Prognostická imunohistochemie u sarkomů měkkých tkání

DIZERTAČNÍ PRÁCE

Prognostická imunohistochemie u sarkomů měkkých tkání MUDr. Karel Veselý Školitel: prof. MUDr. Aleš Rejthar, CSc.

I. patologicko - anatomický ústav FN u sv. Anny a LF MU v Brně Obor: Patologie Číslo oboru: 5103V046

Brno 2008

2

1

PODĚKOVÁNÍ Chtěl bych poděkovat především svému školiteli, prof. MUDr. Aleši Rejtharovi, CSc., za

jeho cenné náměty, přispívající k realizaci studie, a za jeho trpělivost při recenzování pracovní verze textu dizertační práce. Moje poděkování patří i prim. MUDr. Rudolfu Nenutilovi, CSc. a MUDr. Pavlu Fabiánovi, Ph.D. z Masarykova onkologického ústavu v Brně za důleţité podněty, a za technickou pomoc při přípravě tkáňových microarrays. Doc. MUDr. Markétě Hermanové, Ph.D., přednostce I. patologicko-anatomického ústavu FN u sv. Anny a LF MU v Brně, bych chtěl poděkovat za intenzivní podporu a za její kritické připomínky. Za pomoc při statistické analýze velmi děkuji MUDr. Michalu Jurajdovi, Ph.D. z Ústavu patologické fyziologie LF MU v Brně.

3

2 1 2 3 4

OBSAH PODĚKOVÁNÍ ..............................................................................................................2 OBSAH ..........................................................................................................................3 POUŢITÉ ZKRATKY ....................................................................................................6 ÚVOD .......................................................................................................................... 12 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9

Definice.................................................................................................................. 12 Epidemiologie ........................................................................................................ 13 Etiologie ................................................................................................................. 13 Histogeneze ............................................................................................................ 14 Klasifikace ............................................................................................................. 14 Genetika ................................................................................................................. 18 Klinické příznaky ................................................................................................... 19 Diagnostika ............................................................................................................ 20 Terapie ................................................................................................................... 22

4.9.1

Cílená biologická terapie ................................................................................. 23 Prognostické faktory sarkomů měkkých tkání ..................................................... 23

4.10

4.10.1 Etablované prognostické faktory......................................................................23 4.10.1.1 4.10.1.2 4.10.1.3

Staging .................................................................................................. 25 Lokální recidiva ..................................................................................... 27 Vzdálené metastázování ......................................................................... 28

4.10.2 Kontroverzní prognostické faktory .................................................................. 29 4.10.3 Grading sarkomů měkkých tkání ..................................................................... 30 4.10.3.1 4.10.3.2 4.10.3.3 4.10.3.4 4.10.3.5

NCI gradingový systém ......................................................................... 31 FNCLCC gradingový systém ................................................................. 32 Prognostický význam gradingu .............................................................. 35 Kontroverzní body gradingu a jeho limitace ...........................................37 Reproducibilita gradingu sarkomů měkkých tkání .................................. 40

4.10.4 Molekulární prognostické markery .................................................................. 41 4.11 Bliţší charakteristika vybraných imunohistochemicky detekovaných antigenů s moţným vztahem k prognóze sarkomů měkkých tkání ................................................... 44 4.11.1 4.11.2 4.11.3 4.11.4 4.11.5

Ki-67 ............................................................................................................... 44 p53 .................................................................................................................. 45 mdm-2 ............................................................................................................. 47 Cyklin D1........................................................................................................ 48 p16 .................................................................................................................. 49

4

4.11.6 nm23 ............................................................................................................... 49 4.11.7 EGFR .............................................................................................................. 50 CÍLE PRÁCE ............................................................................................................... 52 MATERIÁL A METODIKA ........................................................................................ 53

5 6

6.1 6.2 6.3 6.4 6.5

Soubor.................................................................................................................... 53 Ki-67 proliferační index ......................................................................................... 53 Konstrukce tkáňových microarrays a imunohistochemie ......................................... 54 Nastavení prahů ......................................................................................................56 Statistické metody .................................................................................................. 57

VÝSLEDKY ................................................................................................................ 58

7

7.1 7.2

Charakteristika souboru .......................................................................................... 58 Imunohistochemie .................................................................................................. 60

7.2.1 7.2.2 7.2.3 7.2.4 7.2.5 7.2.6 7.2.7 8

Ki-67 proliferační index .................................................................................. 60 p53 .................................................................................................................. 61 mdm-2 ............................................................................................................. 61 Cyklin D1........................................................................................................ 61 p16 .................................................................................................................. 61 nm-23 .............................................................................................................. 64 EGFR .............................................................................................................. 64

DISKUSE ..................................................................................................................... 66 8.1 Frekvence imunohistochemicky detekovaných antigenů, jejich korelace s histologickým grade a s dalšími proměnnými ................................................................. 66 8.1.1 8.1.2 8.1.3 8.1.4 8.1.5 8.1.6 8.1.7 8.2

Ki-67 proliferační index .................................................................................. 66 p53 .................................................................................................................. 68 mdm-2 ............................................................................................................. 70 Cyklin D1........................................................................................................ 71 p16 .................................................................................................................. 71 nm-23 .............................................................................................................. 72 EGFR .............................................................................................................. 72

Budoucnost gradingu .............................................................................................. 73

ZÁVĚRY...................................................................................................................... 76 OBRAZOVÁ DOKUMENTACE ................................................................................. 77 SOUHRN ..................................................................................................................... 80 SUMMARY ................................................................................................................. 81 SEZNAM PUBLIKACÍ AUTORA ............................................................................... 82

9 10 11 12 13

13.1

PUBLIKACE ......................................................................................................82

5

13.2 14

ABSTRAKTA .................................................................................................... 83

POUŢITÁ LITERATURA ............................................................................................ 85

6

POUŽITÉ ZKRATKY

3

AIDS

syndrom získaného imunodeficitu

AJCC

American Joint Committee on Cancer

AR

amfiregulin

ARMS

alveolární rabdomyosarkom

ASPL

gen fúzující s genem transkripčního faktoru TFE-3 u alveolárního sarkomu měkkých částí a u karcinomů z renálních buněk

ATF1

gen kódující aktivační transkripční faktor 1

BTC

β-cellulin

CCND1

gen cyklinu D1

CD44

adhezní molekula

CD44

adhezní molekula

Cdk

cyklin dependentní kináza

CDK

cyklin dependentní kináza

CDKN2A

cyklin dependentní kináza 2A, alternativní název pro p16 protein

cDNA

komplementární DNA

c-KIT

receptor pro cytokiny s tyrozin kinázovou aktivitou

COL1A1

gen kódující α1 řetězec kolagenu typu I

7

ČR

Česká republika

DFS

disease free survival, beznádorový interval

DNA

deoxynukleová kyselina

E1AF

gen účastnící se translokace t(17;22), typicky nalézané u tumorů rodiny Ewingova sarkomu

EGF

epidermální růstový faktor

EGFR

receptor pro epidermální růstový faktor

ErbB1-4

receptory pro ligandy se vztahem k epidermálnímu růstovému faktoru

EREG

epiregulin

ERG

gen účastnící se translokace t(21;22), typicky nalézané u tumorů rodiny Ewingova sarkomu

ERMS

embryonální rabdomyosarkom

ETV1

gen účastnící se translokace t(7;22), typicky nalézané u tumorů rodiny Ewingova sarkomu

ETV6

gen kódující transkripční faktor, účastní se řady chromozomálních rearanţí u leukémií a infantilního fibrosarkomu

EWS

gen účastnící se translokace t(11;22) a dalších, typicky nalézaných u tumorů rodiny Ewingova sarkomu

Fem 1a

produkt genu zapojeného do buněčné proliferace a diferenciace

8

FEV

gen účastnící se translokace t(2;22), typicky nalézané u tumorů rodiny Ewingova sarkomu

FKHR

gen kódující transkripční faktor, účastní se translokace s PAX3 u alveolárního rabdomyosarkomu

FLI1

gen účastnící se translokace t(11;22), typicky nalézané u turmorů rodiny Ewingova sarkomu

FN

fakultní nemocnice

FNAB

fine-needle aspiration biopsy, tenkojehlová aspirační biopsie

FNCLCC

Fédération Nationale des Cenres de Lutte Contre le Cancer

GIST

gastrointestinální stromální tumor

HB-EGF

heparin-váţící epidermální růstový faktor

HPF

high-power field, mikroskopické pole velkého zvětšení

HRP

horseradish peroxidase, křenová peroxidáza

CHN

gen kódující receptorový protein s moţnou funkcí transkripčního aktivátoru, účastnící se translokací u extraskeletálního myxoidního chondrosarkomu

CHOP

gen kódující transkripční faktor, účastnící se translokace t(12;16), typicky nalézané u myxoidních liposarkomů

I. PAÚ

I. patologicko – anatomický ústav

INK4A

gen kódující protein p16

9

LF MU

lékařská fakulta Masarykovy univerzity

mdm-2

murine double minute 2, protein inaktivující p53

mf

mitotická figura

MFH

maligní fibrózní histiocytom

MIB-1

monoklonální protilátka proti Ki-67

MPNST

maligní tumor periferní nervové pochvy

NCI

National Cancer Institute

NS

nespecifikovaný

NTRK3

gen

kódující

receptor

s tyrozin

kinázovou

aktivitou,

vázající

neurotrofin, účastnící se translokace u infantilního fibrosarkomu OS

overall survival, celkové přeţití

p16

protein regulující RB tumor supresorovou dráhu

p19ARF

protein zapojený do buněčných signálních drah

p53

protein p53

pARMS

alevolární rabdomyosarkom se specifickou chromozomální translokací

PAX3

gen kódující transkripční faktor, účastnící se translokace u alveolárního rabdomyosarkomu

PAX7

gen kódující transkripční faktor, účastnící se translokace u alveolárního rabdomyosarkomu

10

PCNA

proliferating cell nuclear antigen, jaderný antigen proliferujících buněk

PCR

polymerázová řetězová reakce

PDGFB1

gen pro destičkový růstový faktor

PDGFR α

receptor pro destičkový růstový faktor

PECom

nádory s perivaskulární epiteloidní buněčnou diferenciací

Pgp

P-glykoprotein

PI

proliferační index

PNET

primitivní neuroektodermový tumor

pRb

retinoblastomový protein

RB1

retinoblastomový gen

RBP56

gen kódující podjednotku transkripčního faktoru, účastní se translokace u extraskeletálního myxoidního chondrosarkomu

RT

radioterapie

RT-PCR

reverzní transkriptázová polymerázová řetězová reakce

SFT

solitární fibrózní tumor

SS

synoviální sarkom

SSX2

gen účastnící se t(X;18) translokace typicky nalézané u synoviálního sarkomu

11

SYT

gen účastnící se t(X;18) translokace, typicky nalézané u synoviálního sarkomu

TFE3

gen kódující transkripční faktor, účastní se translokace typicky nalézané u alveolárního sarkomu měkkých částí a u karcinomů z renálních buněk

TGF-α

transformující růstový faktor-α

TLS

gen účastnící se translokace t(12;16), typicky nalézané u myxoidních liposarkomů

TMA

tkáňová microarray

TNM

tumour, nodi, metastases; klasifikační systém nádorů s určením stadia na

základě

velikosti

primárního

tumoru,

počtu

metastázami

postiţených regionálních lymfatických uzlin a přítomnosti či absenci vzdálených metastáz TP53

tumor supresorový gen kódující protein p53

TSS

tumor-specific survival, tumor-specifické přeţití

UICC

International Union against Cancer

USA

Spojené státy americké

VEGF

vaskulární endoteliální růstový faktor

WHO

Světová zdravotnická organizace

WT1

gen Wilmsova tumoru

12

ÚVOD

4

4.1 Definice Sarkomy měkkých tkání jsou vzácné maligní tumory, tvořící pouze kolem 1% všech malignit dospělých a okolo 7% všech zhoubných nádorů dětského věku [82], reprezentují široké spektrum histologických typů s četnými subtypy, a jsou charakterizované velmi variabilním biologickým chováním. Vznikají ve tkáních mezenchymálního původu a nejčastěji se objevují v hlubokých měkkých tkáních končetin, nicméně se mohou objevit v kterékoli anatomické lokalizaci, v podkoţí, v měkkých tkáních trupu, v retroperitoneu, i v oblasti hlavy a krku (Tabulka 1). Měkké tkáně jsou definovány jako neepiteliální extraskeletální tkáně, které zahrnují svalstvo, tukovou tkáň a vazivové podpůrné struktury, které

se

vyvíjejí

převáţně

z embryonálního

mezodermu

s určitým

příspěvkem

neuroektodermové komponenty. Vzácné, přesto dobře dokumentované, jsou viscerální lokalizace sarkomů [40,111]. Pokud ke skupině sarkomů měkkých tkání přiřadíme gastrointestinální stromální tumory (GIST) a orgánově specifické sarkomy, jako jsou děloţní leiomyosarkomy a endometriální stromální sarkomy, zastoupení sarkomů vnitřních orgánů vzroste [18]. Obecně, sarkomy měkkých tkání nejsou následkem maligní transformace nebo dediferenciace benigních nádorů měkkých tkání [26].

Tabulka 1. Lokalizace sarkomů měkkých tkání LOKALIZACE Pletenec pánevní a dolní končetina Pletenec ramenní a horní končetina Retroperitoneální a intraperitoneální lokalizace* Trup Hlava a krk

INCIDENCE (%) 40 20 20 10 10

* Jsou zahrnuty i gastrointestinální stromální tumory Upraveno podle: Clark MA, Fisher C, Judson I, Thomas JM.: Soft-tissue sarcomas in adults. N Engl J Med. 2005;353(7):701-11.

13

4.2 Epidemiologie V České republice byla v roce 2005 incidence sarkomů měkkých tkání 2,32 případů na 100 000 obyvatel a mortalita 1,01 na 100 000 obyvatel [32], přičemţ ze statistických dat je patrné, ţe incidence i mortalita dlouhodobě oscilují kolem těchto hodnot, bez zřetelného vzestupného nebo sestupného trendu. Podíl na všech zhoubných onemocnění včetně in situ neoplázií je tak v ČR 0,37 %. Pro srovnání, v USA se objevuje přibliţně 9 500 nových případů sarkomů měkkých tkání ročně, a nádory této kategorie v USA představují 0,63 % případů všech malignit a zodpovídají za 1,15 % všech úmrtí v důsledku zhoubných nádorů [26,67]. Incidence sarkomů měkkých tkání se zvyšuje s věkem, v ČR s maximem výskytu kolem 75 roku věku.

4.3 Etiologie Naprostá většina sarkomů měkkých tkání je sporadických a jejich příčina není známa. Některé genetické a environmentální faktory jsou nicméně jasně asociované s těmito nádory [18]. Je zřejmá asociace mezi určitými virovými infekcemi (zejména virem Epsteina-Barrové u pacientů s AIDS) a leiomyosarkomy. Pacienti s hereditárním retinoblastomem a dalšími dědičnými chorobami, včetně neurofibromatózy, jsou v riziku vzniku sarkomů. Děti s hereditárním retinoblastomem v důsledku germinální mutace v RB1 tumor supresorovém genu jsou vystaveny zvláště vysokému riziku vzniku osteosarkomu a sarkomů měkkých tkání. Neurofibromatóza typu I je spojena s 10% celoţivotním rizikem vzniku maligních tumorů periferní nervové pochvy. Sarkomy byly rovněţ popsány u pacientů s Li-Fraumeni syndromem, jehoţ příčinou je germinální mutace v TP53 tumor supresorovém genu. Několik látek, například dioxiny, je povaţováno za etiologická agens při vývoji sarkomů. Rovněţ ionizující záření přispívá k riziku vzniku sarkomů měkkých tkání [67], tumory se mohou vyvinout za 3 – 15 let po terapeutické radiaci pro lymfom, karcinomy hlavy a krku, testikulární tumory nebo pro karcinom prsu či děloţního hrdla. Incidence sarkomů se zvyšuje 8 – 50x u pacientů po zevní radioterapii [26]. Riziko vzniku sarkomu je zřejmě na dávce závislé. Angiosarkom spojený s chronickým lymfedémem po axilární disekci (Stewart-Trevesův syndrom) je vzácnou komplikací terapie karcinomu prsu. Angiosarkomy byly rovněţ popsány po filarióze a v podmínkách kongenitálního nebo hereditárního lymfedému, kdy je obvyklou lokalizací tumoru dolní končetina [26,67].

14 Další rizikové faktory zahrnují profesionální expozici určitým chemickým látkám, například herbicidům, jako je fenoxyoctová kyselina, nebo konzervačním látkám typu chlorofenolů [26].

4.4 Histogeneze Dle současného poznání všechny nádory jsou odvozené z multipotentní prekurzorové buňky, tedy kmenové buňky, která je programovaná k diferenciaci do různě maturovaných buněčných typů [79]. Nádory nemohou vznikat z maturovaných buněk, jako jsou buňky kosterního svalu nebo adipocytů, neboť ty jsou terminálně diferencované a nejsou schopné buněčného dělení. Histogenetické pojetí mezenchymálních nádorů jiţ tedy není obhajitelné, neboť nejsou důkazy, ţe by nádory měkkých tkání vznikaly z jejich normálně se vyskytujících buněčných analogů [35]. V současnosti je uvaţováno v termínech linie diferenciace, která je určena typem genové exprese. U značné části sarkomů měkkých tkání není linie diferenciace zřejmá a není znám jejich nenádorový tkáňový nebo celulární analog. Patří k nim například extraskeletální mezenchymální chondrosarkom, synoviální sarkom, tumory rodiny Ewingova sarkomu, epiteloidní sarkom a další.

4.5 Klasifikace Široce akceptovaná klasifikace vede k uţívání reprodukovatelných diagnostických kritérií, coţ by mělo umoţnit konzistentnější přístupy k predikci biologického potenciálu a rovněţ k terapii [35]. Dále platí, ţe jestliţe jsou nádory tříděny konzistentním způsobem, je snazší výzkum týkající se jejich vlastní biologie, a je snazší identifikovat specifické molekulární nebo genetické léze. Současná uţitečnost cytogenetiky a molekulární genetiky v diagnostice sarkomů měkkých tkání je moţná pouze v důsledku toho, ţe patologové tvoří reprodukovatelné diagnózy. Poslední klasifikace Světové zdravotnické organizace (WHO) [36] rozeznává kolem 50 různých typů sarkomů měkkých tkání (Tabulka 2), s různým biologickým chováním, které jsou většinou pojmenovány podle tkáně, kterou nejvíce připomínají. Dle přehledového článku Cormiera a Polocka z roku 2004 [26] jsou nejčastější maligní fibrózní histiocytom (MFH), který představoval 28 % případů, leiomyosarkom a liposarkom, které tvořily 12 % a 15 % sarkomů, synoviální sarkom (SS), který reprezentoval 10 % případů a maligní tumor periferní nervové pochvy (MPNST), jenţ tvořil 6 % případů. Rabdomyosarkom je nejčastějším

15 sarkomem měkkých tkání dětského věku. V poslední dekádě je diskutována kategorie maligního fibrózního histiocytomu a objevují se nové jednotky MFH připomínající. Hlavní změnou ve WHO klasifikaci v oblasti fibrohistiocytárních tumorů je tak poznání, ţe pleomorfní maligní fibrózní histiocytom není definovatelnou a reprodukovatelnou jednotkou [35], a většina lézí takto dříve kategorizovaných mohou být klasifikovány jako jiné jednotky. Tento fakt má význam i proto, ţe subklasifikace pleomorfních sarkomů má klinické implikace, neboť léze s myogenní diferenciací (jakéhokoli typu) jsou zvláště agresivní. V současné WHO klasifikaci je nyní plemorfní MFH povaţován za synonymum pro nediferencovaný pleomorfní sarkom, a představuje diagnózu per exclusionem, podle Fletchera tvořící ne více neţ 5% adultních sarkomů měkkých tkání. Jde o velmi významnou změnu, vzhledem k tomu, ţe tato jednotka byla po mnoho let povaţována za jeden z nejčastějších měkkotkáňových sarkomů dospělých. Termín MFH byl ve WHO klasifikaci retinován pouze pro vysvětlení těchto konceptuálních změn a je pravděpodobné, ţe v příštích klasifikacích bude od této terminologie upuštěno, i proto, ţe je dlouho známo, ţe tyto léze nemají ţádný vztah k histiocytům/makrofágům. I jednotky jako je obrovskobuněčný nebo inflamatorní MFH představují jiné entity. Rovněţ myxoidní MFH byl označen jako myxofibrosarkom, charakteristický fibroblastický nádor s produkcí mezenchymálního hlenu, který byl realokován do fibroblastické/myofibroblastické kategorie. Při revizi 428 případů MFH Oda et al. [86] reklasifikovali plných 128 případů, z čehoţ 57% tvořily leiomyosarkomy (konvenční, pleomorfní a myxoidní) a autoři uzavírají, ţe leiomyosarkom je hlavní diferenciální diagnózou maligního fibrózního histiocytomu, coţ je diagnóza per exclusionem pro plemorfní vřetenobuněčný sarkom bez zřetelné linie diferenciace. Po revizi vystřídal leiomyosarkom MFH na první pozici v celkovém počtu 1974 případů sarkomů měkkých tkání v instituci autorů.

16 Tabulka 2. WHO klasifikace nádorů měkkých tkání ADIPOCYTÁRNÍ NÁDORY Benigní Intermediární (lokálně agresivní) Lipom 8850/0 Atypický lipomatózní tumor/dobře diferencovaný liposarkom Lipomatóza 8850/0 Maligní Lipomatóza nervu 8850/0 Dediferencovaný liposarkom Lipoblastom/lipoblastomatóza 8881/0 Myxoidní liposarkom Angiolipom 8861/0 Kulatobuněčný liposarkom Myolipom 8890/0 Pleomorfní liposarkom Chondroidní lipom 8862/0 Liposarkom smíšeného typu Extrarenální angiomyolipom 8860/0 Liposarkom, nespecifikován Extraadrenální myelolipom 8870/0 Vřetenobuněčný/ 8857/0 pleomorfmí lipom 8854/0 FIBROBLASTICKÉ/MYOFIBROBLASTICKÉ NÁDORY Benigní Intermediární (lokálně agresivní) Nodulární fasciitis Superficiální fibromatózy (palmární/plantární) Proliferativní fasciitis Desmoidní fibromatózy Myositis ossificans Lipofibromatóza Ischemická fasciitis Intermediární (vzácně metastazující) Elastofibrom 8820/0 Solitární fibrózní tumor a hemangiopericytom Fibrózní hamartom dětství Inflamatorní myofibroblastický tumor Myofibrom/myofibromatóza 8824/0 Nízce maligní myofibroblastický sarkom Fibromatosis colli Myxoinflamatorní fibroblastický sarkom Juvenilní hyalinní fibromatóza Infantilní fibrosarkom Fibromatóza inkluzních tělísek Maligní Fibrom šlachové pochvy 8810/0 Adultní fibrosarkom Desmoplastický fibroblastom 8810/0 Myxofibrosarkom Myofibroblastom mammárního typu 8825/0 Nízce maligní fibromyxoidní sarkom hyalinizující vřetenobuněčný tumor Kalcifikující aponeurotický fibrom 8810/0 Sklerózující epiteloidní fibrosarkom Angiomyofibroblastom 8826/0 Celulární angiofibrom 9160/0 Fibrom nuchálního typu 8810/0 Gardnerův fibrom 8810/0 Kalcifikující fibrózní tumor Obrovskobuněčný angiofibrom 9160/0 TZV. FIBROHISTIOCYTÁRNÍ NÁDORY Benigní Intermediární (vzácně metastazujícíj) Obrovskobuněčný nádor šlachové 9252/0 Plexiformní fibrohistiocytární tumor pochvy

8851/3

8858/3 8852/3 8853/3 8854/3 8855/3 8850/3

8821/1

8815/1 9150/1 8825/1 8825/3 8811/3 8814/3 8810/3 8811/3 8811/3 8810/3

8835/1

17 Pokračování Tabulky 2. Obrovskobuněčný nádor difúzního typu Hluboký benigní fibrózní histiocytom

9251/0

Obrovskobuněčný nádor měkkých tkání

8830/0

Maligní

Pleomorfní „MFH“/nediferencovaný pleomorfní sarkom Obrovskobuněčný „MFH“/nediferencovaný pleomorfní sarkom s obrovskými buňkami Inflamatorní „MFH“/nediferencovaný pleomorfní sarkom s prominentním zánětem HLADKOSVALOVÉ NÁDORY Angioleiomyom 8894/0 Hluboký leiomyom Genitální leiomyom 8890/0 Leiomyosarkom PERICYTÁRNÍ (PERIVASKULÁRNÍ) TUMORY Glomus tumor 8711/0 Myopericytom Maligní glomus tumor 8711/3 NÁDORY KOSTERNÍHO SVALU Benigní Maligní Rabdomyom 8900/0 Embryonální rabdomyosarkom 8904/0 Alveolární rabdomyosarkom Adultní typ 8903/0 Pleomorfní rabdomyosarkom Fetální typ 8905/0 Genitální typ VASKULÁRNÍ TUMORY Benigní Intermediární (lokálně agresivní) Hemangiom 9120/0 Kaposiformní hemangioendoteliom Epiteloidní hemangiom 9125/0 Intermediární (vzácně metastazující) Angiomatóza Retiformní hemangioendoteliom Lymfangiom 9170/0 Papilární intralymfatický angioendoteliom Kompozitní hemangioendoteliom Kaposiho sarkom Maligní Epiteloidní hemangioendoteliom Angiosarkom CHONDROOSEÓZNÍ TUMORY Chondrom měkkých tkání 9220/0 Mezenchymální chondrosarkom Extraskeletální osteosarkom NÁDORY NEJISTÉ DIFERENCIACE Benigní Maligní Intramuskulární myxom 8840/0 Synoviální sarkom Juxtaartikulární myxom 8840/0 Epiteloidní sarkom

9251/1

8830/3 8830/3

8830/3

8890/0 8890/3 8713/0

8910/3 8920/3 8901/3

9130/1 9135/1 9135/1 9130/1 9140/3 9133/3 9120/3 9240/3 9180/3

9040/3 8804/3

18 Pokračování Tabulky 2. Hluboký (agresivní) angiomyxom Pleomorfní hylinizující angiektatický tumor Ektopický hamartomatózní thymom Intermediární (vzácně metastazujícíj) Angiomatoidní fibrózní histiocytom Osifikující fibromyxoidní tumor Smíšený tumor Myoepiteliom Parachordom

8841/0

8587/0 8836/1 8842/0 8940/1 8982/1 9373/1

Alveolární sarkom měkkých částí Extraskeletální myxoidní chondrosarkom Jasnobuněčný sarkom měkkých tkání PNET Extraskeletální Ewingův sarkom Desmoplastický kulatobuněčný nádor Extrarenální rabdoidní tumor Maligní mezenchymom PECom Intimální sarkom

9581/3 9231/3 9044/3 9364/3 9260/3 8806/3 8963/3 8990/3 8800/3

MFH, maligní fibrózní histiocytom; PECom, nádory s perivaskulární epiteloidní buněčnou diferenciací, PNET; primitivní neuroektodermový nádor. Převzato z Fletcher CDM, Unni KK, Mertens F, eds. Pathology and Genetics of Tumours of Soft Tissue and Bone. World Health Organization Classification of Tumours; vol 5. Lyon, France: IARC Press; 2002.

