ISOLASI DAN KARAKTERISASI GEN PEMBUNGAAN PENYANDI SEPAL DAN PETAL PADA TANAMAN APOMIKSIS
YANTI DWI LESTARI
PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
ABSTRAK YANTI DWI LESTARI. Isolasi dan Karakterisasi Gen Pembungaan Penyandi Sepal dan Petal pada Tanaman Apomiksis. Dibimbing oleh LAKSMI AMBARSARI dan TETTY CHAIDAMSARI. Gen pembungaan pada tanaman buah merupakan gen yang sangat penting karena mempengaruhi proses reproduksi. Pada dasarnya bunga yang baik dapat menghasilkan buah dengan kualitas yang baik pula. Penelitian ini menggunakan bunga manggis sebagai contoh bunga tanaman apomiksis karena manggis memiliki peluang investasi yang baik sebagai komoditi ekspor. Tujuan penelitian ini adalah melakukan isolasi dan karakterisasi gen pembungaan penyandi sepal dan petal yang diharapkan dapat menunjang pembentukan bunga yang lebih baik. Dua pasang primer DNA, Mgs1 dan Mgs2 dihasilkan dari perancangan menggunakan dasar daerah terkonservasi. Isolasi dan karakterisasi dengan teknik Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) menunjukkan kedua primer spesifik dapat mengamplifikasi fragmen gen target dengan ukuran 650 bp. Selanjutnya fragmen ini ditransformasi ke dalam sel kompeten E.coli XL1 Blue dengan vektor pGEMT-Easy, klon transforman lalu diurutkan nukleotidanya dan dianalisis dengan blastx. Hasil menunjukkan E-value dari kedua sekuen gen target adalah 3e-21 dan 6e-25, ini menjelaskan gen target memiliki homologi yang tinggi dengan gen yang sama dari individu lain yang ada pada basis data bank gen. Karakterisasi gen target diawali dengan isolasi RNA beberapa bagian jaringan bunga manggis, kemudian diamplifikasi dengan teknik RT-PCR. Elektroforegram yang diperoleh menunjukkan gen target nampak terdapat pada hampir seluruh jaringan bunga.
ABSTRACT YANTI DWI LESTARI. Isolation and Characterization of Flowering Gene Decoding Sepal and Petal at Apomixis Crop. Under the direction of LAKSMI AMBARSARI and TETTY CHAIDAMSARI. Flower gene at fruit crop represents a very important gene because its function that affected reproduction process. Basically good flowers can also yield good fruits. This research using mangosteen flower as apomixis crop flower subject, because its prospect as a very good exporting commodity investment. This research target are isolating and characterizing the flower gene decoding sepal and petal, that expected to support forming a better flower. Two pairs of DNA primers, Mgs1 and Mgs2 were made based on the conserved regions, isolation and characterization with Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technique demonstrated that both the specific primer pairs were able to amplify the targeted gene fragment with predicted size 650 bp. Furthermore this fragment were transformated at competent cell E.coli XL-1 Blue by using pGEMT-Easy as vector, the nucleotide of cloned transforman were sorted and analyzed by blastx. The result showed E-value of the both sequences are 3e-21 and 6e-25, its clarifies that the targeted gene have a high homology with the same gene from different individual on gene bank data base. Characterization of the targeted gene is initialed with RNA isolation from several mangosteen flower tissues and then its amplified with RT-PCR technique. Electrophoregam shows that the targeted gene is found in every flower tissues.
ISOLASI DAN KARAKTERISASI GEN PEMBUNGAAN PENYANDI SEPAL DAN PETAL PADA TANAMAN APOMIKSIS
YANTI DWI LESTARI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biokimia
PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
Judul Skripsi : Isolasi dan Karakterisasi Gen Pembungaan Penyandi Sepal dan Petal pada Tanaman Apomiksis Nama : Yanti Dwi Lestari NIM : G44104039
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr. Tetty Chaidamsari, M.Si Anggota
Dr. Laksmi Ambarsari, M.S Ketua
Diketahui
Dr. drh Hasim, DEA Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, Sang Tiratana karena berkat kekuatan keyakinan penulis dapat menyelesaikan penulisan karya ilmiah ini. Isolasi dan Karakterisasi Gen Pembungaan Penyandi Sepal dan Petal pada Tanaman Apomiksis merupakan judul karya ilmiah hasil penelitian yang dilakukan penulis mulai bulan Maret hingga Juni 2008. Penulis melakukan penelitian di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetika Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia Penulis ingin mengucapkan terimakasih kepada Dr. Laksmi Ambarsari, M.S dan Dr. Tetty Chaidamsari, M.Si selaku komisi pembimbing yang telah memberikan bimbingan dan pengarahan baik dalam proses penelitian hingga penulisan karya ilmiah ini, serta kepada staf laboratorium biologi molekuler yang telah berkenan membantu penulis menghadapi kesulitan-kesulitan selama melaksanakan penelitian. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan untuk Papa, Mama, Ko Adi, Indra dan Ka Dika atas dukungan dan semangatnya. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.
Bogor, Agustus 2008
Yanti Dwi Lestari
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 18 Januari 1986 dari pasangan Wahyudi dan Elly. Penulis merupakan anak kedua dari tiga bersaudara. Tahun 2004 penulis lulus dari SMU Negeri 2 Bogor dan melanjutkan pendidikannya di IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih Program Studi Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam sebagai pilihan studi di IPB. Selama mengikuti perkuliahan penulis aktif dalam kegiatan-kegiatan organisasi kemahasiswaan selama beberapa periode (CREBs periode 2005/2006 dan 2006/2007). Penulis juga aktif mengikuti beberapa acara-acara kepanitiaan di IPB seperti masa pengenalan fakultas MIPA 2006/2007 dan masa pengenalan departemen biokimia 2006/2007. Penulis melakukan Praktik Lapang di Laboratorium Biologi Mikroba, Bidang Biologi Molekular dan Mikrob, Pusat Penelitian Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong, Bogor.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL.................................................................................................. ix DAFTAR GAMBAR........................…………………………………………..... ix DAFTAR LAMPIRAN.......................................................................................... x PENDAHULUAN........…………………………………………………….......... 1 TINJAUAN PUSTAKA Tanaman Apomiksis ........…………………………………………......... Garcinia mangostana....................………………………………............. Gen Pembungaan……..……………………………………...................... Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction ......………………...
1 1 2 3
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ..……………………………………………………....... 4 Metode .……………………………………………………………........ 4 HASIL DAN PEMBAHASAN............................................................................. 6 SIMPULAN........................................................................................................... 11 SARAN.................................................................................................................. 11 DAFTAR PUSTAKA ...……………………………………………………....... 12 LAMPIRAN ......................................................................................................... 14
DAFTAR TABEL Halaman 1 Primer yang digunakan pada proses PCR......................................................
6
2 Hasil analisis blastx urutan basa fragmen hasil sekuensing........................... 10 3 Hasil analisis kuantitatif RNA jaringan bunga............................................... 10
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Bunga manggis..............................................................................................
2
2 Model ABC pada bunga Arabidopsis............................................................
3
3 Tahapan yang berlangsung pada satu siklus PCR.........................................
3
4 Elektroforegram RNA total bunga manggis.....................................................
7
5 Elektroforegram RT-PCR gen target.............................................................
8
6 Elektroforegram PCR koloni.........................................................................
9
7 Elektroforegram plasmid rekombinan......................................................................
9
8 Elektroforegram RNA jaringan bunga manggis............................................ 10 9 Elektroforegram RT-PCR jaringan bunga manggis...................................... 11
DAFTAR LAMPIRAN
1
Halaman Tahapan penelitian....................................................................................... 15
2
Preparasi RNA total.....................................................................................
16
3
Sintesis First strand ………………….............................………………...
