593
Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2015
ISOLASI DAN KARAKTERISASI GEN PENYANDI PROTEIN VP-24 WSSV PADA UDANG WINDU (Penaeus monodon) UNTUK PENGEMBANGAN TEKNOLOGI RNAi Andi Tenriulo*), Bunga Rante Tampangallo*), Andi Parenrengi*), dan Riani Andang Dewi**)
**)
*) Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Payau Jl. Makmur Dg. Sitakka No. 129, Maros 90512, Sulawesi Selatan E-mail:
[email protected] Mahasiswa Jurusan Budidaya Perairan Fakultas Perikanan, Universitas Hasanuddin
ABSTRAK Gen penyandi protein struktural VP-24 WSSV merupakan gen yang mengkode salah satu sifat dari protein struktural utama yang berada di lapisan perantara (intermediet) virus. Tujuan dari penelitian ini untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi gen penyandi protein struktural VP-24 WSSV yang diisolasi dari udang windu, Penaeus monodon. Genom DNA WSSV diisolasi dari kaki renang dan kaki jalan udang windu menggunakan kit IQ 2000 dengan metode ekstraksi DTAB-CTAB. Gen tersebut diisolasi dari udang windu yang positif terserang WSSV menggunakan primer VP-24 dan VP24-R dan dilanjutkan dengan sekuensing. Data yang dihasilkan dianalisis menggunakan program Genetyx Versi 7 dan BLAST-N. Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen penyandi VP-24 WSSV berhasil diisolasi dari udang windu dengan panjang sekuen sekitar 641-648 bp. Hasil alignment dengan BLAST-N menunjukkan tingkat similaritas yang identik (99%100%) antara gen VP-24 yang diisolasi dengan gen VP-24 yang ada di data base Bank Gen. Dari hasil ini disimpulkan bahwa fragmen DNA hasil amplifikasi PCR tersebut merupakan sekuens gen penyandi protein struktural VP-24 WSSV. Gen ini diyakini mampu mengkode karakter penting penyakit WSSV yang utama yaitu VP-24. KATA KUNCI:
isolasi, karakterisasi, gen VP-24, WSSV, udang windu
PENDAHULUAN Virus bintik putih atau dikenal sebagai penyakit white spot syndrome virus (WSSV) merupakan salah satu jenis virus penyebab utama berbagai kasus kematian udang yang hingga kini belum dapat diatasi secara tuntas. Salah satu pendekatan yang mulai dikaji untuk meningkatkan resistensi udang windu terhadap virus WSSV adalah teknologi RNAi. RNAi adalah fenomena biologi di dalam sel yang prinsip dasarnya adalah dengan masuknya dsRNA ke dalam sitoplasma yang akhirnya akan membungkam ekspresi suatu gen di tingkat pasca transkripsi. Mekanisme RNAi ini juga terjadi secara alami, yaitu dengan adanya miRNA (micro RNA) di dalam sel organisme sebagai pengganti dsRNA. miRNA ini merupakan pengkode gen dan mempunyai fungsi dalam regulasi gen. Mekanisme ini cukup bermanfaat pada tumbuhan dan hewan dalam mengatasi penyakit yang disebabkan oleh gengen mutan, gen-gen letal, maupun penyakit lainnya yang disebabkan oleh virus. Studi tentang transkripsi gen virulen WSSV yang menginfeksi P. monodon telah dilakukan (Zuidema et al., 2004). Ekspresi gen WSSV di bagi dalam dua fase yaitu fase awal (early phase) yang terjadi sebelum DNA virus bereplikasi; 2) fase lanjut (late phase) terjadi ketika inisiasi replikasi DNA virus atau setelahnya. Gen-gen WSSV yang ditranskripsikan pada fase lanjut (late phase) meliputi gen-gen yang menyandi protein struktural utama WSSV yaitu VP-28, VP-26, VP-24, VP-19 dan VP-15. Gen VP 28 telah digunakan sebagai pertahanan diri dari serangan WSSV (Mevicack et al., 2011). Xu