i
KARAKTERISASI GEN PARTICULATE METHANE MONOOXYGENASE (pMMO) BAKTERI METANOTROF ASAL SAWAH
ANNISA RETNO FITRIANI
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
ii
ABSTRAK ANNISA RETNO FITRIANI. Karakterisasi Gen Particulate Methane Monooxygenase (pMMO) Bakteri Metanotrof Asal Sawah. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan ALINA AKHDIYA. Bakteri metanotrof adalah bakteri pengoksidasi metan yang memiliki enzim yang spesifik yaitu enzim metan monooksigenase (MMO). Aplikasi bakteri metanotrof dapat mengurangi emisi metan di lahan sawah. Terdapat dua jenis enzim MMO, yaitu soluble MMO (sMMO) dan particulate MMO (pMMO). Enzim pMMO adalah enzim terikat membran yang dimiliki oleh seluruh bakteri metanotrof. Isolat BGM 1 dan SKM 14 menunjukkan morfologi koloni yang berbeda ketika ditumbuhkan pada media Nitrate Mineral Salt (NMS) + 1% metanol. Amplifikasi gen pMMO dengan menggunakan primer A189f dan A682r menunjukkan pita DNA berukuran ~300 bp untuk isolat BGM 1 dan ~500 bp untuk isolat SKM 14. Sekuen yang diperoleh dianalisis menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X. Analisis sekuen amplikon dari BGM 1 menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X berturut-turut menunjukkan kemiripan tertinggi dengan sekuen gen (87%) dan asam amino pada protein (71%) acyl-coA dehydrogenase Xanthobacter autotrophicus Py2. Sedangkan analisis sekuen amplikon dari SKM 14 menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X berturut-turut menunjukkan kemiripan tertinggi dengan sekuen gen (84%) dan asam amino pada protein (62%) subunit B cytochrome bc1 Sinorhizobium fredii HH103. Kata kunci: Metan, Bakteri metanotrof, Enzim pMMO
ABSTRACT ANNISA RETNO FITRIANI. Characterization of Particulate Methane Monooxygenase (pMMO) Gene of Methanotrophs from the Rice Field. Under direction of IMAN RUSMANA and ALINA AKHDIYA. Metanotrophic bacteria are a methane oxidizing bacteria that have specific enzyme called methane monooxygenase (MMO). Application of metanotrophic bacteria can reduce emission of methane in rice fields. There are two types of MMO enzymes, i.e. soluble MMO (sMMO) and particulate MMO (pMMO). The pMMO enzyme is a membrane-bound enzyme that is present in all metanotrophic bacteria. BGM 1 and SKM 14 isolates showed a different colony morphology when grown on Nitrate Mineral Salt (NMS) medium + 1% methanol. The pMMO gene amplification using A189f and A682r primer showed a ~300 bp and ~500 bp of DNA band for BGM 1 and SKM 14 isolates respectively. The sequences were analyzed using BLAST-N and BLAST-X program. Analysis of amplicon sequence from BGM 1 using BLAST-N and BLAST-X program showed highest similarity with sequence of gene (87%) and amino acid in protein (71%) acyl-coA dehydrogenase Xanthobacter autotrophicus Py2 respectively. Whereas analysis of amplicon sequence from SKM 14 using BLAST-N and BLAST-X program showed highest similarity with sequence of gene (84%) and amino acid in protein (62%) subunit B cytochrome bc1 Sinorhizobium fredii HH103 respectively. Keywords: Methane, Methanotrophic bacteria, pMMO enzyme
iii
KARAKTERISASI GEN PARTICULATE METHANE MONOOXYGENASE (pMMO) BAKTERI METANOTROF ASAL SAWAH