18
4
Transformasi …..……………..................................................................… 19 Isolasi DNA Plasmid…………………………….……………................... 20
5 6 7 8 9
Vektor pengklonan pGEM-T Easy............................................................... 21 Penjajaran hasil sekuensing sampel dengan primer Mgs1............................ 22 Penjajaran hasil sekuensing sampel dengan primer Mgs2............................ 22 Hasil analisis blastx sampel dengan primer Mgs1………………………… 23
10 Hasil analisis blastx sampel dengan primer Mgs2…………………………. 23
1
PENDAHULUAN Indonesia adalah negara yang memilki kekayaan alam baik flora maupun fauna. Flora Indonesia cukup banyak diminati hingga ke mancanegara. Buah-buah tropika yang dihasilkan oleh Indonesia sudah banyak yang diekspor, salah satunya adalah manggis (Garcinia mangostana). Buah manggis mengandung karbohidrat, kalsium, gula dan beberapa vitamin. Kulit buah manggis juga dapat digunakan untuk menyamak kulit dan sebagai zat pewarna hitam. Keunggulan lain yang dimiliki manggis yaitu, pohon manggis dapat menghasilkan lateks atau resin kuning yang mempunyai aktivitas sebagai anti mikrob. Ekspor manggis dari Indonesia terus mengalami peningkatan dari 425 ton pada tahun 1991 meningkat menjadi 4.868,53 ton (2001), dan 9.304,51 ton pada tahun 2003, namun menurut data Departemen Pertanian, ekspor manggis tahun 2007 mengalami penurunan menjadi 7.414,418 ton (Deptan 2007). Manggis merupakan salah satu tanaman apomiksis yang melakukan regenerasi dengan cara aseksual serta membutuhkan waktu yang lama untuk tumbuh dan berbuah. Masa juvenil manggis yang relatif lama, mencapai 8 hingga 15 tahun serta produktivitas pohon manggis yang relatif rendah karena bunga yang dihasilkan hanya sedikit, mengakibatkan investasi pada tanaman ini belum banyak dilakukan. Selama ini budidaya tanaman manggis masih mengandalkan kebun rakyat. Demikian pula manggis untuk ekspor masih diusahakan dari kebun rakyat tanpa pemanfaatan terapan teknologi dalam perbanyakannya, hal ini tentu berpengaruh terhadap peningkatan produksi dan kualitas buah manggis. Produksi bunga yang sedikit serta lamanya masa juvenil amat dipengaruhi oleh faktor genetik dari pohon manggis. Bunga manggis membuka pada sore hari dan tidak tahan lama, kemudian petal akan segera mengering dan jatuh dari bunga (Yaacob dan Tindall 1995). Menghadapi masalah ini banyak hal dilakukan diantaranya dengan melakukan rekayasa genetika dalam upaya membantu pemuliaan tanaman manggis. Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) adalah teknik yang digunakan untuk melakukan rekayasa genetika dalam penelitian ini. Dengan menggunakan RNA bunga manggis hasil
isolasi sebagai cetakan (template), akan diperoleh amplikon gen target yang selanjutnya diklon pada vektor (pGEM-T Easy) lalu dilakukan sekuensing pada DNA vektor yang telah terklon. Hasil isolasi gen target selanjutnya akan dipelajari regulasinya pada beberapa jaringan bunga manggis. Penelitian bertujuan mengisolasi dan melakukan karakterisasi gen pembungaan penyandi sepal dan petal pada tanaman apomiksis. Hipotesis dari penelitian ini adalah gen pembungaan penyandi sepal dan petal dapat diisolasi dari bunga manggis serta dapat di cek ekspresinya (karakterisasi) pada beberapa jaringan bunga manggis. Keberhasilan mengisolasi dan karakterisasi gen pembungaan tersebut akan menjadi batu pijakan untuk mengubah ekspresi pembungaan pada manggis baik dengan mempercepat masa juvenil maupun dengan mengatur waktu atau periode pembungaan sehingga dapat meningkatkan produksi dan kualitas manggis Indonesia.
TINJAUAN PUSTAKA Tanaman Apomiksis Apomiksis dalam bidang botani dikenal dengan nama apogami yang bermakna reproduksi aseksual tanpa fertilisasi. Apomiksis dapat terjadi pada tanaman berbunga yang disebut agamospermi. Pada tanaman berbunga apomiksis dapat terjadi dalam dua bentuk yang pertama adalah agamogenesis, embrio berkembang dari sel telur yang tidak dibuahi dan dihasilkan tanpa proses miosis. Jenis apomiksis yang kedua yaitu adventitious embryony, sel-sel nuselus yang berkembang menjadi embrio nucelar. Tanaman apomiksis secara genetik sama dengan induknya dari generasi ke generasi selanjutnya. Sifat genetik yang dimiliki oleh tanaman apomiksis sering diminati terutama oleh usaha yang mengandalkan hasil kebun seperti tanaman apel, jeruk, manggis dan beberapa tanaman buah tropis karena diharapkan hasil panen tanaman yang berkembang secara apomiksis akan memiliki sifat yang sama dengan induknya (San B 2005). Garcinia mangostana Manggis (Garcinia mangostana) merupakan salah satu jenis buah tropika yang berasal dari Maluku dan telah menjadi salah satu buah andalan ekspor Indonesia. Tanaman manggis termasuk dalam famili Guttiferae, ordo Theales, divisi Angiospermae. Tanaman ini
2
memiliki habitus pohon berkayu keras, batang lurus, dan bercabang simetris. Tinggi tanaman ini dapat mencapai 9 sampai 18 meter serta memiliki kulit kayu berwarna hijau terang dan halus yang akan berubah menjadi coklat tua sesuai dengan pertambahan umurnya. Pohon manggis memiliki daun yang agak tebal, membujur bulat panjang dengan ujung meruncing dan berwarna hijau terang dengan panjang 8 hingga 15 cm. Bunga manggis (Gambar 1) adalah bunga tunggal dan berpasangan dengan diameter 2 hingga 5 cm, memiliki 4 sepal dan 4 petal berwarna hijau-kuning dengan pinggiran kemerahan, tebal, dan berdaging (Simanjuntak 2006). Bunga manggis merupakan bunga apomiksis (Suhaeri 2003) yang embrionya berkembang tanpa melalui peleburan gamet jantan dan betina, sehingga merupakan embrio vegetatif yang secara genetik sama dengan induknya. Hal ini terjadi karena benang sari manggis rudimenter, yaitu hanya tumbuh kecil lalu kemudian mengering. Buah yang dihasilkan berdiameter 5 hingga 8 cm, kulit berwarna ungu dan isi buah memiliki 4 hingga 8 bagian. Populasi pohon manggis di Indonesia terus berkurang, karena lahan manggis digunakan untuk pembangunan sektor lain dan petani kurang tertarik untuk menanam manggis. Hal ini disebabkan karena pertumbuhan tanaman manggis sangat lambat, masa juvenil manggis terlalu panjang (8-15 tahun), harga bibit sambungan mahal, dan sulit memperoleh bibit yang baik dalam jumlah besar (Poerwanto 1995). Manggis adalah jenis tanaman yang tumbuh lambat. Pertumbuhan manggis yang lambat disebabkan buruknya sistem perakaran manggis, karena tidak mempunyai bulu akar dan mudah rusak akibat lingkungan yang kurang menguntungkan yang selanjutnya dapat menyebabkan lambatnya penyerapan nutrisi, rendahnya laju fotosintesis, dan pembelahan sel pada meristem (Poerwanto 2000). Semakin tua umur tanaman manggis, rasio bobot akar dan rasio luas daun serta panjang akar semakin meningkat (Hidayat 2004). Selain masalah perakaran yang dihadapi, tanaman manggis juga memiliki masa juvenil yang panjang. Perbanyakan manggis dengan biji, baru menghasilkan buah pada umur 8-15 tahun setelah penanaman. Perbanyakan vegetatif dengan penyambungan dapat mempersingkat umur produksi buah menjadi lima tahun walaupun
batang bawah manggis baru dapat disambung setelah berumur 2-3 tahun (Poerwanto 2000). Namun, teknik penyambungan hanya mempercepat masa berbuah tanpa meningkatkan produktivitas. Lamanya masa juvenil serta sedikitnya produksi bunga atau buah manggis berhubungan dengan produksi hormon pertumbuhan dan aktivitas gen-gen pembungaan. Hal ini merupakan faktor-faktor yang terkait secara genetik.
