III. ANALISIS SEKUEN cdna GEN ANTIVIRUS DARI UDANG WINDU Penaeus monodon *)

III. ANALISIS SEKUEN cDNA GEN ANTIVIRUS DARI UDANG WINDU Penaeus monodon*) ABSTRAK Transgenesis pada ikan merupakan sebuah teknik modern yang berpotensi besar dalam menghasilkan organisme yang memiliki karakter lebih baik, misalnya peningkatan resistensi udang melalui transfer gen antivirus. Gen antivirus PmAV (Penaeus monodon antiviral gene) merupakan salah satu gen pengkode antivirus yang berasal dari spesies krustase. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristik gen antivirus yang diisolasi dari udang windu, Penaeus monodon. Gen antivirus diisolasi dengan menggunakan metode Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction (RT-PCR) dan selanjutnya dikloning serta dipurifikasi untuk sekuensing. Data yang dihasilkan dianalisis dengan program Genetyx Versi 7 dan basic local alignment search tool (BLAST). Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen antivirus PmAV yang berhasil diisolasi dari cDNA udang windu memiliki panjang sekuen 513 bp yang mengkodekan 170 asam amino. BLAST-N menunjukkan tingkat similaritas yang identik (100%) dengan gen antivirus yang ada di Bank Gen. Komposisi asam amino penyusun gen antivirus yang paling besar adalah serina (10.00%), sedangkan yang terkecil adalah asam amino prolina dan lisina masing-masing 1.76%. Analisis sekuen deduksi asam amino (BLAST-P) dari gen PmAV memperlihatkan adanya C-type lectin-like domain (CTLD) yang memiliki kemiripan dengan gen C-type lectin yang diisolasi dari beberapa spesies krustase. Keberadaan CTLD memberikan indikator kuat bahwa gen antivirus PmAV dilibatkan dalam imunitas udang windu melawan virus. Kata kunci: isolasi, karakterisasi, gen antivirus, deduksi asam amino, udang windu.

-------------------*) Bab ini telah dipublikasi dengan judul: Karakteristik Sekuen cDNA Pengkode Gen Antivirus dari Udang Windu, Penaeus monodon, pada Jurnal Riset Akuakultur 2009: 4(1):1-13.

26

ANALYSIS OF cDNA SEQUENCE ON ANTIVIRAL GENE FROM TIGER SHRIMP Penaeus monodon

ABSTRACT Transgenic fish technology is a potential modern technique in producing the better character organism by DNA recombinant of target gene including antiviral gene for improvement of the shrimp immunity. PmAV (Penaeus monodon antiviral) gene is one of the antiviral genes isolated from crustacean species. The research was conducted to analyze the characteristics of antiviral gene isolated from tiger shrimp Penaeus monodon. Antiviral gene was isolated by Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technique, then cloned, and purified for sequencing. Data obtained were analyzed by Genetyx Version 7 and basic local alignment search tool (BLAST) software. The results showed that the PmAV antiviral gene was successfully isolated from cDNA of tiger shrimp at the position of approximately 513 bp that consisted of 170 amino acid residues. BLAST-N on PmAV gene showed the identical sequence (100%) compared with the other antiviral genes deposited at the GeneBank. The highest percentage of amino acid encoding antiviral gene was serine (10.00%), while the lowest was proline and lysine (1.76%). Sequence analysis and amino acid deduction (BLAST-P) on PmAV gene revealed a C-type lectin-like domain (CTLD) that was similar with the C-type lectin gene isolated from several crustacean species. The existence of CTLD on this gene suggested that PmAV antiviral gene is involved in tiger shrimp immune defense to infectious virus. Keywords: isolation, characterization, antiviral gene, amino acid deduction, tiger shrimp

PENDAHULUAN Penggunaan teknik biologi molekuler untuk memproduksi strain udang yang memiliki ketahanan (resistensi) tinggi terhadap patogen melalui teknologi transformasi genetik merupakan peluang strategis dalam pengendalian penyakit pada udang (Bachere 2000). Pada dekade terakhir, resistensi organisme terhadap patogen telah dikembangkan pada beberapa spesies tanaman dan hewan termasuk ikan atau udang. Studi introduksi gen asing ke embrio udang telah menghasilkan data pendahuluan yang telah memperlihatkan ekspresi sementara (transient

27

expression) oleh gen reporter dengan regulator beberapa promoter (Sun et al. 2005; Yasawa et al. 2005). Kemajuan terbaru dalam teknologi transfer gen tersebut memiliki potensi sangat besar untuk pengembangan udang transgenik yang membawa gen peningkatan laju pertumbuhan dan resisten penyakit. Gen pengontrol hormon pertumbuhan (growth hormone, GH) merupakan gen target yang paling banyak digunakan dalam transgenik ikan. Introduksi gen GH pada ikan telah berhasil diaplikasikan dalam rangka peningkatan kecepatan pertumbuhan, misalnya pada ikan rainbow trout Oncorhynchus mykiss (Penman et al. 1991), ikan salmon Pasifik Oncorhynchus spp. (Devlin et al. 1995), ikan salmon arctic charr Salvelinus alpinus (Pitkanen et al. 1999), ikan mud loach Misgurnus mizalepis (Nam et al. 2001), ikan zebra Danio rerio (Morales et al. 2001), ikan silver sea bream Sparus sarba (Lu

