Praktická cvičení z biologie Zimní semestr

Univerzita Palackého v Olomouci Ústav biologie, Lékařská fakulta

Praktická cvičení z biologie Zimní semestr

Olomouc 2014

Podpořeno projektem EU: Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci, reg. č. CZ.1.07/2.2.00/28.0088

© kolektiv autorů, Ústav biologie LF UP Olomouc

2

v20140903

Obsah 1.

2.

3.

4.

5.

Úvodní praktické cvičení ........................................................................................................... 5 1.1

Náplň předmětu ................................................................................................................................. 5

1.2

Bezpečnostní pokyny......................................................................................................................... 5

1.3

Organizační pokyny........................................................................................................................... 5

1.4

Studijní materiály .............................................................................................................................. 5

Mikroskopická technika ............................................................................................................ 6 2.1

Základy pozorování mikroskopických objektů ................................................................................. 6

2.2

Měření délky mikroskopických objektů (demonstračně) .................................................................. 8

2.3

Měření výšky mikroskopických objektů ........................................................................................... 9

2.4

Určení rozlišovací schopnosti mikroskopu........................................................................................ 9

2.5

Fluorescenční mikroskopie (demonstračně) ...................................................................................... 9

Mikroorganismy ....................................................................................................................... 10 3.1

Demonstrace: Zhodnocení nárůstu po odkryvu misek .................................................................... 10

3.2

Demonstrace: Kultivace bakterií, kultivace kvasinek ..................................................................... 10

3.3

Bakterie ústní dutiny........................................................................................................................ 11

3.4

Prokaryontní buňka v nativním preparátu ....................................................................................... 12

3.5

Prokaryontní buňka v trvalém preparátu ......................................................................................... 12

3.6

Lidský vlas napadený dermatofytem ............................................................................................... 13

Struktura buněk, kultivace savčích buněk ............................................................................ 14 4.1

Stanovení životaschopnosti (viability) buněk ve tkáňových kulturách ........................................... 14

4.2

Určení morfologického typu savčích buněk a manipulace s buněčnou kulturou ............................ 15

4.3

Pozorování suspenzní buněčné kultury ........................................................................................... 15

4.4

Pozorování kolonií krevních buněk na polotuhém médiu ............................................................... 16

Genetická informace a její změny .......................................................................................... 17 5.1

Replikace ......................................................................................................................................... 17

5.2

Transkripce ...................................................................................................................................... 17

5.3

Translace.......................................................................................................................................... 18

5.4

Transkripce a translace .................................................................................................................... 18

5.5

Komplementarita tripletů................................................................................................................. 18

5.6

Alfa a beta globinový gen ................................................................................................................ 18

5.7

Beta globinový gen .......................................................................................................................... 19

5.8

Genové mutace ................................................................................................................................ 19

5.9

Mechanismus účinku chemomutagenu ............................................................................................ 20

5.10

Hemoglobin srpkovité anémie ......................................................................................................... 20

5.11

Patologický hemoglobin HbC ......................................................................................................... 20

5.12

Posunová mutace ............................................................................................................................. 20

5.13

Spontánní mutace v kultuře bakterií ................................................................................................ 20

3

v20140903

5.14

6.

Mutace a kancerogeneze.................................................................................................................. 21

Proteiny ..................................................................................................................................... 22 6.1

Pozorování precipitovaného patologického hemoglobinu na trvalém preparátu............................. 23

6.2

Demonstrace: Detekce hemoglobinopatie pomocí gelové elektroforézy ........................................ 23

6.3

Imunohistochemická detekce buněčně specifického proteinu ......................................................... 23

6.4

Důkaz hemoglobinu......................................................................................................................... 24

7.

Enzymy ...................................................................................................................................... 25 7.1

Stanovení pH optima aktivity kyselé fosfatázy ............................................................................... 27

7.2

Průkaz slinné amylázy člověka........................................................................................................ 28

7.3

Průkaz peroxidázy v krvi ................................................................................................................. 29

8.

Biomembrány a osmóza........................................................................................................... 30 8.1

Rozpad plazmatické membrány erytrocytů – chemická hemolýza ................................................. 32

8.2

Změna tvaru krvinek v hypertonickém prostředí............................................................................. 33

8.3

Průběh plazmolýzy a deplazmolýzy ................................................................................................ 33

8.4

Vznik nadmolekulární struktury autoorganizací ............................................................................. 34

8.5

Traubeho měchýřek ......................................................................................................................... 35

Buněčný cyklus, mitóza ........................................................................................................... 36

9.

9.1

Analýza buněčného cyklu pomocí průtokové cytometrie ............................................................... 37

9.2

Odhadování obsahu jaderné DNA pomocí světelného mikroskopu ................................................ 40

9.3

Mitóza rostlinné buňky .................................................................................................................... 40

9.4

Dělení buněk pučením ..................................................................................................................... 41

10.

Meióza a gametogeneze ........................................................................................................ 42

10.1

Meióza a spermatogeneze u sarančete ............................................................................................. 43

10.2

Spermatogeneze u člověka .............................................................................................................. 45

10.3

Vliv cytostatika na spermatogenezi ................................................................................................. 45

11.

Buněčná diferenciace a apoptóza......................................................................................... 46

11.1

Rýhování zygoty a vývoj zárodku ................................................................................................... 47

11.2

Měření aktivity kaspázy-3 ............................................................................................................... 47

11.3

Pozorování morfologických změn u apoptotických buněk.............................................................. 48

12.

Biologie krve. Krevní elementy ............................................................................................ 49

12.1

Odečet krevního diferenciálu........................................................................................................... 50

12.2

Krevní nátěry ................................................................................................................................... 50

12.3

Pozorování kolonií krevních buněk na polotuhém médiu ............................................................... 50

12.4

Indukce diferenciace nádorových buněk linie K562 ....................................................................... 51

13.

Onkogeny a tumor-supresorové geny (prezentace studentů) ........................................... 52

4

v20140903

1. Úvodní praktické cvičení 1.1

Náplň předmětu

Náplní zimního semestru je buněčná biologie – stručná charakteristika mikroorganismů, dále biologie živočišné buňky. Učivo navazuje na gymnaziální biologii.

1.2

Bezpečnostní pokyny

Studenti jsou povinni dbát pokynů vyučujícího, s elektrickými vodiči a přístroji zapojenými do elektrické sítě je nutno manipulovat se zvýšenou opatrností. Mimořádné události – poranění, rozbití jakéhokoli skla (včetně preparátu), rozlití roztoku, poruchu přístrojů atd. – studenti neprodleně nahlásí vyučujícímu. Rozbité sklo se vyhazuje do označené nádoby – mimo běžný odpad. V učebně pro praktická cvičení je zakázáno jíst a pít. V učebně se chováme tak, abychom předcházeli případným nehodám. Batohy a tašky na stůl ani do uličky mezi stoly nepatří.

1.3

Organizační pokyny

Do učebny přicházejí studenti přezuti, v bílém ochranném plášti a včas. Studenti jsou povinni nastudovat téma pro příslušné cvičení. Student je osobně odpovědný za svěřené přístroje, nástroje, preparáty a další pomůcky. Každý student má své stálé pracovní místo. Z každého cvičení student vypracuje protokol, který obsahuje: 1. název tématu cvičení a datum 2. pro každou úlohu zvlášť protokol obsahuje: a. název úlohy b. materiál, pomůcky c. postup (stručně, heslovitě) d. výsledek e. závěr Nahrazení zameškaného praktika je možné ve stejném výukovém týdnu po domluvě s vyučujícím, případně na konci semestru. Na konci semestru lze nahradit nejvýše 5 cvičení. Náhradu více než 5 cvičení na konci semestru musí schválit studijní oddělení.

1.4

Studijní materiály

Jako studijní materiály pro zimní semestr slouží toto skriptum, dále prezentace ze cvičení a prezentace z přednášek (vše je průběhu semestru dostupné na webu Ústavu biologie). Kromě těchto výukových materiálů je doporučeno nastudovat příslušné kapitoly z učebnice Alberts, Bray, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter: Základy buněčné biologie.

5

v20140903

2. Mikroskopická technika Cíl cvičení Seznámit se s ovládáním mikroskopu, osvojit si základy správného mikroskopování, správného záznamu pozorování v mikroskopu, pochopit souvislosti nastavení jednotlivých parametrů mikroskopu s kvalitou obrazu u různých druhů pozorovaných objektů.

2.1

Základy pozorování mikroskopických objektů

Materiál Optický mikroskop, podložní a krycí skla, mech měřík (Mnium sp.) nebo akvarijní rostlina Elodea canadensis nebo Egeria densa, suspenze fixovaných buněk linie K562, nůžky, pinzeta, Pasteurova pipeta, automatická pipeta, špičky. Postup 1) Příprava nativního preparátu Na čisté podložní sklo nakápněte kapku vody. Z lodyžky mechové rostlinky utrhněte jeden lístek, pomocí pinzety nebo preparační jehly ho ponořte pod hladinu kapky a překryjte podložním sklem. Odstraňte přebytečnou tekutinu ústřižkem buničiny, aby krycí sklo „neplavalo“, ale ne příliš, aby pod krycím sklem nevznikly prázdné plochy bez vody. 2) Zaostření objektivem 10× zvětšujícím a) Zapněte osvětlení mikroskopu, otáčením šroubu pro hrubý posuv („makrošroub“) snižte stolek a zařaďte do optické osy objektiv 10× zvětšující. Na stolek upevněte preparát a nastavte ho tak, aby byl lístek v ose paprsků, vycházejících z kondenzoru. Lístek lépe uvidíme, když zesílíme jas žárovky. Nastavte aperturní clonu na kondenzoru do přibližné pozice pro příslušný objektiv. b) Otáčením šroubu pro hrubý posuv posuňte stolek mikroskopu úplně nahoru. Pozorujte obraz v okulárech mikroskopu a zároveň postupně otáčejte šroubem pro hrubý posuv (stolek se bude pomalu posouvat dolů) až do chvíle, kdy přibližně zaostříte. U objektivu 10× zvětšujícího je vzdálenost mezi objektivem a preparátem větší a nemusíte se obávat, že byste při zaostřování poškodili preparát nebo objektiv vzájemným nárazem. c) Šroubem pro jemný posuv („mikrošroub“) doostřete. Pokud je obraz příliš jasný (přezářený), ztlumte jas žárovky točítkem v noze stativu. Posunem stolku upravte polohu preparátu tak, aby obraz buněk lístku zcela vyplňoval zorné pole. 3) Plynulý přechod na vyšší zvětšení a) Pozorovaný objekt nastavte do středu zorného pole a můžete postupně přecházet na jiná zvětšení (objektivy 20× a 40× zvětšující; případně imerzní objektiv 100× zvětšující). Všechny objektivy jsou plynule zaměnitelné, takže při přechodu na jiná zvětšení pouze otáčíte revolverovým měničem a tím měníte objektiv. Při zařazení objektivu do optické osy mikroskopu revolverový měnič jemně zacvakne v této pozici. Imerzní objektiv zatím nepoužívejte. b) Uvědomte si, že více zvětšující objektiv poskytuje obraz s menší hloubkou ostrosti. Při přechodu na vyšší zvětšení je třeba následně doostřit obraz šroubem pro jemný posuv. Upravte nastavení clony na kondenzoru podle použitého objektivu. Pokud je obraz příliš jasný nebo tmavý, upravte jas žárovky točítkem v noze stativu mikroskopu. 4) Význam správného nastavení mikroskopu pro optimální zobrazení 6

v20140903

a) Zařaďte do optické osy mikroskopu objektiv 40× zvětšující, doostřete a nastavte správně clonu na kondenzoru, upravte jas žárovky. Nyní si všimněte obrazu v mikroskopu – jak vypadají jednotlivé chloroplasty, jak vidíte buněčnou stěnu. b) Nastavte clonu kondenzoru do krajní pozice (pro objektiv 4× zvětšující) a úbytek světla kompenzujte regulací jasu žárovky. Porovnejte obraz s předchozím (správným) zobrazením. c) Nastavte clonu kondenzoru do krajní pozice (pro objektiv 100× zvětšující) a přebytek světla kompenzujte regulací jasu žárovky. Porovnejte obraz se správným zobrazením buněk. Zapište pozorované rozdíly. d) Nativní preparát mechu sundejte ze stolku mikroskopu (stolek nechejte v posledně nastavené poloze, nesnižujte ho) a tento preparát si zatím odložte. Nyní místo nativního preparátu mechu použijeme suspenzi fixovaných buněk buněčné linie K562. Na čisté podložní sklíčko naneseme automatickou pipetou 10 µl buněčné suspenze fixovaných nebarvených buněk. Kapku překryjte krycím sklíčkem. Stolek mikroskopu nesnižujte ani jej nezvedejte. Použijte objektiv 10× nebo 20× zvětšující pro zaostření – pokud jste stolek mikroskopu neposunuli dolů nebo nahoru, stačí doostřit šroubem pro jemný posuv. Upravte správně clonu kondenzoru (na hodnotu odpovídající použitému objektivu) a jas žárovky. Všimněte si, jaké struktury jste schopni rozeznat v nebarvené buňce. Nyní nastavte clonu kondenzoru postupně do obou krajních poloh a změny v intenzitě osvětlení kompenzujte regulací jasu žárovky stejně jako v bodech 4b), 4c). Zapište výsledky pozorování. 5) Do protokolu zodpovězte tyto otázky: 

Jaký je vztah mezi odcloněním/přicloněním a zobrazením barevných objektů (lístek mechu)?



Jaký je vztah mezi odcloněním/přicloněním a zobrazením nebarevných objektů (nebarvené buňky linie K562)?



Jaký je vztah mezi odcloněním/přicloněním a kontrastem obrazu?



Jaký je vztah mezi odcloněním/přicloněním a hloubkou ostrosti? Pozn.: pro správné posouzení změn hloubky ostrosti je nutné pozorovat dostatečně „silný“ objekt při zvětšení 40×.