Gambar
1
Bunga manggis. (Sumber: http://www.deptan.go.id) Gen Pembungaan
Gen-gen yang terlibat dalam pengaturan proses pembungaan biasanya tergolong pada kelompok gen MADS-box yang mempunyai peran kunci dalam spesifikasi identitas organorgan bunga (Soltis et al. 2002). Gen pembungaan berfungsi dari fase awal pembentukan identitas pembungaan hingga pembentukan bunga. Pada tanaman tingkat tinggi, organ pembungaan diatur dalam empat kelompok yang terdiri atas sepal, petal, stamen dan carpel. Spesifikasi identitas organ bunga dapat dijelaskan dengan model ABC (Ferrario et al. 2004). Model ABC dari perkembangan bunga angiospermae ditemukan oleh E. Coen dan Elliot Meyerowitz pada tahun 1991 (Gambar 2). Ekspresi gen kelas A spesifik membentuk sepal pada whorl (lingkaran) pertama. Kombinasi gen kelas A dan B spesifik untuk pembentukan petal pada lingkaran kedua. Kombinasi gen-gen B dan C spesifik dalam pembentukan stamen pada lingkaran ketiga. Sedangkan ekspresi gen kelas C akan spesifik dalam pembentukan karpel pada lingkaran keempat. Penelitian mengenai proses dan gen-gen yang terlibat dalam pembungaan telah banyak dilakukan pada tanaman model seperti Arabidopsis thaliana dan Antirrhinum majus, namun pada tanaman berkayu penelitian ini masih jarang dilakukan. Beberapa tanaman berkayu yang telah diteliti mengenai gen-gen yang berhubungan dengan pembungaan dan termasuk dalam kelompok MADS-box adalah
3
Betula pendula (Elo et al. 2001), apel (Yao et al. 2001), dan citrus (Pilliterri et al. 2004). Pena et al. 2001 juga telah meneliti bahwa pada tanaman jeruk, masa juvenil dapat diperpendek dengan mengekspresikan gen pembungaan APETALA1 maupun LFY dari Arabidopsis.
Gambar
2 Model ABC pada bunga Arabidopsis. (Sumber: Ferrario et al. 2004)
Reverse Transcriptase –Polymerase Chain Reaction Reaksi PCR merupakan teknik penggandaan molekul DNA secara in vitro melibatkan penggunaan bagian kecil dari pasangan komplementer DNA yang akan disintesis (primer) dan DNA polimerase. Teknik ini pertama kali diperkenalkan oleh Kary Mullis pada tahun 1983. Reaksi PCR sangat sensitif, dengan menggunakan DNA template dalam jumlah kecil dapat menggandakan sampai lebih dari sejuta kali sehingga menghasilkan DNA dalam jumlah yang sangat besar (Jonas, 2003). Reaksi PCR telah banyak mengalami modifikasi salah satunya Reverse Transcriptase–Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) yang merupakan modifikasi teknik PCR yang paling sederhana (PCR biasa dan proses transkripsi balik). Bidang biologi molekular menggunakan teknik RTPCR untuk mengamplifikasi potongan molekul RNA yang telah diketahui. Utas RNA yang akan digunakan sebagai cetakan akan mengalami proses transkripsi balik. Pada proses ini primer oligo-dT akan menempel pada bagian poli-A mRNA. Selanjutnya enzim reverse transcriptase akan mengkatalisis pembentukan utas pertama kemudian dilakukan penambahan RNase untuk menyingkirkan RNA, sehingga hasil yang diperoleh adalah utas tunggal
cDNA untuk proses PCR berikutnya. Secara komersial reverse transcriptase dapat diisolasi dari sel yang terinfeksi Moloney murine leukimia Virus (MMLV) dan Avian myleoblastosis Virus (AMV). Sintesis utas pertama kemudian dilanjutkan dengan proses PCR biasa untuk mengamplifikasi gen target. cDNA yang diperoleh digunakan sebagai template. Teknik ini juga didukung oleh beberapa komponen pereaksi, yaitu Taq DNA polimerase, oligonukleotida primer, dNTP, dan larutan bufer. Taq DNA polimerase adalah enzim tahan panas yang diisolasi dari bakteri termofilik Thermus aquaticus, enzim ini akan mengkatalisis proses PCR. Primer merupakan oligonukleotida yang menempel pada daerah spesifik yang diinginkan sehingga DNA polimerase dapat mengamplifikasi fragmen gen yang diinginkan. Sementara dNTP dan bufer dalam reaksi PCR, keberadaan dan konsentrasi kedua komponen ini dapat mempengaruhi spesifitas amplikon. Reaksi PCR merupakan sebuah siklus yang berlangsung dalam tiga tahapan (Gambar 3). Siklus diawali dengan tahap denaturasi pada suhu tinggi (90-95 ºC) yang mengakibatkan untai ganda DNA mengalami pemisahan menjadi untai tunggal. Tahap selanjutnya adalah penempelan primer (annealing) biasanya terjadi pada suhu 45-55 ºC, primer akan melekat pada template DNA sesuai dengan komplementasi basa nukleotidanya. Tahap yang terakhir yaitu pemanjangan nukleotida (elongation), pembentukan molekul DNA menggunakan molekul-molekul dNTP yang merupakan komponen dari template pada suhu 70-75 ºC.
Gambar 3 Tahapan yang berlangsung pada satu siklus PCR. (Sumber Innis et al. 1991)
4
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan yang digunakan sebagai sampel adalah bunga manggis dari perkebunan manggis Leuwiliang Bogor. Larutan dan bahan yang digunakan adalah N2 cair, basa trizma (Sigma), polivinil pirolidon (PVP), NaCl 5 M, metanol 70%, larutan bufer trisHCl 1 M pH 8.0, etanol absolut, N-cetylN,N,N-trimetilamonium bromida (CTAB), larutan EDTA 0.5 M pH 8.0, isopropanol, ddH2O, natrium asetat 3 M pH 5.2, larutan kloroform : isoamilalkohol (CI) 24:1, larutan fenol : kloroform:isoamilalkohol (25:24:1), loading buffer (Brom fenol biru 2.5%; sukrosa 40%), etidium bromida 1% (w/v), Agarosa, Axyprep DNA gel extraction kit (Axygen), molecular water (MW), Taq Polimerase (Bioron), Escherichia coli XL1Blue, pGEM-T Easy vektor (Promega), media LB (Luria Bertani), High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche), T4 DNA ligase, X-Gal, IPTG dan Ampisilin. Alat-alat yang digunakan adalah mesin PCR (Biometra T-Personal), mesin vakum DNA speed vacum 110 savant, eppendorf sentrifus 5417R, sentrifus beckman allegra 64R, laminar air flow cabinet, inkubator bergoyang, pipet eppendorf, gel doc, pendingin Decby -70 °C, vortex, bak elektroforesis gel agarosa, oven microwave, scalpel, pinset, microtube ukuran 2000 µL dan 50 µL (Axygen). Metode Perancangan Primer Primer dirancang menggunakan program primer3 yang tersedia pada situs web http://frodo.mit.edu/. Hal pertama yang dilakukan dalam perancangan primer adalah memasukkan data urutan basa DNA target, urutan dapat diketahui dengan mencari data gen target pada tanaman dikotil lain yang telah tersedia datanya di www.ncbi.nlm.nih.gov. Tanaman yang digunakan untuk merancang primer gen pembungaan penyandi sepal dan petal diantaranya yaitu Arabidopsis dan Citrus. Setiap primer disusun dengan kriteria, memiliki 20-28 bp (base pair; pasang basa), mengandung G+C 50%, pasangan primer (forward dan reverse) tidak saling komplemen, urutan basa primer masingmasing tidak saling membentuk struktur sekunder dan melting temperature (Tm °C) berkisar 57-63 °C (Innis et al. 1991) serta
ukuran perkiraan fragmen hasil PCR antara 100-800 bp. Isolasi RNA Bunga Total Tanaman Apomiksis RNA total diisolasi dari bunga manggis yang mewakili tanaman apomiksis dengan menggunakan prosedur yang diuraikan oleh Chaidamsari et al. (2005). Sebanyak 1 gram jaringan dihaluskan dengan nitrogen cair dan dihomogenkan dengan bufer ekstraksi (20 mM EDTA pH 8.0, 2% CTAB, 2M NaCl, 100 mM tris HCl pH 8.0, PVP) dan 1% ßmerkaptoetanol (yang telah dihangatkan) pada suhu 65 °C selama 1 jam dan divortex pelan setiap 15 menit. Setelah satu jam tabung didinginkan pada suhu kamar kemudian diekstraksi dengan kloroform : isoamilalkohol (24:1) dengan volume yang sama sebelum penambahan dan dikocok hingga kedua lapisan membentuk emulsi. Campuran ekstraksi tersebut kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 15000 rpm selama 15 menit pada suhu ruang, supernatan diambil lalu dilakukan ekstraksi ulang sebanyak volume supernatan yang diperoleh menggunakan fenol : kloroform : isoamilalkohol (25:24:1), dan disentrifugasi pada kondisi yang sama. Supernatan yang dihasilkan diekstraksi kembali dengan kloroform : isoamilalkohol (24:1) lalu disentrifugasi pada kondisi yang sama sebanyak dua kali pengulangan. Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan 10 M LiCl hingga konsentrasi akhir 2 M, RNA diendapkan semalam pada 4 °C. Endapan RNA yang sudah dimalamkan lalu disentrifugasi dengan kecepatan 11000 rpm selama 30 menit pada 4 °C, pelet yang dihasilkan dilarutkan dengan 500 µL MW. Lapisan atas dipindahkan ke dalam tabung mikro baru bebas RNase dan diekstraksi kembali dengan fenol, campuran fenol : kloroform : isoamilalkohol (25:24:1), dan kloroform : isoamilalkohol (24:1) masingmasing sebanyak volume supernatan yang diperoleh lalu disentrifugasi dengan kecepatan 11000 rpm selama 15 menit pada 4 °C. Supernatan kembali dipindahkan ke dalam tabung mikro lalu ditambahkan etanol absolut 3 kali volume supernatan dan Na-asetat 3M pH 5,8 sebanyak 0,1 kali volume supernatan yang diperoleh. Campuran kemudian diendapkan selama satu malam pada suhu -70 °C, lalu disentrifus dengan kecepatan 11000 rpm selama 30 menit pada 4 °C, RNA yang diperoleh dicuci dengan 70% etanol dingin, kemudian dikeringkan dengan mesin vakum dan dilarutkan dengan 30 µL MW.
