PEMURNIAN REKOMBINAN ERITROPOIETIN MANUSIA (rhEPO) MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI AFINITAS Ni-NTA DAN Co-TALON
YANA RUBIYANA
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
2012
ABSTRAK YANA RUBIYANA. Pemurnian Rekombinan Eritropoietin Manusia (rhEPO) Menggunakan Kromatografi Afinitas Ni-NTA dan Co-Talon. Dibimbing oleh IRMANIDA BATUBARA dan ADI SANTOSO. Teknik pemurnian rekombinan eritropoietin manusia (rhEPO) yang sesuai dan efisien diperlukan agar diperoleh protein rhEPO yang murni sehingga dapat dilanjutkan ke arah uji praklinis. Salah satunya menggunakan teknik kromatografi afinitas logam terimobilisasi (IMAC) yang mempunyai beberapa kelebihan di antaranya selektivitas yang tinggi, mudah dielusi, dan mudah dalam proses regenerasi kolom. Sedikitnya terdapat 2 macam resin IMAC komersial yang menggunakan matriks asam nitriloasetat (NTA) sebagai pengelat, yaitu resin IMAC berbasis-nikel (Ni-NTA) dan berbasis-kobalt (Co-NTA) atau lebih dikenal dengan Talon. Pada penelitian ini dipelajari pengaruh ion logam Ni2+ dan Co2+ dalam memurnikan protein rhEPO. Hasilnya menunjukkan bahwa Ni-NTA mempunyai afinitas yang lebih tinggi dalam mengikat protein rhEPO dibandingkan dengan Co-Talon. Total protein rata-rata Ni-NTA sebesar 226.72 µg/mL dan Co-Talon sebesar 60.52 µg/mL, namun kemurnian protein dengan NiNTA tidak sebaik dengan Co-Talon. Berdasarkan jumlah protein (yield) yang dapat dipisahkan, Ni-NTA lebih sesuai digunakan untuk mendapatkan hasil protein rhEPO yang tinggi.
ABSTRACT YANA RUBIYANA. Purification of Recombinant Human Erythropoietin (rhEPO) by Using Affinity Chromatography Ni-NTA and Co-Talon. Supervised by IRMANIDA BATUBARA and ADI SANTOSO. Suitable and efficient techniques for purification of recombinant human erythropoietin (rhEPO) are required to obtain pure rhEPO which can be continued to preclinical trials step. One of these techniques is immobilized metal affinity chromatography (IMAC), which has advantages such as high selectivity, easy to elute, and simple procedure for column regeneration. At least, there are 2 kinds of commercial IMAC resin using nitriloacetic acid (NTA) matrix as chelating agent, namely nickel-based (Ni-NTA) and cobalt-based IMAC resin (Co-NTA), the latter is well known as Talon. This research studied the influence of metal ions Ni2+ and Co2+ in rhEPO purification. The results indicated that NiNTA had higher affinity in binding rhEPO protein compared with Co-Talon. Average total protein by Ni-NTA was 226.72 µg/mL and Co-Talon was 60.52 µg/mL, but the protein purity with Co-Talon was better than Ni-NTA. Base on protein yield that can be separated, Ni-NTA is more suitable to obtain high yield of rhEPO protein.
PEMURNIAN REKOMBINAN ERITROPOIETIN MANUSIA (rhEPO) MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI AFINITAS Ni-NTA DAN Co-TALON
YANA RUBIYANA
Skripsi Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
2012
Judul Skripsi : Nama NIM
: :
Pemurnian Rekombinan Eritropoietin Manusia (rhEPO) Menggunakan Kromatografi Afinitas Ni-NTA dan Co-Talon Yana Rubiyana G44096018
Disetujui
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr Irmanida Batubara NIP 19750807200501 2 001
Dr Adi Santoso NIP 19601217198603 1 004
Diketahui Ketua Departemen Kimia
Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS NIP 19501227 197603 2 002
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas berkat limpahan rahmat dan hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini yang berjudul “Pemurnian Rekombinan Eritropoietin Manusia (rhEPO) Menggunakan Kromatografi Afinitas Ni-NTA dan Co-Talon”. Shalawat serta salam tercurah kepada junjungan Nabi Muhammad SAW yang telah membimbing kita semua sehingga kita dapat merasakan nikmat Islam dan ilmu pengetahuan. Karya ilmiah ini disusun berdasarkan penelitian yang dilaksanakan pada bulan Juli 2011 hingga Maret 2012 di Laboratorium Biologi Molekuler, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI. Penulis mengucapkan terima kasih atas semua bimbingan, dukungan, dan kerja sama yang telah diberikan oleh Dr Irmanida Batubara selaku pembimbing I & Dr Adi Santoso selaku pembimbing II. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada seluruh staf Laboratorium Biologi Molekuler, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI atas bantuan, arahan, bimbingan, motivasi, dan doa selama penelitian. Terima kasih tak terhingga penulis sampaikan kepada seluruh keluarga terutama Bapak, Ibu, Adik, dan seluruh teman Kimia Ekstensi IPB atas dukungan dan doanya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi semua pihak juga perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, Juni 2012
Yana Rubiyana
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 21 Februari 1984 dari pasangan Bapak Pepen Ruspendi dan Ibu Anik Sudiryani. Penulis merupakan anak pertama dari empat bersaudara. Tahun 2002 penulis lulus dari SMA Negeri 6 Bogor dan pada tahun yang sama diterima di Institut Pertanian Bogor (IPB) Program Diploma III jurusan Analis Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Pada tahun 2009, penulis meneruskan pendidikan S1 melalui Program Alih Jenjang Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan IPB. Selama menjalani masa perkuliahan di IPB, penulis pernah mendapatkan penghargaan sebagai peringkat II mahasiswa berprestasi akademik program studi D3 Analis Kimia IPB tahun ajaran 2003/2004. Sejak tahun 2008, penulis tercatat sebagai pegawai di Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia dan sampai saat ini masih aktif dalam kegiatan penelitian di laboratorium biologi molekuler, khususnya dalam bidang rekayasa genetika.
