BAB IV ISOLASI DAN KARAKTERISASI GEN CHITINASE ASAL 5 KULTIVAR PISANG1 Abstrak Chitinase adalah enzim katalitik yang dihasilkan oleh tanaman yang mempunyai peranan sebagai protein pertahanan tanaman terhadap patogen. Dalam penelitian ini, fragmen gen chitinase diisolasi dan dikarakterisasi dari 5 kultivar pisang Indonesia, yaitu: Rejang, Klutuk Wulung, Kepok, Ambon Hijau dan Barangan. Fragmen gen chitinase telah berhasil diisolasi dari DNA genom 5 kultivar pisang tersebut dan disandi dengan MaChi. Selanjutnya fragmen tersebut dikarakterisasi dan dianalisis, meliputi analisis BLASTp, pensejajaran dan filogenetik. Fragmen gen MaChi teridentifikasi mengandung 3 exon (438 pb) dan 2 intron (158 pb), dan dari 5 produk amplifikasi PCR diperoleh delapan sekuen gen chitinase yang mempunyai keragaman basa nukleotida di dalamnya. Berdasarkan hasil analisis sekuen, fragmen MaChi tersebut mengandung daerah terkonservasi yang menjadi ciri dari glikosida hidrolase famili 19 dan mempunyai identity yang tinggi dengan gen chitinase kelas I atau II.
Kata kunci: chitinase, isolasi, karakterisasi molekular, pisang 1
Bab ini telah dikirim ke Journal of Mathematical and Fundamental Sciences untuk dipublikasi dengan judul: Chitinase (MaChi) Gene from Indonesian Banana Plant: Isolation, Characterization, and the Use as Molecular Marker for Disease Resistance
62
ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF CHITINASE GENE FROM 5 BANANA CULTIVARS1 Abstract Chitinase is a catalytic enzyme produced by plants as defense protein against pathogens. In this study, fragments of chitinase gene were isolated and characterized from five Indonesian banana cultivars, e.i: Rejang, Klutuk Wulung, Kepok, Ambon Hijau and Barangan. The fragments of chitinase gene have been successfully isolated from genomic DNA and assigned by MaChi. The fragments were characterized and analyzed, employed BLASTp, multiple alignment and phylogenetic analysis. Fragments of MaChi gene contained three exons (438 bp) and two introns (158 bp). From five PCR products represent five banana cultivars, we obtained eight chitinase gene sequences with nucleotide sequence variabilities. Based on the result of nucleotide sequence analysis, the MaChi fragments contained a typical glycoside hydrolase conserved region of chitinase family 19 and exhibited a high sequence identity to either class I or class II chitinase.
Keywords: banana, chitinase, isolation, molecular characterization 1
This chapter has been submitted to the Journal of Mathematical and Fundamental Sciences, entitled: Chitinase (MaChi) Gene from Indonesian Banana Plant: Isolation, Characterization, and the Use as Molecular Marker for Disease Resistance
63
Pendahuluan Pisang adalah tanaman pangan terpenting keempat di dunia, terutama di negara-negara yang sedang berkembang dan menjadi makanan pokok bagi 400 juta penduduk di dunia (CTB Trade for Development 2011). Namun demikian, produksi pisang menghadapi kendala beberapa penyakit serius seperti layu bakteri dan Fusarium (Molina 2010). Perbaikan kultivar untuk ketahanan terhadap penyakit bisa dikembangkan baik menggunakan metode pemuliaan konvensional maupun program rekayasa genetika. Sayangnya sampai saat ini informasi genetik gen ketahanan tanaman pisang terhadap layu FOC ras 4 tropika masih terbatas (Li et al. 2012). Namun demikian beberapa penelitian telah menghasilkan tanaman pisang transgenik yang tahan terhadap layu FOC ras 1, walaupun pengujian masih dalam taraf rumah kaca (Paul et al. 2011; Mohandas et al. 2013). Interaksi antara tanaman dan patogen bisa terjadi dalam bentuk reaksi kompatibel ataupun inkompatibel (Flor 1947). Perwujudan dari reaksi inkompatibel dari adalah respon ketahanan terhadap penyakit (Agrios 2005). Respon ketahanan dari tanaman pada umumnya dikendalikan oleh 2 kelas gen, yaitu gen ketahanan (R-gene) dan gen respon pertahanan (DR-gene) (Yulong 2006). Reaksi tidak kompatibel antara produk gen ketahanan dari tanaman dan produk dari gen avirulen (Avr-gene) patogen akan memicu aktivasi respon pertahanan dari tanaman inang, yang sering termasuk di dalamnya produksi pathogenesis-related (PR) proteins. Sampai saat ini sebanyak 17 kelompok protein PR telah ditemukan dan dikarakterisasi (Edreva 2005). Sejumlah pengujian enzimatik secara in vitro menunjukkan bahwa protein PR-3 menghasilkan aktivitas chitinase. Chitinase adalah enzim yang mempunyai peranan yang kritis dalam pertumbuhan dan perkembangan cendawan, berperanan penting dalam pertahanan terhadap cendawan patogen, dan parasitisme serangga oleh cendawan entomopatogen. Pentingnya chitinase dalam berbagai mekanisme pertahanan telah banyak dikaji (Graham & Sticklen 1994; Zhang et al. 2013). Chitinase (EC. 3.2.1.14) merupakan enzim dengan aktivitas glikosida hidrolase dan mengkatalisis degradasi chitin. Enzim ini terdapat pada berbagai organisme dan berperanan penting baik secara fisiologi maupun ekologi. Chitinase menghidrolisis ikatan β-1,4 glycosidic dari chitin (Dahiya et al. 2006), yang akan menghasilkan pelemahan dinding sel dan menyebabkan sel peka terhadap tekanan osmosis. Enzim chitinases (PR-3) dan β-1,3-glucanases (PR-2) dapat bekerja secara sinergis menghambat pertumbuhan cendawan baik secara in vitro maupun dalam tanaman (Selitrennikoff 2001). Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi chitinase dari fragmen DNA genom asal 5 kultivar pisang Indonesia meliputi analisis BLASTp, pensejajaran dan filogenetik sekuen hasil amplifikasi.
Bahan dan Metode Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan mulai bulan Agustus sampai Desember 2012 di laboratorium Pemuliaan dan Biologi Molekuler Tanaman, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian IPB.
64
Bahan Penelitian dan isolasi DNA Kultivar pisang yang digunakan Rejang (AA), Klutuk Wulung (BB), Ambon Hijau (AAA), Barangan (AAA) dan Kepok (ABB), sedangkan bahan tanaman yang digunakan adalah daun muda tanaman hasil perbanyakan kultur jaringan yang telah berumur 2 bulan setelah aklimatisasi. Isolasi DNA berdasarkan metode CTAB (Doyle & Doyle 1987) yang dimodifikasi oleh Das et al. (2009). Selanjutnya stok DNA hasil isolasi disimpan dalam lemari pendingin bersuhu -20°C sampai siap untuk digunakan. Perancangan Primer dan PCR Sebanyak 2 pasang primer, Chi2-1 dan Chi2-2, didisain berdasarkan sekuen chitinase kelas II asal Musa spp. (FJ040802 dan FJ222751) yang ada di pangkalan data GenBank NCBI, menggunakan perangkat lunak Primer3 (http://biotools. umassmed.edu/ bioapps/primer3_www.cgi). Runutan basa nukleotida primer yang digunakan dalam penelitian ini ditampilkan pada Tabel 9. Reaksi PCR dilaksanakan dengan volume 25 µl menggunakan KAPA2GTM PCR Kit (Kapa Biosystems Inc., USA), yang komposisinya terdiri atas 5.0 µl 5 X buffer PCR (di dalamnya terkandung 1.5 mM Mg2+), 0.5 µl MgCl2 25 mM, 0.5 µl dNTPs 10 mM, 1.0 µl masing-masing primer dengan konsentrasi 10 µM (primer forward dan reverse), 30 ng DNA genom, 0.1 µl Taq DNA polymerase (5 U µl-1) dan15.4 µl