et al. (2007) menyatakan bahwa penggunaan VP28 siRNA telah menyebabkan penurunan yang signifikan dalam produksi DNA viral dari udang yang terinfeksi WSSV, dan penggunaan VP 28 siRNA dapat meningkatkan sintasan sebesar 33% pada udang L. vannamei yang ditantang dengan WSSV (Wu et al., 2007). Beberapa penelitian vaksinasi udang menggunakan agen WSSV sebagai sumber vaksin baru-baru ini telah menunjukkan kemajuan dan memperoleh hasil yang menggembirakan. Xie & Yang (2006) menemukan anti-VP24 IgG yang berasal dari struktural protein permukaan VP24 WSSV, yang mana
Isolasi dan karakterisasi gen penyandi protein ..... (Andi Tenriulo)
594
dapat dijadikan vaksin sebagai pencegah terjadinya penyakit yang disebabkan oleh White spot syndrome virus (WSSV) pada udang windu. Penelitian tersebut membuktikan bahwa pada penyuntikan lobster dengan menggunakan anti-VP24 IgG WSSV yang terlebih dahulu diinkubasi menunjukkan pencegahan awal kematian setelah terjangkit WSSV. Hal ini disebabkan karena senyawa yang disuntikkan di lobster dapat merangsang sistem hostdefence tersebut. Infeksi yang disebabkan WSSV benar-benar ditangguhkan atau dinetralkan oleh VP-24. Gen VP-24 memiliki homologi yang tinggi dengan protein-protein histon oleh karena itu protein ini diperkirakan memiliki peran dalam pengikat DNA WSSV, membentuk poros nukleoprotein (nucleoprotein core) dan berperan dalam infeksi sistemik pada udang, dan dapat menstimulasi munculnya sistem kekebalan pada udang windu (Underwood et al., 2013). Informasi mengenai penggunaan gen VP-24 untuk meningkatkan kekebalan pada udang windu masih sangat kurang, oleh karena itu penelitian mengenai isolasi dan karakterisasi gen penyandi VP-24 WSSV pada udang windu perlu dilakukan sebagai informasi dasar dalam upaya peningkatan resistensi udang windu terhadap penyakit virus WSSV melalui teknologi RNAi. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi gen virulen VP-24 WSSV dari udang windu yang akan digunakan sebagai bahan pengembangan teknologi RNAi. METODE PENELITIAN Deteksi WSSV Sampel udang windu yang sakit dengan bobot berkisar 7-15 g dengan gejala terinfeksi WSSV, seperti berenang di pinggir pematang, sebagian udang mati dan terdapat bintik putih dikarapaksnya, diambil secara aseptik dan dimasukkan ke dalam botol yang telah berisi larutan ethanol 70%. Prosedur identifikasi virus WSSV meliputi ekstraksi DNA genom, amplifikasi dengan menggunakan thermacycler, dan elektroforesis. Ekstraksi DNA genom dan uji PCR untuk mengetahui keberadaan virus WSSV pada udang windu menggunakan kit IQ-2000 WSSV metode DTAB-CTAB (Dodecyl Hexadecyl Trimetgyl Ammonium Bromide - Cationic Hexadecyl Trimetgyl Ammonium Bromide). Untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA udang windu yang diisolasi, DNA genom dianalisis dengan metode spektrofotometer. Sebanyak 7 μL DNA genom dimasukkan ke dalam kuvet kemudian diukur absorbannya pada panjang gelombang (ë) 260 dan 280 nm menggunakan Gen Quant 1300. Setelah dilakukan uji PCR, sampel yang positif terinfeksi WSSV selanjutnya digunakan untuk mengisolasi gen VP-24. Isolasi dan Karakterisasi Gen Virulen VP-24 WSSV Isolasi gen VP-24 WSSV dilakukan dengan menggunakan teknik PCR. DNA genom yang telah diisolasi dari udang windu digunakan sebagai cetakan DNA (templat) pada proses PCR. Metode isolasi mengacu pada metode