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR GAMBAR .................................................................................................. viii DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................... viii PENDAHULUAN ......................................................................................................... 1 BAHAN DAN METODE .............................................................................................. 1 Bahan dan Alat .................................................................................................... 1 Metode Penelitian ................................................................................................ 2 HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................................................... 4 Fermentasi Transforman Pichia pastoris............................................................. 3 Pemurnian rhEPO dengan IMAC Ni-NTA dan Co-Talon .................................. 4 Jumlah (Yield) Protein rhEPO ............................................................................. 5 Kemurnian Protein rhEPO ................................................................................... 7 SIMPULAN DAN SARAN ........................................................................................... 8 Simpulan .............................................................................................................. 7 Saran .................................................................................................................... 7 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................... 7 LAMPIRAN ................................................................................................................... 9
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Elektroforegram blot western supernatan rhEPO hasil fermentasi ............. 4 2 Ikatan koordinasi antara rantai samping histidin dan kelat Ni-NTA yang diimobilisasi .................................................................................................. 4 3 Dot blot supernatan rhEPO ........................................................................... 5 4 Elektroforegram blot western hasil pemurnian rhEPO ............................... 5 5 Pembelahan medan ligan .............................................................................. 5 6 Reaksi biuret .................................................................................................. 6 7 Elektroforegram pewarnaan perak hasil pemurnian rhEPO ........................ 7 8 Elektroforegram biru brilian commassie hasil pemurnian rhEPO .............. 7
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Diagram alir penelitian .................................................................................. 10 2 Reagen SDS-PAGE dan blot western ............................................................ 11 3 Komposisi reagen untuk pewarnaan perak..................................................... 12 4 Komposisi reagen untuk biru brilian commassie ............................................ 13 5 Pembuatan larutan standar BSA dalam uji protein asam bisinkoninat ............ 14 6 Energi stabilisasi medan ligan (LFSE) ........................................................... 14 7 Pengukuran dan perhitungan total protein sampel hasil pemurnian IMAC ..... 15
1
PENDAHULUAN Eritropoietin manusia (hEPO) adalah suatu glikoprotein yang mengandung 165 asam amino, memiliki bobot molekul sekitar 37 000 Dalton, dan bertindak sebagai hormon. hEPO sangat esensial dalam produksi sel darah merah karena berfungsi mengatur proses eritropoiesis pada manusia. Menurunnya kandungan hEPO dalam tubuh dapat menyebabkan anemia karena rendahnya proses eritropoiesis. Gen hEPO diekspresikan sebagian besar pada jaringan ginjal dan hati sebagai respons terhadap defisiensi oksigen pada tubuh (hipoksia) (Yin & Blanchard 2000). Ketika jaringan mengalami keadaan hipoksia, kadar hEPO dalam darah meningkat. Kenaikan kadar hEPO memicu proses diferensiasi sel progenitor dalam sumsum tulang. Eritrosit akan dihasilkan oleh sumsum tulang dan dialirkan ke dalam darah sehingga dapat mencegah anemia. Penelitian tentang hEPO terus berkembang dan menjadi topik penelitian utama para peneliti yang bertujuan mendapatkan bahan terapeutik. Teknik kloning dan ekspresi gen digunakan untuk mengembangkan hEPO menjadi rekombinan hEPO (rhEPO) sebagai obat. Sejak tahun 1980, rhEPO menjadi komoditas utama dalam industri bioteknologi; penjualannya meningkat dari tahun ke tahun hingga mencapai miliaran dolar (Sytkowsky 2004). rhEPO telah digunakan untuk pengobatan klinis pada penderita anemia yang disebabkan oleh kanker, infeksi HIV, gagal ginjal, dan transplantasi sumsum tulang (Park et al. 2000). Saat ini, produksi rhEPO menggunakan sel mamalia, yaitu pada sel indung telur hamster cina (CHO) (Egrie 1990). Namun, produksi rhEPO pada sel mamalia ini secara ekonomis dan teknis sangat mahal, dan dibutuhkan sistem alternatif yang lebih efisien dan lebih murah. Salah satu alternatif ialah khamir Pichia pastoris yang memiliki beberapa kelebihan untuk produksi protein rekombinan di antaranya tingkat ekspresi protein rekombinan yang tinggi, kemudahan melakukan proses perbanyakan (scaling-up), dan biaya produksi yang jauh lebih murah dibandingkan dengan kultur sel mamalia (Santoso et al. 2008). Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI telah berhasil mengekspresikan rekombinan αhEPO dalam sistem khamir P. pastoris dan membuktikan bahwa supernatan hasil
fermentasi mengandung rhEPO dengan teknik blot western. Untuk tahap selanjutnya diperlukan teknik pemurnian yang sesuai untuk mendapatkan protein murni. Teknik pemurnian protein yang umum dilakukan adalah kromatografi filtrasi gel atau penukar ion, namun teknik tersebut tidak dapat menjamin protein yang dihasilkan benarbenar murni. Saat ini telah berkembang teknik pemurnian yang memanfaatkan sifat interaksi spesifik protein dengan suatu ligan ion logam yang dikenal dengan nama kromatografi afinitas logam terimobilisasi (IMAC) (Muhaimin et al. 2005). Berdasarkan interaksi spesifik tersebut, diharapkan teknik IMAC lebih baik dalam memurnikan protein dibandingkan dengan teknik pemurnian lain. IMAC merupakan teknik pemurnian protein yang memanfaatkan hubungan spesifik antara rantai samping asam amino dan borderline Lewis dari ion logam (seperti Cu2+, Co2+, Ni2+, dan Zn2+). Ion logam diimobilisasi melalui zat pengelat yang ditempelkan pada penyangga diam. Zat pengelat yang paling banyak digunakan untuk aplikasi ini ialah asam iminodiaseatat (IDA) dan asam nitrilotriasetat (NTA). Heksahistidin (6×His) digunakan untuk menandai protein target, sehingga akan terjadi ikatan spesifik antara protein rekombinan dan ligan dari IMAC. Dengan adanya ikatan spesifik tersebut, protein target dapat dipisahkan dari protein lain (Charlton & Zachariou 2008). Sedikitnya terdapat 2 macam resin IMAC komersial yang menggunakan matriks NTA sebagai pengelat, yaitu resin berbasis-nikel (Ni-NTA) dan berbasis-kobalt (Co-NTA) atau lebih dikenal dengan Talon. Dalam penelitian ini, afinitas ion logam Ni2+ dan Co2+ dalam memurnikan protein rhEPO dibandingkan untuk mendapatkan teknik IMAC yang sesuai dalam pemurnian protein rhEPO.
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah bacto yeast, bacto peptone, glukosa 20%, bacto agar, kalium fosfat 1 M, yeast nitrogen base, biotin, dan gliserol 30%, larutan bufer fosfat pH 7.4, imidazola 2 M, akuabides (ddH2O), membran nitroselulosa (Hybond), poliakrilamida 40%, natrium dodesil sulfat (SDS) 10%, bufer tris, glisin, NaCl, HCl pekat,
2
MgCl2, Tween 20, tetrametiletilenadiamina (TEMED), amonium persulfat (APS) 10%, susu bebas lemak, antibodi primer EPO (Calbiochem), antibodi sekunder (antikonjugat fosfat kelinci), penanda protein (Thermo), tetrazolium biru nitro (NBT), 5bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (BCIP) (Promega), EPO rekombinan dari sel mamalia (CHO) (Merck), resin Ni2+-NTA, resin Co2+-Talon, asam bisinkoninat (BCA) kit uji protein (Pierce), kit pewarnaan perak, biru brilian Commasie, dan akuades. Alat yang digunakan adalah spektrofotometer UV-tampak Beckman DU 650, inkubator, shaker inkubator, penangas air, alat elektoforesis gel poliakrilamida (Biorad), mikropipet, kolom kromatografi polipropilena (Qiagen), sentrifus Profuge 14D, tabung polipropilena 1.5 mL, dan peralatan kaca. Metode Penelitian Metode penelitian ini diringkaskan dalam diagram alir penelitian pada Lampiran 1. Fermentasi Transforman P. pastoris Transforman P.pastoris yang mengandung gen hEPO ditumbuhkan pada media padat YPD (1% khamir, 2% pepton, 2% glukosa 20% dan 2% agar) pada suhu 30 °C selama 2 hari. Satu koloni tunggal kemudian diambil dan ditumbuhkan pada media cair BMGY (1% khamir, 2% pepton, 100 mM kalium fosfat, 1.34% yeast nitrogen base, 0.00004% biotin, dan 1% gliserol) pada suhu 30 °C selama 1 hari. Sel kemudian ditumbuhkan pada konsentrasi rapatan optis (OD) 1 pada media BMMY (seperti pada media BMGY dengan 1% gliserol diganti dengan 0.5% metanol) pada suhu 30 °C selama 2 hari. Setelah 2 hari, sel disentrifugasi selama 10 menit pada 2300 g. Supernatan kemudian dianalisis dengan teknik blot western (Invitrogen 2001). Pemurnian rhEPO dengan IMAC Co2+Talon dan Ni2+-NTA Supernatan yang mengandung protein rhEPO dimurnikan dengan teknik IMAC. Pada proses ini, sebanyak 1 mL resin CoTalon atau Ni-NTA disetimbangkan dengan bufer fosfat pH 7.4 yang mengandung 20 mM natrium fosfat, 500 mM NaCl. Selanjutnya 20 mL supernatan dicampurkan dengan resin IMAC dalam tabung, lalu dikocok dengan shaker (150 rpm) selama 60 menit. Campuran contoh dan resin dimasukkan ke dalam kolom sampai memadat dan filtrat contoh (flow-
through) ditampung. Kolom dicuci dengan menggunakan bufer pencuci (20 mM natrium fosfat, 500 mM NaCl) dan larutan hasil pencucian ditampung. Selanjutnya dilakukan elusi dengan bufer yang mengandung 20 mM natrium fosfat, 500 mM NaCl, dan 500 mM imidazola. Hasil elusi difraksinasi masingmasing 1 mL dan ditampung dalam 5 tabung polipropilena 1.5 mL (GE Healthcare 2011). Selanjutnya filtrat contoh, larutan cuci, dan fraksi-fraksi eluat dianalisis dengan teknik blot western dan diukur dengan spektrofotometer untuk mencari fraksi yang mengandung EPO rekombinan paling tinggi. Elektroforesis Natrium Dodesil Sulfat-Gel Poliakrilamida (SDS-PAGE) Gel SDS-PAGE terdiri atas gel pemisah dan gel penutup (Lampiran 2). Gel pemisah dibuat dengan mencampur semua bahan terlebih dahulu, APS dan TEMED ditambahkan paling akhir secara berurutan. Setelah semua bahan tercampur, larutan dituang ke dalam kaca pembuat gel, ditambahkan air suling hingga kaca penuh, dan ditunggu hingga gel memadat (sekitar 30 menit). Air suling diserap dengan tisu dan larutan gel penutup dituang di atas gel pemisah yang telah memadat. Sisir pembentuk sumuran segera dipasang 0.5 cm di atas dasar gel. Supernatan hasil fermentasi di-running. Sebanyak 15 µ L sampel (filtrat contoh, larutan cuci, fraksi-fraksi eluat), 2 µL EPO rekombinan dari sel CHO (kontrol positif), dan 5 µL marka protein, masing-masing ditambahkan loading dye hingga volume akhir 20 µL. Setiap campuran dimasukkan ke dalam sumur yang terdapat dalam gel. Elektroforesis dilakukan dalam running buffer (Lampiran 2) dengan tegangan 90 volt selama 120 menit (Ausubel et al.1992). Analisis Protein Western
dengan
Metode
Blot
Sampel yang akan dianalisis terlebih dahulu dipisahkan dengan elektroforesis. Gel hasil elektroforesis ditransfer ke dalam membran nitroselulosa yang sebelumya telah dibasahi bufer elektrotransfer (Lampiran 2). Gel ditempatkan dalam alat elektrotransfer pada sisi katode (-) yang sebelumnya dilapisi kertas saring dan busa. Membran nitroselulosa diletakkan di atasnya dalam posisi sejajar dan dipastikan tidak terdapat gelembung. Membran kemudian ditutup dengan kertas saring dan busa, membran nitroselulosa berada di sisi anode (+). Selanjutnya alat elektrotransfer dimasukkan
3
ke dalam tangki electroblotting dan dilakukan proses elektroforesis dengan tegangan konstan 90 volt selama 90 menit dalam kondisi dingin (balok es ditempatkan di dalam dan di luar tangki). Membran yang sudah ditransfer direndam dan digoyang dalam larutan perebat (blocking), yaitu 10% susu bebas lemak dalam larutan tris buffer saline (TBS) (Lampiran 2) selama 60 menit. Kemudian membran dicuci dengan larutan pencuci (0.1% Tween 20 dalam larutan TBS) sebanyak 3 kali (15 menit; 5 menit; 5 menit). Selanjutnya membran direndam dan digoyang dalam antibodi primer (Ab-EPO) yang dimasukkan ke dalam larutan perebat dengan nisbah 1:500 selama 60 menit dan dicuci seperti sebelumnya. Setelah itu, membran direndam dan digoyang dalam antibodi sekunder yang dimasukkan ke dalam larutan perebat dengan nisbah 1:3000 selama 60 menit, dilanjutkan dengan pencucian seperti sebelumnya. Pita protein divisualisasi dengan merendam membran dalam reagen NBT-BCIP yang dimasukkan ke dalam larutan bufer fosfatase basa (AP) pH 7.5 (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2 dengan nisbah 2:1:300) (Ausubel et al.1992). Analisis Protein dengan Pewarnaan Perak (Silver Stain)
Metode
Sampel protein terlebih dahulu dipisahkan menggunakan SDS-PAGE. Gel hasil elektroforesis ditempatkan dalam wadah yang bersih, kemudian direndam dan digoyang dengan larutan pengikat I (Lampiran 3) selama 1 jam. Rendaman larutan pengikat I diganti dengan larutan larutan pengikat II (Lampiran 3) selama 20 menit, 3 kali ulangan, lalu gel dicuci dengan ddH2O selama 20 detik, 2 kali ulangan. Selanjutnya gel direndam dan digoyang dengan larutan pemeka (sensitizing) (Lampiran 3) selama 1 menit, dicuci kembali dengan ddH2O selama 20 detik, 2 kali ulangan. Gel kemudian direndam dan digoyang dengan larutan pewarna (Lampiran 3) selama 20 menit dan dicuci kembali dengan ddH2O selama 20 detik, 2 kali ulangan. Setelah itu, gel direndam dan digoyang dengan larutan pengembang (Lampiran 3) sampai muncul pita-pita berwarna cokelat. Pewarnaan gel dihentikan dengan larutan stop (Lampiran 3) setelah pita terlihat jelas (Fermentas 2011).
Analisis Protein dengan Metode Pewarnaan Biru Brilian Comassie Sama halnya seperti metode pewarnaan perak, sampel protein dipisahkan terlebih dahulu mengunakan SDS-PAGE. Gel hasil elektroforesis ditempatkan dalam wadah yang bersih, kemudian direndam dan digoyang dengan larutan pewarna (Lampiran 4) selama 1 hari. Kemudian gel dicuci dengan larutan penghilang warna I (Lampiran 4) selama 1 jam, lalu dilanjutkan dicuci kembali dengan larutan penghilang warna II (Lampiran 4) selama 1 jam (Bio-rad 2011) Analisis Total Protein dengan Kit Uji Protein Asam Bisinkoninat Terlebih dahulu dibuat sederetan larutan standar albumin serum sapi (BSA) dengan konsentrasi 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500, dan 2000 µ g/mL (Lampiran 5). Larutan kerja dibuat dengan mencampurkan 50 mL larutan A (Na2CO3, NaHCO3, asam bisinkoninat, dan natrium tartrat dalam NaOH 0.1 M) dengan larutan B yang mengandung Cu-sulfat 4%. Sebanyak 0.1 mL standar, sampel, dan blangko dipipet masingmasing ke dalam tabung reaksi bersih, kemudian ditambahkan 2 mL larutan kerja, dikocok perlahan sampai bercampur dengan baik. Campuran diinkubasi dalam penangas air dengan suhu 37 °C selama 30 menit. Setelah didinginkan dalam suhu kamar, segera diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-tampak pada panjang gelombang 562 nm (Pierce 2011).
HASIL DAN PEMBAHASAN Fermentasi Transforman P. pastoris Sebanyak 25 koloni tunggal khamir P. pastoris ditumbuhkan pada medium kompleks-gliserol tersangga (BMGY) dan medium kompleks-metanol tersangga (BMMY) sehingga dihasilkan 25 klon supernatan yang diharapkan mengandung protein rhEPO. Supernatan selanjutnya dideteksi dengan teknik dot blot menggunakan antibodi yang spesifik terhadap protein hEPO sehingga yang terwarnai hanya protein hEPO. Diperoleh 3 klon yang positif mengandung protein rhEPO, yaitu klon 9, 11 dan 18. Klon-klon
4
tersebut diseparasi dengan teknik SDSPAGE dan pita- pita protein dideteksi dengan teknik blot western. Hasil analisis blot western ditunjukkan pada Gambar 1. Lajur 1 adalah kontrol positif (standar rhEPO) . Lajur 2 berupa marka protein yang sudah diketahui bobot molekulnya. Lajur 3, 4, dan 5 merupakan supernatan hasil fermentasi rekombinan EPO klon 18, 11, dan 9. Pada setiap lajur tersebut , terlihat pita yang berukuran sama dengan standar rhEPO, yaitu sekitar 37 kDa yang menandakan bahwa di dalam supernatan terseb ut terkandung protein rhEPO. Pita pada lajur 3 terlihat lebih tebal , menandakan jumlah rhEPO yang lebih besar pada klon 18. Ketebalan pita berdasarkan jumlah protein yang mengikat antibodi hEPO. Semakin banyak protein yang teradsorpsi dalam membran nitroselulosa, antibodi yang terikat akan semakin banyak. A dsorpsi pewarna yang berasal dari reaksi antara NBT-BCIP dan bufer AP yang terkonjugasi dengan antibodi sekunder hEPO ( antirabbit) akan semakin banyak pula dan membuat pita semakin tebal. Selanjutnya rhEP O klon 18 digunakan dalam proses produksi dan pemurnian dengan metode IMAC.
Gambar 1
Elektroforegram blot western hasil supernatan r hEPO fermentasi. Lajur 1: standar rhEPO, Lajur 2: ma rka protein, Lajur 3, 4, dan 5: supernatan r hEPO klon 18, 11 dan 9.
Pemurnian rhEPO dengan IMAC Ni-NTA dan Co-Talon Prinsip pemurnian dengan teknologi IMAC ialah interaksi berbagai macam rantai samping residu asam amino pada suatu
protein dengan ion-ion logam transisi yang diimobilisasi. Di antara residu-residu asam amino tersebut, residu histidin memiliki selektivitas yang tinggi (Gambar 2) sehingga banyak dimanfaatkan dalam IMAC (Porath et al. 1989; Zhao et al. 1991). Teknik IMAC mempunyai beberapa kelebihan di antaranya selektivitas yang tinggi, mudah dielusi, dan mudah dalam proses regenerasi kolom (Zatloukalova & Kucerova 2004)
Gambar 2 Ikatan koordinasi antara rantai samping histidin dan kelat logam Ni- NTA yang diimobilisasi ( http://pages. usherbrooke.ca). Dalam pemurnian dengan IMAC, pertama-tama resin IMAC dijenuhkan (disetimbangkan) dengan bufer fosfat pH 7.4 yang mengandung Na3PO4 20 mM dan NaCl 500 mM agar tidak terjadi protonasi atom N imidazola dari residu histidin. Menurut Porekar dan Menart (2001), agar terjadi interaksi antara ion logam dan residu histidin, atom N dari gugus imidazola harus dalam bentuk tidak terprotonasi. Bentuk ini dapat terjadi pada pH netral atau sedikit basa. Oleh karena itu, digunakan bufer fosfat pH 7.4 untuk menjenuhkan resin IMAC. Selain itu, ditambahkan pula garam NaCl yang bertujuan mengurangi interaksi elektrostatik nonspesifik. Tahap selanjutnya adalah pencucian. Diharapkan molekul-molekul lain yang tidak diinginkan dapat terbuang tanpa ikut membawa protein target. Tahap terakhir adalah elusi kolom. Resin IMAC dielusi dengan senyawa yang interaksinya lebih kuat daripada residu histidin, yaitu imidazola 500 mM. Ion logam dari IMAC lebih berinteraksi kuat dengan imidazola, sehingga ikatan koordinasi histidin dengan ion logam akan terputus dan protein dapat terelusi. Hasil pemurnian rhEPO, terlihat seperti Gambar 3. Pada flow through (filtrat contoh) dan washing (larutan cuci) tidak terlihat adanya pita protein rhEPO, yang dapat berarti semua protein rhEPO terikat pada resin
5
IMAC atau protein rhEPO terbuang, tetapi terencerkan oleh larutan bufer sehingga tidak terdeteksi oleh teknik dot blot.
Gambar 4
Gambar 3 Dot blot supernatan rhEPO. FT: flow through, W: washing, E1– 5: eluat fraksi ke 1–5. Pada fraksi-fraksi eluat, hasil pemisahan dengan Ni-NTA sedikit lebih tebal dibandingkan dengan Co-Talon. Hal ini menandakan bahwa fraksi-fraksi dari Ni-NTA lebih banyak mengandung protein rhEPO, yang berarti pula bahwa resin Ni-NTA lebih banyak mengikat protein rhEPO. Hal ini mungkin disebabkan karena perbedaan afinitas ion Ni 2+ dan Co2+ terhadap histidin pada protein rhEPO. Zhao et al. (1991) mengemukakan bahwa kekuatan interaksi dalam IMAC dipengaruhi oleh jenis ion logam dan rantai samping asam amino. Jumlah (Yield) Protein rhEPO Jumlah protein rhEPO dianalisis dengan teknik blot western. Fraksi-fraksi yang mengandung protein rhEPO digabungkan dan diidentifikasi, hasilnya ditunjukkan pada Gambar 4. Lajur 1 adalah marka protein yang sudah diketahui bobot molekulnya. Lajur 2–5 merupakan eluat hasil pemurnian dengan resin Ni-NTA. Lajur 6–9 merupakan eluat hasil pemurnian dengan resin Co-Talon. Secara visual, pita eluat hasil pemurnian dengan Ni-NTA lebih tebal dibandingkan dengan hasil pemurnian dengan Co-Talon. Hasil ini menandakan lebih banyak protein rhEPO berhasil dipisahkan dengan Ni-NTA.
Elektroforegram blot western hasil pemurnian rHEPO. Lajur 1: marka protein, Lajur 2–5: fraksi eluat Ni-NTA. Lajur 6–9: fraksi eluat CoTalon.
Afinitas ion Ni 2+ yang lebih tinggi daripada ion Co2+ dalam mengikat residu histidin sesuai dengan hasil penelitian sebelumnya. Porath et al. (1992), diacu dalam Sidenius et al. (1999), mengemukakan bahwa afinitas kation logam borderline Lewis dengan ligan iminodiasetat (IDA) terhadap protein yang mengandung residu histidin secara berurutan ialah Cu(II) > Ni(II) > Zn(II) > Co(II). Perbedaan afinitas ini mungkin disebabkan oleh perbedaan stabilitas medan kristal antara kompleks logam Ni dan Co. Energi stabilisasi medan ligan (LFSE) menggambarkan stabilitas yang dihasilkan dari penempatan ion logam pada medan yang dibentuk oleh sekelompok ligan. LFSE terjadi ketika 5 orbital d memisah pada medan ligan menjadi 2 kelompok orbital dengan tingkat energi yang berbeda (Gambar 5).
Gambar 5 Pembelahan medan ligan.
6
Orbital dx 2 -y 2 dan dz 2 terletak pada kelompok orbital e g , sedangkan orbital dxy , dxz, dan d yz akan terletak pada kelompok orbital t 2g . Energi t 2g lebih rendah daripada energi e g . P erbedaan energi antara orbital e g dan t 2g dinyatakan sebagai ∆o, dengan indeks o menyatakan oktahedral (Saito 1996). Perbedaan energi ini memenga ruhi kestabilan geometri kompleks logam. Stabilitas ion kompleks bertambah dengan adanya LFSE, karena LFSE merupakan energi penstabilan oleh tambahan yang diaki batkan pembelahan orbital d (Suyanta 2010). Nila i LFSE logam Co dengan bentuk geometri oktahedral sebesar 0.8 ∆o, sedangkan logam Ni sebesar 1.2 ∆o. (Lampiran 6). Nilai LFSE logam Ni lebih besar dibandingkan Co. Dengan demikian Ni akan lebih stabil membentuk kompleks dibandingkan Co. Hasil analisis blot western didukung dengan kadar total protein yang diperoleh dengan metode BCA. Metode ini dilakukan berdasarkan reaksi biuret. Bila larutan protein dalam suasana basa kuat direaksikan dengan larutan CuSO4 pekat, akan dihasilkan warna ungu. Warna tersebut disebabkan oleh ikatan koordinasi antara ion Cu2+ dan pasangan elektron bebas dari atom N pada protein (Gambar 6). Reaksi ini positif terhadap 2 buah ikatan peptida atau lebih, tetapi negatif untuk asam amino bebas atau dipeptida. Oleh karena itu, metode BCA ini dapat mengukur kadar total protein dalam sampel (Thermo Scientific 2011).
Gambar 6 Reaksi biuret. ( http://www.pierce net.com) protein Hasil pengukuran total ditunjukkan pada Tabel. Kadar total protein Ni-NTA rerata sebesar 226.72 µg/mL dan Co-Talon rerata sebesar 60.52 µg/mL. Proses perhitungan ini dapat dilihat pada Lampiran 7. Hasil ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Hefti et al. (2001), yaitu total protein menggunakan Ni-NTA lebih besar
daripada menggunakan Talon dalam memurnikan protein NIFA, NIFL, dan NTRC. Tabel
Konsentrasi total protein eluat hasil pemurnian dengan Ni-NTA dan CoTalon Konsentrasi (µ g/mL) Ulangan Ni-NTA Co-Talon 1 2 3 4 5 Rerata
275.6 399.7 145.2 206.7 106.4 226.72
63.7 147.7 41.4 25.4 24.4 60.52
Variasi afinitas ion logam terhadap protein d apat diprediksi menggunakan konsep asam-basa keras- lunak (HSAB). Pearson mengklasifikasikan asam -basa Lewis sesuai dengan kekerasan dan kelunakannya. Ion logam seperti K, Ca, Mg, dan Fe diklasifikasikan sebagai asam L ewis keras, sedangkan ion logam seperti Ag dan Au dikategorikan asam Lewis lunak. Ion- ion logam transisi, Co, Zn, Cu, dan Ni, dianggap asam perbatasan antara keras dan lunak (Pearson 1968 ) . Konsep te rbaru mendalilkan bahwa ada 3 jenis utama ligan. (1) L igan yang mengandung oksigen (misaln ya karboksilat), nitrogen alifatik (misalnya asparagin dan glutamin), dan fosfor us (misalnya asam amino terfosforilasi ) digolongkan basa Lewis keras. (2) Ligan yang mengandung sulfur (misalnya sistein) diklasifikasikan sebagai basa Lewis lunak. (3) Ligan yang mengandung nitrogen aromatik (misalnya histidin dan Lewis triptofan) dianggap basa perbatasan. Ion- ion pada logam perbatasan asam keras- lunak seperti Co, Zn, Cu, dan Ni dapat berkoordinasi dengan atom nitrogen aromatik (basa perbatasan) dan juga dengan atom sulfur (basa lunak) (Morganti et al . 2002). Oleh karena itu, Ni dan Co dapat berikatan koordinasi dengan protein- protein lain yang berasal dari media atau sel -sel inang yang juga mempunyai residu histidin atau triptofan. Namun, afinitas Ni lebih besar dibandingkan dengan Co, maka Ni selain mengikat protein rhEPO, juga dapat mengikat protein-protein lain lebih banyak. Hal ini membuat total protein hasil
7
pemurnian dengan Ni-NTA lebih besar dibandingkan dengan Co-Talon. Kemurnian Protein rhEPO Kemurnian berperan penting dalam uji praklinis karena berpengaruh terhadap aktivitas biologis. Teknik produksi produk biologis dengan menggunakan mikroorganisme, rekayasa genetika, atau ekstraksi cairan biologis dapat memberikan beragam ketidakmurnian. Ketidakmurnian secara umum dapat berasal dari senyawa antara (intermediate subtance), hasil samping proses produksi, hasil degradasi, senyawa yang ikut terisolasi, serta senyawa kimia dari luar (Garnick et al. 1995). Identifikasi kemurnian protein rhEPO pada Gambar 7 dan 8 memperlihatkan beberapa pita protein p ada supernatan rhEPO. Pita- pita protein yang berbobot molekul di bawah 35 kDa sudah tidak tampak lagi pada eluat Co-Talon dan terlihat sangat tipis pada eluat Ni -NTA. Namun, pita- pita protein yang berbobot mole kul sekitar 50 dan 85 kDa masih ada. Kemungkinan pita pengotor tersebut berasal dari media atau sel-sel inang yang juga mempunyai residu histidin sehingga dapat berikatan dengan kedua resin IMAC. Berdasarkan hasil ini, terlihat bahwa afinitas Ni-NTA kurang spesifik dibandingkan dengan Co-Talon. Resin Ni-NTA masih dapat mengikat pengotor yang berada di sekitar 30 kDa. Dengan demikian hasil pemurnian dengan Ni-NTA tidak sebaik dengan CoTalon. Namun, jumlah protein (yield) yang dapat dipisahkan dengan Ni-NTA lebih baik dibandingkan dengan Co-Talon.
Gambar 8
Elektroforegram biru brilian coomassie hasil pemurnian rhEPO. Lajur 1: marka protein. Lajur 2 –5: fraksi eluat Ni- NTA. Lajur 6 –9: fraksi eluat Co- Talon.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Pemurnian dengan IMAC dapat memisahkan prote in rhEPO dari pengotor pengotor dengan cukup baik, walaupu n belum benar- benar murni. Ni -NTA mempunyai afinitas yang lebih tinggi dalam mengikat protein rhEPO dibandingkan dengan Co- Talon . Total protein rata-rata Ni- NTA sebesar 226.72 µg/mL dan Co-Talon sebesar 60.52 µg/mL. Karena itu, Ni-NTA lebih sesuai digunaka n untuk mendapatkan hasil protein rhEPO yang tinggi. Saran Perlu dilakukan tahap pemurnian lanjutan dengan metode penukar ion atau filtrasi gel agar dihasilkan protein rhEPO yang benarbenar murni.
DAFTAR PUSTAKA Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Sruhl K. 1992. Short Protocols in Molecular Biology. Ed ke-2. New York: J Wiley. Gambar 7
Elektroforegram pewarnaan perak hasil pemurnian rhEPO . Lajur 1: mar ka protein, lajur 2: supernatan rhEPO, lajur 3: eluat Co- Talon, lajur 4: e luat Ni-NTA
Bio-rad. 2011. Instructions for staining polyacrylamide gels. http://www.biorad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bul letin_4307051A.pdf [23 Jun 2011] Charlton A, Zachariou M. 2008. Immobilized metal ion affinity chromatography of
8
histidine-tagged fusion proteins. Di dalam: Zachariou M, editor. Methods in Molecular Biology. Vol. 421: Affinity Chromatography: Methods and Protocols. Ed ke-2. Totowa: Humana Pr. hlm 137140. Egrie J. 1990. The cloning and production of recombinant human erythropoietin. Pharmacotherapy 10:3s-8s. Fermentas. 2011. Silver Staining Kit #K0681. http://www.fermentas.com/templates/files/ tiny_mce/coa_pdf/coa_k0681.pdf [23 Jun 2011] Garnick RI, Ross MJ, Mee CP. 1995. Analysis of recombinant biologicals. Di dalam: Swarbrick C, Boylan JC, editor. Encyclopedia of Pharmaceutical Technology Vol. New York: Marcell Dekker. hlm 253-214. GE Healthcare. 2011. Instructions Batch/column-Purification. http://gelife sciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content /F9FC97065685BDD2C1257628001D20 A0/$file/28401039AC.pdf [23 Jun 2011] Hefti MH, van der Toorn CJG, Dixon R, Vervoort J. 2001. A novel purification method for histidine-tagged proteins containing a thrombin cleavage site. Anal Biochem 295:180-185. Invitrogen. 2001. Easy Select Pichia Expression Kit: A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins Using pPICZ and pPICZα in Pichia pastoris. Manual Methods. Carlsbad: Invitrogen Corp. Morganti L, Ueda EKM, Gout PW. 2002. Current and prospective applications of metal ion-protein binding. J Chromatogr B 735:85-91. Muhaimin, Liang OB, Ratnaningsih E, Purwantini E, Retnoningrum DS. 2005. Purifikasi protein fusi MBP-Mga Streptococcus pyogenes hasil ekspresi heterolog di Escherichia coli. J Mat & Sains 10:31-36 Park JH, Kim C, Kim WB, Kim YK, Lee SY, Yang JM. 2000. Efficiency of promoter and cell line in high-level expression of erythropoietin. Biotechnol Appl Biochem 32:162-172. Pierce. 2011. Instructions BCA protein assay. http://abhayjere.com/Documents/BCA.pdf [23 Jun 2011]
Pearson RG. 1968. Hard and soft acids and bases, HSAB, part II: Underlying theories. J Chem Educ 45:643-648. Porekar VG, Menart V. 2001. Perspectives of immobilized-metal affinity chromatography. J Biochem Biophys Methods 49:335360. Porath J, Sulkowski E, Zhao Y, Hemdan ES. 1989. Surface topography of histidine residues: A facile probe by immobilized metal ion affinity chromatography. J Biochem 86:1811-1815. Saito T. 1996. Buku Teks Kimia Anorganik online. Ismunandar, penerjemah. Tokyo: Iwanami Shoten. Terjemahan dari: Inorganic Chemistry Textbooks. Santoso A, Fuad AM, Ningrum, RA, Herawati N, Wardiana A, Rubiyana Y, Kusumawati A. 2008. Heterologous expression and production of recombinant human erythropoietin in Pichia pastoris. Di dalam: The 4th Indonesian Biotechnology Conference “Biotechnology for better food, health and environment”; Bogor, 5 Agu 2008. Bogor: Konsorsium Bioteknologi Indonesia. hlm 203-209. Sidenius U, Farver O, Jons O, Gammelgaard B. 1999. Comparison of different transition metal ions for immobilized metal affinity chromatography of selenoprotein P from human plasma. J Chromatogr B 735:85-91. Suyanta. 2010. Kestabilan senyawa kompleks. http://www.suyantakimiafmipaugm.wordp ress.com/ [7 Agu 2012] Sytkowsky AJ. 2004. Erythropoietin: Blood, Brain and Beyond. Weinheim: WileyVCH. Thermo Scientific. 2011. Chemistry of Protein Assays.http://www.piercenet.com/browse. cfm?fldID=876562B0-5056-8A76-4E0CB764EAB3A339 [21 Apr 2011] Yin H, Blanchard KL. 2000. DNA methylation represses the expression of the human erythropoietin gene by two different mechanisms. Blood 95:1-4. Zatloukalova E, Kucerova Z. 2004. Separation of cobalt binding proteins by immobilized metal affinity chromatography. J Chromatogr B 808:99-103. Zhao Y, Sulkowski E, Porath J. 1991. Surface topography of histidine residues in lysozymes. J Biochem 202:1115-1119.
LAMPIRAN
10
Lampiran 1 Diagram alir penelitian
Koloni tunggal transforman P. pastoris
Fermentasi Analisis blot western
Supernatan rhEPO
Pemurnian dengan IMAC Ni-NTA
Pemurnian dengan IMAC Co-Talon
Fraksi eluat, filtrat contoh, larutan cuci
Fraksi eluat, filtrat contoh, larutan cuci
Jumlah protein
• •
Analisis blot western Spektrofotometer UVtampak
Jumlah protein
Kemurnian protein
•
•
Analisis pewarnaan perak Analisis brilian biru Commasie
• •
Analisis blot western Spektrofotometer UVtampak
Kemurnian protein
•
•
Analisis pewarnaan perak Analisis brilian biru Commasie
11
Lampiran 2 Reagen SDS-PAGE dan blot western Komposisi gel pemisah 12% Komponen
Volume (mL)
Akrilamida-bisakrilamida 40% Tris-HCl 1M pH 8.8 Akuades SDS 10% TEMED APS 10%
4 2.5 3.5 0.1 0.006 0.1
Komposisi gel penutup 3% Komponen
Volume (mL)
Akrilamida-bisakrilamida 40% Tris-HCl 1M pH 6.8 Akuades SDS 10% TEMED APS 10%
1.3 1.3 7 0.1 0.012 0.1
Komposisi larutan elektroforesis running buffer Komponen
Jumlah (g)
Tris Glisina SDS Air suling
3.03 14.4 1.0 Sampai 1 L
Komposisi larutan bufer elektrotransfer Komponen
Jumlah
Tris Glisina Metanol absolut Air suling
3.03 g 14.4 g 200 mL Sampai 1 L
Komposisi larutan tris buffer saline (TBS) Komponen
Jumlah
Tris NaCl Akuades HCl pekat
8.70 g 1.21 g Sampai 1 L Hingga pH 7.6
12
Lampiran 3 Komposisi reagen untuk pewarnaan perak Komposisi larutan pengikat Larutan pengikat 1
Larutan pengikat 2
Reagen
Volume
Konsentrasi akhir (v/v)
Volume
Konsentrasi akhir (v/v)
Etanol Asam asetat glasial ddH2O
50 mL 10 mL 40 mL
50% 10%
90 mL 210 mL
30%
Total volume
100 mL
300 mL
Komposisi larutan pewarna Reagen
Larutan pemeka
Larutan pewarna
Larutan pengembang
Larutan stop
Reagen pemeka Reagen pewarna Reagen pengembang Reagen stop ddH2O Formaldehida
0.4 mL 99.6 mL -
4 mL 96 mL 54 µL
10 µL 10 mL 90 mL 27 µL
8 mL 92 mL -
Total volume
100 mL
100 mL
100 mL
100 mL
13
Lampiran 4 Komposisi reagen untuk biru brilian commasie Komposisi larutan pewarna, penghilang warna I, dan penghilang warna II Larutan pewarna Reagen
Larutan penghilang warna I
Larutan penghilang warna II
Volume
Konsentrasi akhir (v/v)
Volume
Konsentrasi akhir (v/v)
Volume
Konsentrasi akhir (v/v)
Metanol Asam asetat glasial ddH2O
20 mL 3.5 mL 26.5 mL
20% 7%
20 mL 3.5 mL 26.5 mL
20% 7%
2.50 mL 3.50 mL 44 mL
5% 7%
Total volume
50
mL
50
mL
50
mL
Lampiran 5 Pembuatan larutan standar BSA dalam uji protein asam bisinkoninat (BCA) Pembuatan larutan standar BSA Vial A B C D E F G H I
Volume Pengenceran (µL) 0 125 325 175 325 325 325 400 400
Volume BSA (µL)
Konsentrasi BSA
300 µL dari stok 375 µL dari stok 325 µL dari stok 175 µL dari vial B 325 µL dari vial C 325 µL dari vial E 325 µL dari vial F 100 µL dari vial G 0
2.000 µg/mL 1.500 µg/mL 1.000 µg/mL 750 µg/mL 500 µg/mL 250 µg/mL 125 µg/mL 25 µg/mL Blangko
14
Lampiran 6 Energi stabilisasi medan ligan (LFSE) Energi stabilisasi medan ligan (LFSE) dn 1
Contoh 3+
d Ti d2 V3+ 3 d Cr3+, V2+ d4 Cr2+, Mn3+ 5 d Mn2+, Fe3+ d6 Fe2+, Co3+ 7 d Co2+ 8 d Ni2+ d9 Cu2+ 10 d Cu+ (Saito 1996)
Oktahedral (∆o)
Tetrahedral (∆t)
0.4 0.8 1.2 0.6 0 0.4 0.8 1.2 0.6 0
0.6 1.2 0.8 0.4 0 0.6 1.2 0.8 0.4 0
Konfigurasi elektron Co dan Ni: 27 Co: [Ar] 4s2 3d7 28 Ni: [Ar] 4s2 3d8
Co:
Ni:
Perhitungan Energi stabilisasi medan ligan untuk geometri oktrahedral = [-0.4 × n (t2g)] + [0.6 × n (eg)]∆o LFSE Co = [-0.4 × 5 (t2g)] + [0.6 × 2 (eg)]∆o = (-2.0 + 1.2) ∆o = 0.8 ∆o LFSE Ni = [-0.4 × 6 (t2g)] + [0.6 × 2 (eg)]∆o = (-2.4 + 1.2) ∆o = 1.2 ∆o
15
Lampiran 7 Pengukuran dan perhitungan total protein hasil pemurnian IMAC Pengukuran standar BSA dengan metode uji protein asam bisinkoninat Konsentrasi BSA (µg/mL)
Abs
25
0.0456
125 250
0.2224 0.4095
500 750
0.8091 1.1043
1000 1500 2000
1.4107 1.9285 2.5994
3
Asorbansi
2,5
y = 0.001x + 0.095 R² = 0.995
2 1,5 1 0,5 0 0
500
1000
1500
2000
2500
Konsentrasi BSA (µ µg/mL) Pengukuran sampel dengan metode uji protein asam bisinkoninat Sampel
Absorbans
Konsentrasi (µg/mL)
Ni-NTA
Co-Talon
Ni-NTA
1
0.3706
0.1587
275.6
63.7
2 3
0.4947 0.2402
0.2427 0.1364
399.7 145.2
147.7 41.4
4 5
0.3017 0.2014
0.1204 0.1194
206.7 106.4
25.4 24.4
Contoh perhitungan untuk sampel 1: Persamaan garis: y = 0.001x + 0.095 0.3706 = 0.001x + 0.095 x = (0.3706 – 0.095) / 0.001 x = 0.2756 / 0.001 x = 275.6 µg/mL
Co-Talon