et al. 2002), ikan nila

Oreochromis niloticus (Rahman et al. 2001; Kobayashi et al. 2007), ikan salmon coho O. kisutch (Devlin et al. 2004), dan ikan salmon Atlantik Salmo salar (Yaskowiak et al. 2006). Sementara itu, introduksi gen AFP (anti-freeze protein) pada ikan koki dapat meningkatkan toleransinya terhadap suhu dingin (Wang et al. 1995), sedangkan transfer gen GFP (green fluorescent protein), YFP (yellow fluorescent protein) dan RFP (red fluorescent protein) dapat menghasilkan ikan zebra yang berwarna-warni (Gong et al. 2003a). Penerapan teknologi transgenesis dalam peningkatan resistensi ikan dan udang terhadap serangan penyakit atau patogen merupakan salah satu alternatif pemecahan masalah penyakit pada akuakultur. Injeksi gen pengkode glikoprotein IHNV (infectious hematopoetic necrosis virus) menggunakan promoter CMV (cytomegalovirus) pada salmon, menunjukkan proteksi yang signifikan sampai dengan 12 minggu (Traxler et al. 1999). Seperti halnya dengan gen glikoprotein IHNV, daya tahan ikan medaka terhadap Pseudomonas fluorescens dan Vibrio anguillarum dapat ditingkatkan melalui transfer gen cecropin (Sarmasik et al. 2002).

Upaya peningkatan resistensi udang windu terhadap penyakit telah

dilakukan melalui injeksi protein rekombinan GST-PAP (glutathione-Stransferase-Phagocytosis Activating Protein) (Chotigeat et al. 2007). Transgenesis pada udang yang berhasil dilaporkan adalah masih terbatas pada udang vaname L. vannamei dengan mengintroduksikan gen pengkode TSV-

28

CP dengan menggunakan promoter β-aktin udang (pβactP2) (Sun et al. 2005; Lu & Sun 2005). Gen pengkode antivirus pada udang windu P. monodon yang diberi nama PmAV telah diidentifikasi oleh Luo et al. (2003) dan gen hemosianin oleh Zhang et al. (2004). Isolasi dan karakterisasi DNA komplementer (cDNA) pengkode antivirus merupakan tahapan kedua pada proses transfer gen antivirus dalam upaya mendapatkan spesies udang yang memiliki resistensi yang tinggi. Penelitian isolasi dan karakterisasi gen antivirus dari udang windu ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui tingkat similaritas sekuen dengan gen antivirus yang ada dalam Bank Gen. Selain itu, analisis sekuen nukleotida dan deduksi asam aminonya dilakukan untuk mengkonfirmasi kebenaran gen antivirus yang telah diisolasi.

BAHAN DAN METODE Sampel Udang Windu Penaeus monodon Udang windu P. monodon berukuran 10,1-74,4 g dikoleksi dari beberapa tambak udang di Sulawesi Selatan, termasuk dari tambak yang telah terserang penyakit virus bintik putih (white spot syndrome virus, WSSV). Sampel udang dikoleksi secara hidup dan selanjutnya dibawa ke Laboratorium Bioteknologi, Balai Riset Perikanan Budidaya Air Payau (BRPBAP) Maros untuk pengambilan hepatopankreas udang secara aseptik sebagai bahan untuk ekstraksi RNA total.

Ekstraksi RNA RNA total diekstraksi dengan menggunakan kit isogen (Nippon Gen) dengan cara seperti yang dijelaskan oleh Alimuddin (2009). Sebanyak 10-25 mg sampel hepatopankreas udang windu dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5 mL, kemudian dilarutkan dalam 200 µL isogen dalam wadah yang berisi es. Sampel yang sudah digerus dengan grinder tabung mikro ditambahkan kembali isogen sampai mencapai 800 µL, kemudian diinkubasi dalam suhu ruang selama 5 menit agar sampel dapat terlisis sempurna. Sampel ditambahkan dengan 200 µL

29

kloroform kemudian divorteks dan dibiarkan kembali dalam suhu ruangan selama 2-3 menit. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit kemudian disimpan pada suhu ruangan selama 5 menit dan supernatan yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabung mikro baru yang telah berisi dengan 400 µL iso-propanol. Sampel dihomogenkan dengan membolak-balikkan tabung mikro secara perlahan kemudian disimpan dalam suhu ruangan selama 5-10 menit. Sampel disentrifugasi kembali pada kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4oC selama 15 menit. Supernatan dibuang, sedangkan pelet dilarutkan dalam 1 mL etanol 70% dingin dan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4oC selama 15 menit. Supernatan dibuang, dan selanjutnya pelet dalam tabung mikro dikering-udarakan. Pelet RNA dilarutkan dengan DEPC 0,1% sebanyak 50 µL dan dilanjutkan dengan sintesis cDNA. Skema ekstraksi RNA disajikan pada Lampiran 6. Kemurnian dan kandungan RNA total hasil isolasi diukur dengan menggunakan alat UV-VIS spektrofotometer. Kemurnian dihitung berdasarkan perbandingan nilai absorpsi 260 nm dengan 280 nm, sedangkan konsentrasi DNA dapat dihitung berdasarkan nilai absorpsi 260 nm berdasarkan rumus yang telah dikembangkan oleh Linacero et al. (1998).

