METODE SKRINING UNTUK MEMPEROLEH KLON POSITIF PADA KLONING SHOTGUN TERMOZIM XILANASE DARI Streptomyces costaricanus 45I-3

J. Sains MIPA, Desember 2009, Vol. 15, No. 3, Hal.: 179 - 187 ISSN 1978-1873

METODE SKRINING UNTUK MEMPEROLEH KLON POSITIF PADA KLONING SHOTGUN TERMOZIM XILANASE DARI Streptomyces costaricanus 45I-3 Heri Satria1, *, Anja Meryandini2 dan Etty Pratiwi3 1Jurusan

Kimia, FMIPA, Universitas Lampung, Bandar Lampung 35145 Indonesia Biologi, Institut Pertanian Bogor, Kampus Darmaga Bogor, 16680, Indonesia 3Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika Pertanian Bogor (BB-Biogen), Bogor 16111 *E-mail : [email protected] 2Departemen

Diterima 17 November 2009, disetujui untuk diterbitkan 2 Desember 2009

ABSTRACT Xylanases is a group of enzyme that has ability to hydrolyse xylan or polymer of xyloses and xylooligosaccharides. Complete hydrolysis of xylans involves the synergistic action of a xylanolytic enzymes, including ß-xylanase, ß-xylosidase, α-glucuronidase, α-L-arabinofuranosidase, and acetyl xylan esterase. The aims of this research were to isolate xylanase gene from Streptomyces costaricanus 45I-3 with the shotgun cloning technique. To obtain positive clone some screening techniques used based on properties material genomic which are use in cloning. Genomic DNA was obtained from S. costaricanus 45I-3 that have known has ability to produce thermostabile extracellular xylanase. Genomic DNA was partially digested with restriction enzyme Sau3A1. Genomic DNA fragments of size 4-10 kb were inserted at BamHI site in pBluescript II KS (+) vector and transformed into E. coli DH5α. Based on blue-white selection approximately 12000 recombinant colonies were obtained. The presence of xylanase gene was identified by screening employing congored plate clearance assay. One positive clone containing the xylanase gene was confirmed and was designated as pHS11. Preliminary characterization of pHS11 using EcoRI showed that it contained a 6.0 kb DNA insert. Xylanase were produced has xylanase spesific activity 6.393 U/mg, β-xylosidase activity 0.208 U/ml, arabinofuranosidase activity 0.079 U/ml and acetyl xylan esterase activity 0.063 U/ml as well. Keywords: cloning, xylanase, thermozyme, Streptomyces costaricanus 45I-3

1. PENDAHULUAN Penguraian biopolimer xilan secara lengkap menjadi unit-unit penyusunnya membutuhkan suatu sistem enzim xilanolitik yang tersusun oleh β-1,4-endoxilanase, β-xilosidase, α-L-arabinofuranosidase, αglukuronidase, asetil xilan esterase, dan asam fenolat (asam ferulat dan p-koumerat ) esterase1). Enzimenzim xilanolitik banyak dihasilkan oleh mikroba yang hidup pada sisa tumbuhan seperti fungi dan bakteri dengan mensintesis endo-1,4-β-xilanase (1,4-β-D-xilanxilanohydrolase, EC. 3.2.1.8) dan β-xilosidase (1,4-βD-xilanxilanohydrolase, EC. 3.2.1.37) biasanya berhubungan dengan penguraian sisa tumbuhan tersebut. Salah satu bakteri penghasil xilanase adalah genus Streptomyces. Produksi xilanase secara komersial dari Streptomyces kurang efisien dan ekonomis. Hal ini disebabkan pertumbuhan Streptomyces yang lambat dibandingkan dengan bakteri pada umumnya. Pendekatan teknik rekombinasi DNA yang lebih dikenal dengan kloning gen merupakan suatu alternatif untuk memproduksi xilanase yang berasal dari S. costaricanus 45I-3 secara heterologus di Escherichia coli2). Di dalam biologi sel istilah kloning memiliki dua pengertian yaitu penggandaan sekuen tertentu dari DNA sehingga menghasilkan DNA yang identik, dan pengisolasian sekuen tertentu dari DNA suatu organisme atau sel untuk diperbanyak pada organisme atau sel yang berbeda3). Metode kloning umumnya mengikuti lima tahap4) meliputi (1) pemotongan DNA dengan menggunakan enzim restriksi endonuklease yang memiliki situs pemotongan tertentu (2) memilih DNA vektor yang memiliki kemampuan bereplikasi secara otonom seperti yang dimiliki oleh virus dan plasmid (3) menggabungkan secara kovalen potongan DNA dengan DNA vektor menggunakan enzim ligase sehingga menghasilkan DNA rekombinan (4) memasukkan DNA rekombinan tersebut ke dalam sel inang yang memiliki enzim-enzim yang dibutuhkan DNA rekombinan untuk bereplikasi (5) menyeleksi sel inang yang mengandung DNA rekombinan.