4.6 Genetika Klasifikace sarkomů měkkých tkání se vyvíjí v důsledku doplňování histologické analýzy imunohistologickými nálezy a poznáváním základních genetických změn. Jsou stále rozšířenější metodiky, které lze aplikovat na formalinem fixované a v parafinu zalité tkáně. Genetické alterace byly popsány u mnoha tumorů měkkých tkání a umoţňují identifikovat nádory, u kterých byla dříve klasifikace obtíţná, zvláště u pleomorfních sarkomů měkkých tkání [102]. Genetické aberace mohou být hereditární nebo získané. Genetika klasifikuje sarkomy do dvou velkých skupin, v první skupině jsou sarkomy se specifickými konzistentními genetickými alteracemi, například recipročními translokacemi se vznikem fúzních genů [18,26], viz Tabulka 3, nebo pravidelnými bodovými mutacemi (např. mutace KIT u GIST). Nejznámější genetickou rearanţí jsou translokace t(11;22) nebo t(21;22) u rodiny tumorů Ewingova sarkomu/primitivního neuroektodermového tumoru (PNET), tedy EWS-FLI-1nebo EWS-ERG fúze, dále translokace t(12;16) u myxoidního liposarkomu (TLSCHOP fúze) a translokace t(X;18) u synoviálního sarkomu (SSX-SYT fúze), Fúzní geny vznikající následkem těchto translokací, kromě toho, ţe jsou specifickými diagnostickými markery, kódují chimérické proteiny, které jsou významné v biologii tumorů – mají roli abnormálních transkripčních faktorů nebo tyrozin kináz, které deregulují četné klíčové signální buněčné dráhy, coţ zakotvuje jejich zásadní roli v patogenezi sarkomů měkkých tkání. Ve druhé skupině sarkomů z aspektu genetických změn jsou jednotky s nespecifickými

19 genetickými alteracemi a komplexními nebalancovanými karyotypy, s četnými genetickými ztrátami a zisky [15]. Tato skupina zahrnuje například maligní fibrózní histiocytom, liposarkomy jiného typu neţ myxoidní, leiomyosarkom a angiosarkom. U této skupiny sarkomů je zřejmě klíčovým momentem onkogeneze ztráta kontrolní funkce TP53, s vysokou prevalencí alterací dráhy p53. Běţné formy inaktivace dráhy p53 u sarkomů zahrnují bodové mutace TP53, homozygotní delece genu CDKN2A, který kóduje p14 ARF a p16, a amplifikace genu MDM-2. Mutace TP53 jsou pozorovány u 30 – 60 % sarkomů měkkých tkání [26]. Prognostický význam alterací dráhy p53 u sarkomů se specifickými translokacemi je vysoký, na rozdíl od skupiny s komplexními genetickými změnami. U sarkomů se specifickými translokacemi je alterace p53 vzácným jevem, ale pokud je přítomna, je silným prognostickým faktorem, se signifikantně sníţeným přeţitím u např. u synoviálního sarkomu, myxoidního liposarkomu a Ewingova sarkomu. Kromě TP53 dalším tumor supresorovým genem, který má význam při onkogenezi sarkomů měkkých tkání je gen retinoblastomu (RB) [26]. Mutace nebo delece RB genu mohou vést k vývoji retinoblastomu a sarkomů měkkých tkání a kosti.

4.7 Klinické příznaky Klinické příznaky sarkomů měkkých tkání jsou nespecifické, nejběţněji se jedná o nebolestivé, postupně rostoucí zduření odpovídající lokalizaci tumoru. Velikost nádoru v době diagnózy kolísá podle lokalizace, tumory distálních partií dolních končetin, hlavy a krku jsou obvykle menší, protoţe jsou zpozorovány časněji, zatímco nádory retroperitonea a stehna mohou dosáhnout značné velikosti. Sarkomy měkkých tkání rostou jako sférická masa nebo se šíří podél tkáňových rovin, ale infiltrují nádorovou pseudokapsulu a někdy okolní struktury. Relativně vzácné postiţení kostí nebo neurovaskulárních svazků produkuje bolest nebo edém [26]. Metastázy jsou přítomné u 13 % pacientů v době diagnózy [19]. Dominantním typem metastazování je hematogenní diseminace, nejčastější lokalizací metastáz jsou plíce, následované kostmi, játry a mozkem. Metastázy se obvykle objevují v průběhu 2 – 3 let po ukončení terapie. Lymfogenní metastázy jsou vzácné (méně neţ 1 %), s výjimkou několika histologických typů, mezi něţ patří epiteloidní sarkom, synoviální sarkom, rabdomyosarkom, světlobuněčný sarkom, a angiosarkom. V sestavách některých autorů [127] byla frekvence metastáz do lymfatických uzlin 3 %, tedy poněkud vyšší, ale stále v řádu jednotek procent.

20 Tabulka 3. Chromozomální translokace u sarkomů měkkých tkání. Typ tumoru Synoviální sarkom

Translokace t(X;18)(p11.2;q11.2)

Myxoidní nebo kulatobuněčný liposarkom Ewingův sarkom nebo periferní primitivní neuroektodermální tumor

t(12;16)(q13;p11) t(12;22)(q13;q11-q12) t(11:22)(q24;q12) t(21:22)(q22;q12) t(7;22)(p22;q12) t(2;22)(q33;q12) t(17;22)(q12;q12) t(11;22)(p13;q12)

Postižené geny SSX1 nebo SSX2, SYT CHOP, TLS CHOP, EWS FLI1, EWS ERG, EWS ETV1, EWS FEV, EWS E1AF, EWS WT1, EWS

t(2:13)(q35;q14) t(1;13)(p36;q14) t(9;22)(q21-31;q12.2) t(9;17)(q22:q11) t(12;22)(q13;q12) t(X;17)(p11;q25) t(17;22)(q22;q13)

PAX3, FKHR PAX7, FKHR CHN, EWS CHN, RBP56 ATF1, EWS TFE3, ASPL COL1A1, PDGFB1

t(12;15)(p13;q25) t(7;16)(q34;p11)

ETV6, NTRK3 FUS, BBF2H7

Desmoplastický tumor z malých okrouhlých buněk Alveolární rhabdomyosarkom Extraskeletální myxoidní chondrosarkom Světlobuněčný sarkom Alveolární sarkom měkkých částí Dermatofibrosarkom nebo obrovskobuněčný fibroblastom Infantilní fibrosarkom Low-grade fibromyxoidní sarkom

Podle: Clark MA, Fisher C, Judson I, Thomas JM. Soft-tissue sarcomas in adults. N Engl J Med. 2005;353(7):701-11.

4.8 Diagnostika Předléčebné radiologické zobrazovací metody jsou nutné pro určení lokálního rozsahu tumoru, staging choroby, kontrolu bioptického odběru, a pro určení diagnózy [26]. MRI je primární modalitou uţívanou pro detekci léze a lokální staging sarkomů měkkých tkání, zvláště končetinových [15,26], CT je preferovanou zobrazovací metodou pro hodnocení retroperitoneálních sarkomů. Nicméně klinické a radiologické odlišení mezi benigními měkkotkáňovými masami a sarkomy měkkých tkání je obtíţné [19]. Zobrazovací metody jsou nepostradatelné rovněţ pro monitorování změn nádoru po terapii, zvláště po neoadjuvantní chemoterapii nebo radioterapii; a při detekci recidiv po chirurgickém zákroku [26], i kdyţ po chirurgickém zákroku a radiační terapii je interpretace diagnostických zobrazovacích metod obtíţná [19]. PET u sarkomů měkkých tkání především napomáhá identifikovat neočekávané lokalizace metastáz u pacientů s recidivujícími vysoce maligními tumory [67].

21 Pro diagnózu sarkomu měkkých tkání je esenciální histopatologické vyšetření bioptického vzorku nebo resekátu, popřípadě cytologické vyšetření, s určením histologického typu a stanovením stupně malignity (histologického grade) sarkomu [26], a přesná předoperační histologická diagnóza je kruciální pro výběr adekvátní terapeutické strategie. Perkutánní biopsie silnou jehlou je bezpečná a dle některých autorů efektivní, subtyp a grade tumoru mohou být určeny v 80 % biopsií silnou jehlou. Perkutánní biopsie silnou jehlou je v mnoha centrech preferována před incizní biopsií, která má vyšší frekvenci komplikací [18,26]. Je nutná precizní lokalizace jehlové biopsie v tumoru, aby nebyly bioptovány nekrotické nebo cystické oblasti tumoru, které nemají ţádnou diagnostickou hodnotu. Cytologická analýza tenkojehlových aspirátů můţe být uţita pro potvrzení recidivující choroby nebo nodálních metastáz, tenkojehlová aspirační biopsie (FNAB) můţe být rovněţ pouţita i pro primární diagnózu sarkomů měkkých tkání (udávaná diagnostická přesnost v rozmezí 60 – 96 %), nicméně tam, kde je nutný pro plánování terapie histologický grading, je nepouţitelná [26]. V práci Palmera et al. [92] byl sarkom rozpoznán ve FNAB v 59 z 64 reprezentativních případů (92 %); nicméně, specifický histologický subtyp byl identifikován pouze v 9 případech (14 %), tedy s velmi nízkou specificitou. Benigní myxoidní a vřetenobuněčné léze byly obtíţně rozpoznatelné od sarkomů s nízkým stupněm malignity. Cytologické low- a high-grade odpovídalo histologickému grade v 90 % případů. Autoři uzavírají, ţe v případě myxoidních a vřetenobuněčných sarkomů je při pokusech o grading z cytologického materiálu nutná opatrnost. Diagnostická role FNAB při hodnocení sarkomů měkkých tkání zůstává kontroverzní a FNAB má uţití spíše jako screeningová technika při hdonocení biologické povahy léze a určení její mezenchymální povahy. Otevřená incizní biopsie je spolehlivou diagnostickou metodou se získáním dostatečného mnoţství tkáně, s moţností stanovení histologického grade, a s moţností cytogenetického vyšetření, elektron-mikroskopického vyšetření, a tkáňového bankingu. Místo biopsie a jizva by měly leţet v oblasti následné en bloc resekce tumoru [67]. Excizní biopsie můţe být provedena u snadno dosaţitelných superficiálních lézí na trupu nebo končetinách, menších neţ 3 cm [26]. Jakýkoli bioptický nebo cytologický vzorek by měl být hodnocen patologem se zkušenostmi s chorobami měkkých tkání [3,26], sarkomy mohou být mylně diagnostikovány nebo klasifikovány obecnými histopatology aţ ve 25 – 40 % případů. V práci Arbiserové et al. [7] byly pozorovány významné diskrepance, tedy se zásadním vlivem na

22 terapeutická rozhodnutí, v 25 % případů; největší proporci těchto neshod tvořily případy benigních lézí klasifikovaných jako sarkomy, podstatné diskrepance v histologickém grade (posun o 2 stupně ve třístupňovém systému) tvořily 12 % ze všech významných rozdílů. Problematické léze byly lipom (vřetenobuněčný lipom a lipom s tukovou nekrózou klasifikovaný jako dobře diferencovaný liposarkom), fasciitis a její neobvyklé varianty a desmoplastický melanom. Zajímavým poznatkem v této sestavě bylo, ţe diagnostické neshody nebyly závislé na selhání schopnosti provést imunohistochemickou analýzu. Genetická analýza můţe být velmi uţitečná v diagnostice, zvláště u sarkomů z malých okrouhlých buněk, a dokonce je dle některých autorů schopna předpovídat chování u specifických sarkomů [70].

4.9 Terapie Optimální terapeutický přístup k sarkomům měkkých tkání závisí na anatomické lokalizaci, lokálním typu růstu, velikosti nádoru a jeho histologickém grade, tedy na přesném určení stadia choroby [15,19] a cílem léčby sarkomů končetin je záchovný konzervativní zákrok. Základní léčbou u sarkomů měkkých tkání je chirurgická excize s dosaţením negativních resekčních okrajů. Pro povrchové (subkutánní) nebo malé intramuskulární (≤ 5 cm) high-grade sarkomy nebo low-grade sarkomy jakékoli velikosti by měl být terapií volby samotný chirurgický zákrok, pokud je dosaţeno resekčních okrajů > 1 cm. U sarkomů vyššího grade, u velkých tumorů a marginálních resekcí se v léčbě dále pouţívá adjuvantní radioterapie (RT). Pooperační radioterapie by měla být zvaţována v případech resekčních okrajů < 1 cm, hlubokého extramuskulárního postiţení nebo předchozí excizní biopsie. Část studií neprokazuje efekt radioterapie na výskyt rekurencí a přeţití [112]. V čase prodělaly radioterapeutické protokoly určitý vývoj, v 60. a 70. letech minulého století byla preferována pooperační radioterapie, v 80. a 90. letech předoperační radioterapie [127]. V některých případech můţe být uţit protokol s předoperační radioterapií po limitované resekci makroskopického tumoru, před definitivní resekcí nádorového lůţka (tzv. sandwich RT). Účinek adjuvantní chemoterapie je v léčbě sarkomů měkkých tkání stále kontroverzním tématem [18] s výjimkou tumorů z „malých modrých okrouhlých buněk“, mezi něţ patří rodina tumorů Ewingova sarkomu a rabdomyosarkomy, které jsou standardně léčeny indukční chemoterapií, a histologická odpověď na terapii je nejvýznamnějším prognostickým faktorem při multivariační analýze [18,84]. Chemoterapie je paliativní u většiny pacientů s neresekovatelnými nádory nebo metastatickou chorobou. Pacienti se sarkomy končetin

23 s vysokým stupněm malignity větší neţ 5 cm jsou obvykle selektováni pro vysoké riziko vzdáleného metastazování pro chemoterapii [127], která je obvykle aplikována po dokončení lokoregionální terapie. Doxorubicin, dacarbazin a ifosfamid jsou dle některých autorů spojeny s konzistentní odpovědí 20 % nebo více u pokročilých sarkomů měkkých tkání [26]. Základní limitací pouţití adjuvantní chemoterapie jsou nepříznivé toxické účinky u pacientů jinak neodpovídající na terapii. Uţití chemoterapie u pacientů s resekovatelnými sarkomy měkkých tkání zůstává stále kontroverzním tématem, např. u synoviálních sarkomů [112] nebylo pozorováno signifikantní vylepšení prognózy pacientů. Intraabdominální a retroperitoneální nádory jsou spojeny s terapeutickými obtíţemi, pro blízkost vitálně důleţitých orgánů, obvykle značnou velikost a lokální pokročilost při diagnóze a pro nemoţnost dosaţení adekvátních chirurgických okrajů. Na rozdíl od končetinových sarkomů je smrt obvykle důsledkem lokální progrese choroby [15]. Přes moderní terapeutické přístupy 50 % pacientů se sarkomem měkkých tkání umírá v důsledku tohoto onemocnění. U naprosté většiny případů je jediným kurativním přístupem kompletní chirurgická excize.

4.9.1 Cílená biologická terapie Sarkomy, zvláště ty s jednoduchými a pouze několika genetickými abnormalitami, mohou být vhodným substrátem cílených terapií. Úspěch imatinib mesylátu v léčbě GIST ukazuje na slibný směr vývoje nových agens zamířených proti dalším cílům identifikovaných u dalších sarkomů. Tyto cíle mohou zahrnovat jak extracelulární receptory a antigeny, tak intracelulární signální proteiny, jako jsou serinové kinázy, tyrozin kinázy, nebo transkripční faktory [15].

4.10 Prognostické faktory sarkomů měkkých tkání 4.10.1

Etablované prognostické faktory

Při hledání prognostických faktorů s ohledem na dosaţení adekvátních počtů pro statistickou analýzu je nutné vzhledem k relativní vzácnosti těchto lézí zařadit do studií typy sarkomů s velmi různým klinickým chováním. Většina sarkomů měkkých tkání je charakterizována tendencí pro lokální recidivy, ale různé typy se velmi liší v metastatickém potenciálu. Některé metastazují velmi vzácně, další metastazují přibliţně v 50 % případů, a v poslední skupině jsou léze, které metastazují ve většině případů, chovají se velmi agresivním způsobem a jsou spojeny se špatnou prognózou a vysokou mortalitou [17,38].

24 Prognostické faktory sarkomů měkkých tkání mají vztah k přeţití, ať jiţ celkovému přeţití (OS, overall survival), či tumor-specifickému přeţití (TSS, tumour-specific survival) nebo k beznádorovému intervalu (DFS, disease free survival). Beznádorový interval reflektuje absenci či přítomnost lokální recidivy, a případné metastatické šíření do lymfatických uzlin a nepřítomnost vzdálených metastáz [127]. 5-ti leté přeţití je udáváno u sarkomů všech stadií pouze v rozmezí 50 – 60 %, většina pacientů umírá v důsledku metastatické choroby, která se rozvíjí v průběhu 2 – 3 let po úvodní diagnóze v 80 % případů [26,67], přičemţ klíčovou determinantou přeţití je kontrola lokální recidivy a vzdálené diseminace. Například 5-ti leté přeţití u souboru 1116 pacientů ve studii Hashimota et al. [51] bylo 43,6 %. Prognóza u sarkomů měkkých tkání je tak určena především lokálními recidivami a vzdáleným metastazováním, a celkové přeţití závisí zejména na rozvoji metastatické choroby. Nicméně v některých lokalizacích, jako je retroperitoneum, určuje celkové přeţití rovněţ lokální recidiva. Podle většiny publikovaných studií je nejvýznamnějším faktorem, který předpovídá lokální recidivu, kvalita chirurgických okrajů [26,75,76], zatímco rozvoj metastatického onemocnění a celkové přeţití korelují především s histologickým grade [20,43,52,76]. Neadekvátní chirurgický okraj není, ne ovšem dle všech autorů, rizikem rozvoje metastatické choroby [114]. Lepší lokální kontrola s niţší frekvencí lokálních recidiv se nepromítá do niţší frekvece metastáz, a proto ani do lepšího přeţití. To je podporováno faktem, ţe kvalitnější lokální kontrola se nepromítá do lepšího přeţití u sérií, které srovnávají končetinu zachovávající zákroky doplňované adjuvantní radiační terapií s amputacemi. Mezi standardní prognostické parametry u sarkomů měkkých tkání patří stadium, histologický typ nádoru, histologický grade, velikost nádoru a jeho lokalizace, zejména ve vztahu k superficiální fascii (tedy povrchové a hluboké nádory) a kvalita primární operace, představující status chirurgických resekčních okrajů [6,41,128], přičemţ velikost tumoru, lokalizace vzhledem k superficiální fascii, histologický grade, a přítomnost nebo absence nodálních či vzdálených metastáz jsou součástí stagingového systému American Joint Committee on Cancer/International Union against Cancer (AJCC/UICC). V souboru Zagarse et al. [127] bylo u 1225 lokalizovaných sarkomů měkkých tkání 5-ti leté specifické přeţití (disease specific survival) 73 %, 10-ti leté 68 %. Nepříznivými faktory, které sniţovaly přeţití, byl vysoký histologický grade, tumor větší neţ 5 cm, tumor lokalizovaný na hlavě, krku a hlubokých tkáních trupu, histotyp rabdomyosarkomu, epiteloidního sarkomu, světlobuněčného sarkomu; věk pacienta vyšší neţ 64 let a pozitivní nebo nejisté resekční okraje. Velikost tumoru můţe významně ovlivnit přeţití bez metastázy (metastatic-free

25 survival) a celkové přeţití [67]. Vliv velikosti tumoru na riziko lokální recidivy je diskutabilní. Hasegawa et al. [47] ve svém souboru 193 sarkomů měkkých tkání při univariační analýze zdokumentoval významný vliv na celkové přeţití pro proměnné, zahrnující hloubku tumoru, velikost tumoru, histologický typ, MIB-1 skóre, histologický grade a stadium. Případy liposarkomu vykazovaly lepší přeţití ve srovnání se skupinou MFH, synoviálních sarkomů, vřetenobuněčných sarkomů a kulatobuněčných sarkomů. Myxoidní subtyp MFH (myxofibrosarkom dle recentní nomenklatury) rovněţ vykazoval lepší průběh křivek celkového přeţití ve srovnání se storiformním – pleomorfním subtypem. Při multivariační analýze byl nejvýznamnějším nepříznivým prognostickým faktorem histologický grade 3. Dalšími nepříznivými prognostickými faktory byly stadium III, histologický grade 2, histologický typ vřetenobuněčného sarkomu, a věk nad 50 let v době manifestace choroby. Histologický typ liposarkom byl identifikován jako příznivý prognostický faktor. 4.10.1.1

Staging

Ideální stagingový systém by měl poskytovat přesné informace o prognóze, které umoţňují selekci adekvátní terapie [67]. Stagingový systém rovněţ umoţňuje komparaci klinických zkušeností mezi různými terapeutickými centry a srovnání různých terapií i v průběhu času. Staging sarkomů měkkých tkání je zaloţen na histologických i klinických informacích [36,67]. Současný standardní stagingový systém, navrţený International Union against Cancer a American Joint Committee on Cancer, tedy TNM systém (Tabulka 4) inkorporuje histologické grade, velikost nádoru a hloubku uloţení, metastázy do regionálních lymfatických uzlin a vzdálené metastázy [26], čili kombinuje nejvýznamnější parametry přeţití u lokalizovaných sarkomů měkkých tkání. V současnosti je v uţívání 6. revize TNM klasifikace z roku 2002. Zahrnutí histologického grade do skupin stadia je jedinečné pro stagingovou klasifikaci sarkomů měkkých tkání a stagingový systém pro tyto nádory se odlišuje od jiných malignit, protoţe biologické chování sarkomů měkkých tkání je závislé zejména na histologickém grade [21], které je esenciálním faktorem ve stagingovém systému pacientů se sarkomy. Uţití konvenčních stagingových systémů u retroperitoneálních tumorů je prognosticky méně přesné, protoţe současný AJCC/UICC stagingový systém byl designovaný pro všechny lokalizace sarkomů, ale validovaný pouze pro končetinové sarkomy měkkých tkání a van Dalen et al. [116] navrhli odlišný postchirurgický klasifikační systém, zaloţený na histologickém grade, kompletnosti excize a přítomnosti vzdálených metastáz.

26 Tato klasifikace účinně stratifikovala pacienty do skupin podle 5-ti letého specifického přeţití. Poněkud v rozporu jsou závěry Stojadinovice et al. [109], kdy stav resekčních okrajů nepředpovídal lokální kontrolu u retroperitoneálních sarkomů. Stagingová kritéria nejsou aplikovatelná na viscerální sarkomy, Kaposiho sarkom, protuberující dermatofibrosarkom a desmoidní tumory [26]. Tabulka 4: TNM klasifikace sarkomů měkkých tkání, 6. vydání 2002 primární tumor (T)

regionální lymfatické uzliny (N)

vzdálené metastázy (M)

Tx: primární tumor nelze hodnotit T0: bez známek primárního tumoru T1: tumor ≤ 5 cm v největším rozměru T1a: superficiální tumor* T1b: hluboký tumor T2: tumor > 5 cm v největším rozměru T2a: superficiální tumor T2b: hluboký tumor NX: regionální lymfatické uzliny nelze hodnotit N0: bez metastáz v regionálních lymfatických uzlinách N1: metastázy v regionálních lymfatických uzlinách M0: bez vzdálených metastáz M1: vzdálené metastázy

* superficiální nádor je uloţen nad superficiální fascií bez invaze do této fascie. Hluboký nádor je uloţený pod povrchovou fascií nebo nad ní, s invazí do fascie, nebo prorůstající fascií. Retroperitoneální, mediastinální a pánevní sarkomy jsou klasifikovány jako hluboké. Rozdělení do stadií: STADIUM Stadium IA Stadium IB Stadium IIA Stadium IIB Stadium III Stadium IV

T T1a T1b T2a T2b T1a T1b T2a T2b jakékoli T jakékoli T

N N0,NX N0,NX N0,NX N0,NX N0,NX N0,NX N0,NX N0,NX N1 jakékoli N

M M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M1

G Nízký stupeň Nízký stupeň Nízký stupeň Nízký stupeň Vysoký stupeň Vysoký stupeň Vysoký stupeň Vysoký stupeň Jakýkoli stupeň Jakýkoli stupeň

27

4.10.1.2

Lokální recidiva

Lokální recidiva je u sarkomů měkkých tkání končetin a trupu vzácně letální, ale je často příčinou značné morbidity a objevuje se aţ u 20 % pacientů s těmito nádory [127]. U sarkomů končetin a trupu je tedy lokální kontrola obecně dobrá, a příčinou smrti pacienta je diseminace choroby. Naopak u retroperitoneálních lézí je smrt nejčastěji následkem lokální progrese [15]. Faktory, které jsou signifikantní pro lokální recidivy, jsou méně dobře definovány neţ parametry ovlivňující rozvoj metastatické choroby [127], a patří mezi ně především mikroskopický stav resekčních okrajů, kdy je pozitivní resekční okraj asociován se signifikantně zvýšeným rizikem lokální rekurence téměř ve všech studiích, dle některých autorů zvláště při absenci adjuvantní radioterapie [15,109,114,128]. Méně konzistentně jsou mezi rizikovými faktory lokální recidivy uváděné předchozí místní rekurence, vyšší věk, lokalizace na hlavě a krku nebo v retroperitoneu, vysoký histologický grade, a určité histologické typy sarkomů měkkých tkání. 10-ti letá frekvence lokálních recidiv byla 13 %, pokud byly okraje < 1 cm, naproti tomu při okraji ≥ 1 cm byla 10-ti letá frekvence recidiv 0 % [15]. Kritickou determinantou adekvátnosti resekce je skutečný mikroskopický resekční okraj [128]. Rovněţ velikost nádoru v některých textech koreluje s rizikem vzniku lokální recidivy [127], dle jiných autorů je však vliv velikosti tumoru na riziko lokální recidivy diskutabilní [67]. V původní studii, která byla podkladem pro návrh gradingového systému National Cancer Institute (NCI), byla nejlepším histopatologickým parametrem predikujícím čas do lokální recidivy nádorová nekróza [27]. Mnoho studií naznačuje, ţe adjuvantní radioterapie ovlivňuje frekvenci recidiv. Nicméně, po radioterapii se mohou objevit závaţné komplikace, dehiscence chirurgických ran, u dětí rozdíly v délce končetiny, avaskulární nekróza a patologické fraktury. Dle některých studií lokální recidiva neovlivňuje přeţití [8], ale jiní autoři uvádí, ţe pozitivní resekční okraj dokonce koreluje se zvýšeným rizikem vývoje metastatické choroby a zkráceným přeţitím [128]. Ve velkém souboru 1225 lokalizovaných sarkomů měkkých tkání byla 5-ti letá frekvence lokálních recidiv 80 %, přičemţ rizikovým faktorem lokální recidivy byly pozitivní nebo nejisté resekční okraje, lokalizace tumoru na hlavě, krku a hlubokých tkáních trupu, vyšší věk pacienta neţ 64 let a histotyp maligního fibrózního histiocytomu, maligního tumoru periferní nervové pochvy a epiteloidní sarkom; dále velikost tumoru větší neţ 10 cm a vysoký histologický grade [127].