Jaký vliv má zesílení nebo zeslabení zdroje světla na všechny výše zmíněné parametry obrazu (zobrazení barevných a nebarevných objektů, kontrast a hloubku ostrosti)?



Jaký je vztah mezi použitým zvětšením a částí preparátu, která je zobrazena v zorném poli okuláru?

6) Výstižný a nezkreslený záznam pozorování Vezměte opět nativní preparát mechu a na základě souvislostí poznaných v bodě 4) nastavte optimální zobrazení pozorovaného objektu (rostlinného pletiva lístku) a zakreslete do protokolu. Respektujte následující zásady pro výstižný a nezkreslený záznam pozorování:  pokud se objekt pozorování skládá ze stejných objektů (např. pletivo z buněk), zaznamenávejte obraz jen jednoho objektu  obraz kreslete dostatečně velký (na formátu A4), využijte celou šířku stránky  protože se zobrazení objektu mění se změnou parametrů optického systému, zaznamenávejte jen charakteristické vlastnosti, které jsou málo závislé na nastavení mikroskopu př.: nemá smysl zachycovat vzhled buněčné stěny stínováním, vystihujícím momentální 7

v20140903

kontrast obrazu; smysl má jednoduchá čára (resp. dvojčára) jako reprezentativní obraz buněčné stěny (jde nám o záznam schematicky věrného obrazu, nikoli o přesnou reprodukci nebo uměleckou impresi)  při záznamu sledujte a zachovávejte správné proporce – má-li např. v obraze kulovitý chloroplast průměr cca dvojnásobný oproti tloušťce buněčné stěny, musí být tento poměr správně reprodukován i ve schematickém nákresu; je-li např. při okrajích buňky více chloroplastů než ve středu, zachovejte tuto distribuci i ve svém nákresu (přesná poloha jednotlivých chloroplastů samozřejmě nemusí být reprodukována, v každé buňce je jiná)  není nutné zaznamenávat objekty barevně; stačí černobílý nákres se slovní poznámkou o barevnosti objektů  je správné zaznamenat ke každému obrázku celkové zvětšení mikroskopu (uvědomte si však, že jste obraz dále sekundárně subjektivně zvětšili při záznamu na papír)

2.2

Měření délky mikroskopických objektů (demonstračně)

Materiál Optický mikroskop s digitální kamerou a software pro analýzu obrazu, podložní a krycí skla, mech měřík (Mnium sp.) Postup Moderní mikroskopy mohou být vybaveny digitální kamerou a software pro analýzu obrazu, které umožňují zaznamenávat obraz skládající se z jednotlivých obrazových bodů (pixelů). Podle rozlišení tohoto systému se obraz skládá z většího či menšího počtu obrazových bodů. S použitím vhodného software pak můžeme určit velikost struktur i jejich plochu (software zaznamená počet obrazových bodů – na délku nebo plošně). Skutečná velikost obrazového bodu je relativní – závisí na použitém zvětšení mikroskopu. Pro každý objektiv je nutné po instalaci software provést kalibraci pomocí objektivního měřítka (jako měřítko slouží podložní sklo s vyrytými vrypy o rozestupech 10 µm). S použitím konkrétního objektivu zobrazíme pomocí software obraz tohoto měřítka na monitoru počítače. Dále pomocí myši označíme vybraný počet dílků měřítka (např. 40 dílků; každý dílek měří 10 µm) a jako údaj pro kalibraci objektivu uvedeme, že délka zvoleného „objektu“ je 400 µm (40×10). Systém zaznamená počet obrazových bodů, odpovídající při daném zvětšení a rozlišení např. vzdálenosti úsečky 400 µm. Přepočtem poté program určí relativní velikost obrazového bodu (při použití tohoto konkrétního objektivu) a přepočítá velikost struktur při vlastním měření na hodnotu uvedenou v µm podle toho, kolika obrazovým bodům odpovídá velikost určitého objektu. Tento postup je třeba zopakovat pro všechny objektivy mikroskopu. Pokud již máme celý systém nakalibrovaný, můžeme jednoduchým způsobem měřit velikost objektů pozorovaných v mikroskopu pomocí software – myší klikneme na ikonu měření objektů, dále ve vyfotografovaném obrazu označíme počátek a konec měřeného objektu a do objektu se automaticky vloží úsečka s údajem o délce měřené struktury. Je však třeba vždy před měřením zkontrolovat, zda jsme v software správně zvolili použitý objektiv.

8

v20140903

2.3

Měření výšky mikroskopických objektů

Materiál: Optický mikroskop, podložní a krycí skla, mech měřík (Mnium sp.) Postup: a) Na stolek mikroskopu znovu umístěte nativní preparát mechu měříku. Zaostřete nejprve objektivem 10× zvětšujícím a poté otáčením revolverového měniče vyměňte za objektiv 40× zvětšující. Nastavte správné osvětlení (nastavením clony a regulací jasu žárovky). Doostřete obraz mikrošroubem. b) Několikrát mikrošroubem otáčejte v obou směrech a všímejte si, které chloroplasty vidíte zaostřeně a které vidíte rozostřeně. Chloroplasty, které zaostříte jako první a poslední, jsou chloroplasty na úplném vrchu a spodu buňky (záleží na směru otáčení mikrošroubu, zda nejprve zaostříte chloroplasty na vrchu nebo na spodu buňky). c) Mikrošroubem zvedněte stolek mikroskopu právě tak, aby byl ostře zobrazen povrch buňky. Obraz buněčné stěny je rozmazaný, ostře jsou zobrazeny chloroplasty ve svrchní části buňky. Odečtěte polohu mikrošroubu podle stupnice na pravém mikrošroubu a rysky na pravém makrošroubu. d) Nyní pomocí mikrošroubu zaostřete na spodek buňky. Znovu odečtěte polohu mikrošroubu. Spočítejte, o kolik dílků jste pootočili mikrošroubem. 1 dílek odpovídá zdvihu/snížení stolku o 2,5 µm. Počet dílků vynásobte koeficientem 2,5 a získáte výšku buňky v µm. Praktický význam Všimněte si, že při spodním, středním a horním zaostření určité buňky získáte o této buňce různý obraz, tedy nestejné informace. Mluvíme o horní, střední a spodní rovině ostrosti. Jsou to tři hlavní optické roviny z velkého počtu možných optických rovin „protínajících“ objekt při zvedání a snižování stolku mikroskopu. Při pozorování preparátu stále doostřujte (jemně pohybujte mikrošroubem), jinak by byla vaše informace o objektu neúplná. Nahrazujete tím akomodaci lidského oka; optická soustava mikroskopu sama akomodovat „neumí“.

2.4

Určení rozlišovací schopnosti mikroskopu

Cíl úkolu Definovat konkrétní omezení rozlišovací schopnosti používaného mikroskopu. Určete konkrétní rozlišovací schopnost mikroskopu při použití „suchých“ objektivů 10× a 40× zvětšujících a imerzního objektivu 100× zvětšujícího (imerzní objektiv se používá s imerzním olejem – index lomu cca 1,5).

2.5

Fluorescenční mikroskopie (demonstračně)

9

v20140903

3. Mikroorganismy Studijní příprava Hierarchie živých soustav podle složitosti jedinců. Buňky prokaryontní a eukaryontní. Biologie virů – virion, virový genom, reprodukce virů. Virogenie. Cíl cvičení Seznámíme se s charakteristickými znaky vybraných mikroorganismů. Kontrolní otázky: 1. Jaké jsou hlavní rozdíly mezi prokaryontní a eukaryontní buňkou? 2. Jak rychlé může být dělení bakterií? Jaké jsou důsledky? (množství buněk, evoluce) 3. Mohou se viry množit v mrtvých buňkách? Zkuste vysvětlit váš závěr.

3.1

Demonstrace: Zhodnocení nárůstu po odkryvu misek

Materiál Petriho misky se ztuženým kultivačním médiem (SGA nebo krevní agar), které byly před týdnem ponechány 5-15 min. odkryté (na různých místech). Příprava SGA (studenti neprovádějí): 40 g glukózy/l; 10 g peptonu/l; 0,4 g kvasničného lyzátu/l; 15 g agaru/l. Po rozmíchání se vše autoklávuje (sterilizace v páře; 15 min při 121°C). Po částečném zchladnutí (na cca 60-80°C) se médium rozlije do sterilních Petriho misek (ve sterilním prostředí). Příprava krevních agarů (studenti neprovádějí): složení vychází ze ztužených kultivačních médií; po autoklávování a částečném ochlazení (na cca 50°C) je přidáno cca 5-10 % defibrinované krve. Postup Petriho misky s kultivačním médiem byly odkryty na 5-15 min a ponechány na různých místech (např. na lavici, na parapetu, na podlaze). Po odkryvu byly misky zavřeny, popsány a loženy v termostatu s teplotou nastavenou na 37°C. Po nárůstu kolonií mikroorganismů ze achycených buněk a spor byly misky přemístěny do pokojové teploty nebo do lednice (podle míry nárůstu kolonií). Při hodnocení misky neotvíráme, hodnotíme pouze pohledem přes víko. Výsledek Zapíšeme, jaké typy kolonií mikroorganismů jsme pozorovali v miskách (např. kolonie vláknitých hub, kolonie solidní; popíšeme velikost, barvu kolonií). Snažíme se spočítat nebo alespoň odhadnout počet kolonií na misce.

3.2

Demonstrace: Kultivace bakterií, kultivace kvasinek

Materiál Petriho misky se ztuženým kultivačním médiem, na které byla roztěrem naočkována bakteriální kultura (například Escherichia coli); Petriho misky se ztuženým kultivačním médiem, na které byla roztěrem naočkována kultura kvasinky rodu Candida. Postup Naočkování bakteriální nebo kvasinkové kultury se provádí ve sterilním boxu na sterilní kultivační médium v Petriho misce. Sterilní kličku lehce otřeme o bakteriální (kvasinkovou) kolonii narostlou na kultivačním médiu a touto kličkou provedeme několik souběžných tahů po povrchu nového sterilního média. Kličku sterilizujeme ožehnutím v plameni kahanu a po jejím vychladnutí 10

v20140903

provedeme opět několik souběžných tahů kličkou tak, že vycházíme přibližně z místa, kde jsme skončili první tahy kličkou. Posléze ještě můžeme postup jednou nebo dvakrát zopakovat. Petriho misku zavřeme a necháme kultivovat v termostatu při vhodné teplotě (E. coli při teplotě 37°C) několik dní (zpravidla 2-5). Komentář Zmíněný postup je užíván v mikrobiologii pro přípravu tzv. bakteriálních nátěrů; obdobně se zpracovávají i některé kvasinky (např. rodu Candida). Cílem může být např. získání jednotlivých kolonií na konci stopy nátěru. Tak můžeme dále odebrat bakterie (kvasinky) pouze z jediné kolonie a dále je kultivovat, získáváme tak bakteriální (kvasinkový) klon pocházející z jediné původní buňky.

3.3

Bakterie ústní dutiny

Materiál a chemikálie Sterilní vatový tampon na špejli, sterilní fyziologický roztok (0,9% roztok NaCl), roztok karbolfuchsinu (0,025 %), mikroskopické potřeby, mikroskop. Příprava roztoku karbolfuchsinu (studenti neprovádějí): do 10 ml 70% etanolu přidáme 0,5 g krystalického karbolfuchsinu, rozdrtíme jej skleněnou tyčinkou a zamícháme. Přidáme 90 ml destilované vody. Získáme 0,5 % zásobní roztok karbolfuchsinu. Tento zásobní roztok naředíme 20× destilovanou vodou (získáme tak 0,025% pracovní roztok karbolfuchsinu). Místo krystalického karbolfuchsinu lze použít také krystalický zásaditý fuchsin; potom bychom ale při přípravě zásobního roztoku museli použít místo destilované vody 5% vodný roztok fenolu. Postup Tampon namočíme do fyziologického roztoku. Jemně (ale dostatečně) jej přitlačíme na bukální sliznici ústní dutiny a táhlým pohybem provedeme stěr. Setřené částečky sliznice přeneseme na suché podložní sklo otiskem tamponu: tampon lehce přitlačíme k podložnímu sklu a valivým pohybem jej otáčíme tak, aby se otisknul po celém obvodu na sklo. Pozor: buňky jsou ploché a snadno se deformují. Přikápneme 0,025% roztok karbolfuchsinu. Přikryjeme krycím sklem a necháme preparát probarvit. Je třeba dát pozor na vysychání preparátu (můžeme na podložní sklíčko k okraji krycího sklíčka přikápnout kapku barviva). Pozorujeme nejdříve za půl hodiny (případně i za hodinu, podle stáří připraveného roztoku barviva), kdy začíná být dostatečné i probarvení bakterií. Při pozorování nejprve najdeme s objektivem 10× zvětšujícím oblast, kde se nachází nejvíce epiteliálních buněk zbarvených růžově až červeně; vyměníme objektiv za 40× zvětšující a pozorně prohlédneme jednotlivé epiteliální buňky. Nespěcháme při pozorování, pozorně si prohlížíme buňky v preparátu a současně jemně proostřujeme mikrošroubem; neustálé proostřování je důležité, abychom mohli vidět bakterie na povrchu buněk (bakterie jsou zbarveny temně fialově). Máme-li zaostřeno např. na jádro epiteliální buňky, nejsou již bakterie na jejím povrchu zaostřené (leží mimo hloubku ostrosti) a můžeme se mylně domnívat, že na povrchu buňky žádné bakterie nejsou. Výsledek Zakreslíme a popíšeme epitelovou buňku bukální sliznice (pokud možno nedeformovanou) i jádrem a viditelnými organelami; zakreslíme také schematicky bakterie kolonizující povrch této buňky (podle našeho pozorování). Při zhotovení nákresu dbáme na zachování poměru velikostí bakteriální buňky a epitelové buňky včetně jejích organel.