 2009 FMIPA Universitas Lampung

177

H. Satria dkk… Metode Skrining untuk Memperoleh Klon Positif

Tiga metode yang umum digunakan untuk mengidentifikasi klon yang mengandung gen yang diinginkan meliputi5) (1) Hibridisasi DNA, keberadaan gen dilacak dengan menggunakan pelacak sehingga akan terbentuk ikatan hidrogen antara pasangan basa yang sesuai dari utas tunggal gen dan utas tunggal DNA pelacak (2) Immunologi assay, jika DNA klon diekspresikan pada sel inang menghasilkan protein, keberadaan protein tersebut dapat dideteksi dengan antibodi primer. Untuk lebih spesifik ditambahkan antibodi sekunder yang biasanya berupa enzim yang dapat mengubah substrat menjadi produk yang berwarna, sehingga klon yang positif mengandung gen yang diinginkan akan menghasilkan warna pada media (3) Aktivitas protein, jika gen target dapat menghasilkan protein enzim maka pemilihan klon dapat dilakukan dengan menggunakan aktivitas enzim untuk mengkatalis substrat menjadi produk pada media. Jika protein enzim yang dihasilkan penting untuk pertumbuhan sel inangnya maka sel inang memiliki kemampuan untuk tumbuh pada media minimum yang hanya mengandung substrat untuk enzim yang dihasilkan tersebut. Melihat teknologi rekombinasi yang dikembangkan saat ini, ada tiga hal yang menjadi fokus penseleksian klon yaitu DNA target, vektor, dan sel inang. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan klon yang membawa gen xilanase dari S. costaricanus 45I-3, dengan mengembangkan sistem penyeleksian klon berdasarkan aktivitas gen yang digunakan sebagai material dalam kloning. Aktivitas yang dimaksud adalah gen resistensi terhadap antibiotik ampisilin (bla), gen penyandi α fragment dari β-galaktosidase (lacZ) yang dibawa oleh vektor (pBluescript II KS (+)), aktivitas gen lacZ∆M15 yang menghasilkan subunit ω protein βgalaktosidase yang dibawa oleh inang Escherichia coli DH5 α, dan aktivitas xilanase dari gen yang diisolasi dari S. costaricanus 45I-3. Diharapkan penelitian ini bermanfaat sebagai landasan dalam seleksi klon xilanase secara shotgun, dalam upaya meningkatkan efisiensi produksi xilanase yang berasal dari S. costaricanus 45I3 dengan memproduksi xilanase secara heterologus di E. coli.