28

4.10.1.3

Vzdálené metastázování

Diseminace onemocnění, nejčastěji ve formě plicních metastáz, postihuje asi jednu třetinu pacientů se sarkomy měkkých tkání [45] a ve studii Zagarse et al. [127] byla metastatická diseminace nejčastějším typem rekurence u sarkomů měkkých tkání. Při hledání prognostických proměnných, které by určily pravděpodobnost metastázování, byly sledovány a navrţeny různé histologické parametry, nejkonzistentnějšími silnými prognostickými faktory mezi nimi jsou velikost tumoru, hloubka uloţení tumoru vzhledem k fascii

a

histologický

grade,

přítomnost

vaskulární

invaze

a

nádorová

nekróza

[20,42,44,86,114,127], přičemţ vyjma vaskulární invaze a nádorové nekrózy jsou tyto parametry součástí UICC/AJCC stagingového systému. Další autoři přidávají ještě další komponenty, které jsou obvykle součástí histologického grade, jako je mitotická aktivita [8]. Dle většiny studií mají pacienti s nádory menšími neţ 5 cm lepší prognózu přeţití, neţ je tomu v případě nádorů s maximálním rozměrem nad 5 cm, velikost nádoru je tedy důleţitým independentním rizikovým faktorem [86,112], přičemţ velikost nádoru nad 10 cm je spojena s ještě výrazněji zkráceným přeţitím [47]. Zagars et al. [127] popisuje 5-ti leté přeţití bez metastázy u 71 % pacientů s lokalizovanými sarkomy měkkých tkání. Rizikovými faktory pro rozvoj metastatické choroby byly vysoký histologický grade, velikost nádoru nad 5 cm, a histotyp leiomyosarkomu, rabdomyosarkomu, synoviálního sarkomu nebo epiteloidního sarkomu. Data o vlivu histotypu na rozvoj metastatické choroby jsou poměrně vzácná, ale je součástí obecného onkologického povědomí, ţe některé typy sarkomů měkkých tkání, jako je rabdomyosarkom, Ewingův sarkom a PNET mají vysoký metastatický potenciál, a histologický typ/subtyp sarkomu dle části studií vliv na přeţití má [112,127]. Existuje i silná korelace mezi rozvojem metastatického onemocnění a lokální recidivou [114], přičemţ ale vztah mezi lokální rekurencí a metastázou není kauzální. Tento nesoulad lze vysvětlit neúplnou znalostí prognostických faktorů, tj. při diagnóze prognostické faktory, jako velikost tumoru a histologický grade, poskytují nekompletní prognostickou informaci o skutečné malignitě tumoru, a to v důsledku skutečného chybění informací a v důsledku chyb měření. Pacienti s danými hodnotami těchto proměnných (tj. velikost a grade) jsou stále heterogenní mnoţinou v aspektu rizika rozvoje metastatického onemocnění. Lokální recidivu lze v tomto pohledu povaţovat za biologický marker malignity, vysoce maligní tumory kombinují lokální agresivitu i vysokou schopnost zakládat vzdálené metastázy, a pokud dojde k lokální recidivě, pacient je ve vyšším riziku metastázy neţ pacient se stejnými hodnotami

29 původních rizikových faktorů, ale bez přítomnosti lokální recidivy. Proto u části pacientů s lokálními recidivami lze uvaţovat o adjuvantní chemoterapii, neboť jsou ve vyšším riziku metastatického onemocnění. Přeţití dále můţe záviset na stavu okrajů resekce, kdy při prosté lokální excizi byl vyšší počet lokálních recidiv a kratší tumor-specifické přeţití neţ u resekce s širokými okraji; a na přítomnosti nebo absenci neurovaskulární invaze [112]. Stojadinovic et al. [109] po analýze rozsáhlého souboru 2 084 lokalizovaných primárních adultních sarkomů měkkých tkání uzavírá, ţe pozitivní mikroskopické resekční okraje signifikantně sniţují přeţití do lokální recidivy, vyjma skupiny retroperitoneálních sarkomů, a nezávisle předpovídají přeţití bez metastázy a tumor-specifické přeţití. Nicméně i u retroperitoneálních sarkomů mají pozitivní mikroskopické okraje signifikantní prognostickou hodnotu pro disease-specific přeţití a pro přeţití do vzdálené rekurence. Dle názoru autorů studie by měl být mikroskopický stav okrajů začleněn do stagingového systému.

4.10.2

Kontroverzní prognostické faktory

Kontroverznější potenciální prognostické faktory, s konfliktními daty v různých studiích, zahrnují pohlaví [112], kdy v sestavě 128 synoviálních sarkomů bylo nepříznivým faktorem muţské pohlaví, naopak v jiných studiích na sestavě SS [41] pohlaví nebylo nepříznivým prognostickým faktorem; věk [47,112] – s vyšším věkem jako nepříznivým prognostickým faktorem, typ terapie; a dle některých autorů lokalizace nádoru, kdy nádory lokalizované proximálně od loketního nebo kolenního kloubu mají méně příznivou prognózu [8] – vliv lokalizace nádoru můţe souviset s větší velikostí centrálně lokalizovaných nádorů a s obtíţemi dosáhnout negativních resekčních okrajů [112], coţ je v souhlase i se závěry Stojadinovice et al. [109], v jehoţ rozsáhlé sestavě byla pravděpodobnost pozitivních mikroskopických resekčních okrajů vyšší u nádorů hlavy, krku a retroperitonea. Lokalizace v dutině břišní, retroperitoneu a na hlavě a krku byla nepříznivým prognostickým faktorem při univariační analýze [86] souboru 428 maligních fibrózních histiocytomů. Hasegawa et al. [49] vliv mladšího věku a lokalizace na přeţití nezaznamenal. U sarkomů měkkých tkání hlavy a krku byly v recentní studii nejvýznamnější prognostické faktory stav chirurgických okrajů a přítomnost nebo absence metastáz v lymfatických uzlinách [29], které ovlivňovaly celkové přeţití a tumor-specifické přeţití. Kvalita chirurgických okrajů a status lymfatických uzlin v této sestavě nebyl prognostickým faktorem pro bezpříznakový interval.

30 U jednotlivých histologických typů sarkomů měkkých tkání, například u synoviálního sarkomu, byly dále sledovány specifické histologické proměnné, jmenovitě rozsah glandularity, přítomnost kalcifikací nebo osifikací, rozsah hyalinizace, přítomnost nebo absenci ţírných buněk a další [8]. V práci Engellaua et al. [34] byly prognostickými parametry, které korelovaly s lokální recidivou, nekróza, vaskulární invaze a exprese cyklinu A. Nejsilnějším prognostickým indikátorem rozvoje metastatického onemocnění v této studii byla vaskulární invaze, značný význam měly rovněţ typ růstu (infiltrativní versus expanzivní) a z imunohistochemicky sledovaných markerů byla prokázána nezávislá prognostická informace u Ki-67, β-cateninu, CD44 a P-glykoproteinu. Je zajímavé, ţe studie nepotvrdila nezávislou prognostickou hodnotu histologického grade, velikosti nádoru a lokalizace sarkomů končetin a trupu (hluboké versus superficiální).

4.10.3

Grading sarkomů měkkých tkání

V současnosti je histologický grade, jehoţ klíčovou komponentou je histotyp, povaţován za

nejvýznamnější

prognostický

faktor

u

sarkomů

měkkých

tkání

dospělých

[17,20,26,50,52,75]. Základním záměrem gradingových systémů je identifikovat a odlišit tumory s příznivou prognózou od sarkomů se špatnou prognózou, se snahou co nejvíce minimalizovat počet případů, které se vyskytují v neinformativní intermediární kategorii [17]. Za ideálního stavu by ve skupině případů s dobrou prognózou měly být tumory, které mají velmi nízký metastatický potenciál i přes tendenci k lokálním recidivám, zatímco skupina nádorů se špatnou prognózou by měla zahrnovat sarkomy se značným rizikem rozvoje metastatické choroby, u kterých by mohla být adjuvantní terapie spojena s benefitem. Ideální gradingový systém by měl nést maximum prognostických informací, měl by být snadno aplikovatelný a interpersonální variabilita by měla být co nejniţší [28]. Příklady histologických parametrů, uţívaných v gradingových systémech, zahrnují stupeň diferenciace, myxoidní degeneraci, celularitu, vaskulární invazi, nekrózu/pyknózu, mitotickou aktivitu a jaderný pleomorfimus. Pokud jsou tyto histologické parametry testovány multivariačními

analýzami,

mitotická aktivita a nekróza

jsou konzistentně

mezi

nejvýznamnějšími proměnnými [28]. V minulosti byly navrţeny různé systémy pro grading sarkomů měkkých tkání, které se opíraly o histologický typ tumoru, celularitu, nukleární atypie, mitotickou aktivitu, rozsah nekrózy a další parametry. První konzistentní a efektivní prognostická klasifikace sarkomů

31 měkkých tkání byla navrţena Russellem et al. v roce 1977 [96], která zavedla histologický grading aplikovatelný na všechny sarkomy měkkých tkání dospělých. Mezi nejuţívanější gradingové systémy současnosti patří systém navrţený v roce 1984 French Federation of Cancer Centers Sarcoma Group, označovaný jako FNCLCC (Fédération Nationale des Centres de Lutte Contre le Cancer, Francie) a National Cancer Institute (NCI; Bethesda, Maryland, USA) grading [27,36,113]. Jde o třístupňové systémy, oba jsou akceptované Světovou zdravotnickou organizací. Přesná histopatologická klasifikace je základem gradingu sarkomů a je esenciální komponentou NCI i FNCLCC gradingového systému. Část sarkomů měkkých tkání je charakterizována specifickými klinickými rysy a biologickým chováním, které můţe být snadno predikované samotnou histopatologickou klasifikací, jak je ilustrováno skupinou dobře diferencovaného liposarkomu (atypického lipomatózního tumoru), který nemetastazuje, pokud je léčen širokou excizí s prevencí lokální recidivy, jejíţ výskyt je spojen s moţností progrese ve vyšší histologický grade. 4.10.3.1

NCI gradingový systém

NCI gradingový systém navrhl Costa et al. v roce 1984 několik měsíců před FNCLCC gradingovým systémem [27]. Je třístupňový (grade 1 – 3), a člení sarkomy měkkých tkání na nádory s minimálním metastatickým potenciálem, agresivní tumory s dlouhým přeţitím a agresivní sarkomy s krátkým přeţitím. Vychází z histologického typu tumoru, lokalizace a rozsahu nekrózy; rozsah nekrózy je u NCI hodnocen kombinovaně makroskopicky i mikroskopicky; u některých typů nádorů jsou dalšími parametry celularita, mnoţství matrix, cytonukleární pleomorfismus a mitotický index. Jisté histotypy nebo subtypy tumorů měkkých tkání, nezávisle na histologických nálezech, jsou spojené s relativně úzkým spektrem biologického chování, a jsou konzistentně indolentní (grade 1 tumory), nebo konzistentně agresivní (grade 3 tumory), Tabulka 5. Zbývající nádory mají konstantně široké spektrum biologického chování, které není předvídatelné pouze na základě histologického typu tumoru, a v tomto případě určuje stupeň malignity rozsah nekrózy. Léze s minimálním rozsahem nekrózy – do 15 %, jsou kategorizovány do grade 2, kdeţto tumory s rozsahem nekrózy nad 15% jsou označeny grade 3. V tomto gradingovém systému nádory grade 1 recidivují, ale pouze vzácně metastazují, přeţití u tumorů grade 2 je přibliţně 90 % a u grade 3 kolem 50 % [27].

32 Tabulka 5. NCI gradingový systém HISTOLOGICKÝ PARAMETR Histologický typ/subtyp Epiteloidní hemangioendoteliom Dobře diferencovaný liposarkom Myxoidní liposarkom Infantilní fibrosarkom Histologický typ, mitotická aktivita, diferenciace Dobře diferencovaný leiomyosarkom (< 6 mitóz/10 HPF) Dobře diferencovaný fibrosarkom (< 6 mitóz/10 HPF) Maligní tumor periferní nervové pochvy (< 6 mitóz/10 HPF) Extraskeletální myxoidní chondrosarkom (bez mitotické aktivity) Histologický typ, nekróza Jakýkoli sarkom, který není explicitně grade 3 a s méně neţ 15% nekrózou Histologický typ/subtyp Jakýkoli sarkom s více neţ 15% nekrózou Rhabdomyosarkom (všechny subtypy) Extraskeletální osteosarkom Ewingův sarkom/PNET Mezenchymální chondrosarkom Pleomorfní liposarkom Alveolární sarkom měkkých částí

GRADE 1

1

2

3

Zkratky: NCI, National Cancer Institute; HPF, high power field; PNET, primitivní neuroektodermový tumor Podle: Costa J et al. The grading of soft tissue sarcomas. Results of a clinicohistopathologic correlation in a series of 163 cases. Cancer. 1984;53(3):530-41.

4.10.3.2

FNCLCC gradingový systém

FNCLCC gradingový systém vypracovali Trojani et al. [113] a modifikovali ho Gillou et al. [42]. Jde rovněţ o třístupňový gradingový systém, pouţívaný zejména v Evropě. Po analýze různých parametrů bylo vyuţito tří histologických proměnných, které jsou nositelem prognostické informace v multivariační analýze – nádorové diferenciace, mitotické aktivity a rozsahu lezionální nekrózy. Na rozdíl od NCI gradingového schématu je rozsah nekrózy hodnocen mikroskopicky. Těmto třem proměnným jsou přiřazeny hodnoty 1 – 3 pro diferenciaci nádoru a počet mitotických figur; a 0 – 2 pro rozsah nekrózy. Součtem hodnot

33 pro kaţdý parametr je získáno skóre, které určuje histologický grade. Histologický grade 1 je definován výsledným součtem 2 nebo 3; grade 2 součtem 4 nebo 5; a grade 3 součtem 6 – 8 (Tabulka 6). Parametr diferenciace nádoru, které ve skutečnosti reflektuje histologický typ sarkomu a reálnou diferenciaci tumoru, byl modifikován v roce 1997 [42]. V Tabulce 6 jsou diferenciační skóre, která jsou ve FNCLCC připisována běţným typům sarkomů měkkých tkání. Skóre 1 náleţí sarkomům, které jsou ve své morfologii velmi podobné benigním tumorům, například dobře diferencovanému liposarkomu. Skóre 3 je přičítáno nízce diferencovaným sarkomům, sarkomům nejistého histologického typu, synoviálnímu sarkomu, rodině tumorů Ewingova sarkomu, pleomorfnímu rabdomyosarkomu a pleomorfnímu liposarkomu. Ostatní sarkomy, u kterých je jistý histologický typ, jako jsou například myxoidní liposarkom nebo konvenční leiomyosarkom, jsou označeny hodnotou skóre 2. Počet mitóz je získán počítáním mitotických figur v 10 sukcesivních zorných polích při velkém zvětšení (HPF, high-power field) a to v oblastech, které jsou mitoticky nejaktivnější. Jednotlivé případy jsou poté stratifikovány a jsou jim přiřazeny bodové hodnoty 1 při počtu mitotických figur 0 – 9; 2 při počtu 10 – 19; a 3 při počtu mitotických figur větším neţ 19. Při počítání mitotických figur je nutné dodrţovat přesná pravidla, zahrnující adekvátní fixaci tkáně a odběr odpovídajícího počtu tkáňových bloků pro histologické zpracování, který by měl být jeden na kaţdý 1 – 2 cm z největšího rozměru nádoru. Pro určení počtu mitotických figur je dále nutná dobrá kvalita histologických řezů a korektní výběr nejvíce mitoticky aktivních oblastí, ve kterých je nutné realizovat počítání mitotických figur. Je rovněţ nutné provést kalibraci plochy zorného pole při velkém zvětšení, aby odpovídala ploše uţité při první studii (HPF = 0,174 mm2) [113]. Pokud je počet mitotických figur blízký prahu, který odděluje jednotlivé bodové hodnoty, tedy 7 – 9 nebo 17 – 19, je důrazně doporučeno nové počítání. Při výběru oblasti, ve které se počítání provádí, je nutné se vyhnout místům nekrotickým, hypocelulárním nebo ulcerovaným. Rozsah nekrózy by měl být hodnocen jak na úrovni makroskopické, tak mikroskopické. Je nicméně zřejmé, ţe makroskopické posuzování rozsahu nekrózy je velmi málo reprodukovatelné, a vţdy mělo být kontrolováno mikroskopicky. Při stanovení rozsahu nekrózy nejsou brány v úvahu nekrózy se vztahem k předchozím chirurgickým zákrokům, a rovněţ nelze započítávat oblasti hyalinizace. Bodové ohodnocení je 0, pokud není nekróza přítomna; 1, pokud je rozsah nekrózy do 50 % a 2, pokud rozsah nekrózy převyšuje 50 %.

34 Tabulka 6. FNCLCC gradingový systém HISTOLOGICKÝ PARAMETR I. Nádorová diferenciace a) Sarkomy připomínající normální tkáň, např. Dobře diferencovaný liposarkom Dobře diferencovaný fibrosarkom Dobře diferencovaný leiomyosarkom b) Sarkomy jistého histotypu/subtypu, např. Myxoidní liposarkom Maligní tumor periferní nervové pochvy Konvenční fibrosarkom Konvenční angiosarkom c) Sarkomy s nízkou diferenciací/nejistého histotypu Nízce diferencovaný leiomyosarkom Epiteloidní/nízce diferencovaný MPNST Rhabdomyosarkom Synoviální sarkom Kulatobuněčný, dediferencovaný, pleomorfní liposarkom Ewingův sarkom/PNET Extraskeletální osteosarkom Alveolární sarkom měkkých částí Epiteloidní sarkom Jasnobuněčný sarkom Epiteloidní/nízce diferencovaný angiosarkom Mezenchymální chondrosarkom II. Nádorová nekróza (zaloţena na histologickém hodnocení) Ţádná 50% nebo méně Více neţ 50% III. Počet mitóz na 10 HPF (1 HPF = 0,174 mm2) 0–9 10 – 19 20 a více Histologický grade 1 2 3

SKÓRE 1

2

3

0 1 2 1 2 3 Celkové skóre 2,3 4,5 6–8

Zkratky: PNET, primitivní neuroektodermový tumor; HPF, high-power field, mikroskopické pole velkého zvětšení. Podle: Trojani et al. Soft tissue sarcomas of adults: study of pathological prognostic variables and definition of histopathological grading system. Int J Cancer. 1984;33:37–42 a Guillou et al. Comparative study of the National Cancer Institute and French Federation of Cancer Centers Sarcoma Group grading systems in a population of 410 adult patients with soft tissue sarcoma. J Clin Oncol. 1997;15:350-62.

35 Oba systémy, FNCLCC i NCI, byly srovnávány ve studii 410 pacientů [42]. Při univariační analýze oba systémy prokázaly dobrou předpovědní hodnotu v aspektu celkového přeţití a vzdáleného metastázování, nicméně v NCI systému bylo více tumorů v grade 2 kategorii a méně v grade 3 kategorii ve srovnání s FNCLCC systémem. Grade 2 je přitom méně informativní, tumory v této skupině zahrnují případy s dobrou i špatnou prognózou. Multivariační analýza prokázala vyšší hodnotu gradingu dle FNCLCC, který vykazoval poněkud vyšší schopnost předpovědi vzniku vzdálených metastáz a mortality se vztahem k nádorovému onemocnění, prokázal tedy lepší korelaci s celkovým přeţitím. Diskrepance v grade mezi oběma systémy byly pozorovány u 34,6 % případů. Jsou uţívány i další gradingové systémy, 2 aţ 4 stupňové, které jsou obecně podobné NCI a FNCLCC schématům [61]. 4.10.3.3

Prognostický význam gradingu

Prognóza sarkomů měkkých tkání je určena zejména lokální recidivou a vzdálenými metastázami. Sarkomy měkkých tkání lokálně recidivují ve 20 aţ 30 procentech a metastazují ve 30 – 50 % případů [22]. Ve většině studií je nejvýznamnějším parametrem, který předpovídá lokální recidivu, kvalita resekčních okrajů; nicméně i grade je dle některých autorů prognostickým prediktorem rekurence [112]. Histologický grade je však nezávislým prediktivním faktorem pro vývoj metastatické choroby u asi 90% adultních sarkomů měkkých tkání a pro celkové přeţití [17,20], a to nezávisle na typu uţitého systému. Metastatický potenciál sarkomů měkkých tkání v jednotlivých gradingových skupinách je 5 – 10 % u lowgrade lézí, 25 – 30 % u intermediárních lézí a 50 – 60 % u high-grade tumorů. Grade by tak měl být vţdy součástí patologické zprávy u jakéhokoli sarkomu měkkých tkání dospělých. Prognostická síla grade se odráţí i v předpovědi přeţití, kdy například u primárních končetinových lézí je 10-ti leté přeţití (tumor-specifické) u high-grade lézí 55 %, ve srovnání s 90 % u low-grade lézí [15]. Prognostická hodnota gradingu byla studována na souboru 1240 případů sarkomů měkkých tkání [20]. V této studii nebyly nalezeny ţádné významné rozdíly mezi nádory grade 1, 2 nebo 3 u základních histologických typů. Multivariační analýza provedená u kaţdého histologického typu prokázala, ţe grade byl nejvýznamnějším faktorem, který předpovídal metastatické riziko u tzv. maligního fibrózního histiocytomu, neklasifikovaných sarkomů a synoviálních sarkomů. Grade byl druhým nejvýznamnějším prognostickým parametrem u leiomyosarkomů po kostní nebo neurovaskulární invazi, a třetí nejvýznamnější u

36 liposarkomů, kde následoval po velikosti nádoru a histologickém subtypu. Grade neměl ţádný prognostický význam u maligních tumorů periferní nervové pochvy, ani u rabdomyosarkomů, nicméně u této skupiny pacientů multivariační analýza neposkytla ţádný prognostický faktor. Dále nebyl hodnotný u sarkomů dětského věku, a jeho uţitečnost nebyla prokázána ani u angiosarkomů,

extraskeletálních myxoidních

chondrosarkomů,

alveolárních sarkomů

měkkých částí, světlobuněčných a epiteloidních sarkomů. Naopak Hashimoto et al. [51] nenalezl ţádný jednotlivý univerzální prognostický parametr, který by byl aplikovatelný na všechny typy sarkomů měkkých tkání. Například mitózy jsou typicky velmi vzácné u kulatobuněčného liposarkomu, alveolárního sarkomu měkkých tkání nebo světlobuněčného sarkomu, které většinou metastazují, naproti tomu jsou obvykle četné u infantilního fibrosarkomu, který metastazuje velmi vzácně. Ve studii na 70 myxofibrosarkomech [74] grading (FNCLCC) ani staging nebyly nezávislé prognostické prediktory. Prediktorem lokální rekurence byly pouze pozitivní chirurgické okraje. Při multivariační analýze byly nezávislými nepříznivými parametry tumor specifického přeţití pozitivní okraje a počet mitotických figur (≥ 20/HPF), coţ je dosti ojedinělé, neboť silná asociace mezi stavem chirurgických okrajů a přeţitím je u jiných běţných typů sarkomů vzácně pozorována. Přeţití bez metastázy nezávisle korelovalo s nekrózou, počtem mitotických figur a pozitivními okraji. V této sestavě neměla prognostický význam ani predominující myxoidní histologie, ani hluboká lokalizace. V podobném duchu byly závěry Huanga et al. [56], který v sestavě low-grade fibrosarkomů nenašel signifikantně lepší přeţití bez metastázy a tumor-specifickou mortalitu mezi skupinou G1 a G2 podle FNCLCC gradingového systému. Na rozdíl od předchozí sestavy počet mitotických figur nebyl statisticky významným parametrem špatné prognózy, s kterou korelovala pouze přítomnost nádorové nekrózy (> 10 %), velikost tumoru a rozsah myxoidní komponenty menší neţ 75 %. Grading není pouze statisticky signifikantní prognostický faktor v univariačních analýzách [86], ale často předčí i jiné parametry v multivariačních analýzách [28], kdy zůstává nejsilnějším prognostickým parametrem přeţití [59,61]. Nejhodnotnější parametry v nádorovém gradingu jsou nekróza a mitotická aktivita [17]. Grading tvoří centrální a nezbytnou součást základních klinických stagingových systémů pro sarkomy [96], a je onkology povaţován za absolutní nezbytnost pro klinická rozhodnutí, kdy grade přispívá k terapeutickým volbám tím, ţe umoţňuje efektivní uţití chemoterapie, na

37 niţ lépe reagují grade 3 tumory neţ grade 1 tumory. U grade 1 nádorů by chemoterapie neměla být uţívána [22,127]. 4.10.3.4

Kontroverzní body gradingu a jeho limitace

Stejně jako jiné systémy, i FNCLCC gradingový systém má určitá omezení, která byla v literatuře poměrně jasně vymezena [43]. Nejvíce kontroverzním parametrem celého systému je diferenciace, ve které se ve skutečnosti prolíná histologický typ sarkomu a reálná diferenciace tumoru, a který byl upraven v roce 1997 [42]. Hodnocení stupně diferenciace u tumorů je velmi subjektivní, navíc hodnocení diferenciace u tumorů, které nemají definovaný normální tkáňový ekvivalent, jako je synoviální sarkom nebo epiteloidní sarkom, není samozřejmě moţné. V důsledku značné diverzity typů a subtypů nádorů měkkých tkání je značná diskrepance typingu lézí měkkých tkání i mezi zkušenými patology [17] a je nutné vést v patrnosti, ţe u ţádného gradingového schématu nelze opustit přesnou diagnózu. Léze, jako je atypický fibroxantom, celulární schwannom nebo ischemická fasciitis, mohou mylně zapadnout do kategorie agresivních sarkomů. Jednou z nejvýznamnějších proměnných, které ovlivňují histologický grading, je histologický typ. Je tedy neoddiskutovatelné, ţe histologický typ je základní determinantou, která určuje grade a určení histologického typu tumoru je pro grading zcela kritické [50]. Výstiţným příkladem je subtypizace liposarkomu. Jeho dobře diferencovaná varianta, pokud je adekvátně široce exstirpována, nemetastazuje, a je proto definičně nízce maligní. Oproti tomu kulatobuněčný liposarkom má obecně prognózu vysoce maligního sarkomu, i přes častou absenci nekrózy nebo signifikantní mitotické aktivity. Příslušná hodnota grade a histologického typu je i jinak problémovou oblastí. Grading je aplikován na sarkomy jako celou skupinu, protoţe klinické a prognostické studie v naprosté většině zahrnují směs histologicky různorodých lézí. Ideální by bylo histotypově specifické klinicko-patologické studium sarkomů, ale v důsledku vzácnosti maligních mezenchymálních tumorů je studium velkých souborů jednotlivých nádorových typů problematické [38]. Někteří autoři tak předpokládají, ţe unifikovaný gradingový systém nelze uţívat u různých typů sarkomů, neboť jeho prognostická hodnota se mění podle histologického typu a domnívají se, ţe namísto generalizace by měl být gradingový systém adaptován pro kaţdý histologický typ ve formě multicentrických studií [8], coţ je nicméně vzhledem k počtu histologických typů sarkomů měkkých tkání pro rutinní praxi velmi málo pouţitelné.