Síntesis cDNA dengan RT-PCR Sistesis DNA komplementer (complementary DNA, cDNA) dilakukan dengan menggunakan kit Ready-To-Go You-Prime Fisrt Strand Beads (GE Healthcare) dengan teknik RT-PCR. Konsentrasi RNA 3 μg dalam 30 µL DEPC 0,1% dihomogenkan dengan vorteks dalam tabung mikro, kemudian diinkubasi pada suhu 65oC selama 10 menit. Selanjutnya tabung mikro dimasukkan ke dalam es selama 2 menit, kemudian RNA dimasukkan ke dalam tabung first strand reaction mix beads yang telah berisi 2 butir bola putih. Primer oligo (dT) 5’-gta ata cga ata act ata ggg cac gcg tgg tcg acg gcc cgg gct ggt ttt ttt ttt ttt ttt t-’3 dengan konsentrasi 1 µg/3µL ditambahkan sebanyak 3 µL ke dalam reaksi, kemudian dibiarkan selama 1 menit. Tabung mikro diinkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam, kemudian cDNA yang terbentuk ditambahkan SDW 50 µL. Skema sintesis cDNA menggunakan teknik RT-PCR disajikan pada Lampiran 6.

30

Isolasi Gen Antivirus Isolasi gen antivirus PmAV dilakukan dengan menggunakan cDNA sebagai templat DNA. Gen PmAV diisolasi dengan menggunakan spesifik primer yang dibuat berdasarkan sekuen yang diakses pada Bank Gen dengan nomor aksesi AY302750.1 (Luo et al. 2003). Primer yang digunakan adalah PmAV-F 5’tag tgc atg cat atg ggt cat aca atc cta-3’ dan PmAV-R 5’-ctg tct cga gct atg tgt cct gct ttc aca-3’, dengan target fragmen sepanjang 513 bp yang mencakup kodon awal dan kodon akhir. Primer tersebut telah dilengkapi dengan situs restriksi (nukleotida yang digarisbawahi) masing-masing adalah SphI dan XhoI untuk membantu dalam proses kloning. Satu milligram cDNA digunakan sebagai templat untuk PCR pada kit PureTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare), kemudian dicampur dengan masing-masing 1 µL (50 ρmol/μL) primer forward dan reverse kemudian ditambahkan SDW sampai mencapai 25 µL. Kit tersebut mengandung 2,5 unit Taq Polimerase; 10 mM Tris-HCl pH 9; 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl2; dan 200 μM setiap dNTP-mix. Amplifikasi gen antivirus dilakukan pada mesin PCR GenAmp 7200 (Applied Biosystem). Proses PCR dijalankan pada suhu pre-denaturasi 94oC selama 2 menit; 35 siklus untuk (denaturasi 94oC selama 30 detik, annealing 60oC selama 30 detik, ekstensi 72oC selama 45 detik); dan final ekstensi 72oC selama 7 menit. Untuk melihat keberhasilan amplifikasi fragmen DNA target, hasil PCR dielektroforesis pada gel agarose 1,0% dan didokumentasi dengan Gel Documentation System (Biometra). Untuk menentukan berat molekul fragmen DNA digunakan marker VC 100bp Plus DNA Ladder (Vivantis).

Kloning Gen Antivirus Kloning gen antivirus PmAV dilakukan dengan mengacu prosedur kloning gen promoter ProAV seperti yang dijelaskan pada Bab II. Secara singkat, kloning gen antivirus PmAV dilakukan melalui tahapan: (1) purifikasi gen antivirus menggunakan kit GF-1 Gel DNA Recovery (Vivantis), (2) ligasi gen antivirus PmAV ke vektor pGEM-T Easy, (3) pembuatan bakteri kompeten E. coli DH5α, dan (4) transformasi gen antivirus PmAV ke bakteri kompeten (inang) untuk

31

perbanyakan plasmid (lihat Bab II). Skema pelaksanaan kloning gen antivirus PmAV pada vektor pGEM-T Easy disajikan pada Lampiran 4.

Identifikasi Transforman Identifikasi klon bakteri pembawa gen antivirus PmAV hasil transformasi dilakukan dalam dua pendekatan yakni metode cracking dan teknik PCR seperti yang dijelaskan pada Bab II. Khusus pada tahapan teknik PCR, primer yang digunakan adalah PmAV-F dan PmAV-R menggunakan larutan hasil cracking sebagai templat DNA. Prosedur PCR amplifikasi gen antivirus PmAV dilakukan dengan mengacu pada metode yang telah dijelaskan pada Sub Bab Isolasi Gen Antivirus pada Bab ini.

Penderetan Nukleotida Gen Antivirus Isolasi plasmid, purifikasi fragmen DNA, dan pembacaan sekuen dilakukan dengan menggunakan metode yang telah dijelaskan pada Sub Bab Penderetan Nukleotida Promoter (lihat Bab II).

Analisis Data Sekuen gen antivirus PmAV dianalisis dengan menggunakan program Genetyx Versi 7 (Genetyx Coorporation) untuk mendapatkan similaritas sekuen dan deduksi asam amino dan keberadaan parameter penanda signal antivirus. Untuk mengetahui kemiripan gen yang dihasilkan, sekuen nukleotida dan deduksi asam amino gen antivirus disejajarkan (alignment) dengan sekuen antivirus yang telah ada di dalam Bank Gen dengan menggunakan program basic local alignment search tool (BLAST-N untuk sekeuns nukleotida dan BALST-P untuk sekuen protein atau asam amino). Data hasil analisis disajikan secara deskriptif.