2. METODE PENELITIAN 2.1. Media Tumbuh Isolat S. costaricanus 45I-3 secara rutin ditumbuhkan pada media agar-agar xilan dengan komposisi (%) : 1,0 ekstrak khamir; 10,3 sukrosa; 0,5 xilan birchwood (Sigma Co., USA); 15,0 agar-agar. Untuk tujuan isolasi DNA Streptomyces sp. 45I-3 dikultur pada media YM (komposisi (%) : 0,4 ekstrak khamir; 1,0 ekstrak malt; 1,5 glukosa) atau media YEME (komposisi (g/L) : ekstrak khamir 3; ekstrak malt 3; glukosa 10; peptone 3; sukrosa 340; MgCl2 5mM; glycine 0.5% w/v) lalu diinkubasi dan diagitasi pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 130 rpm pada suhu ruang selama 2-3 hari. E. coli DH5α ditumbuhkan pada media Luria Betani (LB) pada suhu 37 oC selama 12-16 jam dengan penambahan antibiotika ampisilin (150 µg/ml) jika diperlukan. 2.2. Isolasi DNA Genom S. costaricanus 45I-3 Untuk isolasi DNA genom digunakan lisozim dan SDS 10% dan CTAB sebagai pelisis sel serta fenol kloroform untuk pemurniannya2). Sebanyak 50 ml biakan S. costaricanus 45I-3 disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm pada 4oC selama 10 menit, supernatannya dibuang dan pelet yang terbentuk dicuci dengan bufer STE (komposisi: 0,3M sukrosa; 25,0mM Tris-HCl; 25,0mM EDTA.2Na pH 8), kemudian disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm 4oC selama 10 menit. Supernatannya dibuang dan terhadap pelet yang diperoleh ditambahkan 8,55 ml bufer STE dan 950 µl lisozim ( 20 mg/ml dalam bufer STE), dibolak-balik secara halus lalu diinkubasi pada 30oC selama 20-30 menit hingga terbentuk protoplas. Sebanyak 500 µl SDS 10% dan 50 µl proteinase-K (20mg/ml) ditambahkan pada campuran tersebut dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit. Setelah itu ke dalam campuran ditambahkan 1,8 ml 5M NaCl dan dibolak-balik secara halus, dan ditambahkan 1,5 ml 10% CTAB dalam larutan 0,7M NaCl lalu diinkubasi pada suhu 65oC selama 20 menit. Kemudian ke dalam larutan ditambahkan 1 kali volume fenol:kloroform (25:24) dan disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm pada 16oC selama 10 menit. Fase bening dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan 0,6 kali volume isopropanol, inkubasikan pada suhu -20oC selama 30 menit. DNA yang terbentuk diangkat dengan menggunakan ujung pipet lalu DNA dikeringkan hingga berwarna transparan dan dilarutkan dengan 50 µl ddH2O steril. Larutan DNA disimpan pada suhu 4oC atau -20 oC untuk pemakaian dalam jangka panjang. 2.3. Isolasi pBluescript II KS (+) dari E. Coli E. coli (pBluescript II KS(+)) ditumbuhkan pada media LB yang mengandung 150 µg/ml ampisilin lalu diinkubasi dan diagitasi pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 180 rpm pada suhu 37oC selama 16-18 178


J. Sains MIPA, Desember 2009, Vol. 15, No. 3

jam. Sebanyak 1500 µl biakan E. coli dipindahkan ke tabung mikro lalu disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit. Supernatannya dibuang dan pelet sel diresuspensi dalam 150 µl larutan A (50mM glukosa, 25mM tris HCl pH 8 , 10mM EDTA pH 8) dingin selama 10 menit. Setelah itu sebanyak 200 µl larutan B (0,2N NaOH, 1% w/v SDS) ditambahkan dan dibolak-balik secara halus lalu ditambahkan 150 µl larutan C (5M Na-asetat, 11,5% asam asetat glasial) dan dibiarkan selama 5 menit. Larutan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit lalu supernatan dipindahkan ke tabung mikro yang baru dan ditambahkan 500 µl fenol:kloroform (25:24) dan divortek selama 1 menit. Campuran kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit dan fase cair pada bagian atas dipindahkan ke tabung mikro yang baru. Sebanyak 2 kali volum isopropanol ditambahkan ke fase cair yang diperoleh lalu dibolak-balik secara halus dan diinkubasi pada suhu -20oC selama 30 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan terhadap pelet yang diperoleh ditambahkan 300 µl 70% etanol dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan hingga berwarna transparan dan dilarutkan dalam 50 µl ddH2O steril. Larutan DNA disimpan pada suhu 4oC atau -20oC untuk pemakaian dalam jangka panjang. 2.4. Pembuatan Pustaka Genom DNA genom hasil isolasi dipotong secara parsial dengan menggunakan enzim Sau3A1. DNA berukuran 4-10 kb diisolasi kembali dengan menggunakan glass bead (Geneclean BIO101, USA). Plasmid pBluescript II KS (+) dipotong menggunakan enzim BamHI.Ligasi menggunakan enzim T4 DNA ligase (Invitrogen) pada suhu 16oC selama 16-24 jam. Untuk selanjutnya plasmid ditransformasikan ke E. coli DH5α kompeten (Sambrook dan Russell 2001).Bakteri transforman yang telah dibuat disebar ke atas media LB padat yang mengandung ampisilin 150 µg/ml. Untuk menyeleksi keberhasilan proses transformasi ditambahkan 0,1 M IPTG (0,5 µl/ml) dan 2% X-Gal (40 µg/ml) pada media LB lalu diinkubasi selama 16-18 jam pada suhu 37oC 2.5. Seleksi Klon Xilanase Seluruh koloni berwarna putih yang tumbuh dikoleksi dengan membuat replika pada media LB padat yang mengandung ampisilin. Untuk mengujikan klon yang mampu mengekspresikan enzim xilanase, klon digoreskan ke atas media LB padat yang mengandung ampisilin dan ditambahkan 0,5% xilan birchwood lalu diinkubasi selama 18-20 jam pada suhu 37oC dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 50oC selama 2-3 jam. Klon positif akan menghasilkan zona jernih setelah pewarnaan dengan 2% larutan congo red6).Aktivitas βxilosidase diamati dengan kemampuan klon menghidrolisis senyawa 4-metilumberilferil-β-D-xilosida (Sigma). Klon yang positif akan berpendar jika diamati dibawah sinar UV pada λ 340 nm7). 2.6. Ekspresi Gen Penyandi Xilanase di E. coli DH5α Gen penyandi xilanase dari klon positif diekspresikan dengan menumbuhkan E. coli DH5α pada media LB cair yang mengandung 0,5% xilan birchwood dan diinkubasi bergoyang dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 37oC selama satu malam. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit, filtrat yang diperoleh diujikan aktivitas xilanasenya dengan metode DNS. Pengujian aktivitas xilanase dalam menghidrolisis substrat spesifik dilakukan dengan metode Saha8).

3. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1. Isolasi DNA Genom S. costaricanus 45I-3 Isolasi DNA genom dari S. costaricanus 45I-3 menggunakan metode yang diterap-kan oleh Trihpati and Rawal dengan sedikit modifikasi2). Media yang disarankan untuk mengisolasi DNA adalah YEME, tetapi pertumbuhan S. costaricanus 45I-3 pada media ini menghasilkan pelet yang lebih kompak. Sedangkan bentuk pertumbuhan terdispersi dihasilkan pada media YM. Perbedaan pertumbuhan isolat pada kedua media tersebut akan mempengaruhi hasil ekstraksi DNA genom. Dalam bentuk terdispersi sel lebih mudah dilisis sehingga meningkatkan jumlah DNA yang terekstraksi2). Hal ini dapat dibuktikan secara kuantitas dan kualitas DNA yang diperoleh lebih baik pada media YM dibandingkan dengan media YEME (Gambar 1 dan Tabel 1).Tingkat kemurnian DNA yang diisolasi dapat dilihat dari perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm (λ 260: λ 280). DNA dikatakan murni jika perbandingan serapan pada panjang gelombang tersebut berada pada kisaran 1,8-2,09). Kontaminasi RNA dan fenol akan menurunkan nilai serapan pada panjang gelombang 260 nm sedangkan kontaminasi protein akan menaikkan serapan pada  2009 FMIPA Universitas Lampung

179


panjang gelombang 280 nm10). Tabel 1 dan Gambar 1 menunjukkan perbandingan hasil isolasi DNA genom dari S. costaricanus 45I-3. Karena kualitas dan kuantitas yang sangat baik dihasilkan pada ulangan 3 dari pertumbuhan di media YM maka untuk keperluan kloning selanjutnya DNA tersebut yang digunakan. Tabel 1. Hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA Absorbansi Absorbansi =260 nm =280 nm 1 YM 0,945 0,552 2 YEME 0,333 0,168 Catatan: konsentrasi DNA setelah dikalikan faktor pengenceran 100x No

Media tumbuh Streptomyces

a

M 1

2 3

4

b

1

Ratio λ260 : λ280 1,98 1,70

Konsentrasi (ng/µl) 12375 10369

2 3 4 5 6 7 8 9

Gambar 1. Hasil elektroforesis DNA S. costaricanus 45I-3 yang ditumbuhkan pada media YM. (a. M: standard λ 100 ng/µl, 1-4: DNA hasil isolasi ulangan 1-4) dan media YEME (b. 1-9: DNA hasil isolasi ulangan 1-9) 3.2. Isolasi pBluescript II KS (+) dari E. Coli Isolasi pBluescript II KS (+) dari sel E. coli menunjukkan hasil yang baik. Untuk mengetahui ukuran pBluescript II KS (+) dilakukan pemotongan menggunakan enzim BamH1. Dari hasil elektroforesis diperoleh pita yang sesuai dengan ukuran yang diharapkan yaitu sekitar 3,0 kb (Gambar 2). M 1