11

v20140903

3.4

Prokaryontní buňka v nativním preparátu

Materiál Kultura bakterií (nepatogenních), např. Clostridium butyricum (bakterie máselného kvašení); mikroskopické potřeby, mikroskop. Příprava kultury bakterií (studenti neprovádějí): Nakrájíme neloupané a nemyté brambory na kostičky (o velikosti cca 0,5 cm) a naplníme jimi asi 1/3 Erlenmeyerovy baňky (250 ml). Přidáme 1 g CaCO3 a přelijeme vodou (do 2/3 baňky). Baňku zahřejeme na teplotu 80°C (10 min) – tím usmrtíme méně odolné spory jiných druhů mikroorganismů. Baňku opatříme zátkou z buničiny a po vychladnutí kultivujeme ve tmě při pokojové teplotě. Po 2-3 dnech by mělo být přítomno dostatečné množství bakterií. V kultuře dominují bakterie Clostridium butyricum. Postup Z kultury bakterií si připravíme nativní preparát. Preparát orientačně prohlédneme menším zvětšením (objektiv 20× zvětšující), podrobněji si bakterie prohlédneme větším zvětšením (objektiv 40× zvětšující). Ke kapce bakteriální suspenze je také možno přikápnout 0,025% roztok karbolfuchsinu. Bakterie přidáním roztoku karbolfuchsinu usmrtíme a přestanou se pohybovat, můžeme tak lépe pozorovat jejich tvar. Optimálně by byly probarveny až po 20-30 min. Výsledek Do protokolu zakreslíme několik bakteriálních buněk. Všimneme si jejich tvaru a velikosti.

3.5

Prokaryontní buňka v trvalém preparátu

Materiál Trvalé preparáty bakterie Escherichia coli a Staphylococcus sp. obarvené podle Grama; imerzní objektiv a olej, papírky na čočky, benzin (etanol), mikroskopické potřeby, mikroskop. Postup Pro orientační prohlédnutí preparátu použijeme nejprve objektiv zvětšující 20×, dále objektiv zvětšující 40× a s tímto objektivem doostříme. Ve výrazně obarveném bakteriálním nátěru se snažíme najít slabší vrstvu (bude se při pozorování v mikroskopu jevit jako nejsvětlejší) anebo okraje silnější vrstvy. Následně prohlížíme bakterie imerzním objektivem:  pootočíme revolverový měnič objektivů, ale objektiv 100× zvětšující nezařadíme do optické osy – necháme jej mírně vychýlený  na krycí sklíčko kápneme 1 kapku imerzního oleje; dbáme na to, abychom olejem neznečistili objektiv 40× zvětšující  nyní dokončíme zařazení imerzního objektivu do optické osy mikroskopu – opatrně pootočíme revolverovým měničem objektivů tak, abychom měli imerzní objektiv ponořený do kapky oleje (revolverový měnič jemně zacvakne)  nastavíme clonu na kondenzoru  velmi opatrně zaostříme obraz šroubem pro jemný posuv; imerzní objektiv má velmi krátkou pracovní vzdálenost (cca 0,1 – 0,2 mm) !!! Nyní již nepoužívejte pro pozorování stávajícího preparátu objektiv zvětšující 40× (tento objektiv byste díky jeho krátké pracovní vzdálenosti namočili do imerzního oleje)

12

v20140903

Po ukončeném pozorování vychýlíme imerzní objektiv na stranu a suchým čtverečkem buničiny velmi jemně setřeme olej z objektivu (na objektiv netlačíme). Pro dokonalé setření zbytku oleje nový kousek buničiny mírně navlhčíme etanolem a opět otřeme; nakonec čočku utřeme do sucha čistým čtverečkem buničiny. Výsledek Do protokolu zakreslíme několik bakteriálních buněk. Všimneme si jejich tvaru a velikosti. Komentář Bakterie E. coli jsou gramnegativní (G-), bakterie rodu Staphylococcus jsou grampozitivní (G+) bakterie. Toto barvení pouze rozlišuje bakteriální buňky na tzv. G- nebo G+ podle biochemického složení buněčné stěny.

3.6

Lidský vlas napadený dermatofytem

Materiál Trvalý preparát normálního lidského vlasu a vlasu napadeného in vitro dermatofytem Microsporum gypseum nebo Trichophyton ajelloi; mikroskopické potřeby. Postup Při slabém a středním zvětšení prohlédneme preparáty zdravých lidských vlasů a vlasů napadených dermatofyty. Popíšeme rozdíly mezi normálním a napadeným vlasem. Zakreslíme část normálního a destruovaného vlasu při středním zvětšení. Výsledek Do protokolu zakreslíme vlas napadený dermatofytem.

13

v20140903

4. Struktura buněk, kultivace savčích buněk Teoretický úvod Kultivace buněk a tkání in vitro (tj. tzv. „ve skle“, tedy ve zkumavce, mimo živý organismus) se stala rutinní a důležitou metodou v medicínském výzkumu i v diagnostické praxi. Ve výzkumu se kultivace buněk in vitro používá např. ve farmakotoxikologii, při vývoji a testování nových léčiv. V klinické praxi se např. kultivací krevních kmenových buněk standardně vyhodnocuje kvalita tzv. štěpu pro transplantaci kostní dřeně. Co jsou buněčné (příp. tkáňové) kultury? V buněčných kulturách kultivujeme buňky mimo organismus v kultivačních médiích. V tkáňových kulturách kultivujeme mimo organismus část tkáně (tzv. tkáňový explantát). V buněčných kulturách již buňky nejsou dále organizovány do podoby tkáně a rostou jednotlivě. Buňky rostou ve speciálních plastových miskách nebo lahvích buď volně v roztoku (např. různé krevní buňky) nebo se přichycují (adherují) k povrchu plastikové misky či láhve (např. fibroblasty, tj. buňky vaziva). Primární buněčná kultura je tvořena buňkami, které byly odebrány z orgánů nebo tkání a byly přímo nasazeny do kultivačního média. Takovéto buňky mohou v kulturách přežívat jen krátkou dobu (dny, max. týdny), během které se mohou dělit a diferencovat, poté zaniknou. Jako každá savčí buňka mají totiž omezený potenciál dělení, jsou „smrtelné“. Naopak „nesmrtelné“ (imortalizované) buněčné linie se mohou neomezeně dlouho dělit a proto je lze tzv. pasážovat (přenesením části buněk z jedné kultivační nádoby do druhé), mají neomezený potenciál dělení. Imortalizace buněk lze dosáhnout chemickými nebo fyzikálními karcinogeny, příp. virovou infekcí. Někdy může dojít k tomuto jevu spontánně. Transformované buněčné linie jsou imortalizované a navíc vykazují vlastnosti nádorových buněk . Co obsahují kultivační média? Savčí, tedy i lidské buňky rostou in vitro v médiích, která svým složením napodobují vnitřní prostředí organizmu, a proto obsahují: zdroj energie (glukózu), minerální látky, aminokyseliny, vitamíny a některé doplňkové látky (glutathion, lipidy, aj.), sérum (nejčastěji hovězí) jako zdroj stimulačních růstových faktorů a hormonů, pufr na bázi uhličitanu a barevný indikátor citlivý na změnu pH. Do kultivačních médií také většinou přidáváme antibiotikum a antimykotikum, abychom buněčnou kulturu ochránili před bakteriální nebo plísňovou infekcí. Standardní vybavení laboratoře tkáňových kultur: Sterilní boxy s laminárním prouděním vzduchu: slouží k dodržení aseptických podmínek při manipulaci s buněčnou kulturou. CO2 inkubátory: savčí buňky jsou kultivovány při teplotě 37°C v 5-10% CO2 atmosféře (pro udržení neutrálního pH) a při vysoké vlhkosti prostředí. Centrifugy, sady pipet, inverzní mikroskop pro tkáňové kultury.

4.1

Stanovení životaschopnosti (viability) buněk ve tkáňových kulturách

Životaschopnost buněk je jedním ze základních parametrů, které se posuzují při práci s buněčnými nebo tkáňovými kulturami. Například při zakládání buněčných kultur by viabilita buněk měla dosahovat minimálně 90 %. Jako kritérium životaschopnosti buněk se nejčastěji používá neporušenost jejich cytoplazmatické membrány. Živé buňky mají neporušenou (intaktní) cytoplazmatickou membránu, která volně nepropouští ani malé molekuly nesoucí kladný nebo záporný náboj. Pro posouzení intaktnosti se proto používají různá barviva s nízkou molekulovou hmotností, jež nesou aspoň jeden kladný nebo záporný náboj a barví buď bílkoviny, nebo DNA. 14 v20140903

Takové barvivo pak „obarví“ pouze buňky, do kterých může vniknout, tj. mrtvé buňky s porušenou membránou. Podle povahy barviva lze viabilitu buněk posuzovat buď ve světelném, nebo fluorescenčním mikroskopu. Chemikálie, biologický materiál: 2% (w/v) roztok eosinu ve vodě, dvě buněčné suspenze (buněčná linie K562 nebo HL60) – jedna s viabilními buňkami, druhá ovlivněná látkou, která indukuje buněčnou smrt. Postup: 1. Do mikrozkumavky napipetujeme 200 µl buněčné suspenze a přidáme 10 µl 2% eosinu a protřepeme. 2. Po 5 min stání při laboratorní teplotě naneseme 10 µl obarvené suspenze na podložní sklíčko, překryjeme krycím sklíčkem a přebytek tekutiny odsajeme. 3. Pozorujeme pod mikroskopem (zvětšení 100× až 200×) alespoň 200 buněk. Živé buňky se nebarví (zeleně opaleskují), mrtvé buňky jsou zbarveny červeně. 4. Spočítáme živé a mrtvé buňky a vyjádříme procentový podíl živých buněk.

4.2

Určení morfologického typu savčích buněk a manipulace s buněčnou kulturou

Buňky adherentních buněčných linií mají typicky protáhlý nebo cípatý tvar. V kulturách takto rostou např. fibroblasty (buňky vaziva), endoteliální buňky (buňky vnitřní výstelky cév) nebo buňky hladkého svalstva. Z krevních buněk adherují k povrchům monocyty. Buňky, které neadherují k povrchům a rostou v médiu volně, mají zaoblený tvar a jsou většinou odvozeny z krevních lymfocytů nebo myeloidních krevních buněk. Přichycení buněk k povrchu je zprostředkováno extracelulárními proteiny (tzv. adhezivními proteiny) a ionty vápníku. Přichycené buňky se od plastu uvolní buď mechanicky nebo enzymaticky pomocí roztoku trypsinu a EDTA. Trypsin je proteolytický enzym ze slinivky břišní, který štěpí různé typy proteinů včetně povrchových buněčných proteinů. EDTA je chelatační činidlo, které váže ionty vápníku, což vede k narušení vazby adhezivních buněčných molekul k povrchu. Chemikálie, biologický materiál Roztok trypsinu/EDTA v kultivačním médiu, plastové misky s kulturami savčích buněk. Postup 1. Savčí buňky rostly na miskách v kultivačním médiu, v inkubátoru při teplotě 37°C a v 5% CO2 atmosféře. Budeme pozorovat dva různé typy buněčných linií: volně v médiu rostoucí buňky (nepřichycené k povrchu) a buňky přichycené k povrchu plastikové misky (adherentní). 2. Odejmeme vrchní díl plastové Petriho misky a pozorujeme buňky v růstovém médiu při zvětšení 100× (10× objektivem) a při téměř úplném zaclonění. Dbáme na to, abychom objektiv nesmočili v médiu. Popíšeme a zakreslíme morfologický typ pozorovaných savčích buněk. 3. U misky s adherentní buněčnou linií odsajeme médium buničitou vatou (přiložíme ji ze strany kapky) a místo s přichycenými buňkami zakápneme 50 μl roztoku trypsinu, vyhřátého na 37°C. Po 2-5 min pozorujeme v mikroskopu jako v bodě 2. Po 5 min můžeme reakci zastavit přidáním 100 μl 1% roztoku hovězího (bovinního) sérového albuminu (BSA).

4.3

Pozorování suspenzní buněčné kultury

K562 je příkladem neadherující buněčné linie. Jedná se o první lidskou imortalizovanou leukemickou linii odvozenou již v roce 1975 z krevních buněk pacientky s chronickou myeloidní 15

v20140903

leukémií (CML). Buňky linie K562 mají kulatý tvar a rostou volně v médiu. Tato buněčná linie má rozsáhlé použití v buněčné a molekulární biologii, např. v testech tumorigenicity a cytotoxicity nebo pro testování protinádorových léčiv, atd.

4.4

Pozorování kolonií krevních buněk na polotuhém médiu

Dělící se buňky v polotuhém médiu mají omezený pohyb, dělící se buňky vytvářejí kolonie (kolonie = potomstvo jedné dělící se buňky, klon). U krevních buněk můžeme pozorovat hemoglobinizované kolonie červených krvinek a kolonie různých typů bílých krvinek. Chemikálie, biologický materiál Metylcelulozové kultivační médium, hematopoetické (= krvetvorné) růstové faktory, prekurzory lidských krevních buněk Plastové misky s kulturami lidských krevních buněk Postup Prekurzory lidských krevních buněk byly smíchány s metylcelulozovým médiem a do kultury byly přidány hematopoetické růstové faktory, které umožnily růst a diferenciaci krevních prekurzorů do jednotlivých krevních buněčných typů. Kolonie krevních buněk rostly na miskách v polotuhém kultivačním médiu v inkubátoru při teplotě 37°C a v 5% CO2 atmosféře po dobu 10 až 14 dnů. Při zvětšení 100× (použití 10× zvětšujícího objektivu) budeme pozorovat různé typy kolonií krevních buněk. Zakreslíme. Otázky 1. Co obsahuje kultivační médium? 2. Jaký typ buněčných kultur se jednalo v dnešním cvičení (primární buněčné kultury nebo imortalizovaná buněčná linie)? 3. Můžeme na základě morfologického tvaru buněk odhadnout buněčný typ, příp. tkáň, ze kterého byla příslušná buněčná linie odvozena? 4. Proč jsme použili k uvolnění adherentních buněk trypsin? Literatura Vachtenheim J., Duchoň J.: Molekulární biologie pro mediky a lékaře. Karolinum Praha, 1992.