32

HASIL DAN PEMBAHASAN Gen antivirus PmAV telah berhasil diisolasi dari cDNA hepatopankreas udang windu P. monodon dengan teknik RT-PCR. Di antara 22 sampel udang windu dari beberapa lokasi budidaya tambak, 6 sampel (27,3%) memperlihatkan ekspresi gen antivirus. Udang yang mengekspresikan gen antivirus PmAV tersebut didapatkan dari sampel yang berasal dari udang windu yang lolos (survivor) dari serangan WSSV. Hal ini menguatkan dugaan bahwa udang windu yang bertahan hidup dari serangan penyakit virus memiliki pertahanan tubuh lebih kuat yang diindikasikan dengan besarnya ekspresi gen antivirus tersebut. Visualisasi fragment DNA dari gen antivirus PmAV pada gel elektroforesis memperlihatkan pita tunggal pada posisi sekitar 513 bp (Gambar 5). Gambar tersebut juga memperlihatkan bahwa dengan pemurnian atau purifikasi fragmen DNA menggunakan kit melalui ekstraksi langsung dari gel dapat menghilangkan latar belakang (smear) dan dimer primer pada bagian bawah gel agarosa. Pemurnian fragmen DNA sangat penting untuk menghindari adanya kontaminasi fragmen DNA yang dapat terinsersi pada saat kloning gen dan pada saat pembacaan nukleotida (sekuensing).

Gambar 5 Hasil elektroforesis fragmen DNA gen antivirus PmAV yang diisolasi dari cDNA hepatopankreas udang windu P. monodon. Tanda panah menunjukkan fragmen gen antivirus PmAV pada posisi sekitar 513 bp; M=marker VC 100bp Plus DNA Ladder, 1-3=fragmen DNA hasil purifikari dari gel; dan 4-6=fragmen DNA hasil PCR.

33

Identifikasi masuknya gen atau fragmen DNA pada bakteri inang dilakukan dalam dua pendekatan yakni cracking dan PCR. Seleksi koloni bakteri warna putih-biru menunjukkan indikator utama sebelum dilakukan kedua metode tersebut. Insersi gen diindikasikan dengan koloni bakteri warna putih dan adanya penambahan berat molekul plasmid DNA bakteri inang pada metode cracking (Gambar 6). Proses masuknya vektor rekombinan pembawa gen ke dalam sel kompeten (bakteri) diketahui dengan mengamati ekspresi gen yang dibawa oleh vektor tersebut misalnya menggunakan marker gen LacZ yang telah umum digunakan pada vektor kloning. Kobolak & Muller (2003) menyatakan bahwa penggunaan vektor pGEM-T Easy dalam bakteri E. coli memiliki marker gen LacZ sebagai gen pelapor (reporter gene) dan marker gen resisten ampisilin. Selanjutnya Toha (2001) menyatakan bahwa apabila dalam media terdapat IPTG, gen LacZ yang mengkode enzim β-galaktosidase dapat diketahui karena mampu menguraikan 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosida (X-gal) menjadi galaktosa dan 5-bromo-4-kloroindigo, yang menyebabkan koloni bakteri akan berwarna biru. Sebaliknya, jika terjadi insersi gen atau fragmen DNA pada daerah MCS maka koloni bakteri akan berwarna putih karena terjadi gangguan fungsi gen LacZ.

Gambar 6 Seleksi koloni putih-biru, cracking, dan plating klon bakteri pembawa gen antivirus PmAV. A=seleksi koloni klon bakteri yang ditumbuhkan pada media agar dimana tanda panah menunjukkan koloni putih dan biru, dan B=hasil cracking klon bakteri pada gel agarosa dimana tanda panah menunjukkan indikator positif sebagai pembawa gen antivirus dan negatif sebagai kontrol bakteri koloni biru, dan C=hasil plating klon bakteri pembawa gen antivirus pada media agar.

34

Analisis BLAST-N terhadap gen antivirus yang didapatkan menunjukkan similaritas sekuen yang identik (100%) dengan gen antivirus, baik yang disolasi dari mRNA (kode aksesi AY302750.1) maupun yang berasal dari DNA genom (kode aksesi DQ641258.1) udang windu P. monodon. Query dari kedua gen tersebut adalah: 100% dapat dipenuhinya oleh gen yang diisolasi dari mRNA, sedangkan hanya 96% pada gen yang diisolasi dari genom DNA (Tabel 2). Hal ini menunjukkan bahwa sekuen gen antivirus PmAV yang diisolasi dari mRNA identik dengan sekuen dari gen yang diisolasi pada penelitian ini, tetapi hanya sebagian besar sekuen antivirus dari genom DNA yang dapat disejajarkan yang mungkin disebabkan oleh keberadaan sekuen UTR (untranslated region), intron, dan Poly-A. Hasil penyejajaran tersebut memberikan keyakinan bahwa gen antivirus yang telah berhasil diisolasi dari udang windu adalah gen antivirus PmAV. Tabel 2 Similaritas sekuen gen antivirus PmAV udang windu P. monodon dengan gen antivirus pada Bank Gen Deskripsi

Pemenuhan query (%)

Similaritas (%)

mRNA PmAV P. monodon (AY302750.1)

100

100

Gen antivirus P. monodon (DQ641258.1)

96

100

Tingginya similaritas sekuen nukleotida tersebut memberikan indikator dalam kemiripan deduksi asam amino yang diperoleh setelah translasi melalui program Genetyx. Translasi asam amino diawali dengan sekuen ATG atau dikenal dengan kodon awal yang disandikan oleh asam amino metionina (M). Sedangkan kodon akhir ditandai dengan sekuen TAA yang tidak ditranslasi ke dalam bentuk asam amino, tetapi merupakan sekuen signal berakhirnya aktivitas translasi. Sekuen dan deduksi asam amino dari gen antivirus PmAV yang diisolasi dari udang windu, secara lengkap disajikan pada Gambar 7.