yang dikembangkan oleh Xie and Yang (2006), menggunakan primer forward VP-24 F: 5’- CGCGGATCCGATGCACATGTGGGGGGTTTAC -3’ dan VP24-R: 5- CCGGAATTCTTATTTTT CCCCAACCTTAAACAG -3. Amplifikasi fragmen DNA dilakukan pada thermacycler (GeneAmp PCR System 2700, Applied Biosystem). Dalam reaksi amplifikasi digunakan kit PureTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healtcare). Genom DNA sebagai templat sebanyak 1µL dicampur dengan masing-masing 1 μL primer forward dan reverse, PCR dikondisikan dengan : Pre-denaturasi pada suhu 94oC selama 3 menit, diikuti 35 siklus (Denaturasi pada suhu 94oC selama 30 detik, Annealing pada suhu 57oC selama 30 detik, Ekstensi pada suhu 72oC selama 1 menit), dan ekstensi akhir pada suhu 72oC selama 3 menit. Amplikon selanjutnya dipisahkan dengan menggunakan teknik elektroforesis. Untuk melihat keberhasilan amplifikasi fragmen DNA target, 10 μL amplikon dielektroforesis pada gel agarose 2% pada tegangan 50 Volt selama 2 jam dan didokumentasi dengan Gel Documentation System. Berat molekul fragmen DNA ditentukan dengan menggunakan marker 100 bp plus. Gen VP24 WSSV hasil PCR selanjutnya dipurifikasi dengan mengacu pada prosedur manual kit GF-1 Nucleic Acid Extraction (Vivantis). Hasil purifikasi selanjutnya dilakukan penderetan (sekuensing) dengan menggunakan mesin sekuensing otomatis ABI PRISM 310 yang dilakukan di laboratorium First Base di Singapura.
595
Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2015
Sekuens hasil penderetan dianalisis dengan menggunakan program Genetyx Version 7 (Genetyx Coorporation) untuk mendapatkan sekuens sampel dari sekuens forward dan reverse. Kemiripan (similaritas) DNA gen virulensi WSSV yang dihasilkan disejajarkan (alignment) dengan sekuen DNA gen virulensi WSSV yang telah ada di Bank Gen dengan menggunakan program BLAST-N (Basic Local Alignment Search Tool-Nucleotide). Data hasil analisis disajikan secara deskriptif. HASIL DAN BAHASAN Kemurnian dan Konsentrasi DNA Hasil ekstraksi DNA genom dari udang windu yang telah terinfeksi WSSV menunjukkan analisa secara kuantitatif yaitu tingkat kemurnian DNA udang windu yang terinfeksi WSSV berkisar 1,8021,844 (Tabel 1). Nilai tersebut menunjukan kemurnian DNA genom yang tinggi karena nilainya berada pada kisaran kemurnian yang tinggi. Linacero et al. (1998) telah melaporkan bahwa tingkat kemurnian DNA genom yang diisolasi sebaiknya berada dalam kisaran 1,8-2,0. Tabel 1. Kemurnian dan konsentrasi DNA udang windu yang terinfeksi WSSV
Kode
A 260
A 280
Konsentrasi DNA (μg/mL)
Kemurnian DNA A260/A280
Sampel 1 Sampel 2 Sampel 3
0,876 0,800 0,519
0,475 0,444 0,277
43,80 40,00 25,95
1,844 1,802 1,874
Salah satu faktor yang mempengaruhi tingkat kemurnian DNA adalah metode ekstraksi yang digunakan. Metode yang digunakan pada penelitian ini yaitu metode DTAB-CTAB (Dodecyl Hexadecyl Trimetyl Ammonium Bromide - Cationic Hexadecyl Trimetyl Ammonium Bromide). Metode ini mampu menghasilkan kemurnian DNA yang tinggi karena dengan penggunaan buffer CTAB sebagai pengganti nitrogen cair sebanyak 2% yang dapat menghasilkan produk DNA yang berkualitas yang ditunjukan oleh pita DNA genom. Buffer ekstraksi CTAB yang mempunyai fungsi untuk melisiskan membran sel dan membran fosfolipid bilayer. PVP dan mercaptoethanol dalam DTAB akan mereduksi senyawa-senyawa fenolik yang keberadaannya