ANNISA RETNO FITRIANI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
iv
Judul Nama NIM
: Karakterisasi Gen Particulate Methane Monooxygenase (pMMO) Bakteri Metanotrof Asal Sawah : Annisa Retno Fitriani : G34080114
Menyetujui: Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si NIP 196507201990021002
Alina Akhdiya, M.Si NIP 196812082001122001
Mengetahui: Ketua Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Sc NIP 196410021989031002
Tanggal Lulus:
v
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Desember 2011 sampai 2012 ini ialah Karakterisasi Gen Particulate Methane Monooxygenase (pMMO) Bakteri Metanotrof Asal Sawah. Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si dan Ibu Alina Akhdiya, M.Si atas bimbingan, bantuan pendanaan, dan pengarahan yang diberikan selama penelitian dan penyusunan skripsi ini. Terima kasih kepada Bapak Dr. Tri Atmowidi, M.Si. atas saran dan masukan yang telah diberikan sehingga tulisan ini menjadi lebih baik. Terima kasih juga kepada Papa, Mama, Teh Fifi, Kak Beny, Aziz, dan Tika atas segala doa, dukungan, dan kasih sayangnya. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Hadi Rakhmanto, Tri Lugina, Retno, Ayang, Raya, Rima, Rizqi Ammar, Nida, Rini, Tata, Tya, dan Desti atas dukungan dan bantuan yang diberikan. Terima kasih juga kepada keluarga besar laboratorium Mikrobiologi, Whendi, Citra, Andri, Azizah, Ai, Dita, Issanto, Aida, Prima, Putri, Kak Sipri, Mbak Lena, Pak Jaka, Bu Heni, Mas Aldian, serta teman-teman Biologi 45 atas segala doa, dukungan, dan perhatiannya. Serta pihak-pihak yang secara tidak langsung telah membantu dalam pengumpulan data karya ilmiah ini. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, November 2012
Annisa Retno Fitriani
vi
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Pekalongan pada tanggal 15 April 1991 dari ayah Joni Aliando dan Ibu Henny. Penulis merupakan anak kedua dari empat bersaudara. Tahun 2008 penulis lulus dari SMA Negeri 5 Bogor dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui Seleksi Masuk Perguruan Tinggi Negeri. Penulis memilih program studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif menjadi anggota Divisi Pengembangan Sumber Daya Manusia (PSDM) Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio) pada tahun 2009-2010, Ketua Divisi Kesekretariatan Grand Biodiversity Biologi IPB tahun 2010, Sekretaris Masa Pengenalan Departemen (MPD) Biologi tahun 2010, Divisi Acara Workshop dan Diskusi Artikel Ilmiah Populer Biologi tahun 2010. Penulis menjadi peserta lomba Pekan Ilmiah Mahasiswa FMIPA tahun 2010 dengan judul “Ragam Cendawan Entomopatogen di Wahana Wisata Cangkuang”. Penulis melakukan studi lapang di Taman Wisata dan Cagar Alam Pangandaran dengan judul makalah “Keragaman Kapang dan Khamir yang Berasosiasi dengan Serangga dan Sarang Serangga di Taman Wisata Alam Pangandaran”. Penulis juga melakukan Praktik Lapang di Perusahaan Daerah Air Minum (PDAM) Tirta Pakuan Kota Bogor pada bulan Juli 2011, dengan judul makalah “Manajemen Pengolahan Air di Perusahaan Daerah Air Minum Tirta Pakuan Kota Bogor”. Penulis juga menerima beasiswa Peningkatan Prestasi Akademik (PPA) pada tahun ajaran 2011-2012.