5
Sintesis First Strand cDNA Sintesis first strand (utas pertama) cDNA dilakukan menggunakan kit SuperScriptTM II Reverse Transcriptase (Invitrogen). Volume reaksi sebanyak 20 µL untuk setiap 1 ng sampai 5 µg total RNA. Proses pemanasan dan inkubasi dilakukan dengan mesin PCR (Biometra T-personal). Sintesis dilakukan dalam tabung mikro steril dengan komposisi 9 µL ddH2O, 1 µL 10 mM dNTP mix, 1 µg RNA total bunga manggis dan 1 µL 10 p mol/µL oligo (dT)23 (Ambion). Campuran tersebut dipanaskan pada 65 °C selama 5 menit dan setelah itu segera dimasukkan kedalam penangas es, kemudian ditambahkan 4 µL first strand buffer 5X dan 2 µL 0,1 M DTT. Dicampur dengan segera dan diinkubasi pada 42 °C selama 2 menit. Kemudian ditambahkan 1 µL (200 unit) enzim SuperscriptTM II Reverse Transcriptase dan dicampur dengan pemipetan naik turun. Setelah diinkubasi pada 42 °C selama 50 menit, reaksi dinonaktifkan dengan pemanasan 70 °C selama 15 menit, selanjutnya ditambahkan 1 µL (2 unit) RNase H dan diinkubasi pada 37 °C selama 20 menit. Utas pertama yang cDNA terbentuk selanjutnya digunakan sebagai template untuk amplifikasi fragmen gen penyandi sepal dan petal. Amplifikasi Gen Pembungaan Penyandi Sepal dan Petal dengan Metode RT-PCR Template yang digunakan pada reaksi ini adalah utas pertama cDNA bunga manggis total dan prosedur yang digunakan adalah mengikuti prosedur penggunaan kit Superscript TM II RT (Invitrogen) yang dimodifikasi. RT-PCR dilakukan dengan volume campuran PCR 25 µL yang terdiri atas 2,5 µL bufer lengkap 10x, 1 µL dNTPs, 1 µL primer F, 1 µL primer R, 0,5 µL Taq polimerase, 1 µL template, 18 µL MW. Amplifikasi RT-PCR menggunakan mesin PCR Biometra T-personal dengan program sebagai berikut: initial denaturasi 94 °C selama 5 menit dilanjutkan dengan denaturasi 94 °C selama 45 detik, annealing 50 °C selama 45 detik, ekstensi 72 °C selama 5 menit. Hasil amplifikasi diverifikasi pada gel agarosa 1%. Ekstraksi dan Purifikasi Amplikon dari Gel Prosedur yang digunakan mengikuti prosedur penggunaan Axyprep DNA gel extraction kit (Axygen). Pita DNA yang ukurannya sesuai dengan yang diharapkan
selanjutnya diekstraksi dari gel. Hasil ekstraksi diverifikasi sebanyak 2 µL pada gel agarosa 1% dan jika positif, selanjutnya diligasi pada vektor kloning. Kloning Fragmen DNA dari Gen Penyandi Sepal dan Petal dengan pGEM-T Easy Hasil amplifikasi yang telah dimurnikan dengan menggunakan Axyprep DNA gel extraction kit (Axygen) disisipkan ke dalam vektor pGEM-T Easy (Promega) menggunakan T4 DNA ligase selama satu jam, 37 ºC. Vektor kemudian ditransformasikan ke dalam E.coli XL-1 Blue yang telah dibuat kompeten. Preparasi sel kompeten dikerjakan sesuai prosedur Okayama et al. (1990). Transformasi dilakukan mengikuti prosedur Doyle (1996). Campuran ligasi ditambahkan ke dalam 200 µL suspensi sel kompeten sebanyak 20 µL. Sel kemudian disebarkan diatas media padat LB agar yang mengandung 100 mg/L ampisilin, 40 mg/L X-Gal, dan 0,1 mM IPTG (LA) kemudian diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37ºC. PCR Koloni Koloni yang terbentuk adalah sel E.coli yang berhasil ditransformasi. Sel yang tidak berhasil tertransformasi akan mati akibat perlakuan ampisilin. Dua jenis koloni akan terbentuk pada cawan petri. Koloni yang berwarna putih menunjukkan sel yang mengandung plasmid yang berhasil diinsersi. Koloni yang berwarna biru mengandung plasmid yang tidak berhasil diinsersi. Setiap koloni putih yang terbentuk diberi nomor dan ditandai. Koloni yang berwarna putih kemudian diambil sedikit dengan tusuk gigi dan dipindahkan ke media LB agar, dan sisanya dimasukkan ke dalam media LB cair yang mengandung ampisilin untuk dikulturkan kembali selama pada suhu 37 ºC dengan kecepatan 150 rpm. PCR koloni dilakukan menggunakan mesin PCR (Biometra T-personal). Proses ini diawali oleh pemecahan sel (lisis) dengan pemanasan pada suhu 96 °C selama 5 menit kemudian suhu turun menjadi 50 °C dan berlangsung selama 90 detik, suhu naik kembali menjadi 96 °C selama 90 detik, lalu 90 detik selanjutnya pada suhu 45 °C, 1 menit pada suhu 96 °C dan 40 °C selama 1 menit. Setelah pemanasan pada proses lisis, campuran PCR (bufer lengkap, MW, dNTPs, primer M13F, M13R dan Taq polimerase) ditambahkan pada setiap sampel. Proses PCR dilanjutkan kembali dengan suhu 94 °C selama 30 detik, 55°C selama 1 menit dan 2 menit pada suhu 72 °C, siklus yang berlangsung sebanyak 30.
6
Isolasi DNA Plasmid Prosedur yang digunakan mengikuti prosedur penggunaan High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche). Isolasi DNA plasmid dilakukan terhadap koloni yang berdasarkan hasil PCR koloni diketahui mengandung plasmid terinsersi fragmen yang diinginkan. Koloni tersebut dikulturkan dalam media LB cair yang telah ditambahkan ampisilin kemudian diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37ºC dengan pengocokan 150 rpm. Kultur cair diberi label sesuai dengan label koloni masing-masing. DNA plasmid yang diperoleh diverifikasi pada gel agarosa 1% untuk melihat kemurniannya. Sekuensing DNA Sekuensing dilakukan di lembaga Eijkman-Jakarta. DNA disikuen menggunakan primer M13-F dan M13-R. Sekuen DNA yang diperoleh selanjutnya dianalisis dengan menggunakan program bioedit dan blastx untuk membandingkan sekuen nukleotida yang ditranslasi pada seluruh open reading frame (ORF) dengan sekuen protein pada basis data. Analisa menggunakan blastx bertujuan untuk mengetahui kesesuaian urutan basa yang kita dapatkan dengan urutan basa yang ada dalam bank data. Diharapkan urutan yang diperoleh mempunyai tingkat homologi yang tinggi (e-value <10-4) dengan gen penyandi sepal dan petal (Claverie 2003). Karakterisasi Gen Pembungaan Penyandi Sepal dan Petal pada Berbagai Jaringan Bunga Manggis Karakterisasi gen pembungaan penyandi sepal dan petal pada berbagai jaringan bunga manggis akan memperlihatkan ekspresi gen tersebut pada jaringan yang diamati. Untuk melihat ekspresi tersebut maka RNA setiap jaringan bunga diisolasi. Jaringan yang digunakan yaitu sepal, petal, putik, kepala putik, benang sari dan tangkai. Isolasi dilakukan sesuai prosedur Chaidamsari et al. (2005) yang telah diuraikan sebelumnya. Selanjutnya hasil isolasi kembali dianalisis dengan teknik RT-PCR kemudian diverifikasi menggunakan gel agarosa 1%.