ddH2O. Proses PCR menggunakan mesin GeneAmp® PCR System 2400 (Perkin Elmer). Denaturasi cetakan DNA pada awal reaksi pada suhu 95 °C selama 3 menit, diikuti dengan 35 kali siklus 95 °C selama 10 detik, 57 °C selama 10 detik dan 72 °C selama 3 detik, dan diakhiri dengan satu siklus 72 °C selama 10 menit. Produk PCR dipisahkan berdasarkan ukuran dengan menggunakan elektroforesis gel agarose 1 % pada mesin elektroforesis dengan tegangan 80 V selama 25 menit. Selanjutnya dilakukan pewarnaan gel menggunakan ethidium bromide dan visualisasi menggunakan transluminator UV. Produk PCR yang menghasilkan pita tunggal dan jelas dikirim ke 1stBASE (Malaysia) untuk proses perunutan basa nukleotida (sequencing). Analisis sekuen produk PCR Untuk mengetahui identitas fragmen DNA hasil amplifikasi PCR, dilakukan analisis dengan cara membandingkan sekuen DNA dan prediksi asam amino dengan aksesi yang terdeposit pada pangkalan data GenBank NCBI menggunakan alogaritma BLASTn dan BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Translasi sekuen DNA menjadi asam amino menggunakan perangkat lunak Tabel 9
Sekuen primer PCR yang digunakan untuk mengamplifikasi gen chitinase asal fragmen DNA genom pisang dan ukuran produk yang diharapkan Produk yang Primer Sekuen diharapkan (pb) Chi2-1 (F) 5’-CACGAAGAAGAGGGAGATCG-3’ 447 Chi2-1 (R) 5’-CCGTTGATGGAGTTGGTGAT-3’ Chi2-2 (F) 5’-CACGAAGAAGAGGGAGATCG-3’ 438 Chi2-2 (R) 5’-ATGTTGGTGGTGACACCGTA-3’
65
DNAMAN ver. 4.03 (Lynnon Biosoft, Quebec, Canada). Analisis pensejajaran sekuen prediksi asam amino produk PCR dengan 12 sekuen protein chitinase asal tanaman lain yang terdeposit dalam bank data NCBI, yaitu: Musa AB (ACJ06635), Rhododendron irroratum (ADF47472), Triticum aestivum (AAX83262), Arachis hypogaea (ADF87393), Theobroma cacao (EOX95466), Malus domestica (AAM12890), Elaeis guineensis (AEL89178), Oryza sativa (CAA82850 dan BAB21377), Gossypium hirsutum (AAD11255), Hevea brasiliensis (CAD24068), dan Arabidopsis thaliana (NM_191010), menggunakan perangkat lunak GeneDoc ver. 2.7 (Nicholas et al. 1997). Pohon filogenetik didisain berdasarkan metode Neighbor-Joining menggunakan perangkat lunak MEGA5 (Tamura et al. 2011).
Hasil dan Pembahasan Amplifikasi PCR Menggunakan Primer Spesifik Chitinase. Produk amplifikasi pita tunggal yang berukuran sekitar ~600 pb diperoleh dari DNA genom semua kultivar menggunakan pasangan primer Chi21-2 (Gambar 19). Produk dengan ukuran yang sama juga diperoleh dengan menggunakan pasangan primer Chi2-1. Namun demikian produk hasil amplifikasi menggunakan pasangan primer Chi2-1 sangat tipis dan tidak jelas (gambar tidak ditampilkan). Oleh karena itu hanya 5 produk PCR (satu produk PCR mewakili satu kultivar pisang) hasil amplifikasi PCR menggunakan pasangan primer Chi2-2 yang dikirim ke 1stBASE (Malaysia) untuk diproses runutan basa nukleotidanya. Hasil dari proses perunutan basa nukleotida (sequencing) menghasilkan semua produk PCR berukuran 596 pb. Ukuran fragmen DNA lebih besar dari produk yang diharapkan yaitu sebesar 438 pb. Karena cetakan DNA yang digunakan dalam rekasi PCR adalah DNA genom, maka lebih besarnya produk PCR dari yang diharapkan mengindikasikan adanya intron dalam sekuen produk PCR tersebut. Seperti yang telah diduga sebelumnya, terdapat 2 intron yang tersisip dalam sekuen hasil amplifikasi PCR dari semua kultivar pisang. Sebagai contoh dari sekuen DNA dan residu prediksi asam amino dari produk PCR yang berasal dari salah satu kultivar (Rejang) ditampilkan pada Gambar 20.