vii
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ..................................................................................................................... iv DAFTAR GAMBAR ................................................................................................................. iv DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................................................. iv PENDAHULUAN....................................................................................................................... 1 Latar belakang ....................................................................................................................... 1 Tujuan ................................................................................................................................... 1 BAHAN DAN METODE ........................................................................................................... 1 Waktu dan Tempat ................................................................................................................ 1 Bahan......... ............................................................................................................................ 1 Metode Penelitian .................................................................................................................. 1 Peremajaan dan Pengkulturan Bakteri Metanotrof..................... ................................... 1 Isolasi Genom, Amplifikasi Gen pMMO, dan Visualisasi Amplikon ........................... 1 Perunutan DNA dan Analisis Bioinformatika ............................................................... 2 HASIL ......................................................................................................................................... 2 Peremajaan dan Pengkulturan Bakteri Metanotrof ................................................................ 2 Amplifikasi Gen pMMO dan Visualisasi Amplikon .............................................................. 2 Perunutan DNA dan Analisis Bioinformatika ....................................................................... 3 PEMBAHASAN ......................................................................................................................... 3 SIMPULAN ................................................................................................................................ 4 SARAN ...................................................................................................................................... 4 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................................. 4 LAMPIRAN ................................................................................................................................ 6
viii
DAFTAR TABEL Halaman 1. Morfologi koloni isolat bakteri metanotrof BGM 1 dan SKM 14 pada media NMS .............. 2 2. Hasil analisis sekuen amplikon gen pMMO dengan menggunakan program BLAST-N...... . 3 3. Hasil analisis sekuen amplikon gen pMMO dengan menggunakan program BLAST-X ....... 3
DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Koloni isolat bakteri metanotrof yang ditumbuhkan pada media NMS + 1% metanol. (A) Koloni BGM 1 berwarna putih. (B) Koloni SKM 14 berwarna krem jingga ................... 2 2. Pita DNA hasil amplifikasi gen pMMO dari isolat bakteri metanotrof BGM 1 dan SKM 14.......... ......................................................................................................................... 3
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Komposisi media Nitrate Mineral Salt (NMS) 300 ml + 1% metanol .................................... 7 2. Sekuen pita DNA isolat BGM 1 dan SKM 14......................................................................... 8 3. Hasil sekuen gen pMMO, BLAST-N, dan BLAST-X isolat BGM 1 dan SKM 14 ............... 10
PENDAHULUAN Latar Belakang Suasana anaerob pada bagian bawah sedimen sawah merupakan habitat yang sesuai untuk bakteri penghasil metan (metanogen). Bakteri metanogen menggunakan CO2, metil, dan asetat sebagai sumber karbon yang kemudian diubah menjadi metan melalui proses metanogenesis. Sebaliknya pada permukaan sedimen terdapat oksigen terlarut sehingga suasananya menjadi aerob dan sangat cocok untuk pertumbuhan bakteri metanotrof. Bakteri metanotrof adalah bakteri Gram negatif yang menggunakan metan sebagai sumber karbon untuk menghasilkan energinya. Whittenburry et al. (1970) menggolongkan bakteri metanotrof ke dalam lima genus berdasarkan perbedaan morfologi, tipe bentuk fase istirahat, struktur membran intrasitoplasma, dan beberapa karakter fisiologis. Kelima genus tersebut