38 Dalším kontroverzním bodem je typ bioptického vzorku, na kterém je moţné grading provádět. Přirozeně se vyskytující intralezionální heterogenita implikuje moţné významné riziko odběru a vyšetření nereprezentativních oblastí nádoru (sampling error), zvláště pokud je mnoţství vyšetřované nádorové tkáně limitované. V současné době je ve velkých centrech v předléčebné diagnostice preferováno pouţívání biopsií silnou jehlou, coţ podle některých autorů umoţňuje určení histotypu a grade v 80 % případů [18] a moderní strategie v diagnostice a léčbě sarkomů tak vedou k tomu, ţe jsou léčeny tumory nejistého histotypu, s gradingem na stále menších a menších bioptických preparátech před uţitím neoadjuvantní terapie [17]. Diagnózy na základě biopsií silnou jehlou nebo dokonce FNAB jsou stále populárnějším trendem, ale limitovaný objem tkáně můţe činit subklasifikaci sarkomů a grading obtíţný, protoţe např. hodnocení takových parametrů, jako je rozsah nádorové nekrózy, je vysoce závislé na rozsahu samplingu, a stanovení histologického grade je často na těchto vzorcích nespolehlivé, pokud není přítomen evidentní vysoce maligní tumor [38]. Velmi ţádoucí by byly standardní protokoly pro diagnostiku sarkomů měkkých tkání s ohledem na optimální vzorek pro patologickou analýzu [15]. Mělo by být uvaţováno častější uţití iniciálních otevřených biopsií pro zvýšení ne pouze diagnostické/gradingové přesnosti, ale i pro získání tkáně pro cytogenetická vyšetření a okamţité hluboké zmraţení pro budoucí studie, nejlépe multicentrické pro relativní vzácnost sarkomů měkkých tkání. Alterace v důsledku neoadjuvantní chemoterapie nebo radioterapie vedou často k nemoţnosti smysluplného patologického hodnocení resekčních preparátů. Grading by měl být stanoven u neléčených nádorů, neboť radioterapie a/nebo chemoterapie mohou zvýšit rozsah nekrózy, a sníţit mitotickou aktivitu, nebo dokonce změnou klonality v rámci heterogenity nádorové populace ovlivnit i histotypizaci tumoru. Je rovněţ obtíţné aplikovat grading u recidivujících tumorů [18]. Určité parametry některých gradingových systémů, například celularita nebo jaderný pleomorfismus, jsou tak subjektivní, ţe nejsou v podstatě efektivně pouţitelné. Dokonce i u objektivnějších parametrů je značná interpersonální variabilita, při určování stupně diferenciace, rozsahu nekrózy a mitotické aktivity je dosahováno ne více neţ 60 – 70% shody i mezi specialisty [17]. Mitotická aktivita a celularita jsou značně ovlivňovány sampling errorem, tkáňovou fixací, přítomností nekrózy, tloušťkou řezů a plochou zorného pole mikroskopu. Pro hodnocení mitotické aktivity, velmi významné dle značného počtu studií, musí být tkáňové vzorky nádoru adekvátně fixovány, je nutné korektní rozpoznávání mitotických figur, které nelze zaměňovat za jiné formace (apoptotická tělíska, pyknotická

39 jádra, mastocyty, apod.), a jejich rozlišování prakticky garantuje určitý stupeň interpersonální variability. Je nutné selektovat oblast preparátu s vysokou celularitou a s nejvyšším počtem mitotických figur [50], neboť faktory, jako je celularita a velikost buněk mají přímý vliv na počet mitotických figur [42], a počet samozřejmě kolísá i v rámci jedné léze – uplatňuje se tedy opět interlezionální heterogenita. Počítání mitotických figur měří nejkratší periodu proliferující nádorové buněčné populace [25]. V různých gradingových systémech hodnoty oddělující gradingové stupně/skóre kolísají od < 1 na 10 HPF, 1 – 5/10 HPF, a více neţ 5/10 HPF, u jiných je to do 9 mitotických figur na 10 HPF, 10 – 19 a více neţ 20 mitotických figur na 10 HPF včetně. Nekróza je základní komponentou některých gradingových systémů, předpovídá čas do recidivy, a pokud je přítomna ve větším rozsahu, koreluje se špatnou prognózou celkového přeţití [17]. Není nicméně jasné, zda pouhá přítomnost nebo rozsah jsou prognosticky významné. Prahová procenta, separující stupně v různých gradingových systémech mají vzácně identickou hodnotu, a některé studie prokázaly, ţe rozsah nekrózy nemá vliv, kdy pouhá přítomnost jakéhokoli nekrotického loţiska jakékoli velikosti je prognosticky nepříznivé [45,117]. Podobně není dosud vyjasněno, jakým způsobem hodnotit rozsah nekrózy, zda makroskopicky či mikroskopicky. V současnosti mnoho patologů nekrózu makroskopicky nehodnotí z důvodu špatné odlišitelnosti od oblastí myxoidních změn nebo stromálních hemoragií. Navíc přesné makroskopické hodnocení nekrózy,

zejména

v gradingových systémech, které se pokouší o kvantitativní vyjádření tohoto parametru, vyţaduje vyšetření celého tumoru. To činí retrospektivní hodnocení nemoţné a vylučuje grading v podmínkách expertních konzultací. Oproti tomu mikroskopické hodnocení nekrózy je reprodukovatelnější, nicméně má i svoje nedostatky. Při selekci bloků pro histologické vyšetření je tendence vyhnout se nekrotickým oblastem, proto histologická skla téměř vţdy podhodnocují tento parametr. Často není moţné produkovat smysluplný spolehlivý histologický grade z resekčních preparátů v centrech, kde jsou předoperační radioterapie a neoadjuvantní chemoterapie standardem [89]. Tyto procedury alterují mitotickou aktivitu, indukují nádorovou nekrózu a dokonce mění stupeň nádorové diferenciace, ale předoperační biopsie prováděné v těchto centrech často poskytují insuficientní materiál pro spolehlivé stanovení histologického grade. Samozřejmě neexistují ţádné spolehlivé prostředky, makroskopické nebo mikroskopické, které by umoţnily rozlišit terapií indukovanou nekrózu od spontánní [16].

40 Grading samozřejmě nerozlišuje benigní a maligní tumory, a před vlastním hodnocením je nutná jistota, ţe se jedná o skutečný sarkom měkkých tkání, nikoli o pseudosarkomatózní lézi nebo metaplastický karcinom, lymfom nebo melanom. Grading rovněţ není aplikovatelný na všechny sarkomy. Byla prokázána jeho uţitečnost u sarkomů měkkých tkání, nikoli ovšem u sarkomů trávicího traktu nebo ţenského genitálního traktu [22,50]. Histologický grade není spolehlivý prognostický faktor u maligního tumoru periferní nervové pochvy, dětských tumorů, a rovněţ není uţitečný v případě angiosarkomu, alveolárního sarkomu měkkých částí, extraskeletálního myxoidního chondrosarkomu, sarkomu z jasných buněk a epiteloidního sarkomu. Nikoli nezanedbatelným problémem je i současné uţívání několika gradingových systémů, většinou třístupňových, ale jsou rovněţ 2 nebo 4 stupňové systémy [28], s různými histologickými parametry, kterým je přiřazován různý význam. Grade tak není bezprostředně komparovatelné. Nicméně navzdory všem těmto omezením, histologický grading je dobrý prognostický indikátor,

předpovídající pravděpodobnost

vzdálených

metastáz

a

celkové

přeţití

[20,21,51,76,113]. Nádory, u nichţ histologický grade nemá výpovědní hodnotu, tvoří méně neţ 10 % všech adultních sarkomů měkkých tkání [22]. Je zvláště pouţitelný u nádorů, které nemají histotypově specifické chování, u novějších nádorových jednotek s nejistým klinickým průběhem, neklasifikovatelných lézí a u lézí s diagnostickými neshodami. 4.10.3.5

Reproducibilita gradingu sarkomů měkkých tkání

Test reprodukovatelnosti FNCLCC systému [21] prokázal, ţe interpersonální hodnocení histologického grade bylo reprodukovatelnější neţ diagnóza histologického typu. Shoda v hodnocení nádorové nekrózy byla 81 %, v hodnocení mitotické aktivity 73 %. Souhlas při stanovení histologického grade byl 75 %, coţ je významně lepší neţ hodnocení histologického typu, kde bylo dosaţeno souhlasu 61 %. Rozdíly v hodnocení mitotické aktivity mohou mít podklad v subjektivním výběru mitoticky nejaktivnějších oblastí, ve kterých je nutné evaluaci realizovat. Nejvýraznější neshody v aspektu hodnocení nekrózy se týkaly identifikace nekrózy, coţ můţe být eliminováno precizní definicí nekrózy. Obecně, interpersonální variabilita můţe být redukována vylepšenou definicí parametrů, nebo uţitím morfometrie [28].

41

4.10.4

Molekulární prognostické markery

Histologické gradingové metody jsou nutně subjektivní, zatíţené určitou chybou, a proto jsou stále hledána objektivnější kritéria agresivity sarkomů měkkých tkání, se sledováním celé řady dalších parametrů, jako je například DNA ploidita [93], nebo imunohistochemicky detekovaná exprese molekulárních markerů, které mají vztah k buněčnému cyklu, či se jedná o nejrůznější regulační nebo strukturální proteiny, například p53 [6,105], mdm-2 [103], exprese matrix metaloproteináz [11], EGFR [6,99], receptoru pro růstový faktor podobný inzulinu typu 1 [1], β-kateninu a cyklinu D1 [98], bcl-2 [129] nebo proliferačních markerů Ki67 a PCNA [28,46,47,90], popřípadě jde o markery určované metodami molekulární biologie [63,89]. Výčet potenciálních molekulárních prognostických indikátorů je v Tabulce 7. Tyto recentnější metody redukují míru subjektivity, nicméně objevuje se problém interlaboratorní variability, kdy výsledky závisí na typu pouţitých metod. DNA ploidita má prognostickou hodnotu v různých typech epiteliálních tumorů a rovněţ u osteogenních a chondrogenních sarkomů [93]. Z některých studií vyplývá, ţe benigní tumory měkkých tkání jsou převáţně diploidní [69], zatímco sarkomy jsou diploidní nebo aneuploidní, a aneuploidní obsah DNA je častější v high-grade sarkomech. Byl studován vztah obsahu DNA měřené průtokovou cytometrií k prognóze, a některé práce dokazují, ţe adultní sarkomy měkkých tkání s DNA aneuploidním obsahem mají horší prognózu [2]. Jiné práce ovšem vliv DNA ploidity na vyhlídku pacientů nepotvrdily [93], i kdyţ autoři naznačují, ţe S-fáze frakce můţe být prognostickým faktorem, kdy S-fáze frakce ≥ 4 % byla spojena se signifikantním sníţením celkového přeţití [23]. Byl rovněţ studován vztah exprese specifických genů s předpokládanou spojitostí s metastazováním [73], u osteosarkomů a hladkosvalových gastrointestinálních tumorů, kdy ve druhém případě byla nalezena negativní korelace mezi expresí nm23 a přeţitím. U osteosarkomů byla nalezena exprese nm23 u 49 % případů, a nebyl prokázán statistický rozdíl mezi expresí nm23 a časným metastazováním. Role nm23 u sarkomů jako supresoru metastázování není tedy zcela jasná. V současnosti je nejen u sarkomů měkkých tkání pozornost zaměřena na nádorovou neoangiogenezi a faktory ji regulující, jako jeden ze základních patofyziologických procesů, umoţňující vývoj nádoru včetně jeho růstu a vzdáleného metastázování, a které by mohly být předmětem cílené terapie [15,18]. Sarkomy měkkých tkání exprimují vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF), který je velmi účinným promotorem angiogeneze. Účinnost VEGF neutralizující protilátky (bevacizumab) u jiných nádorů je příslibem moţnosti blokování

42 angiogeneze rovněţ u sarkomů. Ve sporadicky se objevujících textech nebyl prognostický význam kapilární hustoty u sarkomů měkkých tkání prokázán [121]. Dalším tématem, které lze přiřadit k tématu prognostických molekulárních parametrů, je predikce odpovědi na terapii, tedy určení chemorezistence a chemosenzitivity [131]. Zde se mohou uplatnit i prognostické faktory z kategorie proliferačních parametrů, jako je proliferační index, mitotická aktivita, zvýšená exprese regulátorů buněčného cyklu, jako je zvýšená exprese cyklinu D1. Prediktorem terapeutické odpovědi můţe být rovněţ exprese P-glykoproteinu (Pgp), která byla rovněţ identifikována jako poskytující nezávislou prognostickou informaci [34]. Tabulka 7: Potenciální molekulární prognostické markery sarkomů měkkých tkání MOLEKULÁRNÍ MARKER p53 pRB PDGFR α c-KIT Fem1a genový produkt Osteopontin Ezrin WT1 Receptor pro inzulinu podobný růstový faktor typu 1 Vaskulární endoteliální růstový faktor CD44 Ki-67 β-catenin mdm-2 p16 p19ARF Cyklin D1 Pgp PCNA

FUNKCE produkt tumor supresorového genu produkt tumor supresorového genu receptor pro destičkový růstový faktor, reguluje buněčnou proliferaci, diferenciaci, role v onkogenezi CD117, receptor pro cytokiny, hraje roli při vzniku některých nádorů plní funkce v apoptotických drahách adhezní protein extracelulární matrix komponenta cytoskeletu, účast při metastazování gen Wilmsova tumoru, role při proliferaci a diferenciaci buněk role při proliferaci a diferenciaci buněk

role při proliferaci a diferenciaci buněk adhezní molekula jaderný protein spojený s proliferací buněk protein buněčných signálních drah protein inaktivující p53 regulace RB tumor supresorové dráhy účast v buněčných signálních drahách regulace buněčného cyklu membránový transportní protein účast v buněčné proliferaci

Podle Kotilingam D, Lev DC, Lazar AJ et al. Staging soft tissue sarcoma: evolution and change. CA Cancer J Clin. 2006;56:282-91.

43

Několik prací se zabývá adhezní molekulou CD44 a jejími variantami, které vznikají alternativním sestřihem. Kahara et al. [60] dokumentuje významné rozdíly v přeţití bez metastázy, kdy skupina pacientů s CD44v6 negativními sarkomy měkkých tkání vykazovala signifikantně delší přeţití neţ případy CD44v6 pozitivní. Naopak v další studii [77] byla nízká exprese CD44v6 detekovaná imunohistochemicky asociována se zkráceným přeţitím, ale vyšší obsah CD44 obecně i CD44v6 předpovídala vyšší riziko lokální recidivy. U synoviálních sarkomů [107] nebyla korelace exprese CD44 s prognózou prokázána. Další studovanou molekulou je β-catenin, součást cadherinového adhezního buněčného systému, jehoţ nukleární exprese v sestavě 44 synoviálních sarkomů byla spojena s nepříznivou prognózou [49], nicméně nebyl nezávislým prognostickým faktorem při multivariační analýze. Ojedinělé jsou práce studující vztah dalších adhezních molekul, intergrinů a receptoru pro laminin k prognóze [13], kdy Benassi et al. našel pozitivní vzah exprese receptoru pro laminin s výskytem metastáz. Dle některých prací je prognosticky nepříznivým jevem u sarkomů měkkých tkání rovněţ amplifikace onkogenu c-MYC [9]. Mezi další kontroverzní molekulární prognostické markery patří například typ SYT-SSX fúzního transkriptu u synoviálních sarkomů, kdy Kawai et al [63] a Nilsson et al [83] našli vztah mezi SYT-SSX1 fúzním transkriptem a zkráceným přeţitím bez rozvoje metastatické choroby, pacienti se SYT-SSX2 fúzním transkriptem měli přeţití bez metastázy delší. Kromě toho Kawai demonstroval, ţe všechny případy synoviálního sarkomu v jeho sestavě s fúzí SYT-SSX1 byly bifázické, zatímco případy s fúzí SYT-SSX2 monofázické; tedy typ fúze ţe determinuje morfologii synoviálního sarkomu. Nicméně další studie [41] tyto nálezy zpochybnily. Podobně konfliktní data produkují studie potenciálního prognostického významu typu I fúzního genu EWS-FLI1 u rodiny tumorů Ewingova sarkomu/primitivního neuroektodermového tumoru [89]. Kontrastující výsledky různých retrospektivních studií prognostického významu translokací mohou být vysvětleny moţností různých selekčních bias,

modifikací různými terapeutickými přístupy, různou velikostí a

odborností

terapeutických center. Zdrojem variací mohou být i různé laboratorní metodiky detekce fúzních genů u jednotlivých studií, kdy výsledky nebyly konfirmovány v nezávislých laboratořích. [83]. Dalším zdrojem diskrepancí mohou být odlišné metody statistické analýzy. Podobně byl studován vztah aktivity telomerázy a exprese reverzní transkriptázy telomerázy (telomerase reverse transkriptase) uţitím RT-PCR u benigních a maligních

44 měkkotkáňových lézí, a aktivita telomerázy nebyla detekována v benigních tumorech, low- a intermediate grade sarkomech měkkých tkáních, ale pouze v 50 % high-grade sarkomů měkkých tkáních [124]. Aktivita telomerázy tak podle autorů není ani spolehlivým markerem rozlišujícím reaktivní či benigní léze od maligních, ani není kritériem agresivity tumoru. Leiomyosarkomy a storiformní/pleomorfní maligní fibrózní histiocytomy vzácně vykazovaly aktivitu telomerázy, nezávisle na jejich grade.

4.11 Bližší charakteristika vybraných imunohistochemicky detekovaných antigenů s možným vztahem k prognóze sarkomů měkkých tkání 4.11.1

Ki-67

Ki-67 je s proliferací asociovaný jaderný a nukleolární protein, jehoţ exprese v jádře je velmi těsně vázaná s buněčným cyklem. Exprese počíná ve střední části G1 fáze, její hladiny se zvyšují během S a G2 fáze, a dosahují vrcholu v M fázi [37]. Antigen je detekovatelný ve většině proliferujících buněk, tedy v buňkách v G2 fázi a v M fázi buněčného cyklu, a v jádrech mnoha buněk v G1 fázi. Na konci M fáze je protein rozpoznávaný protilátkou Ki-67 velmi rychle katabolizován. V G0 fázi není protein Ki-67 v jádře exprimován. V modelových systémech byla nalezena dobrá korelace mezi detekovatelnou expresí Ki-67 a růstovou frakcí [78,101]. Výhodou je rovněţ absence exprese Ki-67 při DNA reparačních procesech, na rozdíl od jiných molekul asociovaných s buněčným cyklem, například PCNA. Exkluzivní exprese v proliferujících buňkách tvoří z protilátek proti Ki-67 proteinu neocenitelný nástroj v hodnocení buněčné proliferace ve výzkumu nádorových chorob, a jejich uţití jako prognostického markeru u různých typů malignit je jiţ etablováno, nebo je v současnosti diskutováno [33]. Funkce Ki-67 je dosud nejasná, ale můţe představovat strukturální protein, který udrţuje vysoce organizovanou strukturu DNA během mitózy [33,100], a jeho nutnost pro buněčnou proliferaci byla potvrzena inkubací buněk s antisense nukleotidy namířenými proti cDNA Ki-67 proteinu. Měření buněčné proliferace určované morfologicky mitotickou aktivitou, která je komponentou

současných

nejrozšířenějších

gradingových

systémů,

je

nezávislým

prognostickým parametrem, ale její hodnota je limitována nízkou reprodukovatelností

45 v důsledku interpretačních obtíţí a metodologických rozdílů [59]. Jiţ na začátku devadesátých let se objevily práce, které dokumentovaly pozitivní korelaci imunohistochemicky detekované exprese proliferačního antigenu Ki-67 s počtem mitotických figur a histologickým grade u sarkomů měkkých tkání [115]. Později četní autoři pouţili Ki-67 proliferační index jako excelentní indikátor buněčné proliferace, který by mohl doplnit nebo nahradit počítání mitotických figur [46,47,48,50]. U sarkomů měkkých tkání Ki-67 proliferační index dobře koreluje s počtem mitotických figur. Pro hodnocení jsou vybírány oblasti s nejvyšším počtem pozitivních jader, které jsou hodnoceny při velkém zvětšení (400x), nebo lze zhotovit mikrofotografie vybraných oblastí histologického preparátu a pomocí osobního počítače a prostého programu analýzy obrazu provést výpočet Ki-67 proliferačního indexu. Zvýšený proliferační index byl u různých tumorů včetně sarkomů asociován s nádorovou progresí a špatnou prognózou [59], byl nalezen vztah mezi vysokým proliferačním indexem, histologickým grade a redukcí přeţití [30]. Asociace Ki-67 s prognózou u sarkomů měkkých tkání byla nalezena v několika nezávislých studiích [30,53]. Ve studii Heslina et al. [53] Ki67 skóre bylo signifikantním faktorem prognózy v univariační i multivariační analýze pro vzdálené metastázy a nádorovou mortalitu u high-grade končetinových sarkomů měkkých tkání. Tateishi et al. [110] pouţil navrhovaný MIB-1 gradingový systém na souboru 50 myxoidních a kulatobuněčných liposarkomů, kdy modifikoval FNCLCC gradingový systém náhradou počtu mitotických figur, a při proliferačním indexu (PI) 0 – 9 % přisoudil nádoru skóre 1, při PI 10 – 29 % skóre 2 a při PI 30 % a více skóre 3. Při multivariační analýze bylo takto modifikované gradingové schéma nejvýznamnějším prognosticky nepříznivým faktorem, s významnou předpovědí celkového přeţití.