1000 500
Gambar 19 Elektroferogram produk amplifikasi PCR yang berasal dari DNA genom 5 kultivar pisang, menggunakan pasangan primer Chi2-2; 1=DNA ladder 100 pb, 2-6=Secara berurutan merupakan produk PCR dari Rejang, Klutuk Wulung, Kepok, Ambon Hijau dan Barangan.
66
Analisis Sekuen Fragmen DNA Genom yang Teramplifikasi Analisis pensejajaran sekuen DNA hasil amplifikasi PCR dengan sekuen chitinase kelas II asal Musa AB, yang tersedia pada pangkalan data GenBank NCBI (aksesi no. FJ222751), mengidentifikasikan adanya 2 intron yang tersisip di antara ekson pada posisi nukleotida 57 sampai 126 dan 281 sampai 368 dari fragmen produk PCR (Gambar 20). Seperti sifat intron pada umumnya, sekuen intron yang teridentifikasi mengandung basa nukleotida TA yang relatif tinggi, yaitu 51.4 % dan 50 %, dan sekuen dimulai dengan GT dan diakhiri dengan AG. Sekuen ekson yang teridentifikasi berukuran 438 pb. Ekson tersebut menyandi 148 residu asam amino. Bagian pertama dari ekson yang teridentifikasi dari fragmen genom yang teramplifikasi menyandikan 18 residu asam amino, mengandung motif SHETT, dan bagian ketiga menyandikan 78 residu asam amino yang mengandung motif NYNYG. Bagian kedua yang terletak di antara bagian pertama dan ketiga, yang menyandi 52 residu asam amino, tidak mengandung motif spesifik. Motif terkonservasi NYNYG berhubungan dengan situs aktif katalitik yang sangat penting dan terdapat pada sebagian besar basic chitinase (Collinge et al. 1993). Motif NYNYG juga terdapat pada chitinase kelas VII yang berasal dari tanaman kapas (Li & Liu 2003). Adanya motif SHETT dan NYNYG juga dilaporkan pada protein gen chitinase yang diisolasi dari tanaman stroberi (Khan 2002). Fwd primer
Rev primer
Gambar 20 Contoh sekuen DNA dan prediksi asam amino dari hasil amplifikasi PCR asal DNA genom pisang Rejang, menggunakan primer spesifik chitinase. Intron ditandai dengan huruf kecil pada sekuen DNA. Residu asam amino di dalam kotak adalah sebagian motif terkonservasi dari chitinase. Huruf kapital di bawah sekuen DNA adalah sekuen prediksi asam amino. Tanda panah di atas sekuen DNA adalah posisi primer forward (fwd) dan reverse (rev).