ialah Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylosistis, dan Methylosinus. Sedangkan berdasarkan perbedaan jalur biosintesisnya (jalur RuMP dan Serin), bakteri metanotrof digolongkan menjadi tiga tipe, yaitu metanotrof tipe I (Methylomonas dan Methylobacter), tipe II (Methylosistis dan Methylosinus), dan tipe X (Methylococcus capsulatus) (Hanson & Hanson 1996). Karakteristik penting dari metanotrof ialah memiliki enzim metan monooksigenase (MMO) yang dapat mengkatalisis metan menjadi metanol. Oksidasi metan oleh bakteri metanotrof di lahan sawah dapat mencapai 80% dari total metan yang diproduksi oleh bakteri metanogen (Conrad & Rothfus 1991). Selain dapat mengoksidasi metan, enzim MMO juga berperan dalam degradasi berbagai senyawa polutan seperti trikloroetilen, isomerisomer dari dikloroetilen, vinil klorida, dan kloroform (Graham et al. 1992). Terdapat dua tipe MMO, yaitu soluble MMO (sMMO) dan particulate MMO (pMMO) (Hanson & Hanson 1996). Enzim pMMO merupakan enzim terikat membran yang dimiliki oleh seluruh bakteri metanotrof dan dapat terekspresi dalam media dengan kandungan tembaga yang tinggi. Sedangkan enzim sMMO hanya dimiliki oleh beberapa bakteri metanotrof dan dapat terekspresi dalam media dengan kandungan tembaga rendah (Stanley et al. 1983). Laboratorium Mikrobiologi FMIPA IPB, telah mengoleksi beberapa isolat bakteri metanotrof yang berasal dari lumpur sawah di Bogor dan Sukabumi. Beberapa isolat telah
diidentifikasi secara molekular dan dikarakterisasi secara terbatas reaksi fisiologis dan biokimianya. BGM 1 merupakan isolat yang mampu mengakumulasi amonium lebih tinggi dibandingkan isolat lainnya, sedangkan SKM 14 merupakan isolat yang memiliki nilai oksidasi metan tertinggi (Hapsari 2008). Hasil analisis gen 16S rRNA yang dilakukan oleh Astuti (2009) memperlihatkan bahwa BGM 1 memiliki tingkat kemiripan 74% dengan Methylocystis rosea strain SV97T dan SKM 14 memiliki tingkat kemiripan 65% dengan Methylobacter sp. Clone GASP-OKA-565E11. Kedua isolat tersebut memiliki enzim pMMO namun belum dilakukan karakterisasi gennya. Informasi mengenai karakterisasi gen pMMO dari isolat BGM 1 dan SKM 14 dapat digunakan landasan ilmiah untuk pemanfaatan bakteri tersebut di lahan pertanian. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi gen particulate methane monooxygenase (pMMO) pada metanotrof asal sawah Bogor dan Sukabumi.
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Desember 2011 sampai Agustus 2012 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB. Bahan Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat bakteri metanotrof BGM 1 dan SKM 14. Kedua bakteri ini diisolasi dari lumpur sawah asal Bogor dan Sukabumi (Hapsari 2008). Metode Peremajaan dan Pengkulturan Bakteri Metanotrof. Kultur bakteri metanotrof diremajakan dan dikulturkan pada media agar NMS + 1% metanol (Lampiran 1) dengan teknik gores kuadran. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 3-14 hari. Isolasi DNA Genom, Amplifikasi Gen pMMO, dan Visualisasi Amplikon. DNA genom diisolasi dari kultur padat bakteri metanotrof yang ditumbuhkan dengan cara sebagaimana disebutkan diatas. Isolasi DNA genom dilakukan menurut metode Lazo (Lazo et al. 1987). Amplifikasi gen penyandi pMMO dilakukan menggunakan primer spesifik, yaitu A189F (GGNGACTGGGACTTCTGG) dan
2
A682r CNGAGAAGA AASGC) (GAASGC (Bourne et al. 2001). Tootal volume caampuran reaksi PCR sebanyak 50 μl dengan koomposisi μ ddH2O, 5 µl 10x sebagai berrikut: 31,5 μl Buffer KOD D Hot Start, 3 μl 25mM MgSO M 4, 5 µl dNTPs, 1,5 1 μl masing--masing primeer, 1,5 μl DNA templaate, dan 1 μl KOD Hot Staart DNA Polymerase (1U/μl). Amplifikasi A d dilakukan selama 30 siklus mengggunakan messin PCR (Perkin Ellmer Biosysttem, USA) dengan kondisi reaaksi PCR seebagai berikuut: pradenaturasi (94ºC, 5 menitt), denaturasi (94ºC, 1 C, 1 menit), elongasi menit), annnealing (54ºC (72ºC, 1 menit), m dan poost-elongasi (75ºC, ( 7 menit). Am mplikon dilarrikan pada 1% gel agarosa kem mudian diwarrnai dengan Ethidium E Bromide (EtBr). ( Visuualisasi pitaa DNA dilakukan menggunakaan perangkaat UVTransluminaator. Analisis utan DNA A dan Perunu Bioinformaatika. Perunuutan nukleotidda pada DNA hasill amplifikasii dilakukan dengan memanfaatkkan jasa perussahaan sekuennsing 1st Base di Siingapura. Sekkuen yang diperoleh d dibandingkaan dengan data sekuenn yang terdapat padda GenBank menggunakan m program Blast-N dann Blast-X dari situs NCBI (N National Center for Biotechnology gy Informationn) untuk MO dari mengetahui tingkat kemirripan gen pMM formatika isolat yang dianalisa. Annalisis bioinfo S menggunakaan software Bioedit Sequence Alignment Editor E dan MEGA M 5.0 (Taamura et al. 2011).