35

10 20 30 40 50 60 atgcgtcatacaatcctagttttcctttccctcggtgttgttgggtcggctgtggcaaca M R H T I L V F L S L G V V G S A V A T 70 80 90 100 110 120 tcatacgagaaaagtgccaatgattccaaggctgtctgctatagcccctatactgccatt S Y E K S A N D S K A V C Y S P Y T A I 130 140 150 160 170 180 gcggatcgctgtttgtttgtcgatcaccagacagatggaagctggtatgacatgcgagag A D R C L F V D H Q T D G S W Y D M R E 190 200 210 220 230 240 tactgtaaccttataaatggagactttctcaagctggatgacgctaatctccttactgat Y C N L I N G D F L K L D D A N L L T D 250 260 270 280 290 300 atcgttgagtacattacttaccaagtgggtgtgaacagagactactggatcggggggagt I V E Y I T Y Q V G V N R D Y W I G G S 310 320 330 340 350 360 gacgagaaccacgagggtctttggctgtggacggacggaactctcatgcggacaggtgtt D E N H E G L W L W T D G T L M R T G V 370 380 390 400 410 420 cccttgtggtaccattgcacctccatctctcaacaaccagatggtggctcctcagagaac P L W Y H C T S I S Q Q P D G G S S E N 430 440 450 460 470 480 tgtgccgtcatgcgctgggactcattttaccatatccatgatgtgtcttgctacacttct C A V M R W D S F Y H I H D V S C Y T S 490 500 510 cggtctgtcatttgtgaaagcaggacacattaa R S V I C E S R T H *

Gambar 7 Sekuen nukleotida dan deduksi asam amino penyandi gen antivirus PmAV yang diisolasi dari udang windu P. monodon. Prediksi signal CTLD diindikasikan dengan huruf tebal; huruf kecil simbol nukleotida a=adenina, c=sitosina, g=guanina, t=timina; dan deduksi asam amino (huruf kapital) A=alanina, R=arginina, N=asparagina, D=asam aspartat, C=sisteina, G=glisina, E=asam glutamat, Q=glutamina, H=histidina, I=isoleusina, L=leusina, K=lisina, M=metionina, F=fenilalanina, P=prolina, S=serina, T=treonina, W=triptofan, Y=tirosina, V=valina, *=kodon akhir).

Kodon (kode genetik) awal atau kodon inisiasi translasi merupakan kodon untuk asam amino metionina yang mengawali struktur suatu polipeptida (protein) sedangkan kodon akhir merupakan kodon terminasi translasi pada suatu gen yang umumnya dicirikan oleh urutan sekuen TAA, TAG, atau TGA (Yuwono 2005). Seperti halnya dengan hasil penelitian ini yang menunjukkan bahwa gen

36

antivirus PmAV dalam bentuk kerangka baca terbuka (open reading frame, ORF) yang diawali dengan kodon awal ATG dan diakhiri dengan kodon akhir TAA. Analisis domain deduksi protein dari cDNA antivirus udang windu menunjukkan adanya situs yang memiliki kemiripan dengan C-type lectin-like domain (CTLD). Susunan CTLD tersebut diperkirakan berada dari urutan asam amino ke-33 sampai dengan ke-166. Hasil penyejajaran asam amino (Gambar 8) menunjukkan bahwa pada urutan ke-33 (sisteina) merupakan asam amino pertama yang sama pada gen kelompok C-type lectin pada spesies krustase. CTLD tersebut merupakan salah satu indikator utama dalam prediksi karakter gen fungsional antivirus. Lektin (lectin) adalah merupakan kelompok glikoprotein yang dapat berperan dalam penggumpalan darah (Yatim 2003), sehingga lektin dikenal juga sebagai salah satu kelompok gen clotting protein (Dong & Xiang, 2007). Keberadaan CTLD juga telah dilaporkan oleh Luo et al. (2003) pada gen antivirus yang diisolasi dari udang windu dan Kong et al. (2008) pada kepiting Portunus trituberculatus. Meskipun pada umumnya lektin memperlihatkan aktivitas pengikatan (bind) dalam mendeteksi struktur gula, fungsi mereka pada beberapa organisme yang berbeda adalah tidak sama. Zelenksky & Gready (2005) telah mereview dengan lengkap fungsi secara luas dari beberapa famili lektin khususnya C-type lectin-like domain. Lektin dikenal memiliki peran penting dalam sistem pertahanan non-spesifik pada invertebrata berdasarkan studi analisis biokimia dan molekuler pada beberapa spesies krustase. Kebanyakan lektin krustase termasuk spesies penaeid, memiliki spesifitas yang umum pada N-acetylated amino sugar khususnya asam sialat (sialic acid) (Marques & Barracco 2000). Analisis hambatan hemaglutinasi (hemagglutination inhibition, HAI) lektin kepiting air tawar, Paratelphusa jacquemontii menunjukkan aktivitas sebagai asam sialat spesifik yang memiliki affinitas tinggi pada 0-acetyl neuraminic acid (Denis et al. 2003).