dapat merusak kualitas DNA (Santoso, 2005). Pada infeksi virus WSSV sesaat setelah terjadi infeksi, tahap selanjutnya adalah proses ekspresi gen di dalam tubuh inang. Ekspresi gen WSSV dibagi dalam dua fase yaitu: 1) fase awal (early phase) yang terjadi sebelum DNA virus bereplikasi; 2) fase lanjut (late phase) terjadi ketika inisiasi replikasi DNA virus atau setelahnya. Gen-gen WSSV yang ditranskripsikan pada fase awal meliputi RR1 (ribunuckleotide reductase berukuran besar), RR2 (ribunuckleotide reductase berukuran kecil), PK (Protein Khinase), TK-TMK (thymidine kinase-thymidylate chimeric protein) dan DNA pol (DNA polymerase), sedangkan gen-gen yang ditranskripsi pada fase lanjut meliputi gen-gen yang menyandikan WSSV protein-protein struktural utama WSSV seperti VP-28, VP-26, VP-24, VP-19 dan VP-15. Ekspresi gen-gen yang termasuk
M
B1
B2
B3
KN
KP
Gambar 1. Hasil elekroforesis udang windu yang positif terinfeksi WSSV. Ket : M = marker, 1-3 = sampel, KN= kontrol negatif, KP= kontrol positif
Isolasi dan karakterisasi gen penyandi protein ..... (Andi Tenriulo)
596
dalam kelompok early gen teramati sejak 2 jam pasca infeksi WSSV, sedangkan gen-gen dalam kelompok late gen dapat dilihat setelah 18-24 jam pasca infeksi (Alim, 2010). Amplifikasi gen VP-24 dengan panjang pita DNA antara 500-750 bp menghasilkan pita tunggal (Gambar 2). Untuk lebih memastikannya, maka dilakukan tahap analisis selanjutnya yakni analisis urutan gen penyandi VP-24 WSSV. Menurut Parenrengi (2010), pemurnian fragmen DNA sangat penting untuk menghindari adanya kontaminasi fragmen DNA yang dapat terinsersi pada saat pembacaan nukleotida (sekuensing).
Gambar 2. Visualisasi gen penyandi VP-24 WSSV yang diisolasi dari udang windu yang terinfeksi WSSV. Ket : B1-B3 = sampel M = marker 1 kb.Tanda panah menunjukan posisi fragmen target Gen penyandi VP-24 WSSV merupakan salah satu gen yang penting dalam pencegahan penyakit bintik putih pada udang windu, dimana gen ini mampu menonaktifkan gen VP-24 yang berada di dalam WSSV sehingga penyebaran infeksi tidak semakin melebar luas ke sistem tubuh inang P. monodon. Hal itu disebabkan karena gen penyandi VP-24 WSSV merupakan repressor dimana protein ini yang akan menghambat terjadinya inisiasi suatu transkripsi ketika protein itu berikatan dengan sekuen pengontrol (operator) di dalam perkembangan WSSV di inang. Kebanyakan proses transkripsi akan berakhir bila adanya suatu sinyal dari sekuen terminator spesifik yang terdapat pada DNA tersebut atau RNA yang baru ditranskripsi (Underwood et al., 2013). Analisis Urutan Nukleotida Gen Penyandi VP-24 WSSV Alignment sekuens ditunjukkan pada gambar berikut, dimana dari hasil alignment dapat diketahui bagian star codon (inisiasi) yang mengkode metionin pada permulaan (ujung amino) pada semua rantai polipeptida eukariotik yaitu ATG, dan stop kodon TAA yang merupakan bagian dari komplemen primer VP-24 R terletak pada 637-639 bp (Lampiran 1). Hasil sekuens DNA gen VP-24 WSSV yang diisolasi menunjukkan tingkat kemiripan yang tinggi dengan sekuen gen VP-24 yang ada di Bank Gen. Hasil analis sekuensing sampel VP-24 WSSV menggunakan software GENETYX 7 diketahui memilki panjang fragmen DNA yaitu 641-648 bp. Analisis kesejajaran lokal (BLAST-N) memperlihatkan isolat gen VP-24 WSSV yang diisolasi memiliki tingkat kesamaan dengan isolat gen yang ada di Bank Gen yaitu 99% - 100% (Tabel 2). Lampiran 2 menunjukkan pohon filogenetik gen penyandi VP24 yang telah diteliti sebelumnya diantaranya China (AY249455.1), South Carolina (AY249456.1), Iran (DQ196431.1), India Tabel 2. Similaritas sekuens gen VP-24 WSSV yang diisolasi dengan sekuen gen VP-24 yang telah ada di Bank Gen (No.Aksesi DQ902656.1)