HASIL DAN PEMBAHASAN Primer Mgs1 dan Mgs2 Keberadaan primer dalam reaksi PCR sangat mempengaruhi hasil amplifikasi reaksi tersebut (amplikon). Primer akan menempel pada daerah spesifik yang diinginkan sehingga DNA polimerase dapat mengamplifikasi fragmen gen target. Primer gen penyandi sepal dan petal pada tanaman apomiksis yang diwakili oleh tanaman manggis dirancang secara spesifik untuk mengenali target. Perancangan primer dilakukan dengan kriteria sebagai berikut, primer memiliki ukuran 20-28 bp (base pair; pasang basa), mengandung 50% G+C, pasangan primer (forward dan reverse) tidak saling komplemen, urutan basa primer masing-masing tidak saling membentuk struktur sekunder dan Tm berkisar 57-63 °C (Innis dan Gelfand 1991). Primer dirancang berdasarkan sekuen gen penyandi sepal dan petal pada tanaman Arabidopsis dan Citrus yang diperoleh dari bank data gen (www.ncbi.nlm.gih.gov). Perancangan primer menghasilkan 2 pasang primer dan diberi nama Mgs1 untuk Arabidopsis dan Mgs2 untuk Citrus (Tabel 1). Pemilihan kedua jenis tanaman ini dengan alasan Arabidopsis mewakili tanaman model yang sering digunakan untuk mengamati gen pembungaan dan Citrus mewakili tanaman dikotil. Jumlah nukleotida pada pasangan primer Mgs1 dan Mgs2 adalah 20-21 bp dengan Tm dibawah 50 °C. Nilai Tm yang rendah dihasilkan dari perhitungan oligonukleotida yang dilakukan oleh Euregentec berdasarkan panjang sekuen, kandungan G+C dalam sekuen, konsentrasi kation seperti Na+ yang juga terkandung dalam primer. Perhitungan tersebut menyebabkan primer yang telah dirancang memiliki Tm yang lebih rendah, namun tetap akan memberikan hasil optimum pada reaksi PCR. Hal ini dibuktikan berdasarkan perhitungan Tm primer secara teoritis Tm (ºC) = 2(A+T) + 4(G+C) (A+T) adalah jumlah nukleotida adenin dan timin sedangkan (G+C) adalah jumlah nukleotida guanin dan sitosin dalam primer. Dari perhitungan teoritis diperoleh Tm yang berkisar 60-66 °C.
Tabel 1 Primer yang digunakan pada proses PCR Nama primer Mgs1-F Mgs1-R Mgs2-F Mgs2-R
Target Sepal dan petal Sepal dan petal Sepal dan petal Sepal dan petal
Sekuen 5’TGTGATGCTGAAGTTGCTGTT3’ 5’TTAAGCAAGGAGGTGGCTGT3’ 5’TGCTGAGGTCGCTTTGATTG3’ 5’TTCCTCCTCATCTCTGGTGCTT3’
Tm (°C) 45,3 46,7 46,7 49,7
Tm Teoritis (°C) 60 60 60 66
7
Suhu annealing yang digunakan pada proses PCR biasanya 2-10 °C dibawah Tm (Sambrook & Russel 2001). Dalam kondisi tersebut primer akan memberikan hasil amplifikasi yang baik. Dalam penelitian ini PCR dilakukan pada suhu annealing 50-55 °C, nilai tersebut terpaut 10 °C di bawah nilai perhitungan Tm teoritis. RNA Total Bunga Manggis Hasil Isolasi Isolasi RNA merupakan tahap awal untuk mengamati ekspresi gen. Gen pembungaan penyandi sepal dan petal yang selanjutnya akan disebut sebagai gen target diperoleh dengan melalui tahapan isolasi RNA bunga total manggis. Secara garis besar proses isolasi RNA terdiri atas tiga tahap yaitu, pemecahan sel yang dilakukan dengan teknik mekanik yaitu pembekuan yang dilanjutkan dengan penggerusan sampel dengan tujuan agar sel mudah dipecahkan dan menjaga RNase dalam keadaan tidak aktif dan tidak mendegradasi RNA. Pada tahapan ini juga digunakan bufer ekstraksi dengan penambahan ßmerkaptoetanol untuk mencegah terjadinya oksidasi yang dapat merusak RNA. Tahap kedua yaitu isolasi dan pemurnian RNA yang meliputi ekstraksi dengan kloroform : isoamilalkohol (24:1), fenol : kloroform : isoamilalkohol (25:24:1), dilanjutkan penambahan LiCl. Ekstraksi menggunakan fenol, kloroform dan isoamilalkohol bertujuan menghilangkan lemak, protein, polisakarida dan pengotor lain karena keberadaan substansi-substansi tersebut dapat mempengaruhi kualitas dan kuantitas RNA yang diisolasi (Tao et al. 2004). Penambahan LiCl secara selektif akan mengendapkan RNA, sementara DNA berada pada bagian supernatan. Dengan demikian kontaminan DNA dapat dihilangkan. Tahap terakhir yaitu pemekatan RNA dengan penambahan Na-asetat yang menyebabkan asam nukleat membentuk kompleks dengan garam sehingga membantu pengendapan dengan etanol (Liu et al. 1998). Hasil isolasi RNA selanjutnya dievaluasi baik kuantitas maupun kualitasnya. Pengukuran secara kuantitatif dilakukan dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 260, 280 dan 230 nm. Nilai absorban lalu dimasukkan ke dalam rumus perhitungan [RNA] = A260 x 40 x fp
A260 adalah absorbansi pada panjang gelombang 260 nm, fp adalah faktor pengenceran (dalam penelitian ini fp sebesar 100) dan 40 adalah nilai yang merupakan perbandingan bahwa nilai 1 pada absorbansi 260 nm sama dengan absorbansi RNA dengan konsentrasi 40 ng/µL. Nilai absorban yang diperoleh masing-masing secara berurutan yaitu 0,547; 0,377 dan 0,424, maka konsentrasi bunga total hasil isolasi adalah 2,188 ng/µL. Nilai absorban pada panjang gelombang 280 dan 230 digunakan untuk mengetahui kemurnian RNA. Menurut Logeman et al. (1997) perbandingan A260/A280 mengindikasikan kontaminan protein dan perbandingan A260/A230 dapat mengindikasikan adanya kontaminan polisakarida. Nilai perbandingan yang menandakan tidak terdapatnya pengotor berada pada kisaran 1,8-2,0 (Asif et al. 2000). Perbandingan absorbansi yang diperoleh dari RNA hasil isolasi yaitu, A260/A280 sebesar 1,449 dan A260/A230 sebesar 1,288. Nilai tersebut menandakan RNA masih memiliki pengotor protein dan polisakarida karena perolehan nilai absorban berada di bawah 1,8. Namun RNA masih dapat digunakan untuk penelitian selanjutnya hal ini ditunjang oleh hasil pengamatan kualitas RNA menggunakan elektroforesis gel agarosa 1% dalam 0,5x larutan TBE, voltase 25 volt selama 1,5 jam (Gambar 4). Elektroforesis tidak menggunakan marker karena hanya bertujuan mengamati bahwa RNA hasil isolasi memiliki integritas yang baik dan tidak terdegradasi. Dua pita RNA yang terbentuk merupakan RNA ribosom (rRNA) dengan subunit 28 S dan 18 S. Perolehan dua pita RNA yang utuh menunjukkan bahwa isolasi RNA bunga total manggis telah berhasil dilakukan.