37

P. monodon (sampel penelitian) PmAV P.monodon PtLP P. trituberculatus C-type lektin L. vannamei C-type lektin L. vannamei C-type lektin P. semisulcatus C-type lektin P. semisulcatus C-type lektin-5 F. chinensis C-type lektin-5 F. chinensis C-type lektin P. monodon C-type lektin P. monodon C-type lektin F. chinensis C-type lektin-4 F. chinensis C-type lektin-4 F. chinensis C-type lektin L. vannamei

1 MRHTILVFLSLGVVGSAVATSYEKSANDSKAVCYSPYTAIAD-RCLFVDHQTDGSWYDMR 1 ..........................................-................. 6 L...VGILAV..ATNI.P..TK---.H..F.E.SG-..VHI.VSKT.T.QN.. 190 ..ALAPFGP..VGGRVS.PVLFIE.GG-L..MFVTWAEET.E.A. 48 .PGG.SLVG.-K..LFVTFVAEPYGEA. 200 ..ALAPFGP..VS.RVT.PILFVEVGG-L.MMFVTWEEET.E.A. 55 A.PGG.SLVGA-K.PMFVTFIAQPYSEA. 178 AA..ALAPLGP..VGGRVE.LA.FVEVGG-L..LFVTWFEDT.ENAQ 36 .PGG..LVGT-K..MFEIFASETHEEAK 180 ..ALVPFGP..VGGRVT.PDLFVEVGG-L.MAFVTWAEVT.E.AG 36 .PGG..LVGT-K..MFEIFASETHEEA. 1 MK..APVILTTLISVA--A..SVRATE.P...EPLDET..I.L.AFVSYT.QETV 36 .PEG.SLVGS-Q..MFVTFALENHREAK 199 .PTF.VEVGG-L..MFVTWAVET.HEAQ 1 MK..APVILTALISVASVR.-..----.PY..EPLD.T.RI.L.AYVTYT.Q.TV

59 59 54 233 74 243 82 223 62 223 62 53 62 225 50


60 60 55 234 75 244 83 224 63 224 63 54 63 226 51

EYCNLINGDFLKLDDANLLTDIVE------YITYQ-VGVNRDYWIGGSDENHEGLWLWTD ........................------.....-........................ KF.QQLG..LVN.S.LQFYG..LL------..ESL-HLPHASF...AT..AT.DV.M... RA.AGASAEL.AIT.VEVFRALYL------..HQD-NLSSHAF.L..T.LAS..T.VY.T QF.HAAK.ELAAITT.ADFKNTID------..HAN-GLSGTSF.LD....AA..V.VTSS QA.AGASS.L.AIT.IEV.RAVYL------F.HAN-SLSGHTF.L....MAS..T.VY.T QF.HAAK.ELTAITT.TDFKNL.D------..NAN-DFTSG.F.LD.T..AT..V.VTSS QM.AGTSS.L.AIT.IEV.RTLYL------F.QAN-GLDGNTF.L....LAS..T.VY.T NF.HDAQ.ELASITT.TDFKNL.D------..HAN-DLFG.TF.VD.R..ET..V..TSS QV.AGLS..L.AIT.IEV.RALYL------F.QTN-GLSGNTF.L....QES..T.VY.T YF.HDAK.ELVAITT.TDFKNL.D------..HAN-GLFG.TF.VD.R..ET..V..TAS DL.KSHG.EI.TIE.CETFALVYD------..RS.D.TKGKH..L.AT..VE..T.KFVN QT.HSVS.EL.AITTPTQFVHV.N------H.HAY-GYTG.QF.LD...AEK..N.VTSS QT.G-DSS.L.AIT..EV.RAVYL------.LHQE-NIADHSF.L....S.-.RN.VF.T DP.KTHS.EI.MIE.CETFALVYD------..KSKD.TQGKHFRL.AT..VE..T.KFVN

112 112 107 286 127 296 135 276 115 276 115 107 115 276 104


113 113 108 287 128 297 136 277 116 277 116 108 116 277 105

GTLMRTGVPLW----YHCTSIS-QQPD-GG-SSEN----CAVMRWDSFYHIHDVSCY-TS ...........----.......-....-..-....----..................-.. ..PV.M.T.F.----ANYGDNNY.M.T-..-EKQ.----.VMLDVNFH.YFN.FT.SN.D .EPVPM.T.F.GL--.AGSASA-.E..-..-TNQ.----.LAITGEGYFNFR.Y..A-SK .EVVPL.T.F.----AAFPN-G-....--N-AH..EHYL.LSSS.--.LYMN.A.SS-AI .EPVPM.T.F.GL--NDMSAP.-.E.N-..-T...----.LAI--GI..NFR.Y..G-SR .EAVPL.T.F.-----AAFGL.-....YVN-GKKH----.LFLPPAW.FYMGNNP.S-AV .EPVPM.T.F.GL--ADMSAP.-.E.N-..-T...----.LAI--GN..NFR.Y..G-SK .EAVPL.T.F.AAFD..------....-NSLGN.H----.LSIPS.W.LYMN..P.S-NI .EPVPM.T.F.GL--TDMSAP.-.E.N-.E-T...----.LAI--GN..NFR.Y..G-SV .EVVPS.T.F.AAFE..------....-NALGN.H----.LSIPS.W.LYMN..V.S-NK NR.TPM.I.Y.---------GV-NE.N-N.-NTY.----..M.HASYNHYWY.AA.G-SK .QAVPR.T.F.----A-AFQDT-....-NAHGA.H----.LE.ESSE.FYLN.AV.E-DK .ESVPM.T.F.GL--.RGD.VM-.E.Q-..-TR..----.LMLHSGGSHYFR..T.S-MR NRAVPQ...F.---------GK-GE.N-S.-NTH.----..I.HASYNHYWY.IQ.E-NK