16

v20140903

5. Genetická informace a její změny Studijní příprava Paměťový systém buňky. Exprese genetické informace. Transkripce. Translace. Replikace DNA. Genetický kód. Šum v genetické informaci – mutace. Mutagenní faktory. Genové mutace, jejich molekulární podstata a důsledky. Detekce mutací v molekulách DNA.

5.1

Replikace

Níže uvedený obrázek znázorňuje replikační vidlici (část replikačního oka): T - G - G - C - A - T 3´ A C A G T A 5´ A - G - T - T 3´ T - C - A - A T A C T G T A - C - C - G - T - A 5´ Přiřaďte příslušné nukleotidy (označené písmeny) k odděleným polynukleotidovým řetězcům replikující se molekuly DNA. Určete, který řetězec je starý a který nový. Může replikace DNA v buňce probíhat takovým jednoduchým přiřazováním nukleotidů? Uveďte, jak se liší skutečná replikace od našeho modelu.

5.2

Transkripce

a) Zařazení aminokyseliny cysteinu do bílkovinné molekuly je v nekódujícím (matričním, templátovém) vlákně DNA určeno tripletem ACA. Určete odpovídající triplet v mRNA. b) Triplet TTC na nekódujícím vlákně DNA určuje aminokyselinu lysin. Určete lysinový triplet v mRNA. Proč se asi sekvence genu uvádí (publikuje) v podobě přítomné na kódujícím vlákně, když se při transkripci kopíruje vlákno protější (nekódující vlákno = matriční)?

17

v20140903

5.3

Translace

Polypeptidový řetězec obsahuje v jednom úseku pět aminokyselin: - arginin - glycin - fenylalanin - histidin - tyrosin a) Jaké jsou odpovídající triplety (kodóny) v mRNA, když víme, že arginin je na úrovni kódujícího vlákna DNA určen tripletem AGA, glycin GGA, fenylalanin TTT, histidin CAT a tyrosin TAC? a) Kolika molekul tRNA je zapotřebí k zařazení těchto aminokyselin? Určete antikodóny, které obsahují.

5.4

Transkripce a translace

Část polypeptidového řetězce obsahuje tuto sekvenci aminokyselin: - valin - cystein - glycin - kys. glutamová Valin je v mRNA kódován tripletem GUA, cystein UGU, glycin GGC, kys. glutamová GAA. a) Jaké triplety odpovídají těmto aminokyselinám v chromozomové DNA? Vezměte v úvahu existenci obou komplementárních vláken – kódujícího a nekódujícího.

5.5

Komplementarita tripletů

Část molekuly inzulínu obsahuje sekvenci aminokyselin, které jsou spolu s odpovídajícími kodóny mRNA uvedeny v tabulce. Uveďte, jaké triplety těmto aminokyselinám odpovídají v tRNA a obou vláknech DNA. aminokyselina

mRNA

leucin

CUU

tyrozin

UAU

leucin

CUA

valin

GUA

cystein

UGU

glycin

GGU

k. glutamová

GAA

arginin

CGU

glycin

GGC

fenylalanin

UUU

5.6

antikodon tRNA

nekódující vlákno DNA

kódující vlákno DNA

Alfa a beta globinový gen

Alfa globin (součást lidského hemoglobinu) je polypeptid obsahující 141 aminokyselin. Je kódován genem v chromozomu 16. Jak veliký je tento gen? (uveďte počet nukleotidů) Beta globin lidského hemoglobinu je polypeptid obsahující 146 aminokyselin. Je kódován genem v chromozomu 11. Jak veliký je tento gen? Uveďte počtem nukleotidů.

18

v20140903

Odpovídá údaj o délce genu, který jste vypočítali, skutečnosti? (Záleží na definici genu – rozeberte.)

5.7

Beta globinový gen

Začátek beta řetězce hemoglobinu obsahuje tuto sekvenci aminokyselin: 1 NH2 - val

2

3

4

5

6

7

8

his

leu

thr

pro

glu

glu

lys

S použitím tabulky genetického kódu určete odpovídající sekvenci tripletů v genu pro beta globin v 11. lidském chromozomu. Je možná jenom jediná sekvence? Mutageneze Mutace je dědičná změna genotypu, která není podmíněna rekombinací ani segregací či jinými zákonitými procesy v rámci životního cyklu. Může se týkat jednoho genu (genová mutace), chromozomu (chromozomová mutace čili aberace) nebo celé chromozomové sady (genomová mutace). Mutageneze je proces vzniku mutace. Mutagenizace je vystavení živé soustavy účinkům mutagenu. Mutagen je chemická látka nebo fyzikální faktor vyvolávající mutaci. Mezi mutageny vyskytující se v přírodě patří např. aflatoxiny produkované toxigenními kmeny plísně Aspergillus flavus (http://www.biotox.cz/toxikon/mikromycety/aflatox.php). Mutanta, mutant je organismus nesoucí mutantní alelu. Alela standardní je varianta genu (čili alela) početně převládající v přirozené populaci. Alela mutantní je varianta genu vzniklá ze standardní alely mutací.

5.8

Genové mutace

Určete, jaké následky způsobí následující genové mutace ve stavbě a funkci nově syntetizované bílkoviny (jsou uvedeny triplety v kódujícím vlákně DNA): a) mutace tripletu

TGT → AGT

b) mutace tripletu

CTG → CTA

c) mutace tripletu

GTG → CTG

d) mutace tripletu

GTG → GAG

e) mutace tripletu

CTG → CGG

Postup Uvedené triplety přepište na kodóny v mRNA a podle tabulky genetického kódu k nim přiřaďte odpovídající aminokyseliny. Následky a) záměnou aminokyseliny se ztrácí možnost tvorby S-S můstku (odůvodněte) b) jedná se o tichou mutaci – vysvětlete. c) jedná se o záměnu dvou neutrálních aminokyselin. d) záměna neutrální za kyselou aminokyselinu. e) záměna neutrální za bazickou aminokyselinu. Otázka Jak mohou uvedené změny ovlivnit stavbu a funkci bílkoviny a proč?

19

v20140903

5.9

Mechanismus účinku chemomutagenu

a) 5-bromuracil (BU) je analogem thyminu. Je-li přidán k buňkám, u nichž probíhá replikace, začleňuje se do DNA a nahrazuje thymin, takže páry bází A-T jsou zaměněny za A-BU. BU v normální laktamové formě (párující se s adeninem) se vzácně spontánně mění v laktimovou formu BU+, párující se s guaninem. Znázorněte schématem, jakou mutaci BU+ vyvolává. Odůvodněte, proč je mutační účinek závislý na replikaci. b) Aminopurin (AP) se páruje normálně s thyminem, ale ve své iminoformě AP+ se váže s cytosinem. Znázorněte schematicky, jakou změnu AP+ vyvolává.

5.10 Hemoglobin srpkovité anémie Hemoglobin srpkovité anémie u člověka se vyznačuje tím, že oproti hemoglobinu normálnímu má na šesté pozici beta globinového řetězce místo glutamové kyseliny valin (viz sekvenci v úkolu 5.7). Tripletem v mRNA pro glutamovou kyselinu je GAG, pro valin GUG. Určete odpovídající kodóny (triplety) na úrovni obou vláken DNA. Jak lze vysvětlit vznik této choroby a proč je dědičná?

5.11 Patologický hemoglobin HbC U pacienta byl zjištěn výskyt abnormálního hemoglobinu HbC. Tento se od normálního hemoglobinu liší tím, že má na šesté pozici svého beta globinového řetězce glutamovou kyselinu nahrazenu lysinem (srovnej sekvenci v úkolu 5.7). Předpokládejme, že zařazení glutamové kyseliny určuje na úrovni mRNA triplet GAG, zařazení lyzinu triplet AAG. Určete odpovídající triplety na úrovni DNA (na obou vláknech). Na které úrovni proběhla původní mutace – v mRNA nebo v DNA? Jaká mutace by mohla způsobit opět syntézu normálního hemoglobinu a vyléčit tuto hemoglobinopatii na genové úrovni? Co soudíte o reálnosti takové možnosti?

5.12 Posunová mutace Úsek DNA v určitém genu kóduje část bílkoviny, která je složena ze 7 aminokyselin: část proteinu:

cys

úsek DNA (nekódující vlákno):

ACG GCA AAA CCA GGA CAT TTA

arg

phe

gly

pro

val

asn

Mutací při replikaci vypadla 3. báze v tripletu pro cystein (G). Jaký následek bude mít tato mutace? Postup Napište nové (posunuté) triplety v DNA. Vyjádřete jim odpovídající transkripty v mRNA. Přiřaďte k nim odpovídající aminokyseliny podle tabulky genetického kódu. Porovnejte sekvenci aminokyselin se sekvencí původní, uvedenou v zadání úkolu. Vysvětlete, co způsobila delece jednoho nukleotidu. Co by způsobila adice nukleotidu? Co způsobí delece (adice) dvou nebo tří nukleotidů?

5.13 Spontánní mutace v kultuře bakterií Kultura získaná kultivací hnisu obsahuje mnoho miliard bakterií citlivých k penicilínu. Jak byste dokázali, že jsou mezi nimi také bakterie k penicilínu rezistentní? Bylo by možné zjistit jejich počet v určitém objemu bakteriální kultury?

20

v20140903

5.14 Mutace a kancerogeneze Vlivem mutace se zvýšila transkripční aktivita genu pro jaterní arylhydroxylázu (enzym katalyzující přeměnu uhlovodíku benzpyrenu z cigaretového kouře na kancerogenní epoxidy). Co lze říci o dispozici nositele této mutace k rakovině plic způsobené kouřením?

21

v20140903

6. Proteiny Cíl cvičení Pochopit vztah mezi strukturou a funkcí proteinu na příkladu molekuly hemoglobinu. Hemoglobin (Hb), červené krevní barvivo, je z funkčního hlediska nejdůležitější bílkovina obsažená v červených krvinkách. Jeho hlavní funkcí je přenos kyslíku (O2) z plic do tkání; hemoglobin se také částečně podílí na přenosu oxidu uhličitého (CO2) z tkání zpět do plic. Teoretický úvod Struktura Hb Hb je tvořen bílkovinou globinem a prostetickou skupinou, hemem. Funkční Hb molekula je tetramer, sestávající ze dvou různých párů globinových řetězců alfa a beta. Pár alfa globinových řetězců je kódován genem na chromozomu 16 a pár beta řetězců je kódován genem na chromozomu 11 (viz obr.). Každý řetězec váže jednu hemovou skupinu uloženou v kapsových dutinách. Hem je protoporfyrin, jehož základem je čtveřice pyrolových jader (tetrapyrol). Ve středu tetrapyrolového jádra je šestivazný iont železa Fe2+. Čtyřmi vazbami je iont železa vázán v tetrapyrolovém kruhu, jednou vazbou na globinový řetězec a zbylá vazba je určena pro kovalentní interakci s molekulou kyslíku. Jedna molekula Hb tedy může vázat 4 kyslíkové molekuly; železo je schopno reverzibilně vázat molekuly kyslíku jen je-li dvojmocné (Fe2+).

Bodové mutace v α nebo β-globinových genech vedou k aminokyselinové záměně v α nebo βglobinových řetězcích a ke vzniku abnormálních hemoglobinů, což se manifestuje jako onemocnění zvané hemoglobinopatie. Jedná se o nejrozšířenější genetické choroby na světě, postihující miliony lidí, zvláště v malarických oblastech. Některé záměny aminokyselin (tj. poruchy na úrovni primární struktury) mohou vést i k porušení sekundární, terciární a kvarterní struktury Hb molekuly. Dochází k tvorbě nestabilní Hb molekuly – vznikají tzv. nestabilní hemoglobiny. V červených krvinkách takto postižených jedinců nestabilní Hb precipituje za vzniku tzv. Heinzových tělísek. Precipitát přisedá na vnitřní stranu erytrocytů. Takové erytrocyty při průchodu krevními kapilárami praskají – dochází k hemolýze, jejím výsledkem je anémie. 22

v20140903

Nestabilní hemoglobinopatie jsou dominantně dědičné. Vyskytují se v Čechách i na Slovensku a jsou příčinou tzv. „hemolytické anémie s Heinzovými tělísky“.

6.1

Pozorování precipitovaného patologického hemoglobinu na trvalém preparátu

Materiál Trvalé preparáty – krevní nátěry barvené briliant kresylovou modří. Postup Budeme pozorovat trvalé preparáty zdravého jedince (normální kontroly) a nemocného s hemoglobinopatií. Pro nalezení vhodné části krevního nátěru použijeme objektiv zvětšující 10×; pro pozorování erytrocytů použijeme objektiv zvětšující 40×. Zakreslíme erytrocyty s precipitáty nestabilního hemoglobinu. Otázky 1. Kde se v rámci globinových řetězců pravděpodobně nacházejí aminokyseliny, jejichž záměna vede k rozpadu Hb molekuly? 2. Proč dochází k hemolýze u nemocných s nestabilní hemoglobinopatií?

6.2

Demonstrace: Detekce hemoglobinopatie pomocí gelové elektroforézy

Materiál Polyakrylamidový gel se vzorky hemoglobinu. Postup Z erytrocytů pacienta trpícího hemoglobinopatií a z erytrocytů zdravého člověka jsou připraveny lyzáty. Ke každému lyzátu se přidá barvivo a lyzáty se nanesou do jamek na polyakrylamidovém gelu (gel je ponořený v elektroforetické vaně v roztoku pufru). Provede se nativní elektroforéza hemoglobinu. Výsledek Na gelu pozorujeme jednotlivé proužky obarvených proteinů. V případě erytrocytů je majoritním proteinem hemoglobin. U zdravého člověka pozorujeme jediný silný proužek, odpovídající jednomu typu molekul hemoglobinu. U pacienta trpícího hemoglobinopatií můžeme pozorovat dva proužky – erytrocyty pacienta obsahují normální i patologický hemoglobin. Komentář Záměna aminokyseliny způsobuje změnu mobility bílkoviny na gelu.