28 S 18 S Gambar 4 Elektroforegram RNA total bunga manggis. Amplikon Gen Pembungaan Penyandi Sepal dan Petal Tanaman Apomiksis Teknik yang digunakan untuk memperoleh amplikon gen target adalah RT-PCR. Teknik ini menggunakan cDNA sebagai template. cDNA merupakan DNA yang berkomplemen dengan mRNA (Dale 1994) sedangkan mRNA adalah
8
transkrip dari gen-gen yang terekspresi dan membawa pesan berupa informasi genetik dari DNA ke dalam bentuk protein (Darnel et al. 1990). Proses transkripsi balik yang terjadi yaitu oligo-dT dari kit Invitrogen yang digunakan untuk sintesis utas pertama pada penelitian ini akan menempel pada bagian poli-A mRNA. Selanjutnya dengan dikatalis oleh SuperScript TM II Reverse Transcriptase dan penambahan RNase H yang dapat mereduksi aktivitas RNase maka sintesis cDNA dapat berlangsung. Utas pertama dalam bentuk cDNA selanjutnya digunakan sebagai template dalam PCR. Proses PCR dilakukan dengan menggunakan primer spesifik yang telah dirancang sebelumnya yaitu Mgs1 dan Mgs2, suhu annealing 55 °C sebanyak 35 siklus. Penggunaan suhu annealing 55 °C untuk proses PCR berdasarkan dari perhitungan Tm perancangan primer, sementara siklus yang berlangsung sebanyak 35 diharapkan dapat memberikan hasil amplifikasi yang terbaik. Hasil RT-PCR selanjutnya dielektroforesis dengan gel agarosa 1%, voltase 100 volt dan diperoleh amplikon dengan primer Mgs1 berukuran 650 bp dan primer Mgs2 menunjukkan amplikon yang sedikit lebih tinggi dibandingkan amplikon pertama yang menggunakan primer Mgs1 (Gambar 5). Perbedaan ukuran amplikon tersebut dapat terjadi karena sekuen gen individu yang digunakan pada saat merancang primer berbeda. Primer Mgs1 menggunakan sekuen gen target pada Arabidopsis dan primer Mgs2 menggunakan sekuen gen target dari Citrus. Kedua amplikon menunjukkan bahwa isolasi gen pembungaan penyandi sepal dan petal dari tanaman apomiksis yang diwakili oleh tanaman manggis telah dapat dilakukan dengan menggunakan primer Mgs1 dan Mgs2, hal ini dibuktikan dari ukuran amplikon yang sesuai dengan perkiraan ukuran fragmen hasil PCR menggunakan primer hasil perancangan, yaitu antara 100-800 bp. Klon Fragmen Gen Pembungaan Penyandi Sepal dan Petal Hasil RT-PCR Fragmen gen target yang diperoleh dari teknik RT-PCR kemudian ditransformasi menggunakan vektor pengklon pGEM-T Easy dan sel kompeten Escherichia coli (E.coli) XL1-blue yang selanjutnya dikultur pada media LB dengan penambahan ampisilin. Vektor pGEM-T Easy diketahui
M
1
2
650 bp
Gambar 5 Elektroforegram RT-PCR gen target; M=marker; 1=cDNA bunga total manggis dengan primer Mgs1; 2=cDNA bunga total manggis dengan primer Mgs2. merupakan vektor berukuran kecil yaitu 3015 bp. Ukuran tersebut relatif kecil sehingga vektor dapat membawa DNA target cukup banyak dan memudahkan preparasi DNA insert dalam jumlah besar. Selain itu, plasmid berukuran kecil lebih mudah dimasukkan ke dalam sel inang, serta lebih mudah dimurnikan karena DNA yang berukuran besar cenderung lebih rapuh (Sambrook et al. 1991). Hasil klon menampakkan sel berwarna biru dan sel berwarna putih. Seleksi sel yang telah mengandung vektor dilakukan berdasarkan pada marka seleksi yang dimiliki oleh vektor. Marka seleksi biasanya berupa gen yang membawa sifat resisten terhadap antibiotik tertentu dan vektor yang digunakan pada penelitian ini memiliki gen resisten ampisilin. Sel inang yang mengandung vektor nampak berwarna putih dan memiliki enzim ß-laktamase yang disandikan oleh gen resistensi terhadap ampisilin, enzim tersebut dapat memecah molekul ampisilin sehingga sel inang dapat tumbuh pada media dengan ampisilin. Klon yang dilakukan pada penelitian ini menghasilkan sel yang telah mengandung vektor dan yang tidak mengandung vektor. Koloni sel inang dengan vektor terbentuk cukup banyak sehingga dari kedua produk klon masing-masing diambil 10 koloni untuk diamplifikasi dengan teknik PCR koloni dan dicek dengan agarosa 1% dengan voltase 100 volt. Proses PCR koloni dilakukan untuk mengetahui bahwa vektor yang ada dalam sel inang telah terinsersi oleh gen target. Elektroforegram menunjukkan terdapat dua klon transforman dengan primer Mgs1 yang berhasil diinsersi yaitu koloni nomor 1 dan 5,
9
hal serupa juga nampak pada hasil klon fragmen dengan primer Mgs2 yaitu 2 koloni yang terinsersi pada nomor 2 dan 9 (Gambar 6). Keberhasilan dalam proses kloning dapat diamati dari ukuran klon transforman. Fragmen mengalami penambahan ukuran sekitar 200 bp sehingga ukurannya menjadi 850 bp, hal ini mungkin terjadi karena terdapat sekuen promotor dari vektor yang menempel pada gen target. Selanjutnya plasmid rekombinan diisolasi dan dimurnikan dengan menggunakan kit Roche dan dicek pada gel agarosa 1% dan voltase 75 volt. Elektroforegram plasmid rekombinan menunjukkan dua buah pita DNA plasmid. Hasil isolasi DNA plasmid rekombinan memiliki integritas yang baik dan tidak terdegradasi dengan ukuran 3850 bp (Gambar 7). Ukuran plasmid tidak jauh berbeda dengan perkiraan ukuran total plasmid pGEM-T Easy yaitu 3015 bp dan ukuran gen target 650 bp. Hasil klon transforman dan ukuran plasmid rekombinan membuktikan bahwa transformasi gen target ke dalam sel kompeten E.coli XL-1 Blue dengan vektor pengklon pGEM-T Easy telah dapat dilakukan.
1
5
Urutan Nukeotida Gen Pembungaan Penyandi Sepal dan Petal hasil Isolasi Fragmen DNA plasmid hasil klon tersebut kemudian dimurnikan dari gel dan hasilnya dikirim ke Lembaga Eijkman Jakarta untuk ditentukan urutan nukleotidanya. Data hasil sekuensing yang berupa urutan basa, selanjutnya diproses menggunakan program bioedit. Melalui program bioedit, urutan basa yang diperoleh disejajarkan baik forward maupun reverse lalu dianalisis selanjutnya dengan program blastx pada web www.ncbi.nlm.nih.gov untuk membandingkan sekuen nukleotida yang ditranslasi pada seluruh Open reading frame (ORF) dengan sekuen protein dalam database (Claverie dan Notredam 2003). Hasil analisis blastx memberikan keyakinan bahwa fragmen yang terbentuk dari hasil PCR dengan menggunakan primer Mgs1 dan Mgs2 adalah gen target (Tabel 2). Kedua sampel dengan primer yang berbeda memperlihatkan nilai E-value yang lebih rendah dari 10-4. Nilai tersebut memperlihatkan tingkat homologi yang tinggi antara sampel gen target hasil sekuensing dengan data gen pembungaan penyandi sepal dan petal yang tersedia di basis data bank gen.