160 160 157 336 175 344 183 324 163 324 163 150 163 326 147


161 161 158 337 176 345 184 325 164 325 164 151 164 327 148

RSVICESRTH .......... V.P...K FNPL. INF...A FNPL. KNF...ATNQ FFPL.IY. KNF...ATVQ FYPL. KNF...ATVQ YNP.. SNF..Q LNP.. YNP..LKK

170 170 164 341 182 349 193 332 173 329 173 155 169 331 155

Gambar 8 Alignment deduksi asam amino gen antivirus PmAV yang diisolasi dari udang windu P. monodon dengan asam amino pada Bank Gen. Sampel penelitian (gen antivirus yang diisolasi dari P. monodon dalam penelitian ini); gen PmAV P. monodon (AAQ75589); C-type lectin-like domain-containing protein PtLP P. trituberculatus (ACC86854); C-type lectin L. vannamei (ABI97374); C-type lectin P. semisulcatus (ABI97372); C-type lectin 5 F. chinensis (ACJ06428); C-type lectin P. monodon (ABI97373); C-type lectin F. chinensis (ABA54612); C-type lectin 4 F. chinensis (ACJ06429); dan Ctype lectin L. vannamei (ABU62825); nomor di awal dan akhir asam amino menunjukkan urutan asam amino; singkatan asam amino A=alanina, R=arginina, N=asparagina, D=asam aspartat, C=sisteina, G=glisina, E=asam glutamat, Q=glutamina, H=histidina, I=isoleusina, L=leusina, K=lisina, M=metionina, F=fenilalanina, P=prolina, S=serina, T=treonina, W=triptofan, Y=tirosina, dan V=valina.

38

Studi yang dilakukan oleh Ma et al. (2007) memperlihatkan indikasi peran penting molekul lektin pada mekanisme pertahanan inang dekapoda dalam pembersihan infeksi patogen. Studi yang dilakukan oleh Sun et al. (2007) mengindikasikan bahwa lektin vaname L. vannamei memperlihatkan hambatan yang luas pada lipo-polisakarida bakteri gram negatif yang mengindikasikan peranan signifikan secara in vivo pada agglutinin humoral dalam respon inang melawan infeksi bakteri. Pada studi lainnya, kloning gen lektin pada level molekuler dan karakteriasi C-type lectin telah dilaporkan oleh beberapa peneliti sebelumnya. Pada udang windu P. monodon dikenal dengan antivirus lectin-like protein dengan carbohydrate-recognition domain (CRDs) (Luo et al. 2003) dan lektin yang memiliki kemampuan pengikatan lipo-polisakarida (Zhang et al. 2004). Selanjutnya Luo et al. (2006), melaporkan bahwa lektin dari cDNA udang P. monodon (PmLec) berperan dalam imunitas non-spesifik khususnya dalam fungsinya sebagai pengenal protein dan opsonin. Zhao et al. (2009) juga melaporkan bahwa L. vanname C-type lectin-1 (LvCTL1) diekspresikan sangat tinggi di hepatopankreas udang vaname, dimana rekombinan LvCTL1 telah dibuktikan dapat memproteksi udang dari infeksi WSSV yang ditandai dengan affinitas tinggi dan mampu melakukan interaksi beberapa protein WSSV. Gen antivirus yang ditemukan pada penelitian ini memiliki deduksi asam amino yang identik dengan gen antivirus PmAV dengan kode aksesi AAQ75589.1 pada Bank Gen. Keberadaan CTLD pada gen yang diisolasi juga didukung dengan kemiripan gen pengkode CTLD yang telah diisolasi dari kepiting, Portunus trituberculatus yang dikenal sebagai C-type lectin-like domain-containing protein PtLP dengan kode akses ACC86854.1. Selain itu, gen antivirus memiliki kekerabatan beberapa gen yang mengkodekan C-type lectin yang diisolasi dari beberapa spesies krustase misalnya dari L. vannamei (kode aksesi AB197374.1; ABU62825.1), P. semisulcatus (kode aksesi ABI97372.1), F. chinensis (kode aksesi ACJ06428.1; ABA54612.1; ACJ06429.1), P. monodon (kode aksesi ABI97373.1; AAZ29608.1). Gen antivirus PmAV yang diisolasi dari udang windu pada penelitian ini tersusun atas 170 asam amino yang dideduksi dari sekuen cDNA. Komposisi asam amino penyusun gen antivirus yang terbesar adalah serina (10,00%),

39

sedangkan yang terkecil adalah asam amino prolina dan lisina masing-masing 1,76%. Komposisi yang sama juga telah dilaporkan pada deduksi asam amino dari sekuen cDNA PmAV yang diisolasi dari udang windu (Luo et al, 2003). Berbeda halnya dengan gen antimikroba penaeidin dimana deduksi asam aminonya memperlihatkan persentase asam amino prolina sangat tinggi (22-29%) pada daerah hulu dan asam amino sisteina (19-23%) pada daerah hilir (Destoumieux et al. 1997; 2000). Deduksi asam amino yang didapatkan pada gen antivirus tersebut lebih besar dibandingkan dengan beberapa deduksi asam amino dari gen antimikroba yang ditemukan sebelumnya, misalnya gen PAP (phagocytosis activating protein) terdiri atas 546 bp yang mengkode 144 asam amino (Chotigeat et al. 2007), antimikroba peptida krustase (penaeidin, P3-a) tersusun atas 82 asam amino (Destoumieux et al. 1997). Isolasi dan identifikasi gen pengkode ketahanan penyakit merupakan langkah awal yang dilakukan dalam upaya peningkatan imunitas pada udang. Dong & Xiang (2007) telah menemukan sedikitnya 34 gen yang dilibatkan dalam fungsi pertahanan atau imunitas pada haemosit pustaka cDNA dari udang F. chinensis, dimana: 38% diantaranya teridentifikasi sebagai gen antimikroba peptida (penaeidin dan anti-lipopolisakarida), 32% adalah gen sistem prophenoloksidase (proPO dan serin proteinase), 15% gen clotting protein (lektin dan transglutaminase), 9% gen signal transduksi inter-selular (peroxinectin dan integrin), dan 6% gen shaperone protein (HSP70 dan thioredoxin peroxidase). Upaya peningkatan imunitas ikan atau udang merupakan salah satu upaya yang dapat dilakukan dalam pengendalian penyakit. Pendekatan teknologi rekombinan khususnya vaksin DNA telah mulai diaplikasikan pada akuakultur. Penyuntikan salmon Atlantik dengan plasmid pengkode glikoprotein IHNV dengan menggunakan promotor pCMV menunjukkan proteksi yang signifikan dengan adanya pembentukan antibodi penetral virus setelah imunisasi dan titernya meningkat setelah uji tantang (Traxler et al. 1999). Salah satu mekanisme yang potensial dalam peningkatan resistensi penyakit adalah produksi hewan akuatik transgenik yang mengandung gen antimikroba peptida. Beberapa informasi telah tersedia luas terkait dengan antibakteri peptida (Bevins & Zasloff 1990; Lehrer et al. 1993; Boman 1996;

40

Hoffmann et al. 1996; Hancock 1997) dimana organisme yang mengandung gen pengkodenya memperlihatkan resistensi patogen yang lebih tinggi. Penemuan cecropin (cationic peptide) (Steiner et al. 1981) sebagai antibakteri merupakan awal dari penelitian antimikroba yang selanjutnya diidentifikasinya beberapa antimikroba lainnya. Struktur yang unik dari cecropin dapat menyebabkan penyatuan sampai membran seluler bakteri, jamur dan parasit sehingga membentuk pori pada membran yang menyebabkan kematian pada patogen (Bechinger 1997). Studi in vitro mengindikasikan bahwa teknologi transgenesis menggunakan konstruksi gen cecropin dapat meningkatkan resistensi organisme. Introduksi konstruksi antimikroba peptida cecropin-B meningkatkan resistensi terhadap bakteri sampai dengan empat kali lipat pada channel catfish (Dunham et al. 2002). Hal yang sama juga ditunjukkan pada ikan medaka transgenik yang memiliki resistensi lebih tinggi dibandikan dengan ikan non-transgenik terhadap bakteri Pseudomonas sp. dan Vibrio sp. (Sarmasik et al. 2002). Gen lisozim telah dilaporkan merupakan salah satu gen pengkode ketahanan penyakit khususnya antimikroba yang tidak spesifik (Austin & Allen-Austin 1985). Dengan menggunakan konstruksi promoter ocean pout AFP dan gen lisozim yang diintroduksi ke ikan salmon menunjukkan adanya kemampuan melawan berbagai jenis mikroba. Pada krustase khususnya pada udang, peningkatan resistensi melalui teknologi transgenesis masih terbatas. Chotigeat et al. (2007) juga telah berhasil mengidentifikasi gen PAP yang memiliki aktivitas dalam peningkatan fagositas hemosit pada udang windu sehingga dengan injeksi intra-muskular dapat meningkatkan resistensi udang windu terhadap WSSV dibandingkan dengan kontrol (tanpa injeksi gen PAP). Penemuan gen pengkode antimikroba penaeidin membuka peluang dalam peningkatan immunitas udang melawan serangan patogen. Aplikasi penaeidin telah memperlihatkan efek peningkatan resistensi pada udang L. vannamei (Destoumieux et al. 1997). Induksi imun pada udang melalui vaksinasi telah dilaporkan dengan penggunaan rekombinan protein WSSV pada udang P. chinensis (Kim et al. 2004), antivirus menggunakan untai ganda RNA (dsRNA) pada udang vaname L. vannamei (Robalino et al. 2004).

41

Keberhasilan isolasi dan karakterisasi serta kloning promoter ProAV (lihat Bab II) dan gen antivirus PmAV merupakan suatu acuan dalam pembuatan konstruksi gen khususnya konstruksi gen all-shrimp construct. Konstruksi gen tersebut dibuat untuk digunakan dalam pengujian secara in vivo pada embrio udang windu, baik pada uji aktivitas promoter ProAV maupun pada analisis ekspresi gen antivirus PmAV. Kegiatan tersebut merupakan kegiatan selanjutnya yang harus dilakukan dalam tahapan produksi udang windu tahan penyakit.

KESIMPULAN Gen antivirus PmAV telah berhasil diisolasi dari cDNA hepatopankreas udang windu P. monodon dan memiliki sekuen yang identik dengan gen antivirus udang windu pada Bank Gen. Gen antivirus tersebut menyandikan 170 asam amino.

III. ANALISIS SEKUEN cdna GEN ANTIVIRUS DARI UDANG WINDU Penaeus monodon *)

Recommend Documents