2

3 kb

Gambar 2. Hasil elektroforesis pBluescript II KS (+) yang diisolasi dengan metode alkalin lisis. M: 1 kb DNA ladder, 1: pBluescript II KS (+) sebelum dilinierisasi, 2: pBluescript II KS (+)-BamH1 3.3. Pembuatan Pustaka Genom Gen xilanase yang berasal dari beberapa mikroba merupakan kelompok gen yang berukuran besar. Tsujibo et al.11) melakukan kloning xilanase dari S. thermovio-laceus OPC-520 dan mempelajari struktur sisipan DNA dengan panjang 3,3 kb pada pXY95 yang dikonstruksi dari pUC19 dan membawa gen yang menyandikan xilanase (stxI dan stxII) dan asetil xilan esterase (stxIII). Pada penelitian selanjutnya ditemukan gen stxIV yang menyandikan α-L-arabinofuranosidase yang ditranskripsikan secara divergen dan letaknya 1,47 kb di atas stxI12). Kulkarni et al.13) menyatakan gen penyandi xilosidase dan xilanase dari B. stearothermophilus 21 berukuran 4,2 kb. Karena besarnya ukuran gen yang menyandikan enzim xilanolitik tersebut, dan untuk mendapatkan struktur gen secara lengkap yang dapat diekspresikan maka kloning shotgun dilakukan dalam penelitian ini. Kloning dengan menggunakan teknik shotgun menggunakan

180



keseluruhan DNA genom S. costaricanus 45I-3 untuk kemudian dipotong menggunakan enzim resitriksi Sau3A1. Enzim ini mengenali sekuen 4 pasang basa 5’-↓GATC-3’ sehingga frekwensi pemotongan lebih banyak dibandingkan dengan enzim restriksi yang mengenali 6 pasang basa. Pemotongan DNA genom dilakukan secara parsial dengan konsentrasi 0,2 U/µl selama 5 menit pada suhu 37 oC. Pemotongan DNA genom menghasilkan ujung kohesif 5’ (5’ over hangs) yang siap diligasikan dengan ujung kohesif 3’ dari vektor. DNA berukuran 4-10 kb yang akan disisipkan ke vektor, diisolasi dari gel agarose menggunakan glass bead (Gambar 3a). Prinsip teknik isolasi ini adalah dengan mengikatkan molekul DNA yang bermuatan negatif dengan komplek silika yang bermuatan positif secara ionik untuk kemudian ikatannya dihilangkan dan DNA dilarutkan dengan air bidestilata pada suhu 55-60 oC. Dengan menggunakan metode ini didapatkan recovery sebesar 79,62% (Gambar 3b) dimana konsentrasi DNA berukuran 4-10 kb yang diisolasi sebesar 412,89 ng/µl diperoleh dari konsentrasi DNA genom awal 518,59 ng/µl. Kemurnian DNA yang diperoleh juga cukup tinggi karena rasio λ260 : λ280 cukup tinggi yaitu sebesar 1,98. M

a1

2

M

M

1

b 10 kb 4 kb 3 kb

10 kb 4 kb

Gambar 3. Isolasi DNA insert 4-10 kb dari DNA genom S. costaricanus 45I-3. a) M: 1 kb DNA ladder, 1 dan 2: hasil pemotongan parsial DNA genom dengan Sau3A1 yang akan diisolasi pada ukuran 4-10 kb. b) M: 1 kb DNA ladder, 1: DNA genom hasil isolasi dari potongan gel agarose dengan menggunakan glass bead Untuk mengkonstruksi plasmid yang membawa gen yang menyandikan enzim xilanolitik digunakan pBluescript II KS(+) yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi BamH1. Enzim ini mengenali sekuen 6 pasang basa 5’-G↓ATCC-3’ sehingga pemotongan-nya menghasilkan ujung kohesif 3’ (3’ over hangs) yang siap diligasikan dengan ujung 5’ DNA yang akan disisipkan. Dengan demikian situs restriksi BamH1 pada daerah MCS akan hilang karena sekuen 5’-GATCC-3’ tidak dihasilkan kembali setelah ligasi. Karena hasil pemotongan pBluescript II KS(+) dan DNA genom S. costaricanus 45I-3 merupakan ujung kohesif, maka dengan penyimpanan pada suhu 4 oC akan me-mungkinkan terjadinya ligasi antar molekul sendiri. Untuk mengatasi hal tersebut sebelum campuran DNA ditambahkan enzim ligase, terlebih dahulu dipanaskan pada suhu 45 oC selama 5 menit untuk memisahkan ujung kohesif yang telah melekat pada ujung kohesif lainnya14). Ligasi dilakukan menggunakan enzim T4 DNA ligase dengan perbandingan volume vektor dan sisipan DNA yang adalah 3:1. Untuk menjamin keberhasilan ligasi reaksi dibiarkan selama 1 malam. Plasmid yang telah dikonstruksi ditransformasikan ke dalam sel E. coli DH5α kompeten dengan melakukan heat shock pada suhu 42 oC. Membran E. coli DH5α yang permeabilitasnya dikondisikan dengan konsentrasi Ca2+ (dari CaCl2) akan membuka dan plasmid yang telah dikonstruksi diharapkan dapat masuk ke dalam sel. 3.4. Seleksi Klon Rekombinan Seleksi transforman dilakukan pada media LB padat yang mengandung ampisilin 150 µg/ml dan Xgal 40 µg/ml. Dengan adanya antibiotik ampisilin sel yang tidak mengandung plasmid yang ditransformasikan tidak akan tumbuh karena tidak memiliki gen penyandi resisten terhadap ampisilin. Sedangkan sel yang mengandung plasmid yang membawa sisipan DNA akan berwarna putih pada media karena tidak dapat menghasilkan ujung α atau bagian N terminal dari protein β-galaktosidase. Jika sel tidak mengandung sisipan DNA ujung α protein ini akan diekspresikan oleh lacZ sehingga akan bergabung dengan ujung ω protein yang dihasilkan oleh sel inang sehingga menjadi protein β-galak-tosidase aktif yang akan


181


menguraikan X-gal menjadi komponennya yaitu 5-bromo-4-kloro-3-indolil dan D-galaktosa. Penumpukan senyawa 5-bromo-4-kloro-3-indolil yang tidak larut ini akan menghasilkan warna biru pada media15). Dari sekitar 12000 koloni putih yang diperoleh terdapat satu koloni yaitu klon 11, yang mampu menghasilkan enzim xilanase. Hal ini diperoleh dengan terbentuknya zona bening disekitar koloni yang menandakan koloni transforman mampu menguraikan substrat xilan birchwood yang ditambahkan (Gambar 4). Koloni akan terlihat jelas jika pada media diwarnai dengan 2% congo red selama 15 menit kemudian dicuci dengan 1M NaCl. Zat warna congo red akan terikat dengan ikatan glikosidik pada xilan menghasilkan warna merah, jika ikatan glikosidik ini diuraikan congo red tidak dapat terikat sehingga warna media tetap bening6).

Klon 11

Gambar 4.

DH5α

Klon 11

DH5α

Koloni yang menghasilkan zona bening pada media LB yang mengandung ampisilin, X-gal dan xilan birchwood. Gambar kiri sebelum media diwarnai dengan congo red dan gambar kanan setelah media diwarnai dengan congo red

Verifikasi plasmid rekombinan pHS11 dilakukan menggunakan enzim restriksi EcoR1. Dari hasil digesti tampak dua pita pada gel hasil elektroforesis masing-masing berukuran 3 kb dan 6 kb (Gambar 5). Pita berukuran 6 kb ini merupakan DNA sisipan, sedangkan pita berukuran 3 kb merupakan vektor pBluescript II KS(+). M

M

1

1

2

2

3 kb

6 kb

Gambar 5. Hasil elektroforesis plasmid rekombinan dari klon 11. M: 1 kb DNA ladder, 1: pHS11 utuh, 2: pHS11-EcoR1 3.5. Pendeteksian Aktivitas β-Xilosidase Dari pengujian dengan menggunakan substrat 4-metilumberilferil-β-D-xilosida diketahui klon 11 memiliki aktivitas β-xilosidase. Hasil positif diketahui dengan melihat adanya koloni berpendar di atas UV transiluminator, yang dihasilkan dari penguraian substrat tersebut menjadi senyawa 4-metilumberilferon yang akan berpendar jika disinari dengan sinar UV7). Aktivitas enzim ini pada substrat xilan akan melepaskan xilosa sebagai produk akhir dari rantai polimer D-xilosida yang lebih pendek hasil dari penguraian oleh enzim endo-β-xilanase13, 16). 3.6. Ekspresi Gen Penyandi Xilanase di E. coli DH5α Ekspresi gen penyandi xilanase pada koloni 11 yang membawa sisipan gen xilanase dilakukan dua tahap. Tahap pertama dilihat kemampuan klon mengekspresikan enzim xilanase secara keseluruhan dengan menggunakan substrat xilan birchwood, dan tahap kedua melihat jenis enzim xilanolitik apa saja yang diekspresikan dengan menggunakan substrat spesifik turunan senyawa nitrofenol8). Aktivitas enzim xilanase

182



akan menghasilkan gula pereduksi yang diukur dengan menggunakan metode DNS. Klon 11 mampu menghasilkan enzim xilanase ekstraselular yang dilepaskan ke media tumbuhnya. Aktivitas spesifik xilanase dari klon 11 sebesar 6,393 unit/mg lebih rendah jika dibandingkan dengan aktivitas spesifik S. costaricanus 45I-3 (12,127 unit/mg). Kulkarni et al.13) mengatakan penurunan aktivitas xilanase yang diekspresikan E. coli rekombinan merupakan hal umum yang dijumpai dalam setiap penelitian. Adanya modifikasi post-translasi pada E. coli seperti glikosilasi dan adanya akumulasi intraselular xilanase rekombinan merupakan hal yang dapat menjelaskan fenomena ini. Hasil pengujian aktivitas xilanase disajikan pada Tabel 2. Tabel 2. Hasil pengujian aktivitas dan aktivitas spesifik xilanase ekstrak kasar Isolat S. costaricanus 45I-3 Klon 11 E. coli DH5α

Aktivitas (Unit/ml) 1,947 0,532 0,000

Kadar Protein (mg/ml) 0,161 0,083 0,024

Aktivitas spesifik (Unit/mg) 12,127 6,393 0,000

Dengan menggunakan substrat spesifik menunjukkan xilanase baik yang berasal dari klon 11 dan S. costaricanus 45I-3 memiliki aktivitas β-xilosidase, arabinofuranosidase dan asetil xilan esterase. Aktivitas βxilosidase dan asetil xilan esterase dari klon 11 dan S. costaricanus 45I-3 memiliki kedekatan nilai (Tabel 3). Tetapi untuk aktivitas arabino-furanosidase klon 11 memiliki tingkat yang jauh lebih rendah. Clark et al.17) menyatakan enzim xilanase yang berasal dari Trichoderma reesei merupakan enzim bifungsional yang dapat memiliki aktivitas xilanase dan arabinofuranosidase termasuk famili glikosida hidrolase. Dari analisa HPLC menunjukkan xilanase yang berasal dari S. costaricanus 45I-3 mampu menghasilkan xilosa dan arabinosa yang cukup tinggi masing-masing 280,22 ppm dan 106,13 ppm18). Hasil ini mengindikasikan bahwa pada S. costaricanus 45I-3 terdapat gen penyandi β-xilosidase dan arabinofurano-sidase.Tsujibo et al.11, 12) mengatakan ORF gen penyandi xilanase dari S. thermoviolaceus OPC-520 saling berlapis dan berdampingan dan diekspresikan secara divergen. Gen stxI dan stxII yang menyandikan xilanase hanya dipisahkan oleh 37 nukleotida dengan gen stxIII yang menyandikan asetil xilan esterase, sedangkan gen stxIV yang menyandikan arabinofuranosidase terpisah sejauh 663 nukleotida dari stxI. Oleh karena itu sekuensing dan analisis terhadap DNA sisipan yang terbawa oleh pHS11 sangat diperlukan untuk mengetahui struktur dan letak gen-gen yang menyandikan enzim-enzim xilanolitik tersebut. Tabel 3. Hasil pengujian aktivitas substrat spesifik xilanase ekstrak kasar Aktivitas (Unit/ml) Substrat spesifik pNP- β-D-xilosida pNP- α-L-arabinofuranosida pNP- β-D-glukoropiranosida pNP- α-D-galaktopiranosida pNP- asetat

S. costaricanus 45I-3 0,340 0,202 0,000 0,000 0,093

Klon 11 0,208 0,079 0,000 0,000 0,063

E. coli DH5α 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

4. KESIMPULAN DAN SARAN Dengan menggunakan aktivitas gen bla, gen lacZ yang dibawa oleh pBluescript II KS (+), gen lacZ∆M15 yang dibawa oleh Escherichia coli DH5 α, dan aktivitas xilanase dari gen yang diisolasi dari S. costaricanus 45I-3, kloning gen xilanase termozim dari S. costaricanus 45I-3 secara shotgun mendapatkan satu klon positif yang membawa DNA sisipan sepanjang 6 kb. Klon dapat mensekresikan enzim xilanase dengan aktivitas spesifik sebesar 6,393 U/mg. Xilanase yang dihasilkan memiliki aktivitas β-xilosidase sebesar 0,208 U/ml, arabinofuranosidase sebesar 0,079 U/ml dan asetil xilan esterase sebesar 0,063 U/ml.Untuk penelitian selanjutnya disarankan melakukan sekuensing terhadap DNA sisipan yang dibawa oleh pHS11 agar panjang dan posisi gen pada DNA sisipan dapat diketahui. Juga perlu dilakukan upaya untuk meningkatkan aktivitas enzim xilanase yang dihasilkan dengan over produksi menggunakan vektor ekspresi.


183


UCAPAN TERIMA KASIH Penulis mengucapkan terimakasih kepada Dr.Yulin Lestari Jurusan Biologi FMIPA IPB untuk isolat S. costaricanus 45I-3, dan juga Kepala Laboratorium Mikrobiologi PAU IPB serta Kepala Laboratorium Biologi Molekuler dan Laboratorium Mikrobiologi Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika Pertanian Bogor yang telah memfasilitasi penelitian ini.

DAFTAR PUSTAKA 1.

Beg, Q.K., Kapoor, M., Mahajan, L. and Hoondal, G.S. 2001. Microbial xylanases and their industrial applications : a review. Appl. Microbiol. Biotechnol., 56:326-338.

2.

Tripathi, G. and Rawal, S.K. 1998. Simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from Streptomyces aureofaciens. Biotechnol. Tech., 3:629-631.

3.

Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. 2002. Molecular Biology of Cell. 4th ed. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.../garlandscience.com [10 Mei 2007]

4.

Nelson, D.L. and Cox, M.M. 2005. Lehingher Principles of Biochemistry 4th ed. NY Wolrch. 37: 306343.

5.

Glick, B.R. ang Pasternak, J.J. 1989. Molecular Biotechnology Principals and Application of Recombinant DNA. ASM press Washington. 683 p.

6.

Teather, R. and Wood, P.J. 1982. Use of congo red-polysaccharide interaction in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovin rumen. Appl. Environ. Microbiol., 43:777-780.

7.

Kaneko, S., Kitaoka, M., Kuno, A. and Hayashi, K.. 2000 Syntheses of 4-methylumbelliferyl-β-Dxylobioside and 5-bromo-3-indolyl-β-D-xilobioside for sensitive detection of xylanase activity on agar plate. Biosci Biotechnol Biochem., 64:741-745.

8.

Saha, B.C. 2001. Purification and characterization of an extracellular β-xylosidase from a newly isolated Fusarium verticillioides. J. Indust. Microbiol. Biotechnol. 27:241-245

9.

Ausubel, S.M., Brent, R., Kingstone.,R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, G.A. and Struhl, K. 1994. Current Protocols in Molecular Biology Vol. 1. John Wiley and Son Inc, Brooklyn NY, p. 3.5.3.3.5.6

10.

Saunders, G.C. and Parkes, H.C. 1999. Analytical Molecular Biology Quality and Validation. Cambridge UK 29 - 80

11.

Tsujibo, H., Ohtsuki, T., Iio, T., Yamazaki, I., Miyamoto, K., Sugiyama, M. and Inamori, Y. 1997. Cloning and sequence analysis of gene encoding xylanases and acetyl xylan esterases from Streptomyces thermoviolaceus OPC-520. Appl. Environ. Microbiol.,63:661-666.

12.

Tsujibo, H., Takada, C., Wakamatsu, Y., Kosaka, M., Tsuji, A., Miyamoto, K. and Inamori, Y. 2002. Cloning and expression of an α-L-arabinofuranosidase gene (stxIV) from Streptomyces thermoviolaceus OPC-520. Biosci. Biotechnol. Biochem., 66:434-438

13.

Kulkarni, N.A. and Shendye, R. M. 1999. Molecular and biotechnological aspects of xylanases. FEMS Microbiol. Rev., 23: 411-456.

14.

George, S.P. 2001. Molecular and Biochemical Aspects of Extremophilic Actinomycete [Thesis]. India: Division of Biochemical Sciences National Chemical Laboratory Pune.

184



15.

Sambrook, J. and Russell, D.W. 2001. Molecular Cloning a Laboratory Manual. 3rd edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

16.

Subramaniyan, S. and Prema, P. 2002. Biotechnology of microbial xylanases : enzymology,molecular biology, and application. Critical. Rev. Biotechnol., 22: 33-64.

17.

Clark, E.M., Tenkanen, M., Nakni-Sentana, T. and Pentika, M. 1996. Cloning of gene encoding αL-arabinofuranosidase and β-xilosidase from Trichoderma reesei by expression in Saccharomyces cereviceae. Appl. Environ. Microbiol., 62:3840-384.

18.

Meryandini, A., Hendarwin, T., Prihandono, P.A. anf Akhdiya, A.2007. Characterization of Streptomyces spp. 45I-3 xylanase. BIOTROPIA 14:32-42


185

METODE SKRINING UNTUK MEMPEROLEH KLON POSITIF PADA KLONING SHOTGUN TERMOZIM XILANASE DARI Streptomyces costaricanus 45I-3

Recommend Documents