67
Berdasarkan adanya motif SHETT dalam produk amplifikasi PCR, dapat disimpulkan bahwa produk amplifikasi tersebut diidentifikasi sebagai fragmen gen chitinase yang berasal dari Musa spp. Berdasarkan hasil sekuensing dari 5 produk amplifikasi PCR diperoleh delapan sekuen dengan variasi nukleotida di dalamnya. Delapan fragmen chitinase yang diisolasi dari DNA genom pisang dalam penelitian ini disandi dengan MaChi_Rjg yang berasal dari Rejang, MaChi_Klt#1 dan #2 berasal dari Klutuk Wulung, MaChi_Kpk#1 dan #2 berasal dari Kepok, MaChi_AH#1 dan #2 berasal dari Ambon Hijau, dan MaChi_Br berasal dari Barangan. Semua sekuen tersebut (delapan sekuen) telah masuk dalam pangkalan data GenBank NCBI dengan nomor aksesi JX984595, JX984596, JX984597, JX984598, JX984599, JX628916, JX628917, dan JX628918. Sequence Identity Chitinase Asal Pisang Berdasarkan analisis BLASTp (Altschul et al. 1997) sekuen prediksi asam amino dari fragmen DNA yang diperoleh dari penelitian ini, terungkap bahwa fragmen DNA tersebut mempunyai kemiripan residu asam amino yang signifikan dengan sejumlah prediksi asam amino dari cDNA chitinase yang berasal dari tanaman. Hal ini terlihat dari persentase identity yang tinggi. Identity asam amino dari semua aksesi berkisar 50 % sampai 90 % (Tabel 10). Query coverage dan nilai E dari sekuen yang dianalisis, masing-masing berkisar 79 % sampai 100 % dan 1e62 – 9e34 (Tabel 10). Berdasarkan hasil analisis BLASTp juga diketahui bahwa sekuen residu prediksi asam amino dari fragmen DNA genom yang teramplifikasi dari penelitian ini mempunyai identity 90 % dengan sekuen asam amino chitinase kelas II yang berasal dari Musa AB (ACJ06635) yang terdeposit dalam bank data NCBI (Tabel 10). Tabel 10 Sequence identity residu prediksi asam amino dari fragmen chitinase yang diisolasi dari pisang Rejang (MaChi_Rjg) dan 12 chitinase yang berasal dari tanaman lain yang terdeposit dalam pangkalan data GenBank NCBI. Penentuan nilai E, persentase query coverage dan identitas sekuen mengunakan alogaritme BLASTp (Altschul et al. 1997) Aksesi ACJ06635 ADF47472 AAX83262 CAD24068 AMM12890 CAA82850 AAD11255 EOX95466 ADF87393 AEL89178 NP_191010 BAB21377
Query coverage (%) Musa AB Group class II chitinase 100 Rhododendron irroratum class II chitinase 100 Triticum aestivum class II chitinase 99 Hevea brasiliensis subsp. brasiliensis class 100 I chitinase Malus domestica class II chitinase 93 Oryza sativa class I chitinase 100 Gossypium hirsutum class I chitinase 100 Theobroma cacao class II chitinase 100 Arachis hypogaea class II chitinase 100 Elaeis guineensis class II chitinase 100 Arabidopsis thaliana class IV chitinase 79 Oryza sativa class IV chitinase 86 Diskripsi
Nilai Identity E (%) 1e-92 90 4e-80 81 8e-77 75 4e-68 72 2e-65 2e-59 5e-68 1e-66 1e-66 1e-62 9e-34 2e-39
71 71 69 68 67 64 50 52
68
Chitinase dikelompokkan dalam glikosida hidrolase famili 18 dan 19 (Henrissat & Bairoch 1993). Anggota dari kedua famili chitinase tersebut dibedakan berdasarkan residu asam amino, struktur 3 dimensi (3D) (Hart et al. 1995; Hahn et al. 2000; Perrakis et al. 1994) dan mekanisme reaksi katalitik. Anggota dari chitinase famili 18 secara luas terdistribusi pada berbagai organisme seperti bakteri, cendawan, virus dan hewan. Chitinase kelas III dan V yang telah teridentifikasi pada tumbuhan tingkat tinggi termasuk dalam chitinase famili 18. Di lain pihak, chitinase famili 19 terdiri dari chitinase kelas I, II dan IV dan sebagian