6.3

Imunohistochemická detekce buněčně specifického proteinu

Cílem imunodetekce proteinů na tkáňových řezech je detekce specifických antigenních determinant s využitím imunologické vazby, tj. s využitím principu vazby antigenu a protilátky. Podrobné seznámení s termíny „antigen“ a „protilátka“ umožní až přednášky ze základů imunologie v letním semestru. Pro potřeby tohoto cvičení stačí představa, že vazba protilátky na buněčný antigen připomíná vazbu specifického klíče k zámku. Specifická protilátka se při inkubaci naváže na specifický buněčný antigen. Detekční systém pak umožní zviditelnění navázané protilátky a tím zviditelnění buněk (resp. buněčných struktur), které exprimují daný antigen (protein).

23

v20140903

Materiál Trvalé preparáty – řezy slezinou – ve kterých byl pomocí imunohistochemického barvení zviditelněn protein, specificky exprimovaný pouze B-lymfocyty. Je možné pozorovat obarvené Blymfocyty ve folikulech. Komentář Slezina má několik funkcí. Ve fetálním období embryogeneze je to krvetvorný orgán. V dospělosti zde dochází k destrukci zanikajících červených krvinek a především – slezina patří mezi orgány imunitního systému. Ve slezině dozrávají B-lymfocyty (které produkují protilátky). Na řezech byl imunodetekcí zviditelněn jeden z proteinů specifických pro B-lymfocyty.

6.4

Důkaz hemoglobinu

Pomůcky Podložní sklíčko se zaschlou kapkou krve kteréhokoli savce, konc. kyselina octová, 0,2% roztok NaBr nebo NaCl ve vodě, elektrická topná plotýnka, mikroskopické potřeby. Postup Na zaschlou krev kápneme kapku roztoku soli a necháme uschnout. Potom přikápneme kyselinu octovou, přikryjeme krycím sklíčkem a preparát položíme na topnou plotýnku. Tím kyselinu pomalu odpařujeme. Malým zvětšením mikroskopu pak vyhledáme ve zbytku kyseliny i v suchých částech preparátu hnědé krystalky (Teichmannovy krystaly), někdy seskupené do srostlic čili drúz. Výsledek Zakreslíme několik krystalů při velkém zvětšení. Výklad V horké kyselině se ničí bílkovinná část hemoglobinu (globin) a uvolňuje prostetická složka – hem. Po odpaření kyseliny se vylučují krystalky soli oxidovaného hemu s ionty Br- nebo Cl- (bromhemin, chlorhemin). Ty jsou důkazem přítomnosti hemoglobinu. Význam Reakce se nazývá Teichmannova zkouška a používala se v soudním lékařství pro důkaz krevních skvrn.

24

v20140903

7. Enzymy Teoretický úvod Metabolismus jako souhrn chemických přeměn v organismu je umožněn působením enzymů. Tyto biokatalyzátory uskutečňují a řídí téměř všechny chemické reakce v živých soustavách. O enzymech pojednává podrobně učebnice biochemie. V úvodu do cvičení připomeneme jen základní fakta nutná pro pochopení některých kapitol biologie. Katalytická funkce enzymů Jako všechny katalyzátory ovlivňují enzymy pouze rychlost příslušné reakce, nikoliv konečný stav, resp. rovnováhu, k níž reakce dospěje. Ta je i u katalyzovaných reakcí určována zákonem o působení aktivní hmoty (Guldberg-Waagův zákon). K uskutečnění chemické změny – reakce – je vždy třeba určité aktivační energie. Pouze molekuly aktivované (za dostatečně vysoké teploty apod.) jsou schopny reagovat navzájem nebo s jinými molekulami. Enzymy působící jako katalyzátory podstatně snižují potřebnou aktivační energii tím, že reakční složky vážou na sebe, orientují je a přibližují navzájem a obvykle rozkládají celý děj na několik reakcí s nízkou aktivační energií. Tím nejen zvyšují rychlost reakcí, ale uskutečňují i reakce, které by za fyziologických podmínek prakticky vůbec neprobíhaly. Stavba enzymové molekuly Všechny enzymy patří mezi bílkoviny a jsou syntetizovány proteosyntetickým aparátem buněk podle genetické informace obsažené v DNA. Některé enzymy patří mezi bílkoviny jednoduché, jiné mezi bílkoviny složené, jež obsahují ještě nebílkovinnou „prostetickou složku“. Část bílkovinná se pak nazývá apoenzym, nebílkovinná koenzym a celek holoenzym. Jedině celistvý holoenzym může vykonávat svou katalytickou funkci. Koenzym může být na bílkovině vázán pevně a trvale, nebo jen labilně a pak ho lze oddělit např. dialýzou. Specifičnost působení Typickou vlastností enzymů je jejich specifita. Ta je v podstatě dvojí: substrátová a funkční. Substrátová specifita spočívá v tom, že enzym působí pouze na jeden substrát nebo skupinu substrátů. Enzymy s velmi úzkou substrátovou specifitou působí na jedinou sloučeninu nebo dokonce na jediný z jejích izomerů. Většina enzymů však působí na několik blízce příbuzných látek a některé i na velkou skupinu sloučenin téhož typu (např. na řadu různých esterů, alkoholů apod.). Substrátová specifita je určována bílkovinnou složkou (apoenzymem). Funkční specifita znamená, že enzym z několika možných přeměn substrátu katalyzuje pouze jediný typ reakce. Tak např. dekarboxyláza mění aminokyseliny na aminy, ne však na oxokyseliny, jiné aminokyseliny, amidy, estery apod. – tyto přeměny uskutečňují jiné enzymy. Funkční specifita je určována především koenzymem (je-li přítomen), podílí se však na ní i složka bílkovinná. Mechanismus působení Vysvětlení katalytického účinku enzymů je třeba hledat v jejich molekulární stavbě. Každá molekula enzymu má na svém povrchu tzv. aktivní místo (aktivní centrum). Toto místo obsahuje skupinu nebo skupiny, schopné reagovat s molekulou substrátu. Srazí-li se molekula enzymu a molekula substrátu ve vhodné orientaci, je substrát v aktivním místě vázán a vzniká tzv. komplex enzym-substrát (ES). Samo aktivní místo tvoří obvykle prohloubeninu povrchu bílkovinné molekuly a substrát do něj zapadá jako do určité „formy“. Tím je zabráněno vazbě jiných látek a zaručena přesná orientace substrátové molekuly. Vazbou substrátu se současně mění struktura aktivního místa i substrátu samého. Vzniká labilní konfigurace, která vyvolává další strukturální změnu, tj. právě příslušnou katalyzovanou reakci. Jakmile je substrát chemicky změněn na produkt, ztrácí schopnost vazby na enzym, uvolňuje se a aktivní místo se vrací do původního stavu. Celý průběh reakce lze znázornit schématem: 25

v20140903

E + S → ES → ES' → E + S' kde E je enzym, S substrát a S' změněný substrát (produkt reakce). U složených enzymů je koenzym vázán právě v aktivním centru a podílí se na vlastní reakci. Některé koenzymy se při reakci samy mění (poskytují např. substrátu vodík), uvolňují se spolu s produkty a mohou se vázat zpět až po regeneraci na jiném místě. I v dalších otázkách je pochopitelně mechanismus mnohých enzymových reakcí složitější, než je ve stručnosti popsáno. Enzymová kinetika Rychlost enzymové reakce závisí na mnoha podmínkách, jejichž vliv studuje enzymová kinetika. Velký vliv má obvykle pH prostředí, a to i u reakcí, jichž se ionty H+ a OH- přímo neúčastní. Na hodnotě pH závisí totiž celá struktura enzymové molekuly, včetně aktivního místa. Pro každý enzym a substrát lze stanovit optimální pH, při němž je rychlost reakce nejvyšší. Rychlost reakce dále závisí na teplotě. Se zvyšující se teplotou rychlost reakce narůstá, při vysoké teplotě však začíná postupná denaturace enzymu a jeho aktivita se opět snižuje. Dále záleží i na poměru koncentrací enzymu a substrátu. Nejvyšší rychlosti reakce je obvykle dosahováno v nadbytku substrátu, kdy je enzym substrátem „nasycen“. Různé substráty jsou ovšem enzymem zpracovávány nestejně rychle. Mírou afinity enzymu k danému substrátu a jeho celkové účinnosti může být např. číslo přeměny. Udává počet molekul substrátu, které přemění v optimálních podmínkách jedna molekula enzymu za minutu. Obvykle jde o několik tisíc, někdy však činí číslo přeměny až několik milionů (u acetylcholinesterázy 18×106 ). Aktivátory a inhibitory Nutnou podmínkou pro činnost některých enzymů jsou také aktivátory, jimiž jsou obvykle ionty kovů (Mg2+, Zn2+, Co2+ aj.). Tyto ionty ovlivňují strukturu enzymové molekuly, neváží se však obvykle přímo do aktivního místa jako koenzymy. Opačně působí tzv. inhibitory, které mohou být pro jednotlivé enzymy velmi specifické. Mechanismus jejich účinku je různý, některé se dočasně nebo trvale váží do aktivního místa namísto substrátu, jiné blokují vlastní aktivní skupiny a další mění normální prostorové uspořádání celé enzymové molekuly. Studium inhibitorů je pro poznání stavby a funkce enzymů velmi důležité. V živých soustavách neprobíhají enzymové reakce odděleně, ale jsou spojeny v enzymové řetězce nebo i rozsáhlé metabolické dráhy. Produkt jednoho enzymu je substrátem dalšího. Při stálé přeměně produktů na další látky probíhají i rovnovážné reakce jednosměrně. Reakce spotřebovávající energii jsou vždy spjaty s reakcemi exergonickými, takže i ony probíhají s dostatečnou rychlostí. Rozdělení enzymů Mezinárodní systém rozeznává 6 tříd podle jejich funkční specifity: 1. Oxidoreduktázy (uskutečňují oxidoredukční reakce, zejména přenos elektronů). 2. Transferázy (přenášejí různé funkční skupiny). 3. Hydrolázy (štěpí molekuly za vstupu vody). 4. Lyázy (štěpí nebo syntetizují vazby C-C, C-O, C-N bez účasti vody). 5. Izomerázy (přeměňují navzájem izomery téže sloučeniny). 6. Ligázy (syntetizují různé vazby za účasti makroergických sloučenin). Pro biologické účely je vhodné i dělení podle jiných hledisek, např. na lyoenzymy rozpuštěné v plazmě a desmoenzymy vázané na pevné struktury, vnitrobuněčné endoenzymy a ektoenzymy, vylučované z buněk do vnějšího prostředí atd.

26

v20140903

Aktivita enzymů Podle soustavy SI je základní jednotkou enzymové aktivity katal (kat). 1 katal odpovídá množství enzymu, jež za daných podmínek přemění 1 mol substrátu na produkt za sekundu. Vedle toho se používá starší mezinárodní jednotka IU (international unit). 1 IU je množství enzymu, jež přemění 1 mikromol substrátu na produkt za 1 minutu při 30°C. Enzymové jednotky: 1 kat = 1 mol/s ⇒ 6×107 IU 1 UI = 1 μmol/min (30°C) ⇒ 16,67 nkat Cíl cvičení Na praktických příkladech si přiblížíme princip detekce enzymové aktivity v buňkách a tělních tekutinách.

7.1

Stanovení pH optima aktivity kyselé fosfatázy

Chemikálie, biologický materiál, pomůcky 1 M Na2CO3, destilovaná voda PBS: pufrovaný fyziologický roztok fosfátovým pufrem Lyzační pufr: 50 mM NaCl, 10mM Tris/HCl, pH=7.3, 2mM MgCl2, 1mM dithiotreithol, 1% Triton X-100 Pufr pro měření aktivity: 100 mM Tris/kyselina mravenčí, pH = 2.5, 3.5, 4.5, 5.5, 6.5, 7.5, 8.5 a 9.5 Substrát: 50 mM p-nitrofenyl fosfát Buňky K562: nádorová buněčná linie, odvozená z myeloidní leukémie s Filadelfským chromosomem; buňky rostou volně v médiu, jsou tedy neadherentní Spektrofotometr Genios, centrifuga. Postup Příprava buněčného lyzátu Přibližně 5×106 buněk sedimentujeme ve zkumavce centrifugací (1500 ot/min, 5 min při lab. teplotě), sediment resuspendujeme v 1 ml PBS pufru a znovu sedimentujeme za stejných podmínek. Supernatant odsajeme pipetou a sediment resuspendujeme ve 200 μl lyzačního pufru a zkumavku inkubujeme v ledové lázni 30 min. Lyzát přečistíme centrifugací (18000 ot/min, 5 min při 4°C). Měření pH optima aktivity kyselé fosfatázy Do 2 sad zkumavek napipetujeme po 500 μl pufru o pH 2,5-9,5. Do každé zkumavky pak přidáme 10 μl substrátu. Reakci iniciujeme přídavkem 10 μl buněčného lyzátu, který přidáme pouze do první sady zkumavek a protřepeme. Do druhé sady zkumavek napipetujeme 10 μl destilované vody (tzv. „blank“). Zkumavky inkubujeme 30 min. při laboratorní teplotě. Reakci ukončíme přídavkem 500 μl 1 M Na2CO3 (do obou sad zkumavek). Pozor: přidání Na2CO3 do kyselého prostředí způsobí uvolňování plynu (CO2) – zkumavky necháme chvíli otevřené, nezavíráme je bezprostředně po ukončení reakce. Z každé zkumavky poté napipetujeme 200 µl směsi do mikrotitrační destičky. U každého vzorku změříme absorbanci při 405 nm. Od naměřené hodnoty vždy odečteme hodnotu absorbance odpovídajícího slepého vzorku (blanku) – tj. slepého vzorku v pufru o stejné hodnotě pH. Aktivitu vyjádříme v bezrozměrných jednotkách jako velikost absorbance při 405 nm (osa Y) proti pH (osa X). O maximální naměřené hodnotě pak řekneme, že je pH optimem pro kyselou fosfatázu. 27