Tabel T 1
M Morfologi koloni isolat bakteri b metanotrof BG m GM 1 dan SK KM 14 paada media NM MS
Isolat
M Morfologi kolooni
BGM 1
Putih, licin, cembung Krem jingga,, l licin, cembunng
SKM S 14
Kecepatan buh tumb 12 haari 10 haari
(A A)
HASIL n dan Pen ngkulturan Bakteri Peremajaan Metanotroff Isolat bakteri metaanotrof BGM M 1 dan SKM 14 yaang ditumbuhkkan pada meddia NMS + 1% metaanol selama 14 1 hari menuunjukkan morfologi koloni k yang berbeda b (Tabeel 1 dan Gambar 1). Koloni isolat BGM 1 berwarna b KM 14 berwarrna krem putih dan kooloni isolat SK jingga. Keccepatan pertum mbuhan kolonni kedua isolat juga berbeda. Isoolat BGM 1 tumbuh d lebih cepat dibandingkan isolat SKM 14.
(B B)
Gambar G 1 K Koloni isolat bakteri metaanotrof yaang ditumbuuhkan pada media N NMS + 1% m metanol. (A) Koloni K BGM 1 berw rwarna putih h. (B) K Koloni SKM 14 berwarnaa krem jinngga. Gen pMMO Amplifikasi A O dan Visu ualisasi Amplikon A DNA hasil ampllifikasi Visualisasii menggunakan m n primer A A189f dan A682r menunjukkan m pita DNA bberukuran ~3 300 bp untuk u isolat BGM B 1 dan ~ ~500 bp untuk k isolat SKM S 14 (Gam mbar 2).
3
M
1
Tabel T 2
2
Hassil analisis seekuen ampliko on gen pMM MMO dengaan menggu unakan program BLAST T-N
% Sekueen bakteri yang homolog iidentitas BGM B Gen acyl-coA a 87%a dehyddrogenase 1 p pada Xanthhobacter autottrophicus Py2 SKM S Gen subunit s B 84%b cytoochrome 14 bc1 pada Sinorrhizobium fredii HH103 a 245/281 nuklleotida overlap ap b 135/160 nukkleotida overlaap Isolat I
~ 500 5 bp ~ 3000 bp
h amplifikkasi gen Gambar 2 Pita DNA hasil pMMO daari isolat bakteri metanotrof BGM B 1 dan SKM S 14. (Keterangan M = markker 1 kb S 14, DNA ladder,, Sumur 1 = SKM Sumur 2 = BG GM 1). dan Analisis DNA Perunutan Bioinformaatika Hasil analisis sekuuen amplikon pMMO program 2 BGM 1 menggunakan m (Lampiran 2) BLAST-N menunjukkann tingkat keemiripan 87% (245/2281 nukleotiida overlap) dengan sekuen genn acyl-coA dehydrogenasse pada Xanthobacteer autotrophiicus Py2. Seedangkan sekuen a amplikon p pMMO SKM M 14 menunjukkaan tingkat kem miripan 84% (135/160 ( nukleotida overlap) o dengaan sekuen genn subunit B cytochrom me bc1 pada Sinorhizobiuum fredii HH103 (Taabel 2 dan Lampiran L 3). Analisis menggunakaan program BLAST-X terhadap sekuen amplikon BGM 1 menunjukkann tingkat d dengan A Acyl-CoA kemiripan 71% m album dehydrogenaase pada Methhylomicrobium BG8. Sedanngkan sekuenn amplikon SKM S 14 menunjukkaan tingkat kemiripan 62% % dengan Cytochromee b pada Methylocystis M s SC2 sp. (Tabel 3 dann Lampiran 3)).