M
2
9
e d c b a Gambar 6 Elektroforegram klon transforman. PCR dengan primer Mgs1 menunjukkan koloni 1 dan 5 merupakan klon transforman. PCR dengan primer Mgs2 menunjukkan koloni 2 dan 9 merupakan klon transforman. Keterangan: a=100 bp; b=500 bp; c=850 bp; d=1650 bp; e= 12000bp. 1 2 3 4 5 12000 bp 3850 bp 1000 bp
100 bp
Gambar 7 Elektroforegram plasmid rekombinan; 1=plasmid rekombinan koloni 1; 2=plasmid rekombinan koloni 5; 3=marker; 4=plasmid rekombinan koloni 2; 5=rekombinan plasmid koloni 9
10
Tabel 2 Hasil Analisis blastx urutan basa fragmen hasil sekuensing Sampel Bunga total dengan primer mgs1 Bunga total dengan primer Mgs2
Urutan basa pada bank data yang bersesuaian PTM1
Evalue
APETALA1-like MADS-box PTAP1-2
6e-25
2e-22
Karakterisasi Gen Pembungaan Penyandi Sepal dan Petal pada Berbagai Jaringan Bunga Manggis Karakterisasi dilakukan untuk mengetahui ekspresi gen target pada berbagai jaringan bunga manggis. Tahap awal yang dilakukan adalah mengisolasi RNA jaringan bunga manggis yaitu, sepal, petal, putik, kepala putik, benang sari dan tangkai. Prosedur isolasi yang dilakukan sama seperti isolasi RNA total yang telah dilakukan pada awal penelitian ini mengikuti uraian Chaidamsari et al. (2005). Hasil isolasi RNA jaringan memiliki konsentrasi yang berkisar antara 400-1664 ng/µL, sepal memiliki konsentrasi terendah dan konsentrasi RNA tertinggi diperoleh dari jaringan petal selain itu kemurnian dari isolasi RNA dengan perbandingan absorban A260/280 berkisar antara 1,689-2,000 dan perbandingan A260/A230 berada pada kisaran 1,527-1,814 nilai-nilai kemurnian tersebut cukup tinggi (Tabel 3). Kontaminan protein nampak masih terdapat pada sepal sementara jaringan yang lain sudah murni dan kontaminan dalam bentuk polisakarida masih terdapat hampir pada seluruh jaringan kecuali tangkai. Selanjutnya hasil isolasi RNA tersebut dicek dengan gel agarosa, tampak RNA jaringan bunga hasil isolasi dalam keadaan utuh dan tidak terdegradasi (Gambar 8) sehingga dapat dilanjutkan untuk proses amplifikasi. Tahap selanjutnya yaitu RNA hasil isolasi diubah menjadi cDNA melalui sintesis utas pertama. Utas cDNA yang terbentuk kemudian akan digunakan sebagai template
Gambar 8 Elektroforegram RNA jaringan bunga manggis; 1=sepal; 2= petal; 3=putik; 4=kepala putik; 5 = benang sari; 6=tangkai bunga. pada proses RT-PCR untuk memperoleh amplikon gen target pada jaringan bunga manggis. Amplikon yang diperoleh dapat memberikan informasi jaringan apa saja yang memiliki gen target. Primer yang digunakan pada saat RT-PCR hanya Mgs1, karena primer ini memberikan hasil E-value yang lebih tinggi pada saat analisis blastx bila dibandingkan dengan sampel yang menggunakan primer Mgs2. Proses RT-PCR dilakukan dengan beberapa variasi kondisi baik suhu annealing maupun jumlah siklus dengan tujuan memperoleh hasil penampakan ekspresi gen target yang terbaik saat dielektroforesis pada gel agarosa 1% dengan voltase 100 volt. Variasi annealing bertujuan mencari suhu yang tepat sehingga primer dapat menempel dengan baik serta spesifik pada saat amplifikasi berlangsung. Jumlah siklus yang divariasikan bertujuan mencari jumlah siklus yang dapat mengamplifikasi gen target secara optimum Variasi RT-PCR yang pertama yaitu annealing 50 ºC sebanyak 30 siklus, elektroforesis hasil RT-PCR menunjukkan amplikon gen target muncul hampir pada semua jaringan dengan intensitas yang sangat rendah ditunjukkan dengan tipisnya pita yang terbentuk (Gambar 9a). Kondisi RT-PCR selanjutnya yaitu annealing 55 ºC dengan jumlah siklus yang bervariasi yaitu 35, 28 dan 33 siklus. RT-PCR dengan kondisi annealing 55 ºC sebanyak 35 siklus menunjukkan gen target terekspresi pada hampir semua jaringan kecuali benang sari dengan intensitas pita amplikon yang cukup tebal (Gambar 9b), hasil yang agak berbeda ditunjukkan pada kondisi
Tabel 3 Hasil analisis kuantitatif RNA jaringan bunga. 1 2 Sampel Sepal Petal Putik Kepala Putik Benang sari Tangkai
3 A260 4 5A2806 0,100 0,059 0,416 0,231 0,219 0,116 0,347 0,181 0,253 0,123 0,182 0,098
A230 0,065 0,267 0,133 0,207 0,142 0,100
A260/A280 1,689 1,801 1,894 1,920 2,000 1,860
A260/A230 1,527 1,558 1,655 1,676 1,781 1,814
[RNA] (ng/µL) 400 1664 876 1388 1012 728
11
RT-PCR annealing 55 ºC sebanyak 28 siklus gen target kembali terlihat pada setiap jaringan dalam intensitas yang amat kecil sehingga pita yang terbentuk amat tipis (Gambar 9c). Sementara variasi kondisi RTPCR yang terakhir yaitu annealing 55 ºC sebanyak 33 siklus menunjukkan hasil yang tidak jauh berbeda yaitu gen target terdapat dalam intensitas yang rendah pada seluruh jaringan bunga manggis (Gambar 9d). Amplikon dari keseluruhan amplifikasi dengan variasi suhu annealing dan siklus memberikan ukuran yang sama yaitu 650 bp ukuran ini menjelaskan bahwa amplikon merupakan fragmen gen target namun keberadaan fragmen tersebut pada hampir semua jaringan bunga manggis masih dianggap kurang spesifik karena diharapkan gen tersebut hanya terekspresi pada jaringan bunga sepal dan petal saja. Adanya gen target pada hampir semua jaringan dapat terjadi karena tidak menutup kemungkinan gen penyandi sepal dan petal dapat menunjang pembentukan bunga total itu sendiri.
M
1
2
3
4
5
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Primer Mgs1 dan Mgs2 hasil perancangan dapat digunakan untuk mengisolasi gen pembungaan penyandi sepal dan petal pada bunga manggis. Ukuran amplikon gen target sebesar 650 bp dan memiliki homologi yang tinggi, nilai E-value amplikon dengan primer Mgs1 sebesar 2e-22, amplikon dengan primer Mgs2 sebesar 6e-25. Karakterisasi gen target pada jaringan bunga manggis belum memberikan hasil yang spesifik. Saran Perancangan primer baru yang lebih spesifik terhadap gen pembungaan penyandi sepal dan petal sehingga ekspresi pada jaringan bunga lebih spesifik. Dapat dilakukan pencarian kondisi optimum PCR untuk mengamplifikasi gen target dengan baik. Selain itu, dapat dilakukan isolasi full length dari gen pembungaan penyandi sepal dan petal.
6
650 bp
M
1
2
3
4
5
6
5
6
650 bp
(a)
M 1
2
3
650 bp
(c)
4
5
6
M 1 2
3
4
650 bp (b)
(d)
Gambar 9 Elektroforegram RT-PCR jaringan bunga manggis, M= marker; 1=sepal; 2=petal; 3= putik; 4=kepala putik; 5=benang sari; 6=tangkai; (a) annealing 50 ºC, 30 siklus; (b) annealing 55 ºC, 35 siklus; (c) annealing 55 ºC, 28 siklus; (d) annealing 55 ºC, 33 siklus.
12
DAFTAR PUSTAKA Asif et al. 2000. A simple prosedur for the isolation of high quality RNA from ripening banana fruit. Plant Molecular Biology Reporter 18: 109-115. [DEPTAN] Departemen Pertanian. 2007. Ekspor hortikultura Indonesia: Nilai dan volume ekspor buah-buahan. [terhubung berkala]. http://www.deptan.go.id [2 Mei 2008]. Chaidamsari et al. 2005. Isolation and characterization of the MADS-box genes AGAMOUS and APETALA1 homologues from cocoa. Di dalam: Chaidamsari T, editor. Biotechnology for cocoa pod borer resistance in cocoa [Tesis]. Wageningen: Wageningen Universiteit. Claverie JM, Notredame Bioinformatics for Indianapolis: Wiley.
C. 2003. Dummies.
Dale JW. 1994. Molecular Genetic of Bacteria. England: John Wiley and sons. Darnell et al. 1990. Molecular Cell Biology. New York: Scientific American Books. Efendi D. 2007. Isolasi gen pengendali pembungaan dan transformasi Manggis (Garcinia mangostana) dengan gen GmAP1 dan TcAP1 [Laporan Akhir Program Riset Dasar]. Bogor: Pusat Kajian Buah-Buahan Tropika, Institut Pertanian Bogor. Elo
et al. 2001. Three MADS-box genes similiar to APETALA1 and FRUITFULL from silver birch (Betula pendula). Physiologia Plantarum 112: 95-103.
Ferrario S, Immink RG, Angenent GC. 2004. Conservation and diversity in flower land. Cur Opin Plant Biol 7: 84– 91. Hidayat R. 2004. Kajian pola translokasi asimilat pada beberapa umur tanaman manggis (Garcinia mangostana L.) muda. Agrosains 6: 20-25. Inoue H, Nojima H, Okayama H. 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96:23-28.
Innis MA, Gelfand, Sninsky. 1991. PCR Protocols. California: Cetus. Jonas NL. 2003. PCR: Principles, procedures, and parameters. Di dalam: Theophilus BDM, Ralpley R, editor. Methods in Moleculer Biology: PCR Mutation Detection Protocols. New Jersey: Humana Pr. hlm 37-46. Kawasaki E S. 1991. Amplification of RNA. Di dalam: Innis MA, Gelfand, Sninsky, editor. PCR Protocols. California: Cetus. Liu et al. 1998. A method for isolation of total RNA from fruit tissues of banana. Plant Molecular Biology Reporter 16: 1-6. Logemann J, Schell J, Willmizer L. 1987. Improved method for isolation of RNA from plant tissues. Anal Biochem 163: 16-20. Pena et al. 2001. Constitutive expression of Arabidopsis LEAFY or APETALA1 genes in citrus reduces their generation time. Nature Biotech 19: 236-267. Pillitteri LJ, Lovatt CJ, Walling LL. 2004. Isolation and characterization of a TERMINAL FLOWER homolog and its correlation with juvenility in citrus. Plant Physiol 135: 1540-1551. Poerwanto R. 2000. Teknologi budidaya manggis. Di dalam: Diskusi Nasional Bisnis dan Teknologi Manggis. Prosiding Pemantapan Teknologi Spesifik Lokasi Wilayah Barat Melalui Temu Pakar. Bogor, 15-16 Nov 2000. Bogor: Departemen pertanian. hlm 11p. Tao et al. 2004. An effective protocol for the isolation of RNA from the pulp of ripening citrus fruit. Plant Molecular Biology Reporter 22: 305a-305f. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual. Ed ke-1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory. Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual. Ed ke-3. New York: Cold Spring Harbor Laboratory.
13
San B, Dumanoglu. 2005. Determination of the Apomitic Fruit Set Ratio in Some Turkish Walnut (Juglans regia L.) Genotypes. Turki: Fakultas Agrikultur, Universitas Ankara. Simanjuntak J. 2006. Pengaruh pemberian kalium terhadap pertumbuhan dan produktivitas tanaman manggis (Garcinia mangostana L) [skripsi]. Bogor: Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Soltis DE et al. 2002. Trends in plant science. J Plant Sci 7: 22-30. Suhaeri M. 2003. Studi keragaman morfologi buah manggis (Garcinia mangostana L) dari lima lokasi sentra produksi di pulau Jawa [skripsi]. Bogor: Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Yaacob, Tindall HD. 1995. Mangosteen cultivation. FAO p: 1-100. Yao et al. 2001. Parthenocarpic apple fruit production conferred by transposon insertion mutations in a MADS-box transcription factor. PNAS 98: 13061311.
14
LAMPIRAN
15
Lampiran 1 Tahapan penelitian
Rancangan primer spesifik gen pembungaan dan petal
Isolasi RNA bunga manggis
Amplifikasi
Kloning
Sekuensing
penyandi sepal
RNA Total
Fragmen gen target
Koloni Terklon
Lembaga Eijkman
Karakterisasi gen target pada berbagai jaringan manggis
16
Lampiran 2 Preparasi RNA total
Gerus dengan N2 cair dan PVP
1 gr jaringan
Vortex 2’
Campur dengan bufer ekstraksi (650C) + 75 µl ß-merkaptoetanol
12.000 g; 15’ 12°C
Ekstrak dengan 1 x vol fenol : kloroform : isoamilalkohol (PCI) (25:24:1)
12.000 g; 15’ 12°C
Supernatan dipindah ke ependorf lain
Supernatan dipindah ke ependorf lain
Ekstrak dengan 25 ml kloroform : isoamilalkohol (CI)
Diamkan 5’, suhu ruang
Ekstrak dengan 1 x vol kloroform : isoamilalkohol (CI) (24:1) (2X)
12.000 g; 15’ 12°C
Diamkan semalam pada 40C Supernatan diambil, + LiCl 10 M sampai konsentrasi 2M
17.000 g; 30’ 4°C
12.000 g; 15’ 4°C Supernatan dipindah ke ependorf lain
Ekstrak dengan 1 x vol Phenol, PCI, CI
Pelet diambil, larutkan dalam 500 µl ddH2O
17
Lanjutan lampiran 2
Diamkan semalam pada -700C Supernatan + 0,1 x vol Na-asetat 3 M, pH 5,8 + 3 x vol etanol absolut 12.000 g; 2’ 4°C etanol yang tersisa dibuang
17.000 g; 30’ 4°C
12.000 g; 5’ 4°C
Pelet dicuci dengan etanol 70%
etanol dibuang
Uji Kualitas (Elektroforesis gel agarose 1%) keringkan dengan speed vac
RNA yang diisolasi dilarutkan dengan 30 µl ddH2O
Uji Kuantitas (Spektrofotometer)
18
Lampiran 3 Sintesis First strand
20 µl Kit SuperScriptTM II Reverse Transcriptase (Invitrogen) Untuk setiap 1 ng-5 µg total RNA
Pemanasan dan inkubasi menggunakan PCR Biometra 9 µL ddH2O, 1 µL 10 mM dNTP mix, 1 µg RNA total bunga manggis dan 1 µL 10 p mol/µL oligo (dT)23 (Ambion).
Panaskan 65 °C selama 5 menit segera dimasukkan kedalam es
4 µL first strand buffer 5X dan 2 µL 0,1 M DTT
Inkubasi 42°C selama 2 menit
1 µL (200 unit) enzim SuperscriptTM II Reverse Transcriptase
Inkubasi 42°C selama 50 menit reaksi dinonakitfkan dengan pemanasan 70 °C selama 15 menit ditambahkan 1 µL (2 unit) RNase H dan diinkubasi pada 37 °C selama 20 menit
cDNA utas pertama yang terbentuk selanjutnya digunakan sebagai template untuk amplifikasi fragmen gen target,, menggunakan primer spesifik.
19
Lampiran 4 Transformasi Heat shock, 42°C tepat detik ke 50 dinginkan 10 menit 10 l produk ligasi dimasukkan dalam 200 l kompeten sel diamkan 30 menit dalam es
800 µL campuran LB cair + Glukosa steril 10% Inkubator goyang 37 °C selama 1,5 jam Kultur sebanyak 100 µL pada Media LA + Amp + IPTG + X-Gal
Sisa kultur 900 µL disentrifus pada suhu 25 °C selama 5’, 3500 rpm
Supernatan dibuang, dan hanya disisakan sedikit untuk resuspensi pelet
Media LA + Amp + IPTG + X-Gal
Inkubasi pada 37 °C, 16 jam/ semalam
Koloni Putih dan Biru
20
Lampiran 5 Isolasi DNA Plasmid Pelet + suspensi bufer + RNase 250 µL + 250 µL bufer lisis, aduk dalam keadaan dingin
8000 rpm; 1’ 25 °C
Diamkan 5 menit 13.000 rpm; 1’ 25 °C Supernatan dipindahkan tube fiter
+ 250 µL binding bufer , aduk dan diamkan di es 5’
ke
13000 rpm; 1’ 13000 rpm; 1’ + 500 µL Wash buffer I
+ 700 µL Wash buffer II
13000 rpm; 1’
Sentrifugasi kembali pada 13000 rpm selama 1’ dalam keadaan kosong
+ 30 µL bufer elusi, diamkan 1 menit 13000 rpm; 1’ Cek dengan elektroforesis gel agarosa 1%
21
Lampiran 6 Vektor pengklonan pGEM-T Easy
22
Lampiran 7 Penjajaran hasil sekuensing sampel dengan primer Mgs1
Lampiran 8 Penjajaran hasil sekuensing sampel dengan primer Mgs2
23
Lampiran 9 Hasil analisis blastx sampel dengan primer Mgs1
Urutan basa pada bank data yang bersesuaian PTM1 (Populus tremuloides)
E-value 2e-22
Score 100 bits
Lampiran 10 Hasil analisis blastx sampel dengan primer Mgs2
Urutan basa pada bank data yang bersesuaian APETALA1-like MADS-box PTAP1-2 (Populus balsamifera subsp. Trichocarpa)
E-value 6e-25
Score 96.7 bits