v20140903

Komentář Fosfatázy jsou enzymy, které hydrolyzují fosforečné monoestery a uvolňují kyselinu ortofosforečnou. V některých buňkách je více fosfatáz, které se dělí na alkalické a kyselé – podle optimálního pH, při kterém jsou tyto enzymy aktivní. Alkalické fosfatázy jsou aktivovány ionty hořčíku, slaběji ionty manganu, zinku a kobaltu. Naproti tomu kyselé fosfatázy nepotřebují ionty hořčíku a lze je selektivně inhibovat fluoridy. Kyselé fosfatázy se nacházejí v lysozomech, kde představují jeden z nejběžnějších hydrolytických enzymů a podílejí se na rozkladu pohlceného materiálu v sekundárních lysozomech. Primární lysozomy vznikají odštěpením z cisteren Golgiho komplexu a obsahují asi 40 hydrolytických enzymů – již zmíněnou kyselou fosfatázu, různé typy proteáz, glykosidázy, riboa deoxyribonukleázy a jiné. Sekundární lysozomy vznikají splynutím primárních lysozomů s membránou obalených váčků, jež obsahují materiál určený k likvidaci. Tyto váčky se nazývají buď autofagosomy (obsahují vlastní buněčný materiál – nefunkční organely) nebo fagosomy (obsahují extracelulární materiál pohlcený při fagocytóze). Kyselá fosfatáza se hojně nalézá u hemopoetických buněk. Bylo zjištěno, že aktivita kyselé fosfatázy je vyšší u některých typů lymfocytárních leukémií (toho se využívá i k diagnostickým účelům). Alkalická fosfatáza je membránově vázaný glykoprotein, jehož přirozený substrát není dosud znám. Přítomnost alkalické fosfatázy lze prokázat prakticky ve všech tkáních a také v tělních tekutinách, například v krevním séru. Medicínsky se nejvíce její aktivita testuje kromě séra také v játrech, kostní tkáni, střevě a placentě. Vysoká aktivita alkalické fosfatázy bývá často spojená s různými onemocněními vč. výskytu nádoru. Otázky 1. Proč je pH optimum kyselé fosfatázy tak nízké? 2. Jaký je pravděpodobný fyziologický smysl nízkého pH optima u lysozomálních enzymů?

7.2

Průkaz slinné amylázy člověka

Pomůcky 1% roztok škrobového mazu (škrob rozpuštěný ve vroucí vodě), Lugolův roztok, destilovaná voda, malá nálevka s papírovou vatou, kádinka, 2 dělené pipety na 5 ml, kapátko, vodní lázeň nastavená na 37°C. Postup Pokus provádíme ve skupinách po 3-4 posluchačích. Pro získání roztoku slinné amylázy podrží jeden ze skupiny v ústech malý doušek destilované vody (25-30 ml) po dobu 5 min. Výplašek pak zfiltruje nálevkou s vatou do kádinky. Získáme tak enzymový preparát. Další studenti napipetují po 1 ml škrobového mazu do dvou zkumavek. Do první (pokusné) zkumavky se dále přidá 1 ml slinného výplašku (s amylázou), do druhé zkumavky (kontrolní) 1 ml destilované vody. Obě zkumavky označíme, protřepeme a vložíme do vodní lázně o teplotě 37°C. Po 15 min obě zkumavky vyjmeme. Porovnáme proti světlu stupeň zákalu roztoku a výsledek poznačíme do protokolu. Do každé zkumavky pak kápneme jednu kapku Lugolova roztoku a promícháme. Všimneme si barevné reakce v obou zkumavkách a porovnáme. Otázky 1. Jakou látku obsahuje Lugolův roztok a jak reaguje toto činidlo se škrobem? 2. O čem svědčí změna reakce po působení slinné amylázy? 3. Jaké látky vznikají enzymovým štěpením (částečným, úplným) ze škrobu? 28

v20140903

4. Jak vysvětlíme změny ve stupni zakalení škrobového roztoku působením enzymu? Poznámka Úkol lze modifikovat tak, že preparát slin od jedné skupiny posluchačů zředíme 10× destilovanou vodou a připravíme deset stejných zkumavek obsahujících po 1 ml škrobového mazu a 1 ml ředěných slin. Vložíme do vodní lázně a pak zkumavky po dvou minutách postupně vyjímáme a přikápneme Lugolův roztok. U kontrolní zkumavky přikápneme tento roztok okamžitě po smíšení škrobového mazu a slin. Ve stojánku seřadíme zkumavky podle doby působení enzymu (doby pobytu ve vodní lázni), přičemž kontrolní zkumavku zařadíme jako první. Pozorujeme postupné mizení zákalu a jodoškrobové reakce. Obvykle lze zachytit vznik tzv. erytrodextrinů, krátkých oligosacharidických řetězců, které se jódem nebarví fialově, ale červeně.

7.3

Průkaz peroxidázy v krvi

Pomůcky Lidská krev; acetátový pufr o pH 4,7 (připravíme smísením stejných dílů 0,1 mol/dm3 roztoků kys. octové a octanu sodného); destilovaná voda; 0,02% roztok indigokarmínu ve vodě; 0,1% peroxid vodíku; zkumavky; dělené pipety na 5 ml a 1 ml. Postup Krev zředíme destilovanou vodou v objemovém poměru 1:1000. Ve zkumavce smícháme postupně 4 ml acetátového pufru, 3 ml ředěné krve, 1 ml roztoku indigokarmínu a 0,5 ml roztoku H2O2. V další zkumavce použijeme namísto roztoku H2O2 destilovanou vodu (kontrola). Výsledek Barva roztoku se v první zkumavce změní během 30-50 s z modré na zelenou a dále žlutorůžovou (barva zředěné krve). V kontrolní zkumavce odbarvení nenastane. Komentář Při oxidačních dějích v buňce vzniká v některých případech namísto vody peroxid vodíku, který je pro svou reaktivitu i v malých množstvím toxický. Je odstraňován jednak katalázou, která jej štěpí na vodu a kyslík, jednak peroxidázami, které pomocí H2O2 oxidují různé další sloučeniny. Krev savců obsahuje katalázu i peroxidázy. V našem případě peroxidáza oxidovala modrý indigokarmín na bezbarvý oxidační produkt. Otázky 1. O čem svědčí možnost provedení reakce v krvi tisícinásobně „zředěné“? 2. Co se stane s erytrocyty, pokud krev „naředíme“ 1000× destilovanou vodou?

29

v20140903

8. Biomembrány a osmóza Studijní příprava Membránový princip organizace buňky. Molekulární struktura biomembrán, chemické složení, uspořádání molekul. Membránové kompartmenty a organely. Obecný význam membránového principu. Plazmatická membrána a její struktura. Membránové přenosy. Teoretický úvod Difúze a osmóza Částice rozpuštěných látek ve zředěných roztocích se chovají podobně jako částice ideálních plynů. Smísíme-li různě koncentrované roztoky téže látky nebo roztoky různých látek, rozptýlí se po určité době všechny přítomné částice rovnoměrně v celém dosažitelném objemu. Nastalo vyrovnání koncentrací difúzí. Složitější případ nastane, oddělíme-li takové roztoky polopropustnou membránou, která propouští pouze molekuly rozpouštědla a nepropouští částice rozpuštěných látek. V tomto případě nastane přesun rozpouštědla přes membránu do koncentrovanějšího roztoku, který se zřeďuje tak dlouho, až se koncentrace na obou stranách membrány vyrovnají. Přesunem rozpouštědla se současně mění objemy roztoků v obou prostorech. Popsaný děj je příkladem osmotického děje. Osmóza je tedy difúze molekul rozpouštědla přes polopropustnou membránu (ve směru koncentračního gradientu). Osmotický tlak a osmolarita Osmotické děje vypadají navenek jako „vysávání“ rozpouštědla (např. vody) ze zředěnějších roztoků roztoky koncentrovanějšími. Sílu, kterou nasává určitý roztok čisté rozpouštědlo přes semipermeabilní membránu v osmotické soustavě, nazýváme osmotický tlak. Měříme jej v jednotkách tlaku, pascalech (Pa). Osmotický tlak má každý roztok sám o sobě, v takové situaci jde však o tlak latentní (tzv. osmotická hodnota). Jako skutečná síla, schopná konat i práci, se tento tlak projeví teprve po vytvoření osmotického systému. Osmotický tlak roztoku je přímo úměrný počtu částic rozpouštěných látek v jednotce objemu. U látek nedisociujících v roztoku závisí proto osmotický tlak na jejich molární koncentraci. U disociujících sloučenin je třeba násobit jejich molární koncentraci c ještě disociačním koeficientem i, který udává, kolik samostatných částic disociuje z jedné molekuly této sloučeniny v roztoku. Takto vyjádřenou koncentraci (c.i) nazýváme koncentrací osmolární. Např. u NaCl, jehož molekuly ve vodě úplně disociují na dvě částice (Na+ a Cl-), je osmolární koncentrace dvojnásobkem molární koncentrace. Osmotický tlak každého roztoku dále závisí na teplotě (s rostoucí teplotou se zvyšuje). Naproti tomu vůbec nezávisí na velikosti, tvaru, hmotnosti nebo náboji částic rozpuštěných látek (tedy na jejich kvalitě). Všechny uvedené závislosti shrnuje vzorec pro výpočet osmotického tlaku: P=R.T.c.i

(Pa)

R ... plynová konstanta T ... absolutní teplota (v Kelvinech) c ... molární koncentrace rozpuštěné látky i ... disociační koeficient (c×i tedy znamená osmolární koncentraci) Vzorec umožňuje vypočítat osmotický tlak každého roztoku z koncentrace rozpuštěných látek a teploty. U biologických tekutin, které jsou složitým roztokem mnoha látek, je stanovení celkové osmolarity z výpočtů pro jednotlivé složky těžko proveditelné. Proto využíváme toho, že na osmolaritě roztoku jsou závislé i další vlastnosti, např. změny bodu varu a bodu tání. Osmolaritu biologických tekutin pak určíme např. kryoskopicky na základě poklesu bodu tání. 30

v20140903

Osmóza v živých buňkách Osmotické jevy hrají velmi důležitou roli ve všech živých soustavách. V buňce se klasické polopropustné membráně nejvíce podobá plazmatická membrána (PM). Tato membrána volně propouští pouze molekuly rozpouštědla, tj. vodu. Látky ve vodě rozpuštěné pouhou difúzí nepropouští (až na výjimky). Podobně se chová membrána na povrchu vakuol, membrány mitochondrií a plastidů a do určité míry i dalších membránových organel. Systémem membrán je tak eukaryotická buňka rozdělena na větší počet osmoticky oddělených prostorů. Nejnápadnější a nejdůležitější jsou osmotické jevy na rozhraní buňky a vnějšího prostředí, tedy na PM. Roztok, který obklopuje živou buňku, může být vůči ní izotonický (má stejný osmotický tlak jako tekutý obsah buňky), hypotonický (má nižší osmotický tlak) nebo hypertonický (má vyšší osmotický tlak). Pokud jsou buňky v izotonickém roztoku, nenastává žádný osmotický děj – buňky neztrácejí ani nepřijímají vodu a jejich životní pochody nejsou narušovány. Jsou-li buňky v hypotonickém roztoku (případně v čisté vodě), proniká voda osmózou ve směru vyšší koncentrace, tedy dovnitř buňky. Mluvíme o tzv. endosmóze vody. Endosmózou se zvětšuje objem buňky a může dojít až k prasknutí PM a vylití cytoplazmy – tzv. plazmoptýze. Plazmoptýza nastává velmi snadno u savčích červených krvinek. Vstříknutí většího množství hypotonického roztoku (nebo vody) do krve vyvolává jejich praskání (osmotickou hemolýzu). Také rostlinné buňky v hypotonickém roztoku nasávají vodu a zvětšují svůj objem. Prasknutí zde však obvykle zabraňuje pevná buněčná stěna. Vytvoří se rovnováha, v níž napínaná buněčná stěna tlačí zpětně na rozpínající se obsah buňky. Tomuto stavu říkáme buněčné napětí neboli turgor. Turgor je podstatnou složkou mechanické pevnosti rostlinných orgánů; při poklesu turgoru rostlina vadne. Na rozdíl od živočišných buněk snášejí rostlinné buňky dobře styk s hypotonickými roztoky i čistou vodou. Pokud jsou buňky v hypertonickém roztoku, nastává exosmóza vody z buněk do koncentrovanějšího prostředí. Živočišné buňky se přitom smršťují a obvykle mění tvar. Takové smrštění nazýváme plazmorhiza. Nápadný je tento děj opět u červených krvinek (viz úkol 8.2.). Rostlinné buňky v hypertonickém roztoku také ztrácejí vodu a živý obsah buňky (protoplast) s plazmatickou membránou na povrchu se smršťuje. Beze změny však zůstává pevná buněčná stěna, která je pro vnější roztok plně propustná. Výsledkem je odtržení plazmatické membrány od buněčné stěny: tento děj nazýváme plazmolýza. Hypertonický roztok proniká pak do prostoru mezi stěnu a plazmatickou membránu, smršťování protoplastu pokračuje a může vést až k jeho roztrhání a zániku buňky. Vznik a složky osmotického tlaku V předchozích odstavcích jsme měli na mysli osmotický tlak živé buňky jako celku. Čím je však dán osmotický tlak v tak složité soustavě? Zjednodušeně jej můžeme rozložit na několik složek, jak vyjadřuje vzorec: P = Pkr + Pko + D – PD Pkr zde znamená osmotický tlak přítomných krystaloidů (látek tvořících pravé roztoky) a Pko osmotický tlak všech koloidů. Koloidy nebývají zcela nasyceny vodou a zvyšují proto příjem vody svým bobtnacím tlakem D. Osmotické jevy ovlivňuje také membránová neboli Donnan-Gibbsova rovnováha (bude probírána ve fyziologii), která osmotický tlak buňky snižuje. Její příspěvek (PD) nese proto záporné znaménko. Naprostou většinu osmotického tlaku v živých soustavách vytvářejí krystaloidy. Koloidy s malým počtem velkých molekul vyvolávají jen malý tlak. Navíc je tento tlak těžko odlišitelný od posledních dvou složek v našem vzorci. Všechny složky osmotického tlaku závislé na přítomnosti koloidů shrnujeme proto pod pojem onkotický tlak PO: PO = Pko + D - PD 31

v20140903

Můžeme tedy shrnout: P = Pkr + PO V krvi člověka je osmotický tlak udržován na hodnotě cca 0,75 MPa; z toho naprostou většinu tvoří tlak krystaloidů (zvlášť NaCl) a onkotický tlak je jen cca 0,003 MPa. Nejjednodušší anorganický roztok izotonický s lidskou krví bývá nazýván roztokem fyziologickým a je to 0,9% roztok NaCl v destilované vodě. V tomto roztoku lze savčí buňky udržet kratší dobu bez poškození a zabránit vzniku hrubých artefaktů. Význam osmotických jevů Osmotické děje jsou pro život rostlin, živočichů i člověka zcela nezbytné. Tak např. vyšší rostliny přijímají vodu kořeny na základě osmózy. Suchomilné druhy přitom vytvářejí v buňkách kořenových vlásků osmotický tlak až 20 MPa. V těle člověka se stále vytváří osmotická rovnováha mezi krví a buňkami a tkáněmi těla. Osmotické jevy hrají zásadní roli při tvorbě a resorpci tkáňového moku (lymfy), příjmu vody a rozpuštěných živin, zahušťování primární moči v kanálcích ledvin a dalších dějích, jimiž se zabývá fyziologie. Poruchy v těchto pochodech mohou vést např. ke vzniku otoků. Cíl cvičení Seznámíme se prakticky s některými vlastnostmi plazmatické membrány a s osmotickými jevy na buněčné úrovni.