No. N ak kses CP00 C 07 781. 1
HE61 H 68 890. 1
Table T 3 Hassil analisis sekkuen ampliko on gen pMM MMO dengaan menggu unakan program BLAST T-X Isolat I BGM B 1
SKM S 14
Sekueen bakteri yang homolog Acyyl-CoA dehyddrogenase p pada Methyylomicro bium m album B BG8 Cytocchrome b p pada Methhylocystis spp. SC2
% identitas 71%
No. N ak kses ZP P_0 98 865 56 66.1
62%
YP P_0 06 659 02 200. 1
PEMBAH HASAN b mettanotrof BG GM 1 Isolat bakteri memiliki m moorfologi kolooni yang berbeda dengan d SKM 14. Kolonii BGM 1 berrwarna putih p sedangkan SKM 114 berwarna krem jingga (Tabeel 1). Warnna koloni bakteri b dipengaruhi d o oleh pigmen yyang diproduk ksinya. Bakteri B metannotrof menghhasilkan berm macammacam m pigmeen terlarut dann tak larut. Pigmen P terlarut t sepertti putih, krem m, dan oranyee lebih sering s ditemuukan (Murrelll & Dalton 1992). Selain S itu, beberapa peeneliti melap porkan produksi p piggmen kuningg atau keco oklatan (Hanson ( & Haanson 1996), pink muda (E Eller & Frenzel F 2001), serta pigmenn oranye kemerahan dan d karotenoiid (Holt et al. 1994). Pigm mentasi dipengaruhi d o oleh faktor geenetis, faktorr umur
4
biakan, dan tahapan fisiologis bakteri (Murrell & Dalton 1992). Oksidasi metan pada bakteri metanotrof diinisiasi oleh enzim methane monooxygenase (MMO) yang mampu menambahkan satu atom oksigen ke dalam molekul metan untuk membentuk senyawa metanol. Selain mengkatalisis reaksi oksidasi metan, enzim MMO terikat membran (pMMO) juga berperan dalam proses degradasi senyawa hidrokarbon terhalogenasi seperti trikloroetilen (Dispirito et al. 1992). Enzim pMMO tersusun atas tiga subunit yaitu α, β, dan γ yang masing-masing disandikan oleh gen pmoA, pmoB, dan pmoC (Semrau et al. 1995). Amplifikasi gen pMMO menggunakan primer A189f dan A682r menghasilkan pita DNA dengan ukuran ~500 bp dan ~300 bp berturut-turut untuk isolat BGM 1 dan SKM 14. Analisis sekuen amplikon dari BGM 1 menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X berturut-turut menunjukkan kemiripan tertinggi dengan sekuen gen (87%) dan asam amino pada protein (71%) acyl-coA dehydrogenase Xanthobacter autotrophicus Py2. Sedangkan analisis sekuen amplikon dari SKM 14 menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X berturut-turut menunjukkan kemiripan tertinggi dengan sekuen gen (84%) dan asam amino pada protein (62%) subunit B cytochrome bc1 Sinorhizobium fredii HH103. Hasil analisis kedua sekuen amplikon tersebut tidak sesuai dengan gen target (pMMO pada bakteri metanotrof). Ketidaksesuaian hasil analisis tersebut diduga disebabkan antara lain oleh spesifitas primer yang rendah, sekuen yang dianalisis terlalu pendek, atau keterbatasan data base pada GeneBank. Primer A189F/A682r diduga kurang spesifik untuk mengamplifikasi gen pMMO bakteri tropis walaupun primer ini berhasil diaplikasikan untuk mendeteksi serta menganalisis keragaman gen pMMOA metanotrof di padang rumput dan oaks di Denmark (Bourne et al. 2001). Holmes et al. (1995) melaporkan bahwa primer A189F/A682r juga dapat mengamplifikasi gen Ammonium Mono-oxygenase (AMO) yang terdapat pada bakteri pengoksidasi amonium. Selain primer tersebut, gen pMMO juga dapat diamplifikasi menggunakan primer A189f/mb661 yang lebih spesifik untuk mendeteksi gen pMMO bakteri metanotrof (Bourne et al. 2001). Ketepatan dan nilai tingkat kemiripan pada hasil analisis kesejajaran sekuen menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X juga sangat dipengaruhi oleh
panjang sekuen DNA yang dianalisis dan kelengkapan data base yang terdapat pada GeneBank. Semakin panjang sekuen yang dianalisis dan semakin banyak data base yang terdapat pada GeneBank, maka semakin tinggi tingkat ketepatan dan nilai tingkat kemiripan yang akan diperoleh. Sebagian besar data yang terdapat pada GenBank berasal dari sampel daerah temperate. Sedangkan sekuen DNA yang dianalisis pada penelitian ini berasal dari bakteri tropis. Oleh karena itu, hasil analisis sekuen amplikon gen pMMO yang diperoleh dalam penelitian ini tidak sesuai dengan gen target.