4.11.2

p53

TP53 tumor supresorový gen, lokalizovaný na chromozomu 17, se účastní regulace buněčného cyklu a suprese vzniku nádorů, jeho produkt má funkce sekvenčně specifického transkripčního faktoru, a hraje roli v regulaci genů, které podporují zástavu buněčného cyklu a apoptózu v odpovědi na buněčný stres [58], zabraňuje vstupu buněk s defektní DNA do buněčného cyklu [71,72,126] a udrţuje tak integritu genomu. Poškození DNA má za následek zvýšenou syntézu p53 proteinu, a jeho zvýšené mnoţství vede k zástavě buněčného cyklu v G1 fázi, coţ umoţňuje buňce reparovat poškození DNA nebo iniciovat apoptózu, coţ zabraňuje akumulaci mutací. Specifická odpověď na buněčný stres je závislá na funkčním stavu pRb [58]. U pRb kompetentních buněk p53 indukuje zástavu buněčného cyklu v G1

46 fázi, zatímco u pRb deficientní buňky buněčný cyklus progreduje přes G1 kontrolní bod a buňka podléhá p53-dependentní apoptóze. Nemutovaná („wild-type“) forma p53 proteinu má krátký biologický poločas, a není ve tkáních imunohistochemicky detekovatelná. Inaktivace tumor supresorové aktivity p53 je téměř univerzální událost ve vývoji humánních malignit [71], při výzkumu humánních nádorů, vycházejících z více neţ 50 buněčných a tkáňových typů, jich více neţ 50 % z nich nese mutace v genu TP53 [58]. Změny funkce p53 mohou nastat různým mechanismem, mohou být následkem mutace s nebo bez delece druhé alely (ztráta heterozygozity), vazby na různé proteiny, včetně virových, vyloučení z jádra nebo neregulované degradace [122]. Mutace nebo jiné změny proteinu p53 vedou ke ztrátě schopnosti specifické vazby na DNA [71]. Většina změn v p53 a jeho drahách vedou k produkci stabilního proteinu p53, který se akumuluje v buňkách a je imunohistochemicky detekovatelný. Při mutaci genu TP53 nebo při jeho inaktivaci produkty onkogenů, jako je mdm-2, dochází k nekontrolované proliferaci buněk s poškozenou DNA, které jsou geneticky méně stabilní, s akumulací mutací, a chromozomálních rearanţí, coţ vede k rychlé selekci maligních klonů. Mutace genu TP53 byly popsány v různých karcinomech a sarkomech, ačkoli jejich přesná role v karcinogenezi není známa. Mutace v genu TP53, nebo imunohistochemicky detekovatelná akumulace p53, byly asociovány s vyšším grade maligních nádorů a nepříznivou prognózou u některých nádorů. Würl et al. [123] testoval na souboru 198 sarkomů měkkých tkání 5 protilátek proti p53, mezi nimi i DO-1, rozpoznávající N-terminus molekuly p53, a zaznamenal pozitivitu v rozsahu 36,2 – 62,6 %. V jeho práci pouze protilátky s epitopem na N-konci molekuly p53 (DO-1 a DO-7) vykazovaly multivariační korelaci s přeţitím. Ve studii na sarkomech dělohy byla overexprese p53 nalezena u 63 % sarkomů, respektive 48 % high-grade leiomyosarkomů, a korelovala s celkovým přeţitím [6,65]. Imunohistochemicky detekovaná akumulace p53 měla signifikantní vztah ke stadiu nádorového onemocnění a mitotickému indexu. Rovněţ u Ewingova sarkomu byla nalezena korelace mezi expresí p53, kdy byl stanoven práh pro hodnocení tumoru jako p53 pozitivní 2,3 % zbarvených jader nádorových buněk a relapsem choroby [4]. U některých maligních nádorů byla nalezena korelace mezi expresí p53 a Ki-67 [30,59], ve studii Drobnjaka a kolegů byla rovněţ pozorována významná korelace mezi expresí p53 a grade a velikostí tumoru, s redukcí přeţití u p53 pozitivních tumorů. Schneider-Stock et al. [105] pozorovali p53 pozitivitu u 21 % liposarkomů. Současně v této sestavě alterace TP53 a vysoký proliferační index korelovaly signifikantně

47 s redukovaným celkovým přeţitím. Alterace TP53 genu, sledované pomocí imunohistochemie s overexpresí p53 proteinu, byly významně častěji pozorovány u kulatobuněčné komponenty myxoidních/kulatobuněčných liposarkomů, jejíţ přítomnost je spojena s horší prognózou pacienta [87]. V sestavě 34 synoviálních sarkomů byly nalezeny missense mutace TP53 u 2 případů (5,9 %) a imunopozitivita p53 u 10 případů (29,4 %) z 34 [104]. Nebyla nalezena ţádná významná korelace mezi alterací TP53 genu a histologickým subtypem synoviálního sarkomu, věkem, pohlavím, nebo velikostí nádoru. Při multivariační analýze TP53 alterace a velikost nádoru byly nezávislými prognostickými faktory. Oda et al. [85] na sestavě 49 případů synoviálních sarkomů hodnotil imunohistochemicky expresi p53 proteinu, mdm-2 a p21, a sledoval proliferační aktivitu pomocí monoklonální protilátky MIB-1. Jadernou akumulaci p53 proteinu prokázal u 11 případů (24 %). Nenašel korelaci mezi p53 pozitivitou a alterací genu TP53, hodnocenou pomocí PCR. Případy s pozitivním p53 měly tendenci k horší prognóze, rozdíl ale nebyl statisticky významný. V recentní studii na různých typech sarkomů měkkých tkání [97] byla exprese p53 pozorována u 32,2 % případů a byla asociována s vyšším histologickým grade. Oproti výše zmíněným studiím, Nakanishi et al. [80] korelaci mezi expresí p53 a přeţitím pacientů se sarkomy měkkých tkání ve studii na 70 případech nepotvrdil při pozitivitě 44 % případů sarkomů.

4.11.3

mdm-2

MDM-2 (murine double minute 2) onkogen byl původně identifikován jako dominantní transformující onkogen přítomný na „mouse double minute“ chromozomu [71]. U lidí je mapován na chromozom 12 a kóduje protein, který váţe a inaktivuje produkt genu TP53 a tak zabraňuje p53-dependentní zástavě buněčného cyklu nebo apoptóze [130]. Kromě přímé interakce proteinu p53 a mdm-2 s tvorbou komplexu, p53 kontroluje transkripční aktivitu MDM-2 s následnou autoregulační zpětnou vazbou [88]. Overexprese mdm-2 proteinu má za následek inaktivaci nemutované formy p53 proteinu, s biologicky ekvivalentním efektem, jako jsou mutace genu TP53 [24]. Poruchy v jemně regulované rovnováze mezi p53 a mdm-2 mohou mít za následek nekontrolovatelnou buněčnou proliferaci. Protein mdm-2 má rovněţ vazebné místo pro pRb protein; při vazbě dochází potlačování regulačních funkcí pRb proteinu [25]. Overexprese genu MDM-2 můţe být následek genové amplifikace, ale ne vţdy MDM-2 amplifikace koreluje s jeho imunohistochemicky detekovanou akumulací [24].

48 Koexprese p53 a mdm-2 proteinu podle některých studií má negativní dopad na prognózu pacienta se sarkomem měkkých tkání [24]. Overexprese mdm-2 byla nalezena u 60 % sarkomů dělohy, bez signifikantního vztahu k celkovému přeţití [65]. U synoviálních sarkomů byla popsána imunoreaktivita ve 38,8 % [85], přičemţ exprese mdm-2 byla ve významné korelaci s pozitivitou p53 proteinu, a v této studii nebyl nalezen vztah mezi expresí mdm-2 a prognózou. Naopak v jiné studii [97] na různých typech sarkomů měkkých tkání byla nalezena mdm-2 overexprese u 11,8 % případů, a nebyl nalezen vztah k histologickému grade. Yoo et al. [126] popsal overexpresi mdm-2 u 24 % sarkomů měkkých tkání, se signifikantní korelací s histologickým grade sarkomu.

4.11.4

Cyklin D1

Buněčná proliferace implikuje pravidelnou progresi buněčného cyklu, který je kontrolován proteinovými komplexy, tvořenými cykliny a cyklin-dependentními kinázami (Cdk) [25,66], kde cyklin má funkci regulační molekuly a Cdk tvoří katalytickou podjednotku. Jejich regulační funkce je realizována fosforylací klíčových elementů buněčného cyklu, jako je například retinoblastomový protein (pRb). G1 cykliny zahrnují členy rodiny D cyklinů (cyklin D1 – D3), cyklin E a cyklin A. Cykliny D se váţí na Cdk4 a Cdk6, zatímco cyklin E a A jsou asociovány s Cdk2. Fosforylace pRb těmito komplexy vede k aktivaci různých transkripčních faktorů, a je povaţována za základní událost přechodu z G1 do S fáze buněčného cyklu [58]. Gen pro cyklin D1 (CCND1), lokalizovaný na chromozomu 11, byl první gen rodiny cyklinů, u kterého byla popsána jeho účast při maligní transformaci, kdy byla pozorována jeho častá amplifikace u karcinomů prsu [25]. Dále byla amplifikace CCND1 a nebo overexprese cyklinu D1 pozorována u různých tumorů, kromě karcinomů prsu, plic i u ezofageálních a kolorektálních karcinomů, a dále B-lymfomů. Byla popsána asociace mezi overexpresí cyklinu D1 a špatnou prognózou u sarkomů měkkých tkání [66], kdy imunohistochemicky detekovaná overexprese cyklinu D1 byla v signifikantní korelaci s vysokým histologickým grade končetinových sarkomů měkkých tkání a při multivariační analýze byla overexprese cyklinu D1 signifikantně asociována s horším celkovým přeţitím v celé sestavě i v subsetu high-grade lézí. Studie tedy naznačují, ţe amplifikace genu pro cyklin D1 a overexprese cyklinu D1 jsou u jistých nádorů onkogenní událostí, pravděpodobně spojenou s nádorovou progresí.

49

4.11.5

p16

INK4A gen, lépe p16INK4a/p14ARF lokus, alternativně INK4A/ARF lokus vzhledem k produkci dvou odlišných proteinů, je významný tumor supresorový gen, který je mapován na krátkém raménku chromozomu 9. Představuje jednu z nejčastěji alterovaných sekvencí u humánních malignit [12,68], spojuje 2 dráhy kontrolujících buněčnou proliferaci, p53 a pRb [58] a hraje klíčovou roli v regulaci G1 fáze buněčnéo cyklu a to v důsledku schopnosti tvorby 2 odlišných produktů s tumor supresorovou funkcí, p16INK4a proteinu, také známého jako CDKN2, který je inhibitor cyklin dependentních kináz (CDK), konkrétně CDK4 a CDK6 , který svojí aktivitou zabraňuje inhibici pRb, a p14ARF proteinu, který blokuje mdm-2 zprostředkovanou inhibici p53 [130]. Bylo prokázáno, ţe p14ARF protein se váţe na p53/mdm2 komplex a inhibuje mdm-2 zprostředkovanou degradaci p53 a podporuje transaktivaci p53, coţ indikuje, ţe p14ARF hraje roli regulátoru p53 prostřednictvím mdm-2, coţ vede k blokádě degradace p53 a podpoře transaktivace p53, s následnou zástavou buněčného cyklu nebo apoptózou Aktivace p16INK4A a p14ARF má za následek zástavu buněčného cyklu v G1 fázi, popřípadě apoptózu [12]. pRb protein, kódovaný RB1 genem, je součástí regulační dráhy buněčného cyklu. p16 inhibuje funkci cdk4-cyklin D1 komplexů, které regulují pRb prostřednictvím fosforylace. Fosforylace funkčně inaktivuje pRb, coţ umoţňuje vstup buněk do S fáze s následnou buněčnou proliferací. Inaktivace p16 nebo overexprese cdk4 můţe podporovat onkogenezi analogickým způsobem, jako je inaktivace pRb [81]. Delece postihující INK4/ARF lokus tak můţe simultánně postihnout pRb i p53 regulační dráhu [130]. Mutační nebo transkripční inaktivace genu p16INK4a/p14ARF byla popsána u několika typů karcinomů a u sarkomů kostí a měkkých tkání [12,81,62], k inaktivaci dále můţe docházet v důsledku homozygotní delece nebo hypermetylace oblasti promotoru.

4.11.6

nm23

Gen NM23 a jeho proteinový produkt nm23 jsou domnělé metastatické supresory, které byly původně identifikovány v buněčných liniích odvozených z myších melanomových buněk s různým metastatickým potenciálem, kdy vysoká exprese nm23 byla nalezena ve slabě metastazujících liniích [119]. Další studie potvrdily inhibiční efekt nm23 na metastázování na zvířecích modelech a byla pozorována inverzní korelace mezi úrovní exprese NM23 a přítomností metastatické choroby u několika typů humánních malignit [39]. Rodina NM23 zahrnuje nejméně 9 členů, které jsou různě exprimovány ve tkáních a lokalizovány v různých

50 subcelulárních kompartmentech [10], zřejmě s různými biologickými funkcemi, ale pouze dva homology jsou nositelé hypotetické inverzní korelace s metastatickým potenciálem - NM23H1 a NM23-H2, u kterých byla popsána těsná asociace s metastázováním malignit. Geny NM23-H1 a NM23-H2 lokalizované na chromozomu 17 kódují nukleosid difosfát kinázu A a B, přičemţ stále chybí korelace mezi nukleosid difosfát kinázovou aktivitou proteinů nm23 a jejich předpokládanou antimetastatickou biologickou funkcí [10]. Na studiích karcinomů prsu, prostaty, plic, pankreatu a melanomu nejsou výsledky studií exprese NM23 pouze rozdílné, ale kontroverzní [10,39]. Tyto diskordance mohou být důsledkem nekonzistence mezi různými

typy

nádorů,

specificity

pouţitých

protilátek

a

různé

interpretace

imunohistologických barvení. Navíc karcinogeneze je multifaktoriální proces, kdy specifický faktor můţe hrát určitou roli pouze v určitém časovém intervalu, mimo něj se můţe účinek tohoto faktoru měnit. Například redukce v expresi NM23 byly signifikantně asociovány s agresivním průběhem choroby u karcinomu prsu, kolorektálního karcinomu, hepatocelulárního, ovariálního karcinomu a karcinomu ţaludku. Oproti tomu u neuroblastomu a u karcinomu pankreatu byl pozorován opačný trend. U jiných sestav, zahrnující kolorektální, plicní a thyroidální karcinomy exprese NM23 nekorelovala s agresivním průběhem choroby. Na souboru 88 pacientů se sarkomem měkkých tkání [95] nebyla nalezena asociace mezi expresí NM23 a metastatickým potenciálem a autoři uzavírají, ţe exprese NM23 u sarkomů je variabilní a nemá hodnotu jako prognostický faktor. Zcela v protikladu k hypotetické antimetastatické funkci NM23 byly výsledky studie na 46 sarkomech měkkých tkání [31], kdy exprese pozitivně signifikantně korelovala s histologickým grade tumoru.

4.11.7

EGFR

Rodina ErbB nebo receptorů pro epidermální růstový faktor (EGF) patří mezi receptory buněčné membrány s tyrozin kinázovou aktivitou, a zahrnuje EGFR (ErbB1/HER-1), ErbB2/Neu/HER-2, ErbB3/HER-3 a ErbB4/HER-4, které mají významnou roli v buněčné proliferaci, přeţití, migraci a diferenciaci [57,106,125]. Všechny typy ErbB receptorů mají extracelulární část, váţící ligand a intracytoplazmatickou tyrozin kinázovou doménu. ErbB receptory jsou exprimovány v různých tkáních epitelového, mezenchymového i neuronálního původu. ErbB jsou aktivovány různými ligandy, mezi něţ patří epidermální růstový faktor (EGF), transformující růstový faktor-α (TGF-α), amphiregulin (AR), epiregulin (EREG), βcellulin (BTC), a heparin-váţící EGF (HB-EGF). Ligand váţící se na ErbB indukuje tvorbu

51 receptorových homo- a heterodimerů a aktivaci kinázové domény s fosforylací specifických tyrozinových zbytků na cytoplazmatické části molekuly. Jsou tak aktivovány signální transdukční dráhy s přenosem extracelulárních signálů do jádra a s aktivací genové exprese. Tímto způsobem mohou být aktivovány různé signální dráhy, například antiapoptotická nebo podporující přeţití buňky. EGFR a ErbB2 se účastní vývoje mnoha humánních malignit, kdy alterace ErbB receptorů zahrnují genovou amplifikaci s následnou EGFR overexpresí či somatické mutace. Navíc u mnoha tumorů jsou růstové faktory podobné EGF produkované samotnými nádorovými nebo stromálními buňkami s následnou konstitutivní aktivací EGFR. U pacientů s malignitami s aberantní aktivitou ErbB receptorů má choroba tendenci k agresivnějšímu průběhu, a proto jsou ErbB receptory předmětem intenzivního výzkumu jako moţný terapeutický cíl. V současnosti jsou v klinickém nebo preklinickém uţívání 2 typy inhibitorů rodiny EGFR: inhibitory tyrozin kinázy, jako je gefitinib; a protilátky, mezi něţ patří trastuzumab a cetuximab, namířené proti ErbB2 a EGFR. Není zcela jasné, zda overexprese nebo mutace EGFR hrají roli v časné maligní transformaci, či zda jsou alterace EGFR spíše sekundárním následkem selekčního procesu, vedoucí k růstové výhodě jiţ etablovaného tumoru, nicméně je moţné, ţe EGFR má významnou roli v přeţití buňky v časných fázích onkogenní transformace. Receptor pro epidermální růstový faktor je exprimován v sarkomech měkkých tkání s variabilně vysokou incidencí, dosahující u některých subtypů aţ 90% [64,99], zvláště u maligních

tumorů

periferní

nervové

pochvy,

pleomorfního

maligního

fibrózního

histiocytomu, myxofibrosarkomu, synoviálního sarkomu a leiomyosarkomu. Některé práce popisují významně horší progózu sarkomů měkkých tkání s overexpresí EGFR a statisticky významnou korelaci overexprese EGFR s histologickým grade a stadiem tumoru.

52

5

CÍLE PRÁCE Cílem

studie

bylo

stanovit

Ki-67

proliferační

index

a

určit

frekvenci

imunohistochemicky detekované exprese p53, mdm-2, cyklinu D1, p16, nm23 a EGFR, tedy proteinů účastnících se maligní transformace, na souboru sarkomů měkkých tkání, a dále vyhodnotit moţnou asociaci exprese těchto antigenů s histopatologickými proměnnými se vztahem k prognóze, jako je histologický grade tumoru, mitotická aktivita a rozsah nádorové nekrózy, s vyuţitím tkáňových microarray. Objektivizace konvenčního histologického gradingu pomocí imunohistochemicky detekovaných markerů by byla přínosem pro rutinní diagnostiku sarkomů měkkých tkání, zvláště při malých bioptických vzorcích.

53

6

MATERIÁL A METODIKA

6.1 Soubor Z archívu muskuloskeletálních tumorů I. PAÚ FN u sv. Anny a LF MU v Brně bylo z desetileté periody od roku 1999 do roku 2008 vybráno 101 případů primárních sarkomů měkkých tkání končetin a trupu u dospělých pacientů. Jednalo se o vzorky z diagnostických probatorních excizí nebo resekční preparáty celých tumorů, všechny před započetím jakékoli jiné léčby neţ chirurgické. Histologické preparáty všech primárních tumorů byly zrevidovány, pro typizaci nádorů byla uţita kritéria WHO klasifikace [36], v případě pochybností byly provedeny nové či dodatečné imunohistochemické reakce pro přesnou klasifikaci. U všech případů byl proveden nový grading dle aktualizovaného gradingového schématu FNCLCC, zaloţeného na diferenciaci nádoru, počtu mitotických figur a nekróze tak, jak byl popsán výše. Byly spočítány mitotické figury na ploše 1,7 mm2 v místě nejvyšší mitotické aktivity. V dostupných histologických řezech kaţdého tumoru byl zhodnocen rozsah nádorové nekrózy. Nádorová nekróza byla definována jako přítomnost amorfní buněčné debris, obvykle spojená s neutrofilní buněčnou reakcí, nebo trsy zaniklých buněk a apoptotických tělísek, nebo buněčných stínů. Oblasti hyalinizace, edému, fibrinové exsudace bez nádorových buněk, nebo acelulární oblasti fibrózy nebyly za nekrózu povaţovány. Grading byl měněn u 12 případů (11,88 %); vţdy šlo o změnu o jeden stupeň. U 22 případů (21,78 %) histologický grade v primární diagnóze chyběl a byl nově stanoven.

6.2 Ki-67 proliferační index Ki-67 proliferační index byl hodnocen na histologických řezech z celých bloků pro moţnost selekce regionu s nejvyšší intenzitou zbarvení, tedy s nejvyšší proliferační aktivitou. Z archivních formol-parafinových bloků nádorové tkáně byly zhotoveny 4 µm silné řezy. Byly vybírány bloky z oblastí tumoru maximálně celulární, s nejvýraznějšími atypiemi, bez extenzivní nekrotizace. Řezy byly umístěny na podloţní skla, deparafinizovány xylenem a rehydratovány ethanolem. Endogenní peroxidáza byla blokována 3% vodným roztokem peroxidu vodíku po dobu 15 minut. Demaskování antigenů bylo realizováno vysokým tlakem a teplotou v tlakové komoře Pascal (Dako, Glostrup, Dánsko) v pufru pH 6 při 117°C a tlaku

54 10 PSI (68,95 kPa) po dobu 3 minut, poté klesající na 90°C po dobu 20 minut. Po demaskování byla na řezy aplikována primární protilátka proti Ki-67. Detaily o pouţité protilátce jsou v Tabulce 8. Detekce byla provedena polymerovou peroxidázovou metodou. Vizualizace bylo dosaţeno inkubací řezů v diaminobenzidinu (DAB+, Dako, Glostrup, Dánsko), řezy byly dobarveny Mayerovým hematoxylinem. Jako pozitivní kontrola slouţila reaktivní lymfatická uzlina, negativní kontrola byla realizována vyloučením primární protilátky. V histologickém řezu byly vybrány oblasti s nejvyšším počtem zbarvených jader a z těchto oblastí byly zhotoveny digitální mikrofotografie při zvětšení 400x (mikroskop Olympus BX45 vybavený digitálním fotoaparátem Olympus Camedia C-5050Z, Olympus C&S s.r.o., Praha, Česká republika). Vlastní počítání pozitivních jader bylo realizováno pomocí volně dostupného programu ImageJ, zaloţeného na platformě Java (dostupný na adrese http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). Minimum hodnocených jader bylo 1000, počet uţívaný ve většině studií [51], z celkového počtu hodnocených a pozitivních jader byl kalkulován Ki-67 proliferační index (PI), vyjádřený v procentech, podle vzorce:

Nádorové buňky byly povaţovány za Ki-67 pozitivní při jakémkoli zbarvení nukleoplazmy nebo jadérek, nezávisle na intenzitě zbarvení. PI byl vypočten jako podíl pozitivních nádorových buněk a celkového počtu nádorových buněk, vyjádřený v procentech.

6.3 Konstrukce tkáňových microarrays a imunohistochemie Pomocí manuálního přístroje (vlastní výroba - Oddělení onkologické a experimentální patologie, Masarykův onkologický ústav, Brno, Česká republika) byly zhotoveny tkáňové microarrays (TMA), kdy z kaţdého originálního parafinového bloku byly odebrány 3 válce tkáně o průměru 1,5 mm, z reprezentativních oblastí bez nekróz, nejvyšším stupněm cytonukleárních atypií a nejvyšší celularitou, pomocí ocelové trubice s tenkou jehlou s tupým zakončením, které byly poté umístěny do recipientního parafinového bloku ve vzdálenostech 0,8 mm. Kaţdý TMA blok obsahoval 46 tkáňových válců, všech 101 případů tedy pojmulo 7

55 TMA bloků. Z TMA bloků byly zhotoveny řezy 4 µm silné, byly deparafinizovány v xylenu, a rehydratovány sestupnou řadou alkoholů. Endogenní peroxidáza byla blokována 3% H2O2. Byla uţita revitalizace antigenů pomocí vysoké teploty (tlaková komora Pascal, Dako, Glostrup, Dánsko) v pufru pH 6,0 nebo pH 9,0 s maximální teplotou 97°C po dobu 3 minut, poté klesající na 90°C po dobu 20 minut, s výjimkou protilátky proti EGFR, u které bylo uţito demaskování proteinázou K. Poté byly aplikovány primární protilátky detekující p53, mdm-2, cyklin D1, p16, nm23, a EGFR. Detekce v řezech navázaných protilátek byla realizována polymerovou nebo avidin-biotin komplex peroxidázovou metodou. Informace o klonech primárních protilátek, jejich výrobcích, pouţitém ředění, typu demaskování antigenů a uţitých detekčních systémech jsou v Tabulce 8. Vizualizace reakcí bylo dosaţeno inkubací řezů v 3,3´-diaminobenzidinu (DAB+, Dako, Glostrup, Dánsko) po dobu 5 minut. Řezy byly opláchnuty v tekoucí vodě a kontrabarvení jader bylo provedeno Mayerovým hematoxylinem, řezy byly dehydratovány, projasněny a montovány. Tabulka 8: Užité protilátky protilátka klon

výrobce

Ki-67

SP 6

Lab Vision 1:3 000

p53

DO-1

Novocastra 3:100

mdm-2

1B10

Novocastra 1:300

p16

6H12

Novocastra 3:100

EGFR

2-18C9

DAKO

RTU

proteináza K

nm23

Abcam

RTU

Cyclin D1

králičí polyklonální SP 4

vimentin

Vim 3B4

DAKO

tlaková komora, 97°C, pH 6 tlaková komora, 97°C, pH 9 tlaková komora, 97°C, pH 6

diluce

Lab Vision RTU 1:300

demaskování

detekce

tlaková komora, 117°C, pH 6 tlaková komora, 97°C, pH 6

UltraVision LP, Lab Vision Vectastain Universal, Vector Vectastain Universal, Vector Vectastain Universal, Vector HRP polymer EnVision, Dako HRP polymer EnVision, Dako UltraVision LP, Lab Vision HRP polymer EnVision, Dako

tlaková komora, 97°C, pH 9 tlaková komora, 97°C, pH 9

Zkratky: RTU, ready-to-use (předředěná protilátka); HRP, horseradish peroxidase (křenová peroxidáza)

56 Jako pozitivní kontroly byl pouţit u p53 kolorektální karcinom se známou expresí p53, u mdm-2 high-grade sarkom měkkých tkání se známou overexpresí mdm-2, u nm23 karcinom prsu se známou expresí nm23, u p16 pankreatický parenchym, u cyklinu D1 lymfom plášťové zóny, a u EGFR skvamocelulární karcinom se známou expresí EGFR. Negativní kontrola byla realizována vynecháním primární protilátky. Ke kaţdému TMA preparátu s danou imunohistochemickou reakcí byla provedena imunoreakce s protilátkou proti vimentinu pro kontrolu antigenicity tkáně.

6.4 Nastavení prahů U p53 byl nastaven práh pro označení případu jako pozitivního na 10 % pozitivních jader, v souhlase s předchozími pracemi [85,87,97,104,123,126]. U p53 pouze jaderné barvení bylo povaţováno za validní výsledek, cytoplazmatická pozitivita nebyla akceptována. Nádory byly povaţovány za mdm-2 pozitivní, pokud bylo pozitivních více neţ 10 % jader nádorových buněk [85,87,97,126]. Stejně jako u p53 pouze jaderná pozitivita byla povaţována za relevantní. Kaţdý případ byl skórován pro p16 imunoreaktivitu při uţití dříve publikovaných kritérií [68]. Při < 20 % pozitivních nádorových buněk byla exprese klasifikována jako negativní, při pozitivitě 20 – 80 % nádorových buněk jako abnormální, při pozitivitě > 80 % nádorových buněk jako pozitivní [126]. V úvahu byla brána jaderná i cytoplazmatická pozitivita. U cyklinu D1 byl nádor byl označen jako pozitivní při jaderném zbarvení > 5 % nádorových buněk [66]. Případ byl označen jako nm23 pozitivní, pokud více neţ 10 % buněk vykazovalo hnědé zbarvení jádra nebo cytoplazmy [10]. U nm23 byla hodnocena jaderná i cytoplazmatická pozitivita, u cyklinu D1 pouze jaderná pozitivita. U EGFR byla povaţována za relevantní pouze membránová pozitivita, nádor byl označen jako pozitivní, pokud bylo přítomno hnědé zbarvení buněčné membrány u více neţ 10 % nádorových buněk, nezávisle na tom, zda šlo o kompletní nebo nekompletní membránové zbarvení [64].