8.1

Rozpad plazmatické membrány erytrocytů – chemická hemolýza

Pomůcky Krev z krevní konzervy, fyziologický roztok, pipeta, 5% roztok Septonexu, kapátka, mikroskopické potřeby, filtrační papírky; rukavice (nitrilové, latexové nebo vinylové; možno i nesterilní). Postup Krev naředíme fyziologickým roztokem (do růžového zbarvení). Napipetujeme kapku naředěné krve na podložní sklo a přikryjeme krycím sklem. Pozorujeme postupně malým a velkým zvětšením jednotlivé plovoucí erytrocyty. Bez změny polohy stolku mikroskopu přidáme k hraně krycího skla kapku roztoku Septonexu a průnik roztoku pod sklo urychlíme opatrným odsáváním filtračním papírkem u protější hrany krycího skla. Nyní pozorujeme preparát velkým zvětšením postupně od středu k hraně, u níž je kapka Septonexu. Nalezneme hranici, na které probíhá rozpad erytrocytů. Vybereme si jeden dosud neporušený erytrocyt a pozorujeme jej až do jeho rozpadu („rozplynutí“). Pozorování opakujeme a výsledek popíšeme. Výklad Septonex je látka povahy kvarterní amoniové soli; výrazně snižuje povrchové napětí kapalin (povrchově aktivní látka neboli tenzid). V jeho přítomnosti ztrácí bimolekulární film fosfolipidů v plazmatické membráně stabilitu a rozpadá se na kulovité micely. Erytrocyty jsou k působení podobných látek zvláště citlivé, rozpadají se a jejich vnitřní obsah včetně hemoglobinu se vylévá do prostředí. Tento děj se nazývá chemická hemolýza. Při správném zaclonění vidíme na místě erytrocytu po určitou dobu ještě jeho bezbarvý „stín“ ze zbytků buněčných struktur, zejména cytoskeletu. Septonex se díky výše popsaným účinkům na živé buňky používá jako dezinfekční činidlo a k ošetření drobných poranění. Poznámka Podobný rozpad erytrocytů lze pozorovat v hypotonickém roztoku. V tomto případě je však příčinou rozpadu buněk nasávání vody do erytrocytů (po koncentračním gradientu); plazmatická 32

v20140903

membrána mechanicky praská při zvětšení objemu buňky (plazmoptýza, viz úvod). Jedná se o osmotickou hemolýzu.

8.2

Změna tvaru krvinek v hypertonickém prostředí

Pomůcky Krev z krevní konzervy, 1,5% roztok NaCl, 0,9% roztok NaCl (fyziologický roztok), pipety na 1 ml, zkumavky; rukavice (nitrilové, latexové nebo vinylové; možno i nesterilní). Postup Do dvou zkumavek eppendorf napipetujeme po 100 µl krve; do jedné zkumavky přidáme 1 ml fyziologického roztoku, do druhé přidáme 1 ml 1,5% roztoku NaCl. Po promíchání zhotovíme z obou buněčných suspenzí nativní preparát a pozorujeme při silném zvětšení (objektiv 40×). Výsledek Zatímco krvinky ve fyziologickém roztoku zachovávají svůj typický tvar, krvinky ve vyšší koncentraci NaCl se zakulacují, smršťují a nabývají zvláštního „ježatého“ tvaru. Zakreslíme několik erytrocytů typického a změněného tvaru. Výklad Ve fyziologickém roztoku, který je pro krvinky izotonický, mají buňky stejný tvar jako v krvi. V hypertonickém prostředí však exosmózou rychle ztrácejí vodu a jejich objem se zmenšuje. Přitom se svrašťuje membrána na povrchu krvinky a vytváří se typické osténkovité výběžky. Srovnejte tento děj s chováním rostlinné buňky v hypertonickém prostředí (úkol 8.3). Jak reagují krvinky v hypotonickém prostředí? Poznámka Erytrocyty snadno mění svůj tvar i v krvi, která byla zahuštěna pouhým odpařováním – např. v nesprávně zhotoveném krevním nátěru, kapce krve na podložním skle apod.

8.3

Průběh plazmolýzy a deplazmolýzy

Pomůcky Mech měřík (Mnium sp.), 1 M roztok sacharózy, mikroskopické potřeby. Postup Připravíme nativní preparát lístku mechu ve vodě. Pozorujeme jej při malém zvětšení. Při tomto zvětšení prosajeme preparátem roztok sacharózy a pozorujeme pak při zvětšení velkém. Po zakreslení plazmolyzované buňky prosajeme preparátem destilovanou vodu a pozorujeme deplazmolýzu: cytoplazma se vrátí do své původní polohy a plazmatická membrána opět přilne k buněčné stěně. Výsledek Vlivem hypertonického prostředí, do něhož pletivo uvádíme prosáváním roztoku sacharózy, nastává před našima očima plazmolýza buněk. Při silném zvětšení zakreslíme jednu buňku neplazmolyzovanou a jednu plazmolyzovanou. Výklad Plazmolýza je zmenšení objemu protoplastu exosmózou vody z buňky (zejména z vakuol) v hypertonickém prostředí. Morfologicky se projevuje odchlípením cytoplazmy od buněčné stěny.

33

v20140903

8.4

Vznik nadmolekulární struktury autoorganizací

Pomůcky Lecitin, voda (případně roztok KOH), kapátko, jehla, mikroskopické potřeby. Postup Příprava lecitinu (studenti neprovádějí): vaječný žloutek smísíme po kapkách za stálého míchání na el. magnetické míchačce s 20 ml absolutního etanolu. Protřepeme. Přidáme 50 ml éteru. Promícháme. Filtrujeme do odpařovací misky: rozpuštěné lecitiny se oddělí od vysrážených bílkovin. Směs na vodní lázni odpaříme. Zůstane nažloutlá, olejovitá emulze. Misku přeneseme na led a k emulzi přidáme 20 ml vychlazeného acetonu a promícháme. Necháme usadit a žlutou tekutinu odlijeme. Vícekrát opakujeme, až aceton zůstane bezbarvý. Zbylý materiál je surový extrakt lecitinu, má voskovitou konzistenci. Uchováváme jej v chladničce. Na hrotu jehly přeneseme malé množství (asi 1/2 mm3) lecitinu na podložní sklo a trochu jej po skle rozmázneme. Přikryjeme krycím sklem, které na materiál jen slabě přitlačíme. Při malém zvětšení vyhledáme okraj lecitinového materiálu. Pozorujeme jej objektivem 20× zvětšujícím. Materiál je amorfní. Jeho okraj je světlolomný a jeví se jako tmavší. Požádáme sousedního studenta, aby nám přikápnul na podložní sklo (k okraji krycího skla) kapku vody nebo roztoku KOH. Přitom pozorujeme okraj materiálu. Výsledek Z amorfního lecitinu vyrůstají při styku s vodou trubičky, které se různě ohýbají a proplétají. Nazývají se myelinové útvary. Nakreslíme je a vysvětlíme jejich vznik. Výklad Lecitin je fosfolipid. Jeho molekuly obsahují na jednom konci (nepolárním) hydrofobní skupiny (koncové –CH3 skupiny mastných kyselin) a na druhém konci (polárním) hydrofilní skupiny (glycerol, kys. fosforečná a cholin). Molekuly lecitinu jsou tedy amfifilní. Vykazují povrchovou aktivitu ve styku s polární tekutinou – vodou: orientují se na hranici fází. Snižují povrchové napětí vody. Při styku s vodou se polární konce molekul lecitinu orientují směrem do vodného prostředí, zatímco nepolární konce molekul jsou z vodného prostředí vytlačovány; molekuly se sestavují do pravidelných struktur. Dochází k asociaci molekul lecitinu – navzájem asociují mezi sebou vždy jen nepolární konce molekul a stejně tak konce polární (ty se orientují směrem do vodného prostředí). Následkem toho vzniká paralelní uspořádání lecitinových molekul do poměrně stabilní molekulární dvojvrstvy (bimolekulárního filmu) o tloušťce asi 5 nm. K tomuto bimolekulárnímu filmu se paralelně přiřazují velkou rychlostí další dvojvrstvy. Od sebe jsou odděleny mezivrstvou vodních molekul. Z velkého počtu takových dvojvrstev vzniká posléze nadmolekulární struktura tvaru trubičky, kterou vidíme v mikroskopu. Autoorganizace fosfolipidových molekul probíhá, dokud všechny volné hydrofilní konce molekul nejsou „obsazeny“ vodou: proto trubičky přijímají vodu, rostou a přitom se různě prohýbají. Hnací silou tohoto samosestavovacího procesu je tendence vodních molekul směřovat do svého stavu maxima entropie, která "nutí" fosfolipidové molekuly uspořádat se tak, aby jejich uhlovodíkové konce byly co nejméně vystaveny molekulám vody. Význam Vznik výše popsaných útvarů je modelem autoorganizačního procesu. Tento mechanismus (autoorganizace fosfolipidových molekul) také zajišťuje orientaci molekul fosfolipidů v buněčných membránách. Bimolekulární vrstva lipidů typu lecitinů je základem membránových struktur všech buněk. Podílí se na této autoorganizaci genetická informace? 34

v20140903

8.5

Traubeho měchýřek

Pomůcky Zkumavka, stojánek, pinzeta, vodný roztok síranu měďnatého (2 %), krystalický ferokyanid draselný (žlutá krevní sůl). Postup Zkumavku naplníme asi do poloviny roztokem síranu měďnatého a pinzetou do něj vhodíme několik krystalků ferokyanidu. Zkumavku postavíme do stojánku a pozorujeme. Výsledek Na povrchu krystalku vzniká rudohnědá blanka ve tvaru měchýřku, který zvětšuje svůj objem – roste. Zakreslíme tvar měchýřku po 2,5 a 10 min. Výklad Krystal ferokyanidu draselného se rozpouští a reakcí s ionty mědi tvoří semipermeabilní membránu ferokyanidu měďnatého, která má tvar měchýřku: 2 CuSO4 + K4Fe(CN)6 → Cu2Fe(CN)6 + 2 K2SO4 Koncentrovaný roztok uvnitř měchýřku nasává osmoticky volné molekuly vody z roztoku síranu měďnatého (endosmóza), tím se zvětšuje objem měchýřku, až posléze praskne. Otvorem se vylije z měchýřku roztok ferokyanidu draselného, který při styku s roztokem síranu měďnatého okamžitě reaguje podle výše uvedené rovnice, vytvoří se nová membrána (kterou se otvor uzavře) a endosmóza vody se obnoví. Růst celého útvaru se jeví jako naskakování drobných puchýřků. Význam Traubeho měchýřek je anorganickým modelem osmózy. Měchýřky vznikají, rostou, mění tvar a pohybují se z fyzikálně chemických příčin: chemickou reakcí (substitucí) vzniklé molekuly ferokyanidu měďnatého se v použité směsi organizují automaticky do plošných vrstev a formují membránu měchýřku. Ta propouští jenom vodu. Tím vzniká osmotická soustava: uvnitř měchýřku je hypertonický roztok ferokyanidu draselného, který endosmózou vody zvětšuje objem a v jeho okolí je hypotonický roztok síranu měďnatého.