SIMPULAN Morfologi isolat BGM 1 dan SKM 14 memperlihatkan perbedaan warna koloni, tepian, dan elevasi. BGM 1 memperlihatkan warna koloni putih, tepian licin, dan elevasi cembung, sedangkan SKM 14 memperlihatkan warna koloni krem jingga, tepian licin, dan elevasi cembung. Analisis sekuen amplikon dari BGM 1 menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X berturut-turut menunjukkan kemiripan tertinggi dengan sekuen gen (87%) dan asam amino pada protein (71%) acyl-coA dehydrogenase Xanthobacter autotrophicus Py2. Sedangkan analisis sekuen amplikon dari SKM 14 menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X berturut-turut menunjukkan kemiripan tertinggi dengan sekuen gen (84%) dan asam amino pada protein (62%) subunit B cytochrome bc1 Sinorhizobium fredii HH103. Ketidaksesuaian hasil analisis tersebut diduga disebabkan antara lain oleh spesifitas primer yang rendah, sekuen yang dianalisis terlalu pendek, atau keterbatasan data base pada GeneBank.
SARAN Perlu dilakukan lebih lanjut penelitian terhadap gen pMMO BGM 1 dan SKM 14 dengan menggunakan primer yang lebih spesifik.
DAFTAR PUSTAKA Astuti DD. 2009. Karakterisasi Fisiologi dan Identifikasi Molekuler Isolat-Isolat Bakteri Metanotrof Asal Sawah Wilayah Bogor dan Sukabumi [skripsi]. Bogor: Fakultas MIPA, Institut Pertanian Bogor.
5
Bourne DG, McDonald IR, Murrell JC. 2001. Comparison of pmoA PCR primer sets as tools for investigating methanotroph diversity in three Danish soils. Appl Environ Microbiol 67:3802-3809. Conrad R and Rothfus F. 1991. Methane oxidation in the soil surface layer of aflooded rice field and the effect of ammonium. Biol Fertil Soil 12:28-32. Dispirito AA et al. 1992. Trichloroethylene oxidation by the membrane associated methane monooxygenase in type I, type II and type X methanotrophs. Biodegradation 2:151–164. Eller G, Frenzel P. 2001. Changes in activity and community structure of methaneoxidizing bacteria over the growth period of rice. Appl Environ Microbiol 67:23952403. Graham DW, Korich DG, Leblanc RP, Sinclair NA, Arnold RG. 1992. Application of a colorimetric plate assay for soluble methane monooxygenase activity. Appl Environ Microbiol 58:2231-2236. Hanson R, Hanson TE. 1996. Metanotropic bacteria. J Microbial Rev 60:439-471.