Deskripsi SampelB1 SampelB2
Pemenuhan (query) 97% 96%
Similaritas
99% 100%
597
Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2015
(DQ902656.1) dan Jepang (AY249487.1). Terlihat bahwa gen VP-24 WSSV dari hasil dari penelitian ini memiliki kemiripan dengan gen VP-24 WSSV dan berkorelasi dengan sekuens yang telah ada. Hasil ini menunjukkan bahwa gen VP-24 WSSV yang diisolasi memiliki kesamaan karakterisasi dengan gen VP-24 WSSV yang telah diteliti sebelumnya. KESIMPULAN 1. Isolasi gen penyandi protein VP-24 WSSV pada udang windu (Penaeus monodon) berhasil dilakukan ditandai dengan keberadaan pita DNA pada bobot molekul sekitar 640 bp. 2. Gen penyandi protein VP-24 WSSV ini memiliki kemiripan 99%-100% dengan sekuen gen VP-24 WSSV yang ada di Bank Gen. DAFTAR ACUAN Alim, S. (2010). Kloning dan Sekuensing Gen Penyandi Protein Permukaan VP19 WSSV Isolat Situbondo. Institut Pertanian Bogor, hlm. 10. Linacero, J., Rueda, Vazquez, A.M. (1998). Quantification of DNA. Pages 18-21, Isaac G, Ingram DS, editor. Molecular Tools for Screening Biodiversity : Plants and Animals. Chapman and Hall. London, Weinheim, New York, Tokyo, Melbourn, Madras. Mavichak, R., Takano, T., Kondo, H., Hirono, I., Wada, S., & Hatai, K. (2010). The effect of liposomecoated recombinant protein VP28 against white spot syndrome virus in kuruma shrimp, Marsupenaeus japonicus, J Fish Dis., 33, 69-74. Parenrengi, A. (2010). Peningkatan resistensi udang windu Penaeus monodon terhadap penyakit white spot syndrome virus melalui transfer gen Penaeus monodon antiviral. Disertasi Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor, 108 hlm. Santoso, P.J. (2005). Modified CTAB-based DNA isolation procedure for fruit crops. Jurnal Stigma, XIV(1), 1-4. Underwood, D.J., Cowley, J.A., & Johnson, K.N. (2013). Antiviral immunity and protection in penaeid shrimp, Review Article, Versita, Invertebrate Immunity, p. 2-14. Wu, Wenlin, L., Wang, X., & Zhang. Identification of white spot syndrome virus (WSSV) envelope roteins involved in shrimp infection. J of Virology, 332, 578–583. Witteveldt, J., Cifuentes, C.C., Vlak, J.M., & van Hulten, M.C.W. (2004). Protections of Penaeus monodon against white spot syndrome virus by oral vaccination. J Virology, 78, 2057-2061. Xie, X., & Yang, F. (2006). White spot syndrome virus VP24 interacts with VP28 and is involved in virus infection, J. of General Virology, 87, 1903–1908. Zuidema, D., van Hulten, M.C.W., Marks, H., Witteveldt, J., & Vlak, J.M. (2004). Virus-Host.Interactions of White Spot Syndrome Virus. Di dalam: Leung KY, editor. Current Trends in the Study of Bacterial and Viral Fish and Shrimp Diseases. Molecular Aspects of Fish and Marine Biology; volume ke-3. Singapore: World Scientific Publishing, p. 237-255.
Isolasi dan karakterisasi gen penyandi protein ..... (Andi Tenriulo) Lampairan 1. Alignment sekuens gen VP-24 WSSV pada sampel udang windu
Lampiran 2. Pohon filogenetik gen VP-24 WSSV isolat sampel udang windu
598