35

v20140903

9. Buněčný cyklus, mitóza Studijní příprava Dělení buněk, průběh buněčného cyklu. Fáze buněčného cyklu a jeho regulace. Regulace buněčného dělení v mnohobuněčném organismu. Teoretický úvod Zatímco prokaryotická buňka se dělí velmi rychle a jednoduše (obsahuje jediný „chromozom“), buněčné dělení u eukaryotické buňky je mnohem složitější – její jaderný genom je tvořen mnoha chromozomy. Eukaryotické buňky také obsahují mnoho membránových organel a cytoskeletálních filament. Během buněčného cyklu, což je období buňky od jejího vzniku do jejího rozdělení, musí tedy buňka duplikovat svůj jaderný a cytoplazmatický materiál a rovnoměrně jej rozdělit do dceřiných buněk. Tímto způsobem se dělí somatické buňky – jejich buněčný cyklus je zakončen mitózou a vznikají při něm dceřiné buňky se shodnou genetickou výbavou, jakou měla buňka mateřská. Při zrání pohlavních buněk probíhá zvláštní buněčný cyklus, zakončený meiózou, při němž se dceřiné buňky liší genetickou výbavou od buňky mateřské. Buněčný cyklus somatické eukaryotické buňky se skládá z metabolicky aktivní, dlouhé interfáze a ze závěrečné M-fáze – mitózy, která zahrnuje karyokinezi a cytokinezi. Interfáze je doba mezi dvěma buněčnými děleními, kterou dělíme na G1 fázi, S fázi a G2 fázi. G1 fáze obsahuje hlavní kontrolní bod buněčného cyklu a má proto ze všech fází nejvíce proměnlivou délku v závislosti na vnějších podmínkách. V této fázi dochází k intenzivní syntéze RNA a proteinů, buňka roste, duplikuje cytoplazmatické organely. Syntézou DNA polymerázy, některých enzymů a zásoby nukleotidů se připravuje na následující replikaci jaderné DNA, na syntetickou fázi. S fáze (syntetická fáze) je obdobím replikace chromozomální DNA. Nejdříve se replikují jejich euchromatinové úseky chromozomů, později heterochromatinové. Současně s replikací DNA probíhá syntéza histonů (histony jsou nezbytné pro tvorbu nových chromatinových vláken). Na konci S fáze je každý chromozom tvořen dvěma chromatidami spojenými centromerou a jádro obsahuje dvojnásobné množství DNA, než před zahájením S fáze. (Replikace mimojaderné DNA probíhá během celé interfáze.) G2fáze je relativně krátké období, v němž pokračuje růst buňky, syntéza RNA a proteinů, tvorba organel a dalších buněčných struktur. Tato fáze obsahuje kontrolní body pro zahájení karyokineze a cytokineze. M-fáze, mitóza je zahájena kondenzací chromozomů. Je to plynulý sled událostí, který podle morfologie a umístění chromozomů dělíme na 5 stadií: Profáze je zahájena rozestupem dceřiných centriolů k pólům buňky a tvorbou mitotického vřeténka. Kondenzace chromozomů pokračuje, přechodně se pozastavuje jejich genetická aktivita. Jadérko se postupně zmenšuje. Prometafáze začíná náhlým rozpadem jaderného obalu a zánikem jadérka. Chromozomy se připojují na mitotické vřeténko, je dokončována jejich kondenzace. Metafáze vede k postupnému uspořádání chromozomů v ekvatoriální rovině buňky – je to období jejich dynamické stability. Každý chromozom je složen ze dvou chromatid. Anafáze začíná oddělením dceřiných chromatid každého chromozomu, ze kterých se tak stávají dceřiné chromozomy. Každý z nich je tažen k opačnému pólu dělicího vřeténka. Během telofáze se obě sady dceřiných chromozomů dostávají k pólům buňky, vytvářejí se jaderné membrány dceřiných jader. Jádra rostou, v místech nukleolárních organizátorů se tvoří jadérka. Chromozomy dekondenzují do svého aktivního interfázového stavu. Je dokončována cytokineze – 36 v20140903

u živočišných buněk pomocí kontraktilního prstence, u rostlinných buněk tvorbou nové buněčné stěny. Dvě vzniklé dceřiné buňky jsou opět ve stadiu počínající interfáze, tedy G1 fáze. Cíl Naučit se měřit obsah DNA pomocí průtokové cytometrie, rozlišovat fáze eukaryotického buněčného cyklu a fáze mitózy a pozorování dělení buněk pučením.

9.1

Analýza buněčného cyklu pomocí průtokové cytometrie

Princip průtokové cytometrie

Průtoková cytometrie je technika pro rychlé měření optických vlastností jednotlivých částic nebo buněk, které procházejí snímacím místem. Jednou z nejpodstatnějších vlastností průtokové cytometrie (cytometrické analýzy) je skutečnost, že se provádí měření každé jednotlivé buňky nebo částice a nejde tedy o průměrné hodnoty měřené v buněčné suspenzi nebo v buněčném lyzátu. Průtokový cytometr je vybaven laserem (nejčastěji argonovým), který umožňuje analýzu mnoha buněčných parametrů na základě 1) rozptylu laserového paprsku, 2) fluorescence. Rozptyl paprsku i intenzita fluorescence jsou zaznamenávány jednotlivými detektory a softwarově vyhodnocovány. ad 1) Rozptyl laserového paprsku je závislý na velikosti a granularitě (denzitě) procházejících buněk (nebo částic). Například lymfocyty jsou malé a denzní buňky, naopak granulocyty jsou buňky větší s vyšší denzitou (Obr. 1):

Obr. 1. Bodový a vrstevnicový graf zobrazující velikost a granularitu různých leukocytů Bodový graf (vlevo): každá tečka odpovídá 1 buňce – na ose x můžeme odečíst relativní velikost buňky, na ose y potom její granularitu. Vrstevnicový graf (vpravo): jiné zobrazení údajů z grafu vlevo (jednotlivé vrstevnice spojují oblasti s výskytem konkrétní hustoty buněk). osa X – velikost částic (buněk); osa Y – granularita ad 2) Kromě výše uvedené základní analýzy lze buňky obarvit fluorescenčním barvivem a následně stanovit intenzitu fluorescence. Je možné přímo barvit specificky určité organely (např. mitochondrie) nebo biomolekuly (např. DNA). Nepřímo lze obarvit i zvolené proteiny v buňce (např. povrchové antigeny, atd.): na zvolený protein necháme navázat fluorescenčně označenou protilátku (specificky se vážící na tento protein). Každá molekula této protilátky je konjugována s molekulou fluorescenčního barviva. Po nabarvení buněk a následném odmytí nenavázané 37

v20140903

protilátky zůstanou molekuly fluorescenčně označené protilátky navázány pouze na molekulách vybraného proteinu. Takto lze např. u leukocytů určit přítomnost/nepřítomnost tzv. diferenciačních znaků (Clusters of Differentiation – CD) a tím určovat specifické buněčné subpopulace – například CD4+ T-lymfocyty (pozitivně reagují s protilátkou proti znaku CD4 na jejich povrchu). Dále lze použít barviva, která se stávají fluorescenčními v důsledku chemické reakce uvnitř buňky a tak sledovat některé parametry buněčného metabolismu. Analýza buněčného cyklu pomocí průtokové cytometrie Aplikací metod průtokové cytometrie je celá řada. Jednou z velmi hojně používaných aplikací je analýza obsahu jaderné DNA (analýza buněčného cyklu). Tato metoda využívá fluorescenční barvivo, jež se „váže“ specificky a stechiometricky na DNA a jehož fluorescence je zvýšená po „navázání“ na DNA. Měření obsahu DNA v jednotlivých buňkách poskytuje statistický pohled na buněčný cyklus (Obr. 2):

Osa X – intenzita fluorescence (⇒ obsah jaderné DNA); osa Y – počet buněk Obr. 2. Analýza buněčného cyklu průtokovou cytometrií Chemikálie, biologický materiál N6-dimethylaminopurin (nespecifický inhibitor protein kináz) PBS (Phosphate buffered saline; izotonický roztok NaCl pufrovaný fosfátovým pufrem) Fixační směs: 70% etanol/30% PBS (v/v), pH 7,3 Pufr pro barvení jader: PBS obsahující propidium jodid (5 μg/ml) a ribonukleázu (100 μg/ml) Buňky K562: nádorová buněčná linie odvozená z myeloidní chromozomem (buňky jsou volně rostoucí v médiu)

leukémie s Filadelfským

Postup Indukce změn v buněčném cyklu: K buněčné suspenzi přidáme látku, jež blokuje určitou fázi buněčného cyklu (500μM N6-dimethylaminopurin ) a inkubujeme za standardních podmínek. Jako kontrolu použijeme buňky kultivované ve standardním médiu (bez N6-dimethylaminopurinu). Fixace buněk: Přibližně 2×106 buněk inkubovaných 48 h v přítomnosti N6-dimethylaminopurinu sedimentujeme ve zkumavce centrifugací (1500 ot/min, 5 min. při lab. teplotě), sediment resuspendujeme v 1 ml ledové fixační směsi. Buňky necháme ve fixační směsi při -18°C přes noc. Barvení buněk: Fixované buňky sedimentujeme ve zkumavce centrifugací (2000 ot/min, 5 min. při lab. teplotě), sediment resuspendujeme v 1 ml pufru pro barvení. Buňky inkubujeme v pufru pro barvení minimálně 30 min. při 37°C. 38

v20140903

Průtoková cytometrie: U obarvených buněk analyzujeme obsah jaderné DNA (ploiditu) pomocí průtokového cytometru. Relativní četnost (zastoupení) buněk v jednotlivých fázích buněčného cyklu (G0/G1, S a G2/M) stanovíme pomocí softwaru. Porovnáme, jak se liší relativní zastoupení v jednotlivých fázích buněčného cyklu u buněk ovlivněných N6-dimethylaminopurinem a buněk kontrolních. Výsledky analýz viz následující obr.:

Obr. 3: Buňky K562 kultivované za standardních podmínek.

Obr. 4: Buňky K562 kultivované v přítomnosti N6-dimethylaminopurinu 48 h. Otázky 1. Proč je nutné buňky při barvení jaderné DNA pro průtokovou cytometrii inkubovat při 37°C? 2. Kterou fázi buněčného cyklu N6-dimethylaminopurin inhibuje?

39

v20140903

9.2

Odhadování obsahu jaderné DNA pomocí světelného mikroskopu

Chemikálie, biologický materiál PBS; buňky K562 (viz výše); acetorcein (1 % roztok orceinu ve 45 % kyselině octové) Postup: Indukce změn v buněčném cyklu. Postupujeme stejně jako v předcházející úloze. Barvení buněk: Buňky sedimentujeme ve zkumavce centrifugací (1500 ot/min, 5 min při laboratorní teplotě). Sediment resuspendujeme ve 100 μl média, přidáme 300 μl acetorceinu a po dobu 10 min. zahřejeme na 60°C. Pozorování buněčných jader ve světelném mikroskopu. Obarvené buňky naneseme na podložní sklíčko, přikryjeme krycím sklíčkem a pozorujeme při největším možném zvětšení. Všímáme si změny velikosti buněk, zejména se však zaměříme na výskyt dvoujaderných buněk. Spočítáme relativní četnost výskytu dvoujaderných buněk u buněk kultivovaných za standardních podmínek a buněk kultivovaných v přítomnosti N6-dimethylaminopurinu.

9.3

Mitóza rostlinné buňky

Pomůcky Trvalý preparát roztlaků kořínků bobu koňského (Vicia faba) barvených Feulgenovou reakcí. Postup Preparát pozorujeme nejdříve malým zvětšením a vyhledáváme jednotlivé fáze mitózy. Výsledek pozorování Buňky s nalezenými fázemi mitózy pozorujeme objektivem 40× zvětšujícím a zakreslíme. Všímáme si tvaru, velikosti a uložení jednotlivých chromozomů, pokusíme se určit jejich počet. Výklad Princip průkazu DNA Feulgenovou reakcí: Po hydrolýze (maceraci) kyselinou chlorovodíkovou se z řetězců DNA odštěpují purinové báze a v místě jejich odštěpení se na podjednotkách deoxyribózy uvolňují aldehydické skupiny. Schiffovo reagens – leukofuchsin (tj. fuchsin odbarvený siřičitanem) pak reaguje specificky s těmito aldehydickými skupinami za vzniku kontrastního červenofialového zbarvení. Příprava preparátu (studenti neprovádějí): odříznuté primární kořínky naklíčeného bobu koňského (1,5-2 cm dlouhé) fixujeme v alkohol-octové fixáži po dobu 2 hod. Macerujeme v 5M HCl v pokojové teplotě 15 minut. Barvíme 2 hod v Schiffově bazi. Vypíráme v tekoucí vodě 10-20 min. Na podložní sklo natřené glycerolbílkem přeneseme vždy jen špičku kořínku (meristematická zóna o délce 1-2 mm) a přikryjeme celofánovým čtverečkem o velikosti krycího sklíčka zvlhčeným ve vodě. Objekt pak poklepem gumou a rozválením zkumavkou roztlačíme do plochy. Ve formaldehydových parách roztlačené buňky za 45 min přilnou k podložnímu sklu. Po stáhnutí celofánu umístíme preparát na 10-20 min do vody a pak na 3 min do 96% etanolu. Po převedení přes odvodňovací řadu zaléváme preparáty do solakrylu. Složení roztoků: Alkohol-octová fixáž: 3 díly absolutního alkoholu a 1 díl ledové kyseliny octové.

40

v20140903

Schiffova baze: 2 g bazického fuchsinu rozpustíme ve 170 ml vody, přidáme 30 ml 1M HCl a 3,8 g K2S2O5 a mícháme 2 hod. Přes noc umístíme do tmy. Pak přidáme 1g aktivního uhlí. Po 1 minutě přefiltrujeme přes papír zvlhčený v 1M HCl. Výsledná barva je čirá, nažloutlá. Glycerolbílek: směs 25 ml vaječného bílku a 25 ml glycerolu (fixována tymolem). Odvodňovací řada: 100% etanol+xylen 3:1; 1:1 a 1:3; xylen – po 5 minutách).

9.4

Dělení buněk pučením

Pomůcky 24 hod. stará kultura kvasinek (droždí) v tekutém Sabouraudově glukózovém médiu. Mikroskopické potřeby, imerzní objektiv, papírky na čočky, benzín nebo etanol, krycí skla 0. Postup Ze suspenze kvasinek připravíme nativní preparát. Použijeme tenká krycí skla (nejlépe 0). Po orientačním prohlédnutí preparátu malým zvětšením prohlížíme preparát imerzním objektivem. Po skončeném pozorování otřeme imerzní objektiv papírkem na čočky. Pro dokonalé očištění můžeme papírek slabě zvlhčit benzínem nebo etanolem. Výsledek Do protