan ditentukannya ukuran DNA dengan cara interpolasi. Pita-pita DNA dalam gel terwarnai dengan zat warna etidium bromida.Pita DNA dapat dilihat dengan bantuan sinar UV (Old and Primrose, 1989). Beberapa faktor yang mempengaruhi perpindahan DNA dalam gel agarosa yaitu ukuran DNA, konsentrasi agarosa, konformasi DNA, besarnya voltase yang digunakan, arah medan listrik, suhu dan komposisi basa, komposisi buffer elektroforesis(Sambrooket al, 1989).

2.6 Sekuensing DNA Sekuensing

DNA merupakan metode yang digunakan untuk membaca

urutan nukleotida pada molekul DNA yang ditentukan. Ada dua metode yang digunakan dalam DNA sekuensing yaitu secara enzimatik (pengakhiran rantai) oleh F. Sanger dan A.R. Coulsan dan cara degradasi kimiawi oleh A. Maxam dan W. Gilbert (Brown, 2005 ;Smith and Wood, 1991). Langkah pertama pada eksperimen dengan metode enzimatik dikatalis oleh fragmen Klenov DNA polimerase I. primer bergabung dengan vektor pada posisi yang berdekatan dengan poli penghubung. Reaksi sintesis untai DNA

Skripsi


Amaliah Labiqah


20

komplementer dimulai dengan penambahan polimerase Klenow dan masingmasing dari keempat deoksinukleotid (dATP, dTTP, dGTP,dCTP).Masing-masing dATP, dTTP, dGTP,dCTPbersama dengan dNTP membentuk suatu untai DNA dengan bantuan DNA polimerase dan primer. Dari reaksi tersebut fragmen yang kesemuanya berakhir dengan satu macam basa dideoksiribosa dibagian ujung karena basa ini tidak bisa membentuk ikatan fosfodiester. Fragmen-fragmen yang terbentuk dianalisis dengan elektroforesis gel poliakrilamid. Satu lajur hanya bermakna satu basa nukleotida. Metode kedua yaitu metode sekuensing secara degradasi kimiawi dengan menggunakan piperidin, dimetil sulfat dan hidrazin yang secara selektif menyerang purin dan pirimidin sehingga menghasilkan fragmen-fragmen.Dalam proses reaksi tersebut, dimetil sulfat dan piperidina memotong guanin (G), sedangkan Dimetilsulfat dan Piperidina dalam Asam format akanmemotong kedua Guanin (G) dan Adenin (A). Demikian pula, hidrazin dan piperidina akan memotong kedua Timin dan Sitosin sedangkan hidrazin dan piperidina dalam NaClmemotong Sitosin (C). DNA target sebelumnya dilabeli dengan radioaktif dan dapat dianalisis melalui autidiograf. Jika fragmen diidentifikasi melalui elektroforesis gel poliakrilamid akan membentuk empat jalur yaitu jalur 1 basa G, jalur 2 basa G dan A, jalur 3 basa T dan C dan jalur 4 basa C.

2.7 Sequence Aligment dan Program BLAST Suatu proses penyusunan atau pengaturan dua atau lebih sekuens sehingga persamaan sekuens-sekuens disebut sebagai sequence aligment. Metode ini

Skripsi


Amaliah Labiqah


21

digunakan untuk mempelajari evolusi sekuens-sekuens dari sekuens yang ada sebelumnya. Ketidakcocokan dalam aligment diasosiasikan dengan proses mutasi, sedangkan kesenjangan diasosiasikan dengan proses insersi atau delesi. Selain itu sequence aligment juga digunakan untuk mencari sekuens yang sama dalam basis data sekuens. BLAST adalah salah satu metode alignment yang sering digunakan dalam penelusuran basis data sekuens. BLAST menggunakan alogaritma heuristik dalam penyusunan aligmnet. Kelompok program dari NCBI BLAST terdiri dari : 1. Blastp, membandingkan sekuens asam amino dengan sekuens protein database 2. Blastn, membandingkan sekuens suatu nukleotida dengan database sekuens nukleotida lain 3. Blastx, membandingkan sekuens nukleotida dengan database asam amino 4 . tBlastn, pencarian database nukleotida yang telah ditranslasikan dengan pertanyaan (query) suatu protein 5. tBlastx, pencarian database nukleotida yang telah ditranslasikan dengan pertanyaan (query) nukleotida yang telah ditranslasikan pula. Program BLAST dapat juga digunakan untuk beberapa tujuan diantaranya yaitu mengidentifikasi

suatu

spesies,

melokasikan

domains,

membuat

pohon

filogenetik, mencocokkan DNA serta membandingkan spesies yang masih memiliki kekerabatan.

Skripsi


Amaliah Labiqah


22

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Proteomik Institude of Tropical Disease (ITD) Universitas Airlangga. Penelitian dimulai pada bulan Januari sampai dengan Juni 2012.

3.2 Sampel, Bahan dan Alat Penelitian 3.2.1 Sampel Penelitian Sampel penelitian yang digunakan dalam penelitian yaitu bakteri sistem abdominal rayap tanah isolat 7 dari penelitian Ratnadewi dkk. (2007). 3.2.2 Bahan Penelitian Bahan penelitian yang digunakan dalam penelitian yaitu primer forward (endoF), primer reverse (endoR), DNA Taq Polimerase, dNTP, Buffer Taq, dNTP, MgSO4, Tris Cl, Tris HCl, MgCl2, (NH4)2SO4, ddH2O, KIT QIAGEN (QI Aquick Gel Extraction Kit 50), media Luria Bertani (LB) padat dengan komposisi: tripton 1%, NaCl 1%, yeast ekstract 0.5% dan bacto-agar 2%. LB cair yaitu LB tanpa penambahan bacto-agar, buffer TE (50 mM tris HCl pH 8 dan 50 mM EDTA), larutan lisozim, larutan STEP (SDS 1%, Tris Cl, EDTA pH 8, proteinase K ), fenol jenuh, Na-asetat, etanol absolut, etanol 70%, TAE (Tris base, Asam Asetat, EDTA pH 8), agarosa, Buffer Loading (campuran Bromofenol biru dan sukrosa).

22 Skripsi


Amaliah Labiqah


23

3.2.3 Alat Penelitian Peralatan yang digunakan dalam penelitian yaitu pH meter, autoklaf, (OSK 6508 Steam pressure apparatus Ogawa Seiki Co., LTD), laminair air flow cabinet (Kottermann 8580), sentrifuga Beckman (tipe TJ-6), timbangan analitik (Mettler Toledo), oven (Memmert, Jerman), rotary shaker, lemari pendingin -20 0C (Royal Chest Freezer BD195), eppendorf, mikro pipet, waterbath, shaker incubator (Heidolph Polymax 1040), thermocycler, UV transluminator dan alat-alat gelas yang biasa digunakan di laboratorium.

3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Pembuatan Media 3.3.1.1 Pembuatan LB Cair Media LB cair dibuat dengan melarutkan yeast extract 0,5% (b/v), bacto trypton 1% (b/v), NaCl 1% (b/v) dalam akuades sampai 100 mL dalam Erlenmeyer. Bahan yang sudah dicampur kemudian disterilkan menggunakan autoklaf 121 oC selama 15 menit. 3.3.1.2 Pembuatan LB Padat Media LB padat dibuat dengan melarutkan bacto-agar 2% (b/v), yeast extract 0,5% (b/v), bacto trypton 1% (b/v), NaCl 1% (b/v) ke dalam akuades sampai 100 mL dalam Enlemeyer. Campuran bahan kemudian disterilkan menggunakan autoklaf 121 oC selama 15 menit. Media yang masih hangat-hangat kuku kemudian dipindah ke dalam cawan petri steril hingga memadat.

Skripsi


Amaliah Labiqah


24

3.3.2 Peremajaan Isolat 7 Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah Bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah isolat 7 diremajakan dengan cara ditumbuhkan pada media LB padat. Koloni Bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah diambil dari biakan lama dengan menggunakan kawat ose. Kawat ose kemudian digoreskan pada media LB padat lalu diinkubasi pada suhu 37 ˚C selama ±18 jam. Pemindahan biakan bakteri pada media LB ini dilakukan pada laminar dengan proses yang steril. 3.3.3 Isolasi DNA Kromosom Koloni bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah isolat 7 diinokulasikan ke dalam 100 ml LB cair dan diinkubasi pada shaker incubator pada suhu 37 0C dengan kecepatan 150 rpm selama 18 jam. Suspensi sel kemudian disentrifugasi 6.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4˚C. Pellet sel disuspensikan dengan 5 ml buffer TE (Tris HCL EDTA) yang merupakan campuran tris HCl pH 8 50 mM dan EDTA 50 mM. Pellet yang diperoleh dibekukan pada suhu -20˚C selama ±30 menit. Setelah itu ditambahkan larutan lisozim 10 mg/ml sebanyak 500 μL ke dalam sel beku dan kemudian dicairkan pada suhu kamar (23˚C). Larutan yang sudah mencair dipindahkan ke dalam penangas es selama 45 menit. Suspensi sel ditambahkan larutan STEP fresh (SDS 1%, Tris Cl, EDTA pH 8, Proteinase K) sebanyak 1 ml dan dicampur dengan baik. Campuran dipanaskan dalam waterbath 50˚C selama 1 jam sambil digoyang perlahan. Suspensi sel kemudian ditambahkan 6 ml fenol jenuh dalam buffer tris kemudian campur perlahan selama 5 menit hingga terbentuk emulsi. Campuran

Skripsi


Amaliah Labiqah


25

disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit. Fasa paling atas dipindahkan pada tabung eppendorf baru yang steril. Selanjutnya ditambahkan larutan Natrium Asetat 0,3 M sebanyak 0,1 kali dari volume total, lalu dicampur perlahan. Kemudian ditambahkan etanol absolut dingin sebanyak 2 kali volume larutan kemudian tabung dibolak-balik agar tercampur dengan baik. Setelah itu, campuran diinkubasi pada suhu -20oC semalam. Campuran disentifugasi pada 12000 rpm selama 5 menit, kemudian supernatan dibuang dan pellet dicuci dengan 0,6 ml etanol 70%. Campuran disentrifugasi kembali pada 12000 rpm selama 10 menit. Pelet diambil kemudian dilarutkan ke dalam ddH2O. Kadar larutan DNA dapat diukur dengan Spektrofotometer nano-drop pada panjang gelombang A260/A280 nm. 3.3.4 Analisis DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa Gel agarosa dibuat dengan melarutkan 0,4 gr agarosa dalam 40 ml buffer TAE, kemudian dididihkan. Setelah larut sempurna, larutan gel dicetak pada wadah elektroforesis yang telah diberi pencetak sumur, kemudian ditunggu sampai mengeras. Analisis DNA menggunakan elektroforesis gel agarosa dilakukan

dengan

mengambil

buffer

loading

sebanyak

3

µL,

lalu

menghomogenkannya dengan 4 µL DNA yang akan dielektroforesis. Sebelumnya telah

dilakukan

persiapan

pada

perangkat

elektroforesis

yaitu

dengan

menambahkan buffer TAE pada wadah elektroforesis sampai gel agarosa benarbenar tercelup. Campuran DNA dan

buffer loading yang telah homogen

kemudian dimasukkan dalam sumur pada gel agarosa. Gel agarosa yang sudah

Skripsi


Amaliah Labiqah


26

dielektroforesis dicelupkan dalam larutan EtBr untuk pewarnaan. Pita DNA dapat dilihat di atas UV transluminator. 3.3.5 Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase dengan Metode PCR Untuk melakukan PCR dibutuhkan sepasang oligonukleotida primer. Primer didesain dengan menggunakan program computer yang bernama clone manager. Untuk mendesain primer dibutuhkan urutan basa nukleotida penyandi gen endo-1,4-β-xilanase yang didapat dari Genbank, www.ncbi.nlm.nih.gov. Setelah didapatkan urutan gen penyandi endo-1,4-β-xilanase kemudian dicari homologinya. Daerah yang konserv diambil bagian ujung depan sebagai primer forward ujung belakang sebagai primer reverse. Komposisi PCR terdiri DNA kromosom 10 μl, primer forward 2 μl, primer reverse 2 μl, MgSO4 1 μl, Taq polimerase 2 μl, buffer Taq 2 μl dan dNTP 1 μl sehingga menghasilkan komposisi campuran total sebanyak 20 μl. Proses amplifikasi gen endo-1,4-β-xilanase dari bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah isolat 7 dilakukan pada kondisi PCR sebagai berikut: denaturasi pada suhu 94 oC selama1 menit, annealing pada variasi suhu 52 oC; 55 oC; 58 oC; 62 oC dan 64 oC selama 1 menit dan elongasi pada suhu 72 oC selama 1 menit dengan jumlah siklus 30 kali. Proses amplifikasi diawali dengan pra-denaturasi pada suhu 94 oC selama 5 menit dan diakhiri dengan pasca elongasi yang dilakukan pada suhu 72 oC selama 10 menit. Produk PCR kemudian dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa.

Skripsi


Amaliah Labiqah


27

3.3.6 Purifikasi Produk PCR Produk PCR yang dihasilkan dielektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (0.6 gr agarosa dalam 60 mL buffer TAE). Elektroforesis dilakukan dengan mencampur produk PCR dengan buffer loading dan dilakukan pada 50V selama ±1 jam. Gel yang mengandung pita DNA kemudian dipotong dengan cutter steril dan dimasukkan ke dalam tabung eppendrof untuk dilakukan purifikasi dengan menggunakan QI Aquick Gel Extraction KIT 50. Gel yang berada dalam tabung eppendorf ditambahkan dengan larutan capture buffer (asam asetat dan chaotropic agent) dengan perbandingan berat gel : buffer adalah 0.3 gram : 0,9 ml. campuran diinkubasi pada 50˚C selama 10 menit. Tiap 5 menit dikocok agar gel tercampur rata dengan buffer. Setelah itu larutan dimasukkan ke dalam tabung KIT dengan menggunakan mikro pipet. Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit. Supernatan dibuang dan residu yang tertinggal dalam kolom ditambahkan dengan buffer washing (buffer Tris HCl pH 8, EDTA 1 mM dan etanol absolut). Kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 15 menit. Campuran disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit. Residu yang tertinggal dalam kolom dielusi menggunakan 25 μl ddH2O steril dan ditampung dalam tabung eppendorf steril. Larutan diinkubasi pada suhu kamar selama 1-5 menit dan disentrifugasi kembali 12.000 rpm selama 2 menit. Produk purfikasi yang dihasilkan disimpan dalam -20˚C. 3.3.7 Sekuensing Amplikon dengan Metode Sanger Sekuensing dilakukan dengan alat Applied Biosystem 3730XL di Laboratorium Macrogen Singapore.

Skripsi


Amaliah Labiqah


28

3.4 Skema Kerja Isolasi DNA kromosom dari bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah isolat 7

Desain Primer PCR (sepasang primer endoF dan endoR)

Amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xylanase dengan teknologi PCR

Purifikasi produk PCR

Sekuensing produk PCR

Skripsi


Amaliah Labiqah


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi DNA Kromosom Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah Isolat 7

Isolasi DNA kromosom dilakukan menggunakan metode Sambrook et al(1989). Koloni isolat 7 bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah ditumbuhkan dalam media LB cair selama semalam. Suspensi sel yang dihasilkan disentrifugasi dan diambil pelet selnya untuk diresuspensi dengan buffer TE dan kemudian ditambahkan dengan lisozim untuk merusak dinding sel bakteri. Larutan STEP yang terdiri dari SDS 1%, Tris Cl, EDTA pH 8 dan proteinase K ditambahkan ke dalam suspensi sel untuk menyempurnakan kerusakan dinding dan membran sel bakteri. EDTA mampu menghambat kerja-kerja enzim yang merusak DNA serta membentuk ion kompleks dengan magnesium sehingga ion magnesium

yang penting untuk

mempertahankan

struktur

dinding sel

hilang.Proteinase K mampu memecah polipeptida menjadi unit yang lebih kecil dan lebih mudah didenaturasi oleh fenol (Brown, 2001). Untuk itu, fenol ditambahkan guna mempresipitasi protein, larutan DNA akanterlarut pada fasa cair. Sebagian RNA akan tetap bersama DNA dalam fasa cair. Fasa cair yang ada pada bagian atas ini diambil dengan menggunakan mikropipet secara hati-hati dan ditambahkan dengan Natrium Asetat dan etanol absolut. Kedua larutan ini berfungsi untuk mempresipitasi DNA. Dengan adanya garam (kation monovalen Na+) pada temperatur -20ᵒC etanol absolut akan mempresipitasiasam nukleat 29 Skripsi


Amaliah Labiqah


30

polimerik. Larutan DNA kemudian diambil pelet selnya untuk dilarutkan ke dalam ddH2O. Absorbansi ultraviolet dapat digunakan untuk mengetahui kemurnianDNAdengan menggunakan Spektrofotometri nanodrop yang langsung bisa mengukur absorbansi pada panjang gelombang 260 dan 280 nm.Panjang gelombang maksimum yang diserap oleh DNA dan RNA adalah 260 nm. Sedangkan protein menyerap panjang gelombang maksimum 280 nm (Tearae et al, 1997). Pengukuran absorbansi pada panjnag gelombang A260/A280 nmini berfungsi untuk mengetahui rasio kemurnian DNAterhadap protein. Pada isolasi DNA ini didapatkan rasio absorbansilarutan DNA isolat 7 pada adalah sebesar 1,89. Larutan DNA ini bisa dikatakan murni karena rasio absorbasi DNA lebih besar dari 1,8 (Brown, 2001).

Gambar 4.1 Hasil elektroforesis DNA kromosom

Skripsi


Amaliah Labiqah


31

4.2 Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase dengan Metode PCR Amplifikasi gen dengan teknik PCR membutuhkan sepasang primer yang sesuai. Pada penelitian ini didesain sepasang primer forward(endo F) dan primer reverse (endoR) dengan menggunakan software clone manager.Primer didesain berdasarkan pada urutan basa nukleotidagen penyandi endo-1,4-β-xilanase yang diambil dari Genbank.Urutan basa nukleotida gen penyandiendo-1,4-β-xilanase yang diambil berasal dari kelompok hidrolase famili 11 Bacillus subtillis disebabkan karena bakteri xilanolitik dari sistem abdominal rayap isolat 7 telah diidentifikasi secara mikrobiologis memiliki homologi dengan Bacillus subtilis. Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isoalt 7 bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah didesain berdasarkan gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dari beberapa GH famili 11 yaituBacillus subtilisgalur BD403 endo1,4beta-xyl (DQ100306.1), Bacillus subtilisgalur G1 xylanase gene (EU848308.1), Bacillus subtilisgalur MW10 endo-1,4-beta-xyl (DQ100307.1), dan Bacillus subtilisgalur R5 xyl (AB457186.1). Keempat jenis bakteri tersebut mengandung gen penyandi enzim endo-xilanase dengan ukuran rata-rata ± 600 bp dilakukan aligmentsehingga dihasilkan suatu daerah lestari seperti yang dapat dilihat pada Gambar 4.2

Skripsi


Amaliah Labiqah


Gambar

Skripsi

4.2

32

Hasil aligmentBacillus subtilisgalur BD403 endo1,4beta-xyl (DQ100306.1), Bacillus subtilisgalur G1 xylanase gene (EU848308.1), Bacillus subtilisgalur MW10 endo-1,4-beta-xyl (DQ100307.1), dan Bacillus subtilisgalur R5 xyl (AB457186.1)


Amaliah Labiqah


33

Sambrook and Russel(2001), menyebutkan beberapa hal yang perlu diperhatikan untuk mendesain primer yaitu panjang nukleotida antara 18-25, memiliki 40-60% basa GC, tidak terjadi hairpin maupun dimer serta pada ujung 3’ tidak boleh lebih dari 3 nukleotida dari primer forward komplemen dengan primer reverse ataupun sebaliknya. Pada penelitian ini diambil basa nukleotida dengan urutan tertentudan ditambah urutan sisi pengenal enzim restriksi yang terdapat pada multiple cloning side(MCS) pada vektor plasmid pYES2 sehingga dapat diinsersikan pada plasmid pYES2.Dari hasil analisis, urutan sisi pengenal enzim restriksi yang sesuai pada MCS pYES2dan tidak terdapat padahasil aligmentdi atas adalah SacI dan XhoI. Maka selanjutnya primer forward didesain dengan penambahan sisi restriksi SacI (GAGCTC)dengan kodon start ATG pada ujung 5’ dan primer reverse dengan penambahan sisi restriksi XhoI (CTCGAG)pada ujung 3’ dengan stop kodon TAA.Untuk melengkapi %GC primer ditambahkan basa GC sebagai pijakan. Primer forward endoF didesain dengan

panjang basa nukleotida sebesar 39bp dengan urutan basa 5’

GGGGAGCTCTCCATGTTAAGTTTAAAAAGAATTTCTTAGTT 3’. Primer forward endoF memiliki Tm sebesar 67°C, 30% GC, tidak terjadi dimers dan harpains serta serta pada ujung 3’ tidak lebih dari 3 nukleotida dari primer forward komplemen dengan primer reverse ataupun sebaliknya. Sedangkan primer reverse endoR memiliki 23 panjang basa nukleotida dengan urutan basa 5’ GCCTCGAGTTACCACACTGTTAC 3’. Primer reverse endoR memiliki Tm sebesar 64°C, 52% GC, tidak terjadi dimers dan harpains serta serta pada ujung 3’ tidak lebih dari 3 nukleotida dari primer forward komplemen dengan primer

Skripsi


Amaliah Labiqah


34

reverse ataupun sebaliknya. Gambar 4.3 dan 4.4 menunujukkan hasil analisis desain primer forward endoF dan reverseendoR.

Gambar 4.3 Analisis Primer Forward (endoF)

Skripsi


Amaliah Labiqah


35

Gambar 4.4 Analisis Primer Reverse (endoR) Analisis primer oleh program Clone manager pada Gambar 4.3 dan 4.5 menunjukkan primer reverse memenuhi kriteria primer PCR yang disarankan oleh program Clone manager. Sedangkan primer forwardmemiliki beberapa kriteria yang disarankan oleh program Clone manageryang tidak terpenuhi. Primer forward memiliki panjang primer sepanjang 39 dan 30% GC. Dalam teorinya, jika suatu primer terlalu panjang maka dapat menyebabkan kegagalan replikasi (Irawan, 2008 ; Yuwono, 2006). Namun, dalam penelitian(Paice, et al., 1986) dan (Huang et al., 2005) pernah melakukan amplifikasi gen penyandi xilanase dengan panjang basa 39 basa nukleotida. Urutan primer forward yang digunakan yaitu 5’CGAATTCCATGTTTAAGTTTAAAAAGAATTTCTTAGTT

3’.

Primer

tersebut sama seperti primer forwardendoF yang digunakan pada penelitian ini dengan penambahan GC dan penambahan sisi restriksi yang berbeda. Primer

Skripsi


Amaliah Labiqah


36

forward Primer forward endoF dan primer reverse endoR kemudian di-alignment dengan gen endo-1,4-β-xilanase GH 11 dari Bacillus subtillis(Gambar 4.5).

Gambar 4.5 Hasil alignment gen endo-1,4-β-xilanase GH 11 dari Bacillus subtillis dengan primer forward endoF (F3 ENDO ORI) dan primer reverse endoR (R ENDO INVERS)

Skripsi


Amaliah Labiqah


37

Reaksi PCR dilakukan dengan mencampurkan primer, DNA cetakan, MgSO4,enzim Taq DNA polimerase, dNTP serta larutan buffer. Enzim Taq DNA polimerase memiliki aktivitas untuk memperpanjang rantai DNA yang mampu mempertahankan aktivitasnya pada suhu tinggi (sampai 95°C) walaupun dilakukan pemanasan beberapa kali (Bintang, 2010). Ion Mg2+ dari MgSO4 berfungsi sebagai kofaktor bagi enzim Taq polimerase. PCR kemudian dijalankan dengan kondisi sebagai berikut : denaturasi awal 94ᵒC 1menit; annealing 58ᵒC selama 1menit; dan elongasi 72ᵒC selama 1 menit. Pada suhu 94ᵒC yaitu pada proses denaturasi, DNA untai ganda akan terbelah menjadi untai tunggal akibat pemanasan yang merusak ikatan hidrogen yang menghubungkan untai DNA. Suhu kemudian diturunkan pada proses annealing. Pada suhu ini primer akan melekat pada segmen yang komplemen pada DNA untai tunggal. Pada awal penelitian ini annealing dilakukan pada variasi suhu55˚C, 58˚C, 60˚C, 62˚C. Variasi suhu dilakukan adalah untuk mencari suhu optimum yang bisa mengamplifikasi DNA target dengan baik. Dari hasil variasi suhu tersebut, DNA penyandi endoxilanase dari sistem abdominal rayap tanah dapat diamplifikasi pada suhu annealing 58ᵒC. Amplikon PCR kemudian dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa. Agarosa biasa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA dengan rentang ukuran beberapa ratus hingga sekitar 20.000 kb. DNA yang bermuatan negatif akan menuju ke kutub positif dengan adanya arus listrik yang diberikan. DNA dengan ukuran molekul lebih kecil akan lebih cepat bermigrasi melewati gel dibandingkan dengan DNA yang ukuran molekulnya lebih besar. Visualisasi pita DNA dalam gel agarosa ini dapat dilihat melalui UV

Skripsi


Amaliah Labiqah


38

transluminator dimana sebelumnya dilakukan pewarnaan dengan Etidium Bromide (EtBr). Amplikon PCR yang berhasil diamplifikasi pada penelitian ini yaitu sebesar ±500 bp (Gambar 4.4) A

B

3000bp p 1500bp p 1000bp p 500bp

± 0,5bp

250bp

Gambar 4.6. Hasil elektroforesis PCR menggunakan primer endoF dan endoR A. GeneRulerTM 1 kb DNA ladder B. Amplikon gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat 7 bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah hasil PCR

Primer forward endoF dan reverse endoR didesain dengan primer forward menempel dari sisi ujung dengan start kodon ATG dan primer reverse endoR menempel dari sisi ujung dengan stop kodon TAA. Kedua primer bergerak dari ujung ke ujung pada urutan template sepanjang ±600bp sehingga pada amplifikasi dengan primer endoF dan endoR ini dapat diperoleh PCR sebanyak sekitar 0,5bp. Sebelumnya telah didesain pula primer forward dan reversedengan urutan primer forward 5’- GCGAGCTCATGGCAATGGATA -3’ dan primer reverse 5’GCCTCGAGTTACCACACTGTTAC -3’ kedua primer ini memenuhi kriteria

Skripsi


Amaliah Labiqah


39

analisis primer dari software Clone Manager (Gambar 4.6). Jika dilakukan homologi, primer forwardbergerak dari posisi tengah sedamgkan primer reverse di sisi ujung (Gambar 4.7). Kedua primer ini berhasil mengamplifikasi fragmen DNA pada ±200bp (Gambar 4.8). Bila dibandinngkan desain primer 2 mengamplifikasi DNA dengan ukuran yang lebih sedikit dan fragmen yang dihasilkan lebih tipis. Oleh karena itu data yang digunakan adalah data hasil amplifikasi dari primer endoF dan endoR dengan ukuran ±0,5bp.

Gambar 4.7 Analisis primer forward dan primer reverse desain 2

Skripsi


Amaliah Labiqah


40

Gambar 4.7 Hasil aligment desain primer 2

Gambar 4.8 Desain Primer 2

Skripsi


Amaliah Labiqah


A

41

B

3000bp p 1500bp p 1000bp p 500bp 250bp

± 200bp

Gambar 4.9 Hasil elektroforesis PCR menggunakan desain primer 2 A. GeneRulerTM 1 kb DNA ladder B. Amplikon gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat 7 bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah hasil PCR

4.3 Purifikasi atau pemurnian DNA Produk PCR Purifikasi produk PCR dilakukan melalui purifikasi gel menggunakan reagen KIT (QI Aquick Gel Extraction KIT 50). Tahap awal yang dilakukan dalam proses purifikasi ini yaitu memasukkan produk PCR ke dalam gel agarosa 1% (0,6 gram dalam 60 ml TAE). Produk PCR dielektroforesis kemudian gel yang mengandung pita DNA dipotong menggunakan cutter steril. Gel yang mengandung pita DNA kemudian ditambahkan dengan buffer QC (mengandung asam asetat dan caorotropic agent) dengan pemanasan 50ᵒC selama 10menit untuk mendenaturasi protein yang tersisa selama proses PCR. Sampel kemudian dipindahkan ke dalam kolom KIT sehingga DNA akan terperangkap ke dalam matrix kolom. Setelah itu dilakukan penambahan buffer PE yang mengandung

Skripsi


Amaliah Labiqah


42

etanol untuk menghilangkan garam dan kontaminan. DNA produk PCR dalam matrix kolom kemudian dielusikan dengan ddH2O steril. Hasil purifikasi dapat dilihat pada Gambar 4.8

A

B

3000bp p 1500bp p 1000bp p 500bp

± 0,5bp

250bp

Gambar 4.10 Hasil elektroforesis amplikon PCR yang telah dimurnikan dengan reagen KIT (QI Aquick Gel Extraction KIT 50 A. GeneRulerTM 1 kb DNA ladder B. Amplikon gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat 7 bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah 4.4 Analisis Urutan Basa Nukleotida Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase Asal Isolat 7 Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah Urutan basa nukleotida gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat 7 bakteri xilanolitik sitem abdominal rayap tanah dibaca dengan teknik sequencing menggunakan primer forward endoF dan primer reverse endoR. Sekuensing dilakukan dengan alat Applied Biosystems 3730XL squenser. Data hasil sekuensing adalah sebagai berikut :

Skripsi


Amaliah Labiqah


43

a) Sekuensing dengan primer forward endoF dengan Applied Biosystems 3730XL squenser: TCTCCCTGTACTAGGAGATCGTCAGCTTCCCACCTCTCAACTAG ATGT b) Sekuensing dengan primer reverse endoR dengan Applied Biosystems 3730XL squenser: TACATCAGCCTACGTCTGTATCTTTCCGGGGCCCCACAACCAGA GA Kedua hasil sekuensing tidak berhasil membaca urutan basa nukleotida gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat 7 bakteri xilanolitik sitem abdominal rayap tanah secara keseluruhan. Hal ini diindikasikan karena faktor kemurnian DNA produk PCR yang dihasilkan kurang baik.

Skripsi


Amaliah Labiqah


47

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1

Kesimpulan Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa gen penyandi endo-1,4-βxilanase dengan ukuran 0,5 bp asal isolat 7 bakteri xilanolitik sistem abdonminal rayap tanah dapat diamplifikasi dengan metode PCR menggunakan desain primer endoFdanendoR.

5.2

Saran Berdasarkan penelitian yang dilakukan dapat disarankan : 1.

Dilakukan pemurnian dan sekuensing ulang terhadap DNA gen penyandi endo-1,4-β-xilanaseasalisolat7 bakteri xilanolitik sistem abdonminal rayap tanah

2.

Dilakukan amplifikasi ulang dengan primer yang berbeda atau melakukan desain primer baru untuk urutangen penyandi endo-1,4-βxilanase.

Skripsi

44


Amaliah Labiqah


45 45

DAFTAR PUSTAKA Bainbridge B. W., Berna P., 1987, Genetics of Microbes, 2nd edition, Chapman & Hall, New York. Beg Q. K., Kapoor M., Mahajan L., Hoondal G. S., 2001, Microbial Xylanases and their Industrial Applications : a Review, Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 56, p. 326-338. Bock Ralph, 1997, Biolistic Transformation of Plants with anion-exchangepurified Plasmid DNA, Qiagen News, Issue No. 5. Borror, Triplehorn, Johnson, 1992, Pengenalan Pelajaran Serangga, Edisi Keenam, Alih Bahasa : Soetiyono P., Gadjah Mada University press, Yogyakarta. Brown T.A., 2010, Gene Cloning an Introduction, 3rd edition, Chapman & Hall, United Kingdoom. Cheng H. L., Whang P. M., Chen Y. C., Yang S., Chen Y. C., 2008, Cloning, Characterization and Phylogenetic Relationships of stxI, a endoxylanase-encoding Gene from Streptomyces thermonitriWcans NTU-88, Bioresource Technology, Vol. 99, p. 227-231. Corral, O.L., Ortega, F.V., 2006, Xylanases, Advances in Agricultural and Food Biotechnology 305-322 Coughlan, M.P. and Hazlewood, G.P., 1992, Hemicellulose and Hemicellulase, Portland Press, London and Chapel Hill. Debeche, T., Bliard, C., Debire, P., and O’Donohue, M.J., 2002, Probing The Catalytically Essential Residues of the α-L-arabinofuranosidase from Thermobacilus xylanilyticus, Protein Enginering 15: 21-28. Erlich H. A., 1992, PCR Technology : Principles and Application for DNA Amplification, W. H. Freeman and company, USA. Faulet B. M., Niamke S., Gonnety J. T., Kouame, L. P., 2006. Purification and Biochemical Properties of a New Thermostable Xylanase from Symbiotic Fungus, Termitomyces sp., African Journal of Biotechnology, Vol. 5, p. 273-282. Freifelder David, 1987, Molecular Biology, Jones and Barltlett Publisher Inc, USA.

Skripsi


Amaliah Labiqah


46

Girio F. M., Fonseca C., Carvalheiro F., Duarte L.C., Marques S., Lukasik L. B., 2010, Hemicelluloses for fuel ethanol: A review, Bioresource Technology, Vol. 101, p. 4775–4800. Goodenough, U., 1984, Genetika, Edisi Ketiga, Alih Bahasa : Adisoemarto S., Erlangga, Jakarta. Henrissat B., Coutinho P., Deleury E., http://www.CAZy-GH_tables.htm, 8 April 2005 Huang J., Whang G., Xiao L., 2006, Cloning, sequencing and expression of the xylanase gene from a Bacillus subtilis strain B10 in Escherichia coli, Bioresource Technology, Vol. 97, p. 802-808. Innis M. A., Gelfan D. H., John S., PCR Protocols : A Guide to Methode Application, 1990, Academic Press, New York. Irawan B., 2008, Genetika Molekuler, Airlangga University Press, Surabaya. Mishra M., Thakur I. S., 2011, Purification, Characterization and Mass Spectroscopic Analysis of Thermo-alkalotolerant β-1,4endoxylanase from Bacillus sp. and Its Potential for Dye Decolorization, International Biodeterioration & Biodegradation, Vol. 65, p. 301-308. Old R.W., Primrose S.B., Prinsip-prinsip Manipulasi Gen,Edisi ke-4 Alih bahasa :1995, Poorna C. Asha., Prema P., 2006, Production and partial characterization of endoxylanase by Bacillus pumilus using agro industrial residues, Biochemical Engineering, Vol. 36, p. 106-112. Purwadaria T., Ardiningsih P., Ketaren P. P., dan Sinurat A. P., 2004. Isolasi dan Penapisan Bakteri Xilanolitik Mesofil dari Rayap. Jurnal Mikrobiologi Indonesia 9. Puspaningsih N. N. T., 2004, Pencirian Enzim Xilanolitik dan Kloning Gen Penyandi Xilosidase dari Bacillus thermoleovorans IT-08, Disertasi Program Studi Biologi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Radek R., 1999, Flagellates, Bacteria, and Fungi Associated with Termites : Diversity and Function in Nutrition-A Review, Ecotropica, Vol. 5 (2), p. 183-196.

Skripsi


Amaliah Labiqah


47

Ratnadewi A. A. I., Handayani W., Hadi A. F., Sa’diyah H., Budi L., 2007, Isolasi,Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Xilanolitik Asal Mikrob Dalam Sistem Intestin Rayap Untuk Memproduksi Xilooligosakarida Sebagai Pereduksi Resiko Kanker, Uneversitas Jember, Jember. Ratnadewi A. A. I., Puspaningsih N. N. T., Handayani W., 2011, Kloning dan Overekspresi Gen Beta-endoxylanase Asal Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah dan Produksi Xilooligosakarida Sebagai Produsen Probiotik, Universitas Jember, Jember. Russel J. Petter., 1999, Fundamentals Of Genetics, 2nd edition, Addison Wesley Longman, San Francisco. Richana, N., 2002, Produksi dan Prospek Enzim Xilanase dalam Pengembangan Bioindustri di Indonesia, Buletin AgroBio 5 (1) : 29-36. Saha, B. C., 2003, Hemicellulose Bioconversion. Review Paper, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 30 (5, May) : 279 291. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., 1989, Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Shallom, D., Belakhov, V., Solomon, G., Bassov, T., Shoham, Y., 2002, Detailed Kinetic Analysis and Identification of The Nukleophile in α-LArabinofuranosidase From Geobacillus stearothermophillus T6, a Family 51 Glycoside Hydrolase, J Biol Chem, 227: 43666743673. Smith C. A., Wood E. J., 1991, Molecular and Cell Biochemistry : Molecular Biology and Biotechnology, Chapman and Hall, USA Spangler B. D., 2002, Methods in Molecular Biology and Protein Chemistry : Cloning and Characterization of an Enteroxin Subunit, John Wiley & Sons, Ltd., United Kingdoom. Sriyapai T., Somyoonsap P., Matsui K., Kawai F., ChansiriK., 2011, Cloning of thermostable xylanase from Actinomadura sp. S14 and its expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 111 No. 5, 528–536.

Skripsi


Amaliah Labiqah


48

Subramaniyan S., Prema P., 2002, Biotecnology of Microbial Xylanases : Enzymology, Molecular Biology, and Application, Critical Rev Biotechnol, Vol. 22, p. 33-64. Tarumingkeng R. C., 1971, Biologi dan Pengenalan Rayap Perusak Kayu di Indonesia. Laporan L. P. H. No. 138, Departemen Pertanian Direktorat Jenderal Kehutanan Lembaga Penelitian Hasil Hutan, Bogor. Tarumingkeng R. C., 2001, Biologi dan Perilaku Rayap, Program Studi Ilmu Hayati Institut Pertanian Bogor, Bogor (diakses online dari www.rudyct.com/biologi_perilaku_rayap.htm). Teare JM et al. 1997. Measurement of nucleic acid concentrations using the DNA quant and the genequant. Bio Techniques 22:1170-1174 Walker J. M., Rapley R., 2009, Molecular Biology and Biotechnology, 5th edition, Royal Society of Chemistry United Kingdoom. Wirajana I. N., 2010, Ekspressi dan Sekresi α-L-arabinofuranosidase dari E.coli DH5α/pTP510 di Saccharomyces cerevisiae, Disertasi Program Pascasarjana Universitas Airlangga Surabaya, Universitas Airlangga, Surabaya. White B. A., 1997, PCR Cloning Protocols, Humana Press, New Jersey. Yuwono T., 2006, Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction : Panduan Eksperimen PCR untuk memecahkan masalah Biologi Terkini, Penerbit Adi, Yogyakarta. Zhang Min., Jiang Z., Yang S., Hua C., Li L., 2010, Cloning and expression of a Paecilomyces thermophila xylanase gene in E. coli and characterization of the recombinant xylanase, Bioresource Technology, Vol. 101, p. 688–695. Zhou C., Bai J., Deng S., Whang J., Zhu J., Wu M., Wang W., 2008, Cloning of a xylanase gene from Aspergillus usamii and its expression in Escherichia coli, Bioresource Technology, Vol. 99, p. 831-838. Sciencebiotech.net, tanggal akses 23 November 2011 www.wikipedia.com, tanggal akses 23 November 2011.

Skripsi


Amaliah Labiqah


Lampiran 1. Pembuatan Larutan TE Untuk membuat 50 mL larutan TE (50 mM Tris Cl dan 50 mM EDTA) Pembuatan stok 500 mM Tris Cl 50 mL 0,5 M = gr Tris Clx 1000 121,14 50 mL Tris Cl = 3,0285 gram dilarutkan dalam aquades hingga 50 mL Pembuatan stok 500 mM EDTA 25 mL 0,5 M = gr EDTA x 1000 372,24 25 mL EDTA = 4,653 gram dilarutkan dalam aquades hingga 25 mL Pembuatan Larutan TE 50 mL = 50 mM Tris Cl dari stok 500 mM V x 500 = 50 x 50 V = 5 mL 50 mM EDTA dari stok 500 mM V x 500 = 50 x 50 V = 5 mL 50 TE = 5 mL Tris Cl 50 mM ditambah 5 mL EDTA 50 mM dilarutkan dalam aquades hingga volume 50 mL

Lampiran 2. Pembuatan Larutan Lisosim Stok Lisosim 10 mg/ mL Pembuatan 1 mL lisosim = 10 mg/mL x 1 mL = 0,01 gram dilarutkan dalam aquades hingga 1 mL Lampiran 3. Pembuatan Larutan STEP Untuk mebuat Larutan STEP 500 μLterdiri dari SDS 0,5%; Tris Cl 50 mM pH 7,5; EDTA 0,4 M; Proteinase K SDS 0,5% dari stok 25% = 500 μLx 0,5 = 0,0025 gram 100. 1000 μL

Skripsi


Amaliah Labiqah


Tris Cl 50 mM dari stok 500 mM V x 500 = 500 x 50 V = 50μL EDTA 0,4 M dari stok 500 mM V x 0,5 = 500 x 0,4 V = 400μL Protinase K 1 mg/mL dari stok 20 mg/mL 500 μL x 1 mg/mL = V x 20 mg/mL V = 25 μL

Lampiran 4. Pembuatan Na-Asetat 3 M 3 M = gr Na-Asetatx 1000 82,03 10 mL = 2,4609 gram Na-Asetat dilarutkan dalam akuades hingga 10 mL

Lampiran 5. Electropherogram hasil sekuensing Sekuensing menggunakan primer forward endoF :

Skripsi


Amaliah Labiqah


Sekuensing menggunakan primer reverse endoR :

Skripsi


Amaliah Labiqah

AMPLIFIKASI GEN PENYANDI ENDO-1,4-β-XILANASE ASAL ISOLAT 7 BAKTERI XILANOLITIK SISTEM ABDOMINAL RAYAP TANAH SKRIPSI

Recommend Documents