related. FEMS Microbiol Lett 132:203– 208. Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT, Williams ST. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Ed ke-9. Lippincott William & Wilkins: a Wolter Kluwer Co. Lazo GR, Roffey R, Gabriel DW. 1987. Conservation of plasmid DNA sequences and pathovar identification of strain Xantholomonas campestris. Pytopathology 77: 1461-1467. Murrell JC, Dalton H. 1992. Methane and Methanol Utilizers. New York: SpringerVerlag. Semrau et al. 1995. Particulate methane monooxygenase genes in methanotrophs. J Bacteriol 177:3071-3079. Stanley SH, Prior SD, Leak DJ, Dalton H. 1983. Copper stress underlies the fundamental change in intracellular location of methane monooxygenase in methane-oxidizing organisms: studies in batch and continuous culture. Biotechnol Lett 5:487-492.
Hapsari W. 2008. Isolasi dan karakterisasi bakteri metanotrof asal sawah di Bogor dan Sukabumi [skripsi]. Bogor : Institut Pertanian Bogor.
Tamura K et al. 2011. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol 28:2731-2739.
Holmes AJ, Costello A, Lidstrom ME, Murrell JC. 1995. Evidence that particulate methane monooxygenase and ammonia monooxygenase may be evolutionarily
Whittenburry RKC, Phillips, Wilkinson JG. 1970. Enrichment, isolation and some properties of methane utilizing bacteria. J Gen Microbiol 61:205-218.
LAMPIRAN
7
Lampiran 1 Komposisi media Nitrate Mineral Salt (NMS) 300 ml + 1% metanol 1.
120 µl NH4Cl
2.
1200 µl CaCl2
3.
0.3 g MgSO4
4.
150 µl Trace Element
5.
1632 µl KH2PO4
6.
0.3 gr NaNO3
7.
2151 µl Na2HPO4
8.
6 g agar
9.
300 ml akuades
10. 1% metanol
8
Lampiran 2 Sekuen pita DNA isolat BGM 1 dan SKM 14 BGM 1
SKM 14
9
10
Lampiran 3 Hasil sekuen gen pMMO, BLAST-N, dan BLAST-X isolat BGM 1 dan SKM 14 A. Urutan nukleotida gen pMMO isolat BGM 1 ACGACACCGTGAGGAAGAAGGGGTCCACCACCTCGTCGTTGGACTTGTCG CCGTCGACGATGGGGCCCACGAGAGCCTCCTTGGACATCACCTCCTTTTC CACCACGATGGGCCCCGACTGGTTGCCGCGGAGGCCCAGGCCGTCCCACT CGGAGGGGTTGGCCTTCACCTCGTCCTTGGTGACGAGGAAGGGGAAAGGT CGGAATAGTCACCAGAGAATCCGGGGCTGGTGGTCTGCACTATGTACCAG TCTCAAAAGCCTCCGGAGGTGGTCCAGGAGGCCTTCTTCTCCGCCT B. Hasil BLAST-N sekuen gen pMMO isolat BGM 1 dengan data GenBank
C. Hasil BLAST-X sekuen gen pMMO isolat BGM 1 dengan data GenBank
11
D. Urutan nukleotida gen pMMO isolat SKM 14 CAACCTGTTCTCGTCTCTGAACGAGATCATCCCGGGTGTCGGCACCGCCATCGTCG AATGGCTGTGGGGCGGCTACTCCGTCTCCGGCACGACGCTGAACCGCTTCTTCTCG CTCCACTACCTGCTGCCGTTCGTGCTTGCCGGCCTGGTCGTCCTGCACATCTGGGC GCTGCACGTCGCGGGTCAGAACAATCCGACGGGTCTCGACATCAAGACCAAGGCC GACGCCGTGCCGATGTTCCCGTTTGCGGTTGCCAAGGACGCAGTCGGCCTGTTCGC GTTCCTGCTGCTGTTCGCCT E. Hasil BLAST-N sekuen gen pMMO isolat SKM 14 dengan data GenBank
12
F. Hasil BLAST-X sekuen gen pMMO isolat SKM 14 dengan data GenBank