57

6.5 Statistické metody Statistická analýza byla provedena pomocí programu Statistica (StatSoft CR s. r. o. 2007, STATISTICA Cz (softwarový systém pro analýzu dat), verze 8.0, www.statsoft.cz, Praha, Česká republika). Pro studium asociací mezi Ki-67 proliferačním indexem, expresí p53, mdm-2, p16, cyklinu D1, EGFR, mitotickou aktivitou, rozsahem nekrózy a histologickým grade byl uţit χ2 test, Fisherův přímý exaktní test, Spearmanův test korelačního koeficientu a Wilcoxonův test pro nepárové hodnoty (Mann-Whitneyův test). Hodnota p < 0,05 byla povaţována za statisticky významnou.

58

7

VÝSLEDKY

7.1 Charakteristika souboru Soubor zahrnoval 101 případů primárních sarkomů měkkých tkání, u 51 (50,5 %) muţů a 50 (49,5 %) ţen, ve věkovém rozmezí 15 – 91 let, (průměr 57,6 let, medián 58 let). Všechny tumory byly v hluboké lokalizaci, tedy pod superficiální fascií. Maximální frekvence sarkomů měkkých tkání byla mezi 56 – 65 lety, 1 pacient (0,99 %) byl mladší neţ 25 let, 12 pacientů (11,88 %) bylo mladších neţ 35 let, 21 (20,79 %) bylo mladších neţ 45 let, 38 (37,62 %) bylo mladších 55 let, 64 (63,37 %) bylo mladších 65 let a 84 pacientů (83,17 %) bylo mladších 75 let. Nádory byly lokalizovány na dolních končetinách (78 případů; 77,23 %), horních končetinách (11; 10,89 %) a trupu (9; 8,91 %). U tří případů nebyl údaj o lokalizaci dohledatelný. Dolní končetiny tedy byly daleko častěji postiţené neţ horní končetiny a stehno bylo nejčastěji postiţenou lokalizací. Distribuce jednotlivých lokalizací a absence případů postihujících např. hlavu a krk či retroperitoneum jsou dány zaměřením I. ortopedické kliniky LF MU a FN u sv. Anny v Brně, kdy pouze vzorky tumorů pacientů této kliniky tvoří archiv muskuloskeletálních nádorů I. PAÚ. V sestavě bylo 11 základních histologických kategorií, 24 případů maligního fibrózního histiocytomu (23,76 %), 23 případů synoviálního sarkomu (22,77 %), 21 případů liposarkomu (20,79 %), 8 případů leiomyosarkomu (7,92 %), 7 případů myxofibrosarkomu (6,93 %), 5 maligních tumorů periferní nervové pochvy (4,95 %), 3 případy extraskeletálního myxoidního chondrosarkomu

(2,97

%),

2

zástupci

rodiny

Ewingova

sarkomu/primitivního

neuroektodermového tumoru (1,98 %), po 1 případu rabdomyosarkomu a maligního solitárního fibrózního tumoru (0,99 %), a 6 případů sarkomu dále nespecificikovaného (5,94 %), viz Tabulka 9. Počty histotypů zhruba odpovídají frekvencím typů sarkomů měkkých tkání uváděných v textu Cormiera a Pollocka [26] - maligní fibrózní histiocytom 28 %, leiomyosarkom 12 %, liposarkom 15 %, synoviální sarkom 10 % a maligní tumor periferní nervové pochvy 6 % - s poněkud vyšším zastoupením synoviálních sarkomů a poněkud méně četným maligním fibrózním histiocytomem. Z případů maligního fibrózního histiocytomu bylo 23 (95,83 %) storiformně pleomorfních, 1 případ (4,17 %) byl obrovskobuněčný MFH, nevyskytly se případy inflamatorní varianty MFH. Z leiomyosarkomů bylo 7 konvenčních (87,5 %), 1 (12,5 %) pleomorfní. Z liposarkomů byl 1 (4,76 %) dobře diferencovaný

59 (sklerózující), 14 (66,67 %) myxoidních, a 5 (23,81 %) kulatobuněčných, a 1 (4,76 %) dediferencovaný. Nevyskytly se případy pleomorfního liposarkomu. Ze synoviálních sarkomů bylo 14 (60,87 %) monofázických fibrózních, 4 (17,39 %) bifázických a 5 (21,74 %) špatně diferencovaných. 1 případ rabdomyosarkomu v sestavě byl pleomorfní rabdomyosarkom.

Tabulka 9 : Četnosti typů sarkomů měkkých tkání zahrnutých ve studii HISTOTYP maligní fibrózní histiocytom synoviální sarkom liposarkom leiomyosarkom Myxofibrosarkom MPNST myxoidní chondrosarkom Ewingův sarkom/PNET rabdomyosarkom maligní SFT sarkom, NS celkem

POČET 24 23 21 8 7 5 3 2 1 1 6 101

% 23,76 22,77 20,79 7,93 6,93 4,95 2,97 1,98 0,99 0,99 5,94 100

MPNST, maligní tumor periferní nervové pochvy; PNET, primitivní neuroektodermový tumor; SFT, solitární fibrózní tumor; NS, nespecifikovaný 15 (14,85 %) tumorů bylo histologického grade 1, 28 (27,72 %) grade 2 a 58 (57,43 %) grade 3. Počet mitotických figur na 1,7 mm2 byl v rozsahu 1 – 164, s mediánem 26 a průměrem 28,7. Mitotická aktivita byla hodnocena jako vysoká při počtu mitotických figur více neţ 15/1,7 mm2, vysokou mitotickou aktivitu mělo 63 tumorů (62,38 %). Nekróza byla přítomna u 62 nádorů (61,39 %), do 50 % u 55 případů (54,46 %) a nad 50 % u 7 sarkomů (6,93 %). Byla v rozsahu 3 – 70 %. Klinicko-patologické charakteristiky 101 sarkomů měkkých tkání jsou v Tabulce 10.

60 Tabulka 10. Klinicko-patologické charakteristiky 101 případů sarkomů měkkých tkání Věk (roky) Pohlaví Anatomická lokalizace

Mitotická aktivita (1,7 mm2)

Nekróza

Histologický grade

Ki-67 proliferační index (%)

> 40 ≤ 40 muţské ţenské dolní končetina horní končetina trup bez známé lokalizace 0–9 10 – 19 ≥ 20 Nepřítomna ≤ 50 % > 50 % 1 2 3 ≤ 20 > 20

Celkem

17 případů (16,8 %) 84 případů (83,2 %) 51 (50,5 %) 50 (49,5 %) 78 (77,2 %) 11 (10,9 %) 9 (8,9 %) 3 (3 %) 25 (24,8 %) 17 (16,8 %) 59 (58,4 %) 39 (38,6 %) 55 (54,7 %) 7 (6,9 %) 15 (14,85 %) 28 (27,72 %) 58 (57,43 %) 30 (29,7 %) 71 (70,3 %) 101 (100 %)

7.2 Imunohistochemie 7.2.1 Ki-67 proliferační index Ki-67 proliferační index byl v rozmezí 1,26 aţ 75,49 %, s mediánem 26,68 % a průměrem 29,95 %. Skupina sarkomů s histologickým grade 1 měla Ki-67 proliferační index v rozmezí 1,26 – 45, 79 %, medián 8,7 %, průměr 10,84 %; histologický grade 2 v rozmezí 4 – 65,22 %, medián 22 %, průměr 25,17 %; histologický grade 3 v rozmezí 6,02 – 75,49 %, medián 34,05 %, průměr 37,19 %. I přes značné překryvy hodnot v jednotlivých stupních histologického grade vyšší Ki-67 proliferační index při uţití Spearmanova korelačního koeficientu signifikantně koreloval s počtem mitotických figur (r = 0,636; p < 0,0001), s rozsahem nekrózy (r = 0,357; p = 0,0003), histologickým grade (r = 0,58; p < 0,0001). Dále při uţití Mannova-Whitneyova testu Ki-67 proliferační index koreloval s imunohistochemicky detekovatelnou nukleární akumulací p53 (p = 0,0008) a slabší korelace byla nalezena pro koexpresi p53 a mdm-2 a Ki-67 proliferační index (p = 0,017).

61

7.2.2 p53 Jaderná akumulace p53 proteinu byla imunohistochemicky detekována u 25 sarkomů (24,75 %), nebyla pozorována u případů s histologickým grade 1, nejvyšší počet pozitivit byl zaznamenán ve skupině sarkomů s histologickým grade 3. Jaderná akumulace p53 byla přítomna u 4 (14,29 %) případů grade 2 a 21 (36,21 %) grade 3 sarkomů měkkých tkání. p53 imunopozitivita signifikantně korelovala s histologickým grade nádorů při uţití χ2 testu (p = 0,005). Při uţití Mannova-Whitneyova testu byla jaderná akumulace p53 významně asociována s Ki-67 proliferačním indexem (p = 0,0008), mitotickou aktivitou (p = 0,0007) a méně signifikantní korelace byla mezi overexpresí p53 a rozsahem nekrózy (p = 0,047). Nebyla nalezena ţádná korelace mezi p53 pozitivitou a overexpresí mdm-2.

7.2.3 mdm-2 63 ze 101 případů (62,38 %) bylo imunopozitivních pro mdm-2. Nebyla pozorována signifikantní korelace mezi overexpresí mdm-2 a mitotickou aktivitou, rozsahem nekrózy, histologickým grade a Ki-67 proliferačním indexem.

7.2.4 Cyklin D1 Cyklin D1 byl exprimován ve 29 tumorech (28,71 %), v různých histologických typech nádorů. Ţádný z tumorů histologického grade 1 nebyl pozitivní pro cyklin D1, zatímco 9 (32,14 %) grade 2 sarkomů a 20 (34,48 %) grade 3 tumorů bylo pozitivních. Overexprese cyklinu D1 byla ve statisticky signifikantní pozitivní korelaci s histologickým grade (p = 0,028) při uţití χ2 testu a s expresí EGFR (p = 0,0067) při uţití Fisherova exaktního testu.

7.2.5 p16 p16 exprese byla redukována u celkem 95 případů (94 %), kompletně negativních bylo 59 tumorů (58,42 %), 9 (60 %) ve skupině nádorů s histologickým grade 1, 13 (46,43 %) u grade 2 nádorů a 37 (63,79 %) u histologického grade 3. Nebyla nalezena významná korelace mezi sníţenou expresí p16 a histologickým grade, mitotickou aktivitou, rozsahem nekrózy nebo Ki-67 proliferačním indexem.

62

Graf 1: Korelace Ki-67 proliferačního indexu a histologického grade u souboru sarkomů měkkých tkání

Graf 2: Korelace Ki-67 proliferačního indexu a mitotické aktivity u souboru sarkomů měkkých tkání

63

Graf 3: Krabicový graf Ki-67 proliferačního indexu u p53 pozitivních a negativních případů sarkomů měkkých tkání

Graf 4: Krabicový graf mitotické aktivity u p53 pozitivních a negativních případů sarkomů měkkých tkání

64

7.2.6 nm-23 Exprese nm-23 byla sníţena u 42 případů z celkového počtu 101 sarkomů měkkých tkání (41,58 %). Ve skupině G1 sarkomů bylo negativních 8 případů (53,33 %), ve skupině G2 10 (35,71 %) a ve skupině G3 24 případů (43,38 %). Nebyla nalezena ţádná statisticky významná korelace mezi sníţenou expresí nm-23 stanovovanou imunohistochemicky a histopatologickými proměnnými, ani expresí ostatních sledovaných markerů. V rámci četnějších histotypů byla exprese nm-23 nejvíce redukována u leiomyosarkomů (62,50 %), u sarkomů dále nespecifikovaných (66,67 %) a u myxofibrosarkomů (42,68 %).

7.2.7 EGFR EGFR byl imunohistochemicky pozitivní u 45 (44,55 %) sarkomů měkkých tkání. Pouze membránová pozitivita byla povaţována za relevantní. EGFR pozitivní byl 1 (6,67 %) tumor s histologickým grade 1, 11 (39,29 %) případů grade 2 a 33 (56,90 %) grade 3. Pozitivita EGFR

signifikantně korelovala s histologickým grade (p = 0,018) při uţití χ2 testu a

s mitotickou aktivitou (p = 0,008) při aplikaci Mannova-Whitneyova testu. Co se týká vtahů mezi expresí jednotlivých proteinů, při uţití Fisherova exaktního testu byla nalezena statisticky významná korelace mezi expresí EGFR a overexpresí cyklinu D1 (p = 0,0067). Pokud nebyly brány v úvahu sporadicky se vyskytující se jednotky sarkomů měkkých tkání, nejčastěji byla pozitivita EGFR zaznamenána u synoviálního sarkomu, u 19 z 23 (82,61 %), sarkomu dále nespecifikovaného, 4 ze 6 (66,67 %), maligního tumoru periferní nervové pochvy, 3 z 5 (60 %) a maligního fibrózního histiocytomu, 14 ze 24 (58,33 %). EGFR pozitivita nebyla zaznamenána u ţádného ze 7 případů myxofibrosarkomu.

65 Graf 5: Frekvence EGFR pozitivit u jednotlivých subtypů souboru sarkomů měkkých tkání.

LMS, leiomyosarkom; LS, liposarkom; MFH, maligní fibrózní histiocytom; MFS, myxofibrosarkom; MCHS, myxoidní chondrosarkom, MPNST, maligní tumor periferní nervové pochvy; PNET/EWS, primitivní neuroektodermový tumor/Ewingův sarkom; RMS, rabdomyosarkom; SFT, solitární fibrózní nádor; SS, synoviální sarkom; neg, EGFR negativní; poz, EGFR pozitivní.

66

8

DISKUSE Četné studie prokázaly, ţe histologický grade u sarkomů měkkých tkání dospělých má

význam především jako prediktor vývoje metastatického onemocnění a celkového nebo tumor-specifického přeţití [20,59,61], a proto je grade nejlepším parametrem pro výběr pacientů, u nichţ by měla být uvaţována moţnost adjuvantní chemoterapie. Nicméně hodnota histologického grade zůstává stále problematickým tématem [17]. Je dobře známé, ţe morfologicky podobné tumory se mohou chovat velmi odlišně i při identickém stadiu, coţ velmi limituje schopnost předpovědět klinické chování v individuálním případě [25]. Uţití moderních molekulárních a imunohistochemických metod vedlo ke značnému pokroku v poznání buněčného růstu, diferenciace a apoptózy, které jsou klíčovými prvky v onkogenezi. Implementace objektivních prognostických nebo prediktivních analýz zvyšuje naši schopnost hodnotit biologické vlastnosti nádoru a navrhovat efektivní terapeutické přístupy.

8.1 Frekvence imunohistochemicky detekovaných antigenů, jejich korelace s histologickým grade a s dalšími proměnnými 8.1.1 Ki-67 proliferační index Různé studie prokázaly korelaci mezi Ki-67 proliferačním indexem, mitotickou aktivitou, a histologickým grade u sarkomů měkkých tkání, coţ naznačuje, ţe Ki-67 proliferační index můţe být uţitečný pro stanovení histologického grade a určení prognózy u těchto nádorů [50,59,69,115] a tento fakt byl potvrzen i v této studii. Ki-67 proliferační index byl v rozmezí 1,26 aţ 75,49 %, s mediánem 26,68 % a průměrem 29,95 %. Ki-67 PI významně koreloval s mitotickou aktivitou, s rozsahem nekrózy a histologickým grade. Dále Ki-67 proliferační index koreloval s imunohistochemicky detekovanou jadernou akumulací p53. Tyto výsledky jsou v souhlase s literárními údaji. Literatura dále uvádí korelaci mezi vysokým Ki-67 proliferačním indexem, rozvojem metastatické choroby a tumor-specifickou mortalitou [30,53]. Jensen et al. [59] při multivariační analýze prokázal hodnotu Ki-67 proliferačního indexu jako silného nezávislého prognostického parametru celkového přeţití u high-grade sarkomů měkkých tkání. Některé

67 studie Ki-67 proliferačního indexu u sarkomů měkkých tkání [55] byly provedeny na tkáňových microarrays, a přesto byl Ki-67 PI validován jako nezávislý prognostický marker, identifikující pacienty s agresivním onemocněním, kdy vysoký proliferační index (práh 30 % pozitivních jader) byl signifikantně častější ve skupině pacientů s úmrtími ve vztahu k chorobě. V této studii byl Ki-67 proliferační index kalkulován z celých tkáňových řezů pro moţnost výběru proliferačně nejaktivnějších oblastí. Ki-67 proliferační index můţe být velmi uţitečný při rozlišování různých prognostických skupin u sarkomů měkkých tkání i v rámci stejné hodnoty histologického grade, například u myxoidních liposarkomů [105], které jsou obvykle grade 1 a mohou se lišit Ki-67 proliferačním indexem. Hasegawa et al. [50] navrhli a obhajují gradingový systém obdobný FNCLCC schématu, tzv. japonský gradingový systém, u něhoţ nahradili počty mitotických figur proliferačním indexem (Tabulka 11). Jejich gradingový systém uţívající MIB-1 skóre, a z něho vycházející stagingový protokol vykazoval lepší předpovědní hodnotu ve srovnání se standardním gradingovým sytémem (FNCLCC) nebo ve srovnání se samotným MIB-1 skóre [47]. Jeho výhody autoři spatřují především v objektivnějším hodnocení proliferačního indexu s redukcí interpersonální variability, která inherentně zatěţuje počítání mitotických figur. Nicméně, i v metodice stanovení proliferačního indexu mohou být značné interlaboratorní rozdíly, stejně jako u mitotických figur dané různou metodikou fixace, různými metodami demaskování antigenů a v důsledku dalších faktorů. Je nicméně moţné připustit určité výhody, například vyhnutí se různě velkým plochám zorného pole při velkém zvětšení při počítání mitotických figur a snaţší selekci oblastí s nejvyšší proliferační aktivitou. Různě velkým plochám velkého zvětšení by bylo moţno se vyhnout uţitím mitotického indexu, tedy počtem mitotických figur vztaţených k určitému počtu jader. Podle autorů by mělo mít gradingové schéma zaloţené na MIB-1 proliferačním indexu i vyšší reprodukovatelnost, při testování byla míra konkordance 79%, coţ je vyšší hodnota, neţ je udávána pro konvenční metody zaloţené na počítání mitotických figur. Dalším přínosem by mohlo být uţití automatizované počítačové obrazové analýzy pro hodnocení proliferačního indexu, kdy by mohlo dojít k redukci časové náročnosti kalkulace při počítání, ať jiţ při pouţití světelného mikroskopu, nebo pomocí snímaných digitálních obrazů s následným hodnocením na monitoru počítače. Hasegawa et al. [46] prokázal vysoký stupeň shody mezi proliferačním indexem hodnoceným mikroskopicky a pomocí počítačové obrazové analýzy. I zde však mohou být výsledky alterovány například přítomností nenádorových buněčných elementů a variabilní intenzitou zbarvení imunoreakcí.

68 Tabulka 11. Grading sarkomů měkkých tkání založený na FNCLCC schématu a MIB-1 proliferačním indexu PARAMETR I. Diferenciace nádoru Skóre 1 Skóre 2 Skóre 3 II. Rozsah nekrózy Skóre 0 Skóre 1 Skóre 2 III. Počet mitóz Skóre 1 Skóre 2 Skóre 3 IV. MIB-1 proliferační index Skóre 1 Skóre 2 Skóre 3 FNCLCC systém Grade 1 Grade 2 Grade 3 MIB-1 systém Grade 1 Grade 2 Grade 3

KRITÉRIA Tabulka 2 Tabulka 2 Tabulka 2 Bez nekrózy <50% nádorové nekrózy ≥50% nádorové nekrózy 0–9/10 HPF (400×) 10–19/10 HPF ≥20/10 HPF 0–9% 10–29% ≥30% Celkové skóre I, II a III: 2–3 Celkové skóre I, II a III: 4–5 Celkové skóre I, II a III: 6–8 Celkové skóre I, II a IV: 2–3 Celkové skóre I, II a IV: 4–5 Celkové skóre I, II a IV: 6–8

Podle Hasegawa T. Histological grading and MIB-1 labeling index of soft-tissue sarcomas. Pathol Int. 2007;57:121-5.

8.1.2 p53 V této sestavě byla imunopozitivita p53 u 25 (24,75 %) sarkomů měkkých tkání, tedy ve srovnatelné frekvenci jako ve studii Jensena et al. [59] (24 %), Schneider-Stockové et al. [104] (29,4 %), a Ody et al. [85] (22,4 %). V práci Kima et al. a O´Reillyho et al. [65,90] dosahovaly frekvence p53 imunopozitivit 63 %, respektive 40 %. Yoo et al. [126] pozoroval jadernou akumulaci p53 ve 37 %. Schneider-Stock et al. [104] zaznamenali imunopozitivitu u 10 z 34 synoviálních sarkomů (29,4 %), přičemţ u 8 nádorů s p53 imunohistochemickou pozitivitou nebyly detekovány mutace genu TP53. Za tento fenomén jsou pravděpodobně odpovědné aktivace jiných regulačních drah, jako je interakce MDM-2 nebo vazba na Rb/cyklin D1 signální řetězec. Podobně Oda et al. [85] prokázal jadernou akumulaci u 24 %

69 případů synoviálních sarkomů. I kdyţ případy p53 pozitivní měly tendenci mít horší prognózu, rozdíl nebyl statisticky významný. Oda rovněţ neprokázal korelaci mezi p53 pozitivitou stanovovanou imunohistochemicky a alteracemi genu TP53, hodnocené pomocí PCR. Nakanishi et al. [80] detekoval imunohistochemicky jadernou akumulaci p53 u 44 % (31 ze 70) případů sarkomů měkkých tkání různých histotypů, a nepotvrdil korelaci mezi expresí p53 a přeţitím pacientů. Reaktivita p53 proteinu byla různá v různých histotypech, při zahrnutí pouze dostatečného počtu případů v rámci jednoho histotypu byla maximální exprese u leiomyosarkomu (37,50 %), dále v sestupném pořadí u maligního fibrózního histiocytomu (33,33 %) a u synoviálního sarkomu (26,09 %). Jaderná akumulace p53 nebyla detekována ani u jednoho případu ze 7 myxofibrosarkomů. Imunohistochemicky detekovaná p53 overexprese nemusí mít vţdy podklad v mutaci genu TP53 [126], z čehoţ vyplývá, ţe i jiné mechanismy neţ mutace TP53 mohou hrát roli při overexpresi p53. Prognostická hodnota jaderné akumulace p53 proteinu je u sarkomů měkkých tkání stále kontroverzní. Na našem souboru byla prokázána statisticky signifikantní korelace exprese p53 s počtem mitotických figur na 1,7 mm2, rozsahem nekrózy, histologickým grade a s výší Ki-67 proliferačního indexu. Tyto výsledky indikují moţný prognostický význam imunohistochemicky detekované overexprese p53 u sarkomů měkkých tkání. Je moţné, ţe dráha p53 je asociována s progresí low-grade sarkomů v high-grade a lze ji povaţovat marker nádorové progrese. Würl et al [122] detekoval na souboru 198 sarkomů měkkých tkání imunopozitivitu p53 v 115

případech (58

%;

protilátka DO-1),

a při

multivariační

analýze

byla

imunohistochemická pozitivita p53 statisticky významně spojená se špatnou prognózou. Variabilita v imunohistochemické detekci exprese p53 na různých souborech sarkomů měkkých tkání můţe být vysvětlena diferencemi v metodikách, uţitím různých protilátek, různých metod demaskování antigenů, uţitím různých fixačních prostředků. Naprostá většina mutací TP53 zahrnuje missense mutace, charakterizované bodovými mutacemi s následnými konformačními změnami alterovaného proteinu, s prodlouţením biologického poločasu, a moţností imunohistochemické detekce [59]. Naopak, následkem mutací s posunem čtecího rámce nebo nonsens mutací v genu pro p53 nemusí být imunohistochemicky p53 detekován. Navíc, většina protilátek proti p53 (včetně uţité DO-1 v této studii) rozpoznává nemutovanou (wild-type) i mutované formy p53. Demonstrace p53 tak můţe být následkem poruchy

70 regulace se zvýšenou expresí nemutovaného TP53 genu, vazbou p53 na různé celulární proteiny, například mdm-2 protein [88].

8.1.3 mdm-2 Různé studie prokázaly zvýšenou expresi mdm-2 u sarkomů měkkých tkání. V této sestavě byla overexprese mdm-2 u 63 (62,38 %) případů, coţ je hodnota srovnatelná s počtem mdm-2 pozitivních uterinních leiomyosarkomů ve studii Kima et al. [65], ale vyšší neţ u většiny ostatních autorů. Vyšší procento pozitivit můţe být zčásti vysvětleno niţším prahem klasifikujícím tumor jako negativní, v našem případě byl práh nastaven na 10 %, u Heslina et al. [53] byl 20 %. Yoo et al. [126] referoval mdm-2 pozitivitu v 24 %, a rovněţ pozoroval významnou korelaci mezi expresí mdm-2 a histologickým grade sarkomu. V jeho sestavě byla koexprese p53 a mdm-2 v 8 případech z 67 sarkomů měkkých tkání (12 %). Protoţe mdm-2 protein inaktivuje transkripci p53 proteinu, bylo by moţné predikovat, ţe při overexpresi mdm-2 bude p53 negativní. Nicméně jsme pozorovali koexpresi p53 a mdm-2 u 13 (12,87 %) případů, Oda et al. [85] ji zaznamenal v 16,3 % případů. Heslin et al. [53] popsal expresi mdm-2 u 35 % případů sarkomů měkkých tkání a overexprese neměla ţádný vztah k prognóze. Oda et al. [85] pozoroval expresi mdm-2 ve 38 % případů synoviálního sarkomu. V jeho sestavě mdm-2 exprese korelovala s mladým věkem pod 20 let, proximální lokalizací tumoru a bifazickým subtypem, ale neprokázal ţádnou korelaci mezi mdm-2 imunoreaktivitou a prognózou. V jeho práci mdm-2 pozitivita měla významný vztah k jaderné akumulaci p53 proteinu. Cordon-Cardo et al. [24], kteří pozorovali simultánní expresi p53 a mdm-2 v 10 % případů, ve své práci zjistili významný vliv koexprese p53 a mdm-2 na prognózu pacientů se sarkomy měkkých tkání, na druhou stranu, Oda et al. [85] prognostický význam současné exprese p53 a mdm-2 u synoviálních sarkomů nepozoroval. Shen et al. [103] pozorovali jadernou expresi mdm-2 u 6 z 30 případů (20 %). Vliv na prognózu mdm-2 pozitivity u synoviálních sarkomů končetin nezjistili. V našem souboru imunohistochemicky detekovaná exprese mdm-2 nevykazovala korelaci s histologickými parametry, ani s mitotickou aktivitou, ani s rozsahem nekrózy, ani histologickým grade. Rovněţ nebyl patrný ţádný vztah mezi expresí mdm-2 a expresí dalších vyšetřovaných proteinů.

71

8.1.4 Cyklin D1 Overexprese cyklinu D1 v této sestavě nebyla příliš častým jevem, byla pozorována u 29 případů (28,71 %), coţ je zhruba srovnatelné s literárními údaji. Yoo et al. [126] popsal cyklin D1 pozitivitu u 21 % různých sarkomů měkkých tkání, Kim et al. [66] pozorovali overexpresi cyklinu D1 u 29 % (23/79) končetinových sarkomů měkkých tkání. Byla zaznamenána statisticky významná korelace mezi expresí cyklinu D1 a histologickým grade, a dále byl statisticky signifikantní vztah mezi expresí cyklinu D1 a EGFR. Exprese cyklinu D1 nebyla pozorována u sarkomů histologického grade 1. Poměrně frekventní exprese byla u 11 z 23 případů synoviálního sarkomu (47,83 %), u 2 z 5 případů maligního tumoru periferní nervové pochvy (40 %) a u 9 z 24 případů maligního fibrózního histiocytomu (37,5 %). Nejniţší frekvence pozitivit bylo dosahováno v rámci histotypů liposarkomu (1 z 21 případů, 4,76 %). V jednom případě bifazického synoviálního sarkomu, který však nesplňoval kritéria cyklin D1 pozitivity (> 5% zbarvených jader nádorových buněk), byla exprese cyklinu D1 limitována pouze na jádra glandulární komponenty. Overexprese cyklinu D1 u sarkomů měkkých tkání je vzácně důsledkem amplifikace genu pro cyklin D1, která je pozorována u nízkého procenta případů [66]. Overexprese je tak pravděpodobně následkem změn na úrovni transkripce, translace anebo posttranslačních úprav syntézy proteinů. Naše výsledky podporují hypotézu, ţe overexprese cyklinu D1 zřejmě definuje biologicky agresivnější sarkomy měkkých tkání.

8.1.5 p16 Abnormální exprese p16 byla na této sestavě detekována u 94 (93,07 %) případů, přičemţ u 59 případů (58,42 %) šlo o kompletní negativitu, coţ naznačuje, ţe alterace p16 je u sarkomů měkkých částí velmi běţným jevem. Yoo et al. [126] dokumentoval p16 pozitivitu u 6 % různých sarkomů měkkých tkání. Nielsen et al. [81] popsal kompletní ztrátu imunoreaktivity pro p16 protein u 26 % high-grade osteosarkomů, a uzavírá, ţe u těchto tumorů zřejmě došlo k inaktivaci CDKN2A genu. Ztráta imunoreaktivity pro p16 protein v jeho sestavě byla v těsném souhlase s genetickou analýzou homozygotní delece CDKN2A genu, provedenou pomocí PCR. Benassi et al. [12] popisuje ztrátu imunoreaktivity pro p16 nebo jeho slabou expresi do 25 % buněčných jader u 60 % (21/35) humánních osteosarkomů, coţ je výsledek srovnatelný s našimi výsledky a uzavírá, ţe pRb má vztah k prognóze u humánních osteosarkomů, a

72 hypofosforylovaná forma pRb, udrţovaná aktivitou p16, je nutná pro redukci šíření a metastázování osteosarkomových buněk. Kawaguchi et al. [62] pozorovali sníţenou expresi u 32 % leiomyosarkomů měkkých tkání, přičemţ ztráta exprese korelovala signifikantně s velkými rozměry tumoru a při multivariační analýze byla ztráta exprese p16 jediným independentním prognostickým faktorem. Orlowová et al. [91] pomocí molekulárně biologických metod detekovali status INK4A genu u sarkomů měkkých tkání, a pozorovali celkovou frekvenci genetických alterací v rozsahu přibliţně 15 %, přičemţ nenalezli bodové mutace, ale homozygotní a hemizygotní delece a rearanţe. Změny byly limitovány na high-grade případy a alterace v oblasti INK4A genu byly statisticky signifikantním prediktorem krátkého přeţití. Na této sestavě nebyly nalezeny statisticky významné vztahy mezi redukovanou expresí p16 a histologickým grade sarkomů, nebo jakýmikoli jinými proměnnými.

8.1.6 nm-23 Při předpokládané hodnotě histologického grade jako prediktoru rozvoje metastatického onemocnění výsledky studia exprese nm-23 na našem souboru nepodporují domnělou antimetastatickou funkci tohoto proteinu. Redukce exprese nm-23 byla pozorována v přibliţně stejném rozsahu u tumorů s histologickým grade 1, 2 i 3.

8.1.7 EGFR Receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR) je významný regulátor buněčné proliferace s účastí v karcinogenezi [6] a jeho exprese je imunohistochemicky detekovatelná u sarkomů měkkých tkání v poměrně rozsáhlém intervalu frekvencí, dosahující u některých subtypů aţ 90 % [64]. Na studovaném souboru dosahovala exprese EGFR v rozsahu všech histotypů 44,45 %, přičemţ nejvyšší počet EGFR pozitivních případů byl ve skupině synoviálních sarkomů, coţ je ve shodě s literárními údaji o vyšší frekvenci exprese EGFR u synoviálních sarkomů neţ u jiných histologických typů sarkomů měkkých tkání [14]. EGFR pozitivita statisticky signifikantně korelovala s histologickým grade a s mitotickou aktivitou, coţ lze vysvětlit funkcí EGFR v kontrole celulární proliferace. Nové cílené terapeutické protinádorové postupy, namířené proti receptorům růstových faktorů, například proti receptoru pro epidermální růstový faktor, se s úspěchem pouţívají v léčbě různých karcinomů [94]. Overexprese EGFR u sarkomů měkkých tkání ospravedlňuje pokusy s molekulárně cílenou terapií, namířenou proti EGFR, a experimentální výsledky

73 naznačují, ţe blokáda EGFR můţe mít i u sarkomů měkkých tkání terapeutický benefit [64]. Četnost pozitivit, variabilní v různých studiích, vede k různým otázkám o uţitých protilátkách a různých metodách interpretace. Je moţné, ţe pouze membránová lokalizace EGFR indikuje biologicky intaktní receptor a umoţňuje odpověď na cílenou terapii, analogicky jako u HER2/neu, nicméně, cytoplazmatická pozitivita umoţňuje spekulaci, ţe odráţí vysoký intracelulární obsah a obrat EGFR. Po vazbě ligandu je EGFR internalizován a lokalizován v cytoplazmě. Je dosud nejasné, zda intracytoplazmatická lokalizace EGFR má biologické a klinické implikace. Malý počet případů v kaţdé skupině sarkomů měkkých tkání a heterogenita kaţdé skupiny s různými subtypy a různým histologickým stupněm malignity neumoţňují ţádné spolehlivé závěry ohledně korelace specifického imunofenotypu se specifickým typem sarkomu.

8.2 Budoucnost gradingu Jakákoli statistická analýza parametrů, které jsou součástí gradingových systémů, na velkých sériích sarkomů měkkých tkání nevyhnutelně podceňuje faktory, které jsou relevantní pouze u vzácných histologických typů. Je tedy pravděpodobné, ţe nakonec bude gradingový systém navrţen, nebo přinejmenším modifikován, pro kaţdý typ sarkomu [17]. Grading by měl být v budoucnu adaptován pro moderní péči o pacienta a měl by být doplňován radiologickými metodami a molekulárními parametry. U stále většího počtu pacientů je uţívána předoperační terapie ve formě chemoterapie a/nebo radioterapie po primární diagnóze na jehlové biopsii nebo dokonce tenkojehlové aspirační cytologii [22]. Z těchto důvodů by měl být grading adaptován pro tento typ materiálu, protoţe je zřejmé, ţe hodnocení rozsahu nekrózy a mitotické aktivity je na těchto typech materiálu obtíţné. Imunohistochemicky detekovaná exprese různých proteinů se vztahem k prognóze můţe být v budoucnosti součástí hodnocení stupně malignity nádorů a tato práce potvrdila, ţe zejména Ki-67 proliferační index, imunopozitivita p53, overexprese cyklinu D1 a exprese EGFR u sarkomů měkkých tkání statisticky signifikantně korelují s hodnotou histologického grade, a je zřejmý jejich potenciál vyuţití jako doplňkové metody při hodnocení agresivity daného sarkomu měkkých tkání. Bohuţel studie uţívající imunohistochemické metody (Ki-67, PCNA), metody průtokové cytometrie, nebo barvení jaderných organizujících regionů (AgNOR) často korelují

74 s prognózou, ale zatím nevedly k vylepšení histologického grading u sarkomů měkkých tkání [17] a je nutné vést v patrnosti, ţe zvyšující se počet sloţitých testů sebou přináší ekvivalentní zvýšení metodických chyb, artefaktů, a nákladů materiálních i osobních [17]. Navíc, interlaboratorní variabilita je stejný problém jako interpersonální variabilita u mikroskopu. Mitotický index, který je obtíţně hodnotitelný na jehlových biopsiích, by mohl být nahrazen Ki-67 proliferačním indexem [46,47,48,50], kdy bylo prokázáno, ţe MIB1 skóre má vyšší repoducibilitu a má vyšší prediktivní hodnotu neţ klasický histologický grading uţívající mitotický index. Prognostická hodnota MIB1 skóre můţe být testována na jehlových biopsiích sarkomů měkkých tkání. Histologický grade můţe být povaţován za morfologický korelát molekulárních dějů, které determinují agresivnost nádoru. Molekulární parametry tak teoreticky mohou doplňovat, nebo dokonce nahrazovat histologické parametry. U synoviálních sarkomů byla popsána významně lepší prognóza u pacientů se SSX2 translokací neţ u SSX1 translokace [70], nicméně jiným autorům se tuto závislost nepodařilo prokázat [41]. U alveolárního sarkomu některé studie prokazují, ţe typ fúzního transkriptu ovlivňuje prognózu, kdy PAX7 tumory mají lepší prognózu neţ PAX3 nádory [5,108]. V nejrůznějších studiích byla dokazována prognostická hodnota imunohistochemických expresních profilů pro určení pravděpodobnosti vývoje metastatického onemocnění [47,48, 60,122]. Rhabdomyosarkom je klasifikován do dvou základních podskupin, na embryonální (ERMS) a na alveolární (ARMS), a většina alveolárních rhabdomyosarkomů je spojena se specifickou chromozomální translokací (pARMS) t(2;13) nebo t(1;13). Jiţ morfologická subklasifikace má své prognostické uplatnění, neboť alveolární varianta je o mnoho agresivnější neţ embryonální subtyp. Wachtel et al. [118] ve své práci pouţil data genové exprese pro selekci specifických markerů pro jednotlivé subtypy rhabdomyosarkomu. Pro pARMS byly selektovány markery AP2β a P-cadherin, pro ERMS EGFR a fibrillin-2. Tento panel

markerů

umoţňuje

sbuklasifikaci

s vysokou

specificitou

na

podkladě

imunohistochemie, která není zatíţena tak vysokými nároky na kvalitu a dostupnost nativního materiálu, jako cytogenetické či molekulárně biologické metody. Ţe pouţití metodik genových expresních profilů má velkou budoucnost ukazuje i práce Segala et al [102], kteří ukázali, ţe pomocí genových expresních profilů u sarkomů měkkých tkání lze navrhnout geneticky zaloţenou klasifikaci, která by mohla být uţitečná v diagnostice i prognostice či predikci lézí. Podle autorů této práce analýza genových expresních profilů kaţdého z více neţ 50 subtypů sarkomů měkkých tkání vyjasní biologické rozdíly mezi měkkotkáňovými lézemi

75 a navrhne terapeutická specificika pro kaţdou podskupinu sarkomů měkkých tkání, pokud ne terapii specifickou pro individuální nádory. V recentních pracích se objevují další molekulární prognostické markery, například ezrin [120], u kterého byla nedávno naznačena jeho prometastatická funkce u nádorové progrese. Ezrin je členem ezrin-radixin-moesin rodiny proteinů asociovaných s cytoskeletem, který byl původně popsán jako vazebný článek mezi aktinovými filamenty a membránovými bílkovinami, a později byla poznána jeho úloha v několika významných buněčných komplexech a celulárních procesech. Ezrin se účastní buněčné adheze, některých typů signální transdukce a Akt-mediované apoptotické dráhy a snad i buněčné migrace, invaze a přeţití buněk. Je tedy moţné, ţe overexprese nebo deregulace ezrinu můţe přispívat k metastatickému chování nádorů, tak jak naznačují zvířecí modely a prospektivní humánní studie. Významná korelace mezi overexpresí ezrinu a špatnou prognózou byla nalezena kromě sarkomů měkkých tkání u osteosarkomů a intraokulárních melanomů. Byla nalezena silná asociace mezi vysokou expresí ezrinu a vývojem metastáz a následným redukovaným přeţitím u sarkomů měkkých tkání. Lze očekávat, ţe počet imunohistochemicky nebo pomocí molekulárně biologických metod detekovaných indikátorů prognózy u sarkomů měkkých tkání bude neustále narůstat, a ţe v blízké budoucnosti dojde k jejich standardní aplikaci, přičemţ význam budou mít především jejich kombinace. [131].

76

9

ZÁVĚRY Histologický grade je v současnosti u sarkomů měkkých tkání velmi významný nositel

prognostické informace, je nejlepším indikátorem metastatického rizika a v současosti neexistuje ţádný parametr nebo procedura, která by jej nahrazovala [28]. Přes značnou hodnotu je pouţívání histologického grade spojeno s určitými problémovými oblastmi a ţádný současný systém není perfektní. Pokud je gradingový systém aplikován na jednotlivé případy, je časté selhání v predikci prognózy [17]. Histologický grading do současnosti nebyl vylepšen objektivnější analýzou buněčné proliferace, DNA průtokovou cytometrií nebo analýzou tumor supresorových genů. Základem nejrozšířenějších gradingových systémů (FNCLCC, NCI) je přesná histotypizace, která je absolutní nutností spolehlivého určení prognózy. Absence korektní klasifikace tumorů nemůţe být nahrazována zdánlivým vylepšováním nádorového gradingu. Nelze vyloučit, ţe histologický grading bude v budoucnosti doplněn, nebo dokonce nahrazen molekulárními parametry. V budoucnosti je ke sníţení morbidity a mortality v důsledku sarkomů měkkých tkání nutná molekulární a patologická redefinice sarkomů, vylepšení primární péče včetně nových zobrazovacích metod, a identifikace a vývoj cílených systémových terapií [15]. Prognostický význam přesné histotypizace, histologického gradingu, molekulárních prognostických faktorů (např. analýza fúzních genů) je nutné stále testovat v rozsáhlých studiích. Studie naší sestavy sarkomů měkkých tkání potvrdila silnou statisticky významnou korelaci Ki-67 proliferačního indexu, imunohistochemicky detekované jaderné akumulace p53, exprese cyklinu D1 a EGFR s konvenčním histologickým grade dle schématu FNCLCC, coţ indikuje jejich moţné uţití jako doplňkové metody při stanovení histologického grade sarkomu měkkých tkání. Prognostický význam těchto parametrů by měl být dále validován analýzou bezpříznakového intervalu a přeţití na daném souboru. Byla rovněţ verifikována poměrně vysoká frekvence exprese EGFR u sarkomů měkkých tkání, zvláště u synoviálního sarkomu, coţ z těchto nádorů vytváří potenciální substrát cílené biologické terapie. Statisticky významný vztah exprese mdm-2, p16 a nm-23 k histologickému grade nebyl nalezen.

77

10

OBRAZOVÁ DOKUMENTACE

Obrázek 1. Synoviální sarkom, bifázický. Barvení hematoxylin – eozinem, původní zvětšení 200x.

Obrázek 2. Synoviální sarkom, bifázický. Imunoreakce s protilátkou proti cyklinu D1 s pozitivními jádry epiteloidní komponenty. Původní zvětšení 400x.

78

Obrázek 3. Vysoký Ki-67 proliferační index u případu maligního fibrózního histiocytomu. Původní zvětšení 400x.

Obrázek 4. Makrofotografie TMA řezu. Imunohistologie s protilátkou proti EGFR.

79

Obrázek 5. Membránová pozitivita při imunohistologii s protilátkou proti EGFR v případě maligního fibrózního histiocytomu. Původní zvětšení 400x

Obrázek 6. p53 pozitivní konvenční leiomyosarkom, histologický grade 3. Původní zvětšení 400x.

80

11

SOUHRN Na souboru 101 primárních sarkomů měkkých tkání končetin a trupu dospělých pacientů,

neléčených jinak neţ chirurgicky byla nepřímou imunohistochemií vyšetřována exprese proteinů s potenciálním prognostickým významem, proliferačního antigenu Ki-67, p53, mdm2, cyklinu D1, p16, nm-23 a EGFR, kromě Ki-67 s pouţitím tkáňových microarrays. Soubor zahrnoval sarkomy různých histologických typů a subtypů, a byl tvořen 15 sarkomy s histologickým grade 2, 28 tumory histologického grade 3 a 58 sarkomy grade 3. Frakce proliferujících buněk (Ki-67 proliferační index) byla v rozmezí 1,3 – 75,5 %. Nukleární akumulace p53 byla zaznamenána u 25 případů (24,75 %), overexprese mdm-2 u 63 případů (62,38 %). Overexprese cyklinu D1 byla pozorována u 29 případů (28,71 %). Exprese p16 byla alterována u 94 případů (93,07 %), a nm-23 u 42 případů (41,58 %). EGFR byl pozitivní u 45 (44,55 %) z celkového počtu 101 sarkomů měkkých tkání Byla prokázána statisticky vysoce signifikantní korelace Ki-67 proliferačního indexu s počtem mitotických figur a Ki-67 proliferačního indexu, exprese p53, cyklinu D1 a EGFR s histologickým grade sarkomů, stanoveným dle schématu FNCLCC. Výsledky studie ukazují na moţnost vyuţít imunohistochemicky vyšetřovanou expresi p53, cyklinu D1, EGFR a Ki-67 proliferační index jako uţitečný doplněk konvenčních histologických gradingových metod u sarkomů měkkých tkání, zvláště u v současné době populárních malých bioptických vzorků, které jsou pro klasické gradingové systémy málo vhodné.

81

12

SUMMARY 101 patients, 51 men and 50 women, from 1989 to 2008, were diagnosed with a primary

adult soft tissue sarcoma of the trunk and extremities. To identify immunohistochemical markers of potential prognostic significance in adult soft tissue sarcomas and to correlate their expression with the histological grade, the immunohistochemical analysis of Ki-67, p53, mdm-2, cyclin D1, p16, nm-23 and EGFR was carried out on tissue microarrays constructed from the formalin-fixed paraffin-embedded tissue blocks, except Ki-67 labelling index, for which the whole tissue block sections were used. The cases consisted of various types of soft tissue sarcoma, 15 tumours were histological grade 1, 28 sarcomas were grade 2 and 58 tumours were grade 3 determined according to the FNCLCC scheme. The fraction of proliferating cells – Ki-67 labelling index – varied from 1.3 to 75.5 %. Nuclear accumulation of p53 was observed in 25 cases (24.75 %) and overexpression of mdm-2 in 63 tumours (62.38 %). Overexpression of cyclin D1 was seen in 29 cases (28.71 %). Expression of p16 and nm-23 was altered in 95 (94%) and 42 (41.58 %) tumours, respectively. EGFR positivity was found in 45 sarcomas (44.55 %). There was strong statistical correlation between the Ki-67 labelling index, the nuclear accumulation of p53, expression of cyklin D1 and EGFR and the histological grade. The results of this study show that the immunohistochemical evaluation of expression of p53, cyclin D1, EGFR and Ki-67 labelling index is potential valuable adjunct of the conventional grading systems for soft tissue sarcomas, especially in the currently popular small core needle biopsy samples.

82

13

SEZNAM PUBLIKACÍ AUTORA

13.1 PUBLIKACE 1. Veselý K, Jurajda M, Veselá M, Nenutil R. Expression of p53, cyclin D1 and EGFR is correlated with histological grade of adult soft tissue sarcomas: a study on tissue microarrays. Neoplasma 2009. Přijato k tisku 2. Veselská R, Hermanová M, Loja T, Chlapek P, Zambo I, Veselý K, Zitterbart K, Štěrba J. Nestin expression in osteosarcomas and derivation of nestin/CD133 positive osteosarcoma cell lines. BMC Cancer. 2008 Oct 16;8(1):300. 3. Adam Z, Pour L, Krejčí M, Štĕpánková S, Svobodová I, Veselý K, Hájek R. Poškození ledvin při mnohočetném myelomu a dalších monoklonálních gamapatiích. Vnitr Lek. 2008;54(9):847-61. 4. Adam Z, Křikavová L, Krejčí M, Mechl M, Pour L, Moulis M, Vaníček J, Neumann C, Navrátil M, Veselý K, Vorlíček J. Léčba mnohočetné angiomatózy postihující skelet, břišní i hrudní dutinu interferonem α,thalidomidem a zoledronátem. Vnitřní Lékařství 2008; 54(6):653-64. 5. Jedlička V, Doleţel J, Vlček P, Peštál A, Veselý K, Bednařík O, Čapov I. Metastazektomie vícečetných plicních metastáz nízce diferencovaného synoviálního sarkomu. Rozhl Chir. 2007;86(2):85-8. 6. Smilek P, Dušek L, Veselý K, Rottenberg J, Kostřica R. Correlation of Expression of Ki67, EGFR, c-erbB-2,MMP-9, p53, bcl-2, CD34 and Cell Cycle Analysis with Survival in Head and Neck Squamous Cell Cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2006;25(4):549-55. 7. Smilek P, Dušek L, Veselý K, Kostřica R, Rottenberg J. Význam mitoticko-apoptotického indexu a DNA flow-cytometrie v prognóze karcinomů hlavy a krku. Otorinolaryngologie a foniatrie. 2005;54(4):199-205. 8. Smilek P, Dušek L, Veselý K, Rottenberg J, Kostřica R. Prognostic significance of mitotic and apoptotic index and the DNA cytometry in head and neck cancer. Neoplasma, 2005;52(3):199-207. 9. Veselý K, Krpenský A, Jedlička V. Solitární fibrózní tumor plic. Klinická onkologie 2003;6:272-275.

83 10. Smilek P, Kostřica R, Rottenberg J, Hloţek J, Dušek L, Veselý K. Prognostické faktory karcinomu faryngu a supraglottis. Choroby hlavy a krku, Slovenská republika 2002;1:2329. 11. Hušek K, Veselý K. Extraorbital giant cell angiofibroma. Česko-slovenská patologie a soudní lékařství 2002;38(3):117-20. 12. Hušek K, Veselý K. Pleomorphic hyalinizing angiectatic tumor. Česko-slovenská patologie a soudní lékařství 2001;37(4):177-81. 13. Vagunda V, Veselý K, Pochmon D. Stanovení apoptitického a mitotického indexu u maligních non-Hodgkinských lymfomů: metodická studie. Klinická onkologie 1999;2:5657.

13.2 ABSTRAKTA 1. Loja T, Chlapek P, Hermanová M, Zambo I, Veselý K, Zitterbart K, Štěrba J, Veselská R. The identification of cells with cancer stem cell phenotype in pediatric solid tumors. XIX. Biologické dny - Biologický výzkum pro lidské zdraví. Hradec Králové, 2008. 2. Jurajda M, Veselý K. Současné technické moţnosti telepatologie - naše zkušenosti se systémem APERIO. MEFANET, Brno 2008 3. Veselská R, Hermanová M, Loja T, Chlapek P, Zambo I, Veselý K, Zitterbart K, Štěrba J. The identification of cells with cancer stem cell phenotype in osteosarcomas. International Journal of Mol. Medicine 2008; 22 (Sup.)1: 49. The 13th World Congress on Advances in Oncology and the 11th International Symposium on Molecular Medicine. Athens: Spandidos Ltd., 2008. 4. Adámková-Krákorová D, Brančíková D, Bednařík O, Janíček P, Jelínek O, Veselý K. Bone and Soft Tissue Tumours, Multidisciplinary Management: the Czech Experience. Abstracts of 19th International Congress on Anti-Cancer Treatment (ICACT), 5-8.2.2008, Paříţ, Francie. 5. Veselý K, Adam Z, Hofstädter F, Černý J. Interdigitating dendritic cell sarcoma – a case report. Sborník abstrakt, s. 45 ISBN 978-80-7368-331-3. 15. sjezd českých a slovenských patologů společně se 15. Sjezdem České společnosti histologických laborantů 29.31.8.2007, Roţnov pod Radhoštěm.

84 6. Adámková-Krákorová D, Veselý K, Spurný V, Brančíková D. Overexprese HER-2/neu a mutace genu p53 u high-grade osteosarkomů dospělého věku – naše zkušenosti. Edukační sborník XXX. Brněnské onkologické dny s XX. Konferencí pro sestry a laboranty, str. 281, 11.-13. května 2006, Brno. 7. Neuwirthová J, Smilek P, Veselý K, Rottenberg J, Kostřica R, Mechl Z. Význam stanovení EGFR u spinocelulárních karcinomů hlavy a krku. Edukační sborník XXX. Brněnské onkologické dny s XX. Konferencí pro sestry a laboranty, str. 246, 11.-13. května 2006, Brno. 8. Veselý K, Hušek K, Černý J. Vaskulární leiomyom hlubokých měkkých tkání. Poster. Sborník abstrakt, s. 84. ISBN 80-7368-070-X. 13. sjezd českých a slovenských patologů společně se 13. Sjezdem České společnosti histologických laborantů 14. - 16. září 2005, Roţnov pod Radhoštěm. 9. Smilek P, Dušek L, Veselý K, Kostřica R, Rottenberg J. Predictive parameters of the head and neck carcinomas. In Abstract book, s2, 18. IFOS World Congress. International Federation of Oto-Rhino-Laryngological Societies, 2005. Řím, Itálie. 10. Smilek P, Kostřica R, Rottenberg J, Veselý K, Dušek L. Predictive parameters of the waldeyers ring carcinomas (a retrospective study). Abstract Book, s. 234-234. 5th European congress of Oto-Rhino-Laryngology Head and Neck Surgery, 2005, Athény, Řecko. 11. Kostřica R, Smilek P, Rottenberg J, Hloţek J, Dušek L, Veselý K. Prognostic factors of the Pharynx and supraglottic Carcinoma. In HNO Informationen. s. 139-139. ISBN 03 4493 19. 29. setkání německých otolaryngologù, 2004, Stuttgart, Spolková republika Německo.

85

14

POUŽITÁ LITERATURA

1. Ahlen J, Wejde J, Brosjo O, et al. Insulin-like growth factor type 1 receptor expression correlates to good prognosis in highly malignant soft tissue sarcoma. Clin Cancer Res. 2005;11:206-16. 2. Alho A, Skjeldal S, Melvik JE, et al. The clinical importance of DNA synthesis and aneuploidy in bone and soft tissue tumours. Anticancer Res. 1993;13:2383-7. 3. Alvegård TA, Berg NO. Histopathology peer review of high-grade soft tissue sarcoma: the Scandinavian Sarcoma Group experience. J Clin Oncol. 1989;7:1845-51. 4. Amir G, Issakov J, Meller I, et al. Expression of p53 gene product and cell proliferation marker Ki-67 in Ewing's sarcoma: correlation with clinical outcome. Hum Pathol. 2002;33:170-4. 5. Anderson J, Gordon T, McManus A, et al. Detection of the PAX3-FKHR fusion gene in paediatric rhabdomyosarcoma: a reproducible predictor of outcome? Br J Cancer. 2001;85:831–835. 6. Anderson SE, Nonaka D, Chuai S, et al. p53, epidermal growth factor, and plateletderived growth factor in uterine leiomyosarcoma and leiomyomas. Int J Gynecol Cancer. 2006;16:849-53. 7. Arbiser ZK, Folpe AL, Weiss SW. Consultative (expert) second opinions in soft tissue pathology. Analysis of problem-prone diagnostic situations. Am J Clin Pathol. 2001;116:473-6. 8. Baptista AM, Camargo OP, Croci AT, et al. Synovial sarcoma of the extremities: prognostic factors for 20 nonmetastatic cases and a new histologic grading system with prognostic significance. Clinics. 2006;61:381-6. 9. Barrios C, Castresana JS, Kreicbergs A. Clinicopathologic correlations and short-term prognosis in musculoskeletal sarcoma with c-myc oncogene amplification. Am J Clin Oncol. 1994;17:273-6. 10. Belev B, Alerić I, Vrbanec D, et al. Nm23 gene product expression in invasive breast cancer. Acta Oncol. 2002;41:355-61. 11. Benassi MS, Gamberi G, Magagnoli G, et al. Metalloproteinase expression and prognosis in soft tissue sarcomas. Ann Oncol. 2001;12:75-80. 12. Benassi MS, Molendini L, Gamberi G, et al. Involvement of INK4A gene products in the pathogenesis and development of human osteosarcoma. Cancer. 2001;92:3062-7.

86

13. Benassi MS, Ragazzini P, Gamberi G, et al. Adhesion molecules in high-grade soft tissue sarcomas: correlation to clinical outcome. Eur J Cancer. 1998;34:496-502 14. Bode B, Frigerio S, Behnke S, et al. Mutations in the tyrosine kinase domain of the EGFR gene are rare in synovial sarcoma. Mod Pathol. 2006;19:541-7. 15. Borden EC, Baker LH, Bell RS, et al. Soft tissue sarcomas of adults: state of the translational science. Clin Cancer Res. 2003;9:1941-56. 16. Brinck U, Cordon-Cardo C, Stachura J, et al. Proposal of a new grading system for malignant fibrous histiocytomas. Anticancer Res. 2005;25:4293-8. 17. Brown FM, Fletcher CD. Problems in grading soft tissue sarcomas. Am J Clin Pathol. 2000;114 Suppl:S82-9. 18. Clark MA, Fisher C, Judson I, et al. Soft-tissue sarcomas in adults. N Engl J Med. 2005;353:701-11. 19. Cobben DC, Elsinga PH, Suurmeijer AJ, et al. Detection and grading of soft tissue sarcomas of the extremities with (18)F-3'-fluoro-3'-deoxy-L-thymidine. Clin Cancer Res. 2004;10:1685-90. 20. Coindre JM, Terrier P, Guillou L, et al. Predictive value of grade for metastasis development in the main histologic types of adult soft tissue sarcomas: a study of 1240 patients from the French Federation of Cancer Centers Sarcoma Group. Cancer. 2001;91:1914–1926. 21. Coindre JM, Trojani M, Contesso G, et al. Reproducibility of a histopathologic grading system for adult soft tissue sarcoma. Cancer. 1986;58:306–309. 22. Coindre JM. Grading of soft tissue sarcomas: review and update. Arch Pathol Lab Med. 2006;130:1448-53. 23. Collin F, Chassevent A, Bonichon F, et al. Flow cytometric DNA content analysis of 185 soft tissue neoplasms indicates that S-phase fraction is a prognostic factor for sarcomas. French Federation of Cancer Centers (FNCLCC) Sarcoma Group. Cancer. 1997;79:2371-9. 24. Cordon-Cardo C, Latres E, Drobnjak M, et al. Molecular abnormalities of mdm2 and p53 genes in adult soft tissue sarcomas. Cancer Res. 1994;54:794-9 25. Cordon-Cardo C. Mutations of cell cycle regulators. Biological and clinical implications for human neoplasia. Am J Pathol. 1995;147:545-60. 26. Cormier JN, Pollock RE. Soft tissue sarcomas. CA Cancer J Clin. 2004;54:94-109.

87

27. Costa J, Wesley RA, Glatstein E, et al. The grading of soft tissue sarcomas. Results of a clinicohistopathologic correlation in a series of 163 cases. Cancer. 1984;53:530-41. 28. Daugaard S, Mooi WJ, Harris M. Is histological grading of value for the prognosis of soft tissue sarcomas? Eur J Cancer. 1997;33:521-5. 29. de Bree R, van der Valk P, Kuik DJ, et al. Prognostic factors in adult soft tissue sarcomas of the head and neck: a single-centre experience. Oral Oncol. 2006 Aug;42:703-9. 30. Drobnjak M, Latres E, Pollack D, et al. Prognostic implications of p53 nuclear overexpression and high proliferation index of Ki-67 in adult soft-tissue sarcomas. J Natl Cancer Inst. 1994;86:549-54. 31. D'Souza RJ, Sheikh ZA, Busund LT, et al. Expression of nm23 protein in adult soft tissue sarcoma is correlated with histological grade. Anticancer Res. 2003;23:3289-94. 32. Dušek L, Muţík J, Kubásek M, et al. Český národní webový portál epidemiologie nádorů [online]. Masarykova univerzita, [2005], [cit. 2008-6-13]. Dostupný z WWW: http://www.svod.cz. Verze 7.0 [2007], ISSN 1802 – 8861. 33. Endl E, Gerdes J. The Ki-67 protein: fascinating forms and an unknown function. Exp Cell Res. 2000;257:231-7. 34. Engellau J, Bendahl PO, Persson A, et al. Improved prognostication in soft tissue sarcoma: independent information from vascular invasion, necrosis, growth pattern, and immunostaining using whole-tumor sections and tissue microarrays. Hum Pathol. 2005;36:994-1002. 35. Fletcher CD. The evolving classification of soft tissue tumours: an update based on the new WHO classification. Histopathology. 2006;48:3-12. 36. Fletcher CDM, Unni KK, Mertens F, eds. Pathology and Genetics of Tumours of Soft Tissue and Bone. World Health Organization Classification of Tumours; vol 5. Lyon, France: IARC Press; 2002. 37. Gerdes J, Lemke H, Baisch H, et al. Cell cycle analysis of a cell proliferationassociated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67 J Immunol. 1984;133:1710-5. 38. Graadt Van Roggen. The histopathological grading of soft tissue tumours: current concepts. Current Diagnostic Pathology. 2001;7:1-7.

88

39. Graham AN, Maxwell P, Mulholland K, et al. Increased nm23 immunoreactivity is associated with selective inhibition of systemic tumour cell dissemination. J Clin Pathol. 2002;55:184-9. 40. Gruttadauria S, Doria C, Minervini MI, et al. Malignant fibrous histiocytoma of the gallbladder: case report and review of the literature. Am Surg. 2001;67:714-7. 41. Guillou L, Benhattar J, Bonichon F, et al. Histologic grade, but not SYT-SSX fusion type, is an important prognostic factor in patients with synovial sarcoma: a multicenter, retrospective analysis. J Clin Oncol. 2004;22:4040-50. 42. Guillou L, Coindre JM, Bonichon F, et al. Comparative study of the National Cancer Institute and French Federation of Cancer Centers Sarcoma Group grading systems in a population of 410 adult patients with soft tissue sarcoma. J Clin Oncol. 1997;15:35062. 43. Guillou L, Coindre JM. How should we grade soft tissue sarcomas and what are the limitations? Pathol Case Review. 1998;3:1–6. 44. Gustafson P, Akerman M, Alvegård TA, et al. Prognostic information in soft tissue sarcoma using tumour size, vascular invasion and microscopic tumour necrosis-the SIN-system. Eur J Cancer. 2003;39:1568-76. 45. Gustafson P. Soft tissue sarcoma. Epidemiology and prognosis in 508 patients. Acta Orthop Scand Suppl. 1994;259:1-31. 46. Hasegawa T, Yamamoto S, Matsuno Y. Quantitative immunohistochemical evaluation of MIB-1 labeling index in adult soft-tissue sarcomas by computer-assisted image analysis. Pathol Int. 2002;52:433-7. 47. Hasegawa T, Yamamoto S, Yokoyama R, et al. Prognostic significance of grading and staging systems using MIB-1 score in adult patients with soft tissue sarcoma of the extremities and trunk. Cancer. 2002;95:843-51. 48. Hasegawa T, Yokoyama R, Lee YH, et al. Prognostic relevance of a histological grading system using MIB-1 for adult soft-tissue sarcoma. Oncology. 2000;58:66-74. 49. Hasegawa T, Yokoyama R, Matsuno Y, et al. Prognostic significance of histologic grade and nuclear expression of beta-catenin in synovial sarcoma. Hum Pathol. 2001;32:257-63. 50. Hasegawa T. Histological grading and MIB-1 labeling index of soft-tissue sarcomas. Pathol Int. 2007;57:121-5.

89

51. Hashimoto H, Daimaru Y, Takeshita S, et al. Prognostic significance of histologic parameters of soft tissue sarcomas. Cancer. 1992;70:2816-22. 52. Heise HW, Myers MH, Russell WO, et al. Recurrence-free survival time for surgically treated soft tissue sarcoma patients. Multivariate analysis of five prognostic factors. Cancer. 1986;57:172-7. 53. Heslin MJ, Cordon-Cardo C, Lewis JJ, et al. Ki-67 detected by MIB-1 predicts distant metastasis and tumor mortality in primary, high grade extremity soft tissue sarcoma. Cancer. 1998;83:490-7. 54. Hirota S, Isozaki K, Moriyama Y, et al. Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors. Science. 1998;279:577-80. 55. Hoos A, Stojadinovic A, Mastorides S, et al. High Ki-67 proliferative index predicts disease specific survival in patiens with high-risk soft tissue sarcomas. Cancer. 2001;92:869-74. 56. Huang HY, Lal P, Qin J, et al. Low-grade myxofibrosarcoma: a clinicopathologic analysis of 49 cases treated at a single institution with simultaneous assessment of the efficacy of 3-tier and 4-tier grading systems. Hum Pathol. 2004;35:612-21. 57. Hynes NE, Lane HA. ERBB receptors and cancer: the complexity of targeted inhibitors. Nat Rev Cancer. 2005;5:341-54. 58. Chin L, Pomerantz J, DePinho RA. The INK4a/ARF tumor suppressor: one gene--two products--two pathways. Trends Biochem Sci. 1998;23:291-6. 59. Jensen V, Sørensen FB, Bentzen SM, et al. Proliferative activity (MIB-1 index) is an independent prognostic parameter in patients with high-grade soft tissue sarcomas of subtypes other than malignant fibrous histiocytomas: a retrospective immunohistological study including 216 soft tissue sarcomas. Histopathology. 1998;32:536-46. 60. Kahara N, Ozaki T, Doi T, et al. CD44 expression in soft tissue sarcomas. Virchows Arch. 2000;436:574-8. 61. Kandel RA, Bell RS, Wunder JS, et al. Comparison between a 2- and 3-grade system in predicting metastatic-free survival in extremity soft-tissue sarcoma. J Surg Oncol. 1999;72:77-82. 62. Kawaguchi K, Oda Y, Saito T, et al. Mechanisms of inactivation of the p16INK4a gene in leiomyosarcoma of soft tissue: decreased p16 expression correlates with promoter methylation and poor prognosis. J Pathol. 2003;201:487-95.

90

63. Kawai A, Woodruff J, Healey JH, et al. SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma. N Engl J Med. 1998;338:153-60. 64. Kersting C, Packeisen J, Leidinger B, et al. Pitfalls in immunohistochemical assessment of EGFR expression in soft tissue sarcomas. J Clin Pathol. 2006;59:58590. 65. Kim SH, Kim JW, Kim YT, et al. Prognostic factors and expression of p53 and mdm2 in uterine sarcomas. Int J Gynaecol Obstet. 2006;95:272-7. 66. Kim SH, Lewis JJ, Brennan MF, et al. Overexpression of cyclin D1 is associated with poor prognosis in extremity soft-tissue sarcomas. Clin Cancer Res. 1998;4:2377-82. 67. Kotilingam D, Lev DC, Lazar AJ, et al. Staging soft tissue sarcoma: evolution and change. CA Cancer J Clin. 2006;56:282-91. 68. Kratzke RA, Greatens TM, Rubins JB, et al. Rb and p16INK4a expression in resected non-small cell lung tumors. Cancer Res. 1996;56:3415-20. 69. Kroese MC, Rutgers DH, Wils IS, et al. The relevance of the DNA index and proliferation rate in the grading of benign and malignant soft tissue tumors. Cancer. 1990;65:1782-8. 70. Ladanyi M, Antonescu CR, Leung DH, et al. Impact of SYT-SSX fusion type on the clinical behavior of synovial sarcoma: a multi-institutional retrospective study of 243 patients. Cancer Res. 2002;62:135–140. 71. Lane DP. p53, guardian of the genome. Nature. 1992;358:15-6 72. Levine AJ, Perry ME, Chang A, et al. The 1993 Walter Hubert Lecture: the role of the p53 tumour-suppressor gene in tumorigenesis. Br J Cancer. 1994;69:409-16. 73. Liao WM, Chiu KY, Li FB, et al. Expression of nm23 protein in human osteosarcoma in relationship with early metastasis. Orthopedics. 2000;23:1175-8. 74. Lin CN, Chou SC, Li CF, et al. Prognostic factors of myxofibrosarcomas: implications of margin status, tumor necrosis, and mitotic rate on survival. J Surg Oncol. 2006;93:294-303. 75. Mandard AM, Petiot JF, Marnay J, et al. Prognostic factors in soft tissue sarcomas. A multivariate analysis of 109 cases. Cancer. 1989;63:1437-51. 76. Markhede G, Angervall L, Stener B. A multivariate analysis of the prognosis after surgical treatment of malignant soft-tissue tumors. Cancer. 1982;49:1721-33.

91

77. Maula S, Huuhtanen RL, Blomqvist CP, et al. The adhesion molecule CD44v6 is associated with a high risk for local recurrence in adult soft tissue sarcomas. Br J Cancer. 2001;84:244-52. 78. McCormick D, Chong H, Hobbs C, et al. Detection of the Ki-67 antigen in fixed and wax-embedded sections with the monoclonal antibody MIB1. Histopathology. 1993;22:355-60. 79. Miettinen M. Diagostic Soft Tissue Pathology. 1st ed. Churchill Livingstone, 2003. 593 str. ISBN 0443066116 80. Nakanishi H, Ohsawa M, Naka N, et al. Immunohistochemical detection of bcl-2 and p53 proteins and apoptosis in soft tissue sarcoma: their correlations with prognosis. Oncology. 1997;54:238-44. 81. Nielsen GP, Burns KL, Rosenberg AE, et al. CDKN2A gene deletions and loss of p16 expression occur in osteosarcomas that lack RB alterations. Am J Pathol. 1998;153:159-63. 82. Nijhuis PH, Schaapveld M, Otter R, et al. Epidemiological aspects of soft tissue sarcomas (STS)--consequences for the design of clinical STS trials. Eur J Cancer. 1999;35:1705-10. 83. Nilsson G, Skytting B, Xie Y, et al. The SYT-SSX1 variant of synovial sarcoma is associated with a high rate of tumor cell proliferation and poor clinical outcome. Cancer Res. 1999;59:3180-4. 84. Oberlin O, Deley MC, Bui BN, et al. Prognostic factors in localized Ewing's tumours and peripheral neuroectodermal tumours: the third study of the French Society of Paediatric Oncology (EW88 study). Br J Cancer. 2001;85:1646-54. 85. Oda Y, Sakamoto A, Satio T, et al. Molecular abnormalities of p53, MDM2, and H-ras in synovial sarcoma. Mod Pathol. 2000;13:994-1004. 86. Oda Y, Tamiya S, Oshiro Y, et al. Reassessment and clinicopathological prognostic factors of malignant fibrous histiocytoma of soft parts. Pathol Int. 2002;52:595-606. 87. Oda Y, Yamamoto H, Takahira T, et al. Frequent alteration of p16(INK4a)/p14(ARF) and p53 pathways in the round cell component of myxoid/round cell liposarcoma: p53 gene alterations and reduced p14(ARF) expression both correlate with poor prognosis. J Pathol. 2005;207:410-21. 88. Oliner JD, Kinzler KW, Meltzer PS, et al. Amplification of a gene encoding a p53associated protein in human sarcomas. Nature. 1992;358:80-3.

92

89. Oliveira AM, Fletcher CD. Molecular prognostication for soft tissue sarcomas: are we ready yet? J Clin Oncol. 2004;22:4031-4. 90. O'Reilly PE, Raab SS, Niemann TH, et al. p53, proliferating cell nuclear antigen, and Ki-67 expression in extrauterine leiomyosarcomas. Mod Pathol. 1997;10:91-7. 91. Orlow I, Drobnjak M, Zhang ZF, et al. Alterations of INK4A and INK4B genes in adult soft tissue sarcomas: effect on survival. J Natl Cancer Inst. 1999;91:73-9. 92. Palmer HE, Mukunyadzi P, Culbreth W, et al. Subgrouping and grading of soft-tissue sarcomas by fine-needle aspiration cytology: a histopathologic correlation study. Diagn Cytopathol. 2001;24:307-16. 93. Plaat BE, Muntinghe FL, Molenaar WM, et al. Clinical outcome of patients with previously untreated soft tissue sarcomas in relation to tumor grade, DNA ploidy and karyotype. Int J Cancer. 1997;74:396-402. 94. Ranson M. Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors. Br J Cancer. 2004;90:2250-5. 95. Royds JA, Robinson MH, Stephenson TJ, et al. The association between nm23 gene expression and survival in patients with sarcomas. Br J Cancer. 1997;75:1195-200. 96. Russell WO, Cohen J, Enzinger F, et al. A clinical and pathological staging system for soft tissue sarcomas. Cancer. 1977;40:1562-70. 97. Sabah M, Cummins R, Leader M, et al. Immunoreactivity of p53, Mdm2, p21(WAF1/CIP1) Bcl-2, and Bax in soft tissue sarcomas: correlation with histologic grade. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2007;15:64-9. 98. Saito T, Oda Y, Yamamoto H, et al. Nuclear beta-catenin correlates with cyclin D1 expression in spindle and pleomorphic sarcomas but not in synovial sarcoma. Hum Pathol. 2006;37:689-97. 99. Sato O, Wada T, Kawai A et al. Expression of epidermal growth factor receptor, HER2/neu, and CD117/c-kit in adult soft tissue sarcomas: A clinicopathological study of 281 cases. Cancer 2005;103:1881–90. 100. Sawhney N, Hall PA. Ki67 - structure, function, and new antibodies. J Pathol. 1992;168:161-2. 101. Scott RJ, Hall PA, Haldane JS, et al. A comparison of immunohistochemical markers of cell proliferation with experimentally determined growth fraction. J Pathol. 1991;165:173-8.

93

102. Segal NH, Pavlidis P, Antonescu CR, et al. Classification and subtype prediction of adult soft tissue sarcoma by functional genomics. Am J Pathol. 2003;163:691-700. 103. Shen J, Scotlandi K, Baldini N, et al. Prognostic significance of nuclear accumulation of c-myc and mdm2 proteins in synovial sarcoma of the extremities. Oncology. 2000;58:253-60. 104. Schneider-Stock R, Onnasch D, Haeckel C, et al. Prognostic significance of p53 gene mutations and p53 protein expression in synovial sarcomas. Virchows Arch. 1999;435:407-12. 105. Schneider-Stock R, Ziegeler A, Haeckel C, et al. Prognostic relevance of p53 alterations and Mib-1 proliferation index in subgroups of primary liposarcomas. Clin Cancer Res. 1999;5:2830-5. 106. Sibilia M, Kroismayr R, Lichtenberger BM, et al. The epidermal growth factor receptor: from development to tumorigenesis. Differentiation. 2007;75:770-87. 107. Sneath RJ, Mangham DC. CD44 isoform expression in synovial sarcoma correlates with epitheliogenesis but not prognosis. Histopathology. 2000;37:166-74. 108. Sorensen PH, Lynch JC, Qualman SJ, et al. PAX3-FKHR and PAX7-FKHR gene fusions are prognostic indicators in alveolar rhabdomyosarcoma: a report from the Children’s Oncology Group. J Clin Oncol. 2002;20:2672–2679. 109. Stojadinovic A, Leung DH, Hoos A, et al. Analysis of the prognostic significance of microscopic margins in 2,084 localized primary adult soft tissue sarcomas. Ann Surg. 2002;235:424-34. 110. Tateishi U, Hasegawa T, Beppu Y, et al. Prognostic significance of grading (MIB-1 system) in patients with myxoid liposarcoma. J Clin Pathol. 2003;56:579-82. 111. Terasaki H, Niki T, Hasegawa T, et al. Primary synovial sarcoma of the lung: a case report confirmed by molecular detection of SYT-SSX fusion gene transcripts. Jpn J Clin Oncol. 2001;31:212-6. 112. Trassard M, Le Doussal V, Hacène K, et al. Prognostic factors in localized primary synovial sarcoma: a multicenter study of 128 adult patients. J Clin Oncol. 2001;19:525-34. 113. Trojani M, Contesso G, Coindre JM, et al. Soft tissue sarcomas of adults: study of pathological prognostic variables and definition of histopathological grading system. Int J Cancer. 1984;33:37–42.

94 114. Trovik CS, Bauer HC, Alvegård TA, et al. Surgical margins, local recurrence and metastasis in soft tissue sarcomas: 559 surgically-treated patients from the Scandinavian Sarcoma Group Register. Eur J Cancer. 2000;36:710-6. 115. Ueda T, Aozasa K, Tsujimoto M, et al. Pognostic significance of Ki-67 reactivity in soft tissue sarcomas. Cancer. 1989;63:1607-11. 116. van Dalen T, Hennipman A, Van Coevorden F, et al. Evaluation of a clinically applicable post-surgical classification system for primary retroperitoneal soft-tissue sarcoma. Ann Surg Oncol. 2004;11:483-90. 117. van Unnik JA, Coindre JM, Contesso C, et al. Grading of soft tissue sarcomas: experience of the EORTC Soft Tissue and Bone Sarcoma Group. Eur J Cancer. 1993;29A:2089-93. 118. Wachtel M, Runge T, Leuschner I, et al. Subtype and prognostic classification of rhabdomyosarcoma by immunohistochemistry. J Clin Oncol. 2006;24:816-22. 119. Wang YF, Chen JY, Chang SY, et al. Nm23-H1 expression of metastatic tumors in the lymph nodes is a prognostic indicator of oral squamous cell carcinoma. Int J Cancer. 2008;122:377-86. 120. Weng WH, Ahlen J, Astrom K, et al. Prognostic impact of immunohistochemical expression of ezrin in highly malignant soft tissue sarcomas. Clin Cancer Res. 2005;11:6198-204. 121. West CC, Brown NJ, Mangham DC, et al. Microvessel density does not predict outcome in high grade soft tissue sarcoma. Eur J Surg Oncol. 2005;31:1198-205. 122. Wurl P, Meye A, Lautenschlager C, et al. Clinical relevance of pRb and p53 cooverexpression in soft tissue sarcomas. Cancer Lett. 1999;139:159-65. 123. Würl P, Taubert H, Meye A, et al. Prognostic value of immunohistochemistry for p53 in primary soft-tissue sarcomas: a multivariate analysis of five antibodies. J Cancer Res Clin Oncol. 1997;123:502-8. 124. Yan P, Coindre JM, Benhattar J, et al. Telomerase activity and human telomerase reverse transcriptase mRNA expression in soft tissue tumors: correlation with grade, histology, and proliferative activity. Cancer Res. 1999;59:3166-70. 125. Yarden Y. The EGFR family and its ligands in human cancer. signalling mechanisms and therapeutic opportunities. Eur J Cancer. 2001;37 Suppl 4:S3-8. 126. Yoo J, Park SY, Kang SJ, et al. Altered expression of G1 regulatory proteins in human soft tissue sarcomas. Arch Pathol Lab Med. 2002;126:567-73.

95

127. Zagars GK, Ballo MT, Pisters PW, et al. Prognostic factors for patients with localized soft-tissue sarcoma treated with conservation surgery and radiation therapy: an analysis of 225 patients. Cancer. 2003;97:2530-43. 128. Zagars GK, Ballo MT, Pisters PW, et al. Surgical margins and reresection in the management of patients with soft tissue sarcoma using conservative surgery and radiation therapy. Cancer. 2003;97:2544-53. 129. Zhai YL, Nikaido T, Toki T, et al. Prognostic significance of bcl-2 expression in leiomyosarcoma of the uterus. Br J Cancer. 1999;80:1658-64. 130. Zhang Y, Xiong Y, Yarbrough WG. ARF promotes MDM2 degradation and stabilizes p53: ARF-INK4a locus deletion impairs both the Rb and p53 tumor suppression pathways. Cell. 1998;92:725-34. 131. Ţaloudík J, Talač R, Vagunda V, et al. Sarkomy měkkých tkání – přehled novějších diagnostických a léčebných postupů. Klinická onkologie. 2000;13:143-150.