besar terdapat pada tumbuhan. Namun demikian, hasil penemuan yang terbaru mengungkapkan adanya chitinase kelas IV pada Streptomyces (Watanabe et al. 1999) dan Actinobacteria (Kawase et al. 2004; Tsujibo et al. 2003), hal ini mengindikasikan bahwa sebaran yang lebih luas dari chitinase kelas IV yang termasuk dalam famili 19 tidak terbatas hanya pada tumbuhan saja, tetapi juga spesies bakteri yang lain. Sebagai anggota dari glikosida hidrolase famili 19, 4 daerah terkonservasi terdapat pada residu prediksi asam amino. Selain itu 2 residu glutamate (E), sebagai asam amino katalisis, terkonservasi dalam famili glikosida hidrolase tersebut. Residu serine (S) atau threonine (T), sebagai asam amino hidroksil dan berperanan sebagai pengikat molekul air, juga terkandung dalam famili glikosida hidrolase tersebut. Chitinase kelas I mempunyai semua fitur yang merupakan ciri dari hidrolase glikosida famili 19. Di lain pihak, chitinase kelas II mempunyai fitur yang mirip dengan kelas I, kecuali tidak adanya chitin binding dan hinge region. Analisis pensejajaran residu prediksi asam amino dari fragmen genom DNA yang diisolasi pada penelitian ini dengan 12 protein chitinase asal tanaman lain menunjukkan adanya domain terkonservasi dari glikosida hidrolase chitinase famili 19 (Gambar 21). Berdasarkan residu asam amino terkonservasi, fragmen DNA genom yang teramplifikasi pada penelitian ini kemungkinan besar adalah chitinase kelas I atau kelas II yang berasal dari tanaman pisang. Hasil analisis filogenetik menggunakan metode Neighbor-Joining ditampilkan pada Gambar 22. Hasil analisis sekali lagi memperlihatkan sekuen MaChi yang teridentifikasi pada penelitian ini mempunyai kemiripan residu asam amino yang tinggi dengan chitinase kelas I dan II. Sekuen MaChi yang teridentifikasi juga mempunyai hubungan kekerabatan yang dekat dengan gen chitinase yang diisolasi dari Musa AB (aksesi # ACJ06635). Di lain pihak sekuen MaChi mempunyai hubungan yang jauh dengan chitinase kelas IV (Gambar 22). Sebagai anggota dari glycoside hydrolase family 19 chitinase, 4 motif terkonservasi ditemukan pada semua runutan prediksi asam amino MaChi dari kultivar pisang, yaitu 2 residu glutamate (E), sebagai asam amino katalis, ditemukan pada semua sekuen. Residu serine (S) atau threonine (T) sebagai asam amino hidroksil dan berperan dalam mengikat molekul air. Adanya molekul air sangat diperlukan dalam reaksi katalisis (Brameld & Goddard, 1998). Analisis filogenetik digunakan untuk membandingkan delapan runutan asam amino chitinase pisang yang dikode gen MaChi_Rj, MaChi_Klt#1 dan #2, MaChi_Kpk#1 dan #2, MaChi_AH#1 dan #2, dan MaChi_Br dengan 12 protein chitinase dari GenBank NCBI. Pohon filogenetik (Gambar 22) memperlihatkan bahwa protein dari MaChi mempunyai kemiripan asam amino yang tinggi dengan kelompok chitinase kelas I dan kelas II, dan khususnya dengan chitinase kelas II dari Musa AB, tetapi tidak sama dengan chitinase kelas IV.
69
C1
C3
C2
C4
Gambar 21 Hasil analisis pensejajaran sekuen residu asam amino yang diprediksi dari sekuen fragmen produk yang diamplifikasi dari DNA genom kultivar pisang Indonesia (MaChi_Rjg, MaChi_Klt#1 dan #2, MaChi_Kpk#1 dan #2, MaChi_AH#1 dan #2, dan MaChi_Br) dan yang berasal dari chitinase yang tersedia pada GenBank NCBI. Domain terkonservasi dari chitinase ditandai dengan C1, C2, C3 dan C4. Residu aktif ditandai dengan segitiga hitam, dan residu hidroksil ditandai dengan segitiga putih.
70
Chi_II_ACJ06635
62
MaChi_AH#1
45 25 30 80
MaChi_Br MaChi_AH#2 MaChi_Kpk#2
84
69
MaChi_Klt#2 MaChi_Klt#1
86 53
MaChi_Kpk#1 MaChi_Rjg
30
Chi_II_ADF47472 Chi_I_CAA82850
24
Chi_II_AAM12890
14 97
Chi_II_AAX83262 Chi_I_AAD11255 Chi_I_CAD24068
59
Chi_II_ADF87393 Chi_II_EL89178
100 85
Chi_II_EOX95466 Chi_IV_NP_191010 Chi_IV_BAB21377
100
0.05
Gambar 22 Dendogram hasil analisis filogenetik sekuen residu prediksi asam amino chitinase yang berasal dari tanaman pisang dan 11 tanaman lain berdasarkan analisis pensejajaran menggunakan ClustalW2 dan dibuat berdasarkan metode Neighbor-Joining. Angka pada sumbu percabangan adalah nilai bootstrap (1000 ulangan). Skala yang ada di bawah pohon mewakili panjang cabang yang setara dengan rataan substitusi asam amino per situs. Berdasarkan hasil pensejajaran sekuen prediksi asam amino (Gambar 21), terlihat adanya perbedaan residu antar sekuen MaChi, seperti terlihat pada residu asam amino nomor 22, 36, 37, 39, 43, dan seterusnya. Perbedaan residu tersebut disebabkan oleh perbedaan basa nukleotida penyusun kodon. Hal ini mengindikasikan adanya substitusi basa nukleotida (SNP) antar sekuen MaChi tersebut. Keberadaan SNP tersebut berpotensi untuk dapat dikembangkan sebagai marka molekuler.
Simpulan Dalam penelitian ini telah berhasil diisolasi fragmen produk amplifikasi PCR dari DNA genom 5 kultivar pisang. Fragmen MaChi tersebut berukuran 596 pb dan terdiri atas 2 intron (158 pb) dan 3 exon yang berukuran 438 pb, dan menyandi 148 residu asam amino. Berdasarkan hasil proses perunutan basa nukleotida dan analisis prediksi asam amino, dari 5 produk amplifikasi PCR yang mewakili 5 kultivar pisang, diperoleh delapan sekuen MaChi yang mengandung daerah terkonservasi glikosida hidrolase famili 19 dan teridentifikasi sebagai gen chitinase kelas I atau II.
71
Daftar Pustaka Agrios GN. 2005. Plant Pathology. Ed ke-5. Burlington: Elsevier Academic Pr. hlm 125-174. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nuc Acids Res 25:3389-3402. Brameld KA, Goddard WA III. 1998. The role of enzyme distortion in the single displacement mechanism of family 19 chitinases. Proc NatL Acad Sci USA95:4276–4281,. Collinge DB, Kragh KM, Mikkelsen JD, Nielsen KK, Rasmussen U, Vad K. 1993. Plant chitinases. Plant J 3:31-40. CTB Trade for Development. 2011. La Banane, un Fruit en Sursis, Agence Belge de Développement, Bruxelles. Dahiya N, Tewari R, Tiwari RP, Hoondal GS. 2006. Biochemical aspects of chitinolytic enzymes: A review. App Microbiol Biotech 71:773–782. Das BK, Jena RC, Samal KC. 2009. Optimization of DNA isolation and PCR protocol for RAPD analysis of banana/plantain (Musa spp.). Int J Agricul Sci 1(2):21-25. Doyle JJ, Doyle JL. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull 19:11-15. Edreva A. 2005. Pathogenesis-related proteins: research progress in the last 15 years. Gen Appl Plant Physiol 31:105-124. Flor HH. 1947. Current status of the gene-for-gene concept. Annu Rev Phytopathol 9:275-296. Graham LS, Sticklen MB. 1994. Plant Chitinases. Can J Bot 72:1057–1083. Hahn M, Hennig M, Schlesier B, Hõhne W. 2000. Structure of jack bean chitinase. Acta Crystal Sect D Biol Crystal 56:1096–1099. Hart PJ, Pfluger HD, Monzingo AF, Hollis T, Robertus JD. 1995. The refined crystal structure of an endochitinase from Hordeum vulgare L. seeds at 1.8 Å resolution. J Mol Biol 248:402–413. Henrissat B, Bairoch A. 1993. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem J 293:781– 788. Kawase T, Saito A, Sato T, Kanai R, Fujii T, Nikaidou N, Miyashita K, Watanabe T. 2004. Distribution and phylogenetic analysis of family 19 chitinases in Actinobacteria. App Environ Microbiol 70:1135–1144. Khan AA. 2002. Characteriazation of Chitinase Activities, and Cloning, Analysis, And Expression Of Genes Encoding Pathogenesis Related Proteins In Strawberry [disertasi]. Lousiana (US): Louisiana State University. Li J. Liu J-Y. 2003. A novel cotton gene encoding a new class of chitinase. Acta Bot Sin 45:1489-1496. Li CY, Deng GM, Yang J, Viljoen A, Jin Y, Kuang RB, Zuo CW, Lv ZC, Yang QS, Sheng O et al. 2012. Transcriptome profiling of resistant and susceptible Cavendish banana roots following inoculation with Fusarium oxysporum f.sp. cubense tropical race 4. BMC Genomics 13:374 (http://www.biomedcentral.com/ 1471-2164/13/374).
72
Mohandas S, Sowmya HD, Saxena AK, Meenakshia S, Rania RT, Mahmood R. 2013. Transgenic banana cv. Rasthali (AAB, Silk gp) harboring AceAMP1 gene imparts enhanced resistance to Fusarium oxysporum f.sp. cubense race 1. Sci Hort 164:392–399. Molina AB, Williams RC, Hermanto C, Suwanda, Komolog B, Kokoa, P. 2010. Mitigating the threat of banana Fusarium wilt: understanding the agroecological distribution of pathogenic forms and developing disease management strategies. Australia: ACIAR 76 hlm. Nicholas KB, Nicholas HB Jr, Deerfield DW II. 1997. GeneDoc: analysis and visualization of genetic variation. EmbNet News 4:1–4. Paul JY, Becker DK, Dickman MB, Harding RM, Khanna HK, Dale JL. 2011. Apoptosis-related genes confer resistance to Fusarium wilt in transgenic ‘Lady Finger’ bananas. Plant Biotechnol J 9(9):1141-1148. Perrakis A, Tews I, Dauter Z, Oppenheim AB, Chet I, Wilson KS, Vorgias CE. 1994. Crystal structure of a bacterial chitinase at 2.3 Å resolution. Structure 2:1169–1180. Selitrennikoff CP. 2001. Antifungal proteins. Appl Env Microbiol 67:2883-2894. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. 2011. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol 28:2731-2739. Tsujibo H, Kubota T, Yamamoto M, Miyamoto K, Inamori Y. 2003. Characterization of chitinase genes from an alkaliphilic Actinomycete, Nocardiopsis prasina OPC-131. App Env Microbiol 69:894–900. Watanabe T, Kanai R, Kawase T, Tanabe T, Mitsutomi M, Sakuda M, Miyashita K. 1999. Family 19 chitinases of Streptomyces species: characterization and distribution. Microbiol 145:3353–3363. Yulong GAO, Wangzhen GUO, Lei W, Tianzhen Z. 2006. Isolation and characterization of resistance and defense gene analogs in cotton (Gossypium barbadense L.). Sci China Ser C: Life Sci 49(6):530-542. Zhang J, Kopparapu NK, Yan Q, Yang S, Jiang Z. 2013. Purification and characterisation of a novel chitinase from persimmon (Diospyros kaki) with antifungal activity. Food Chem 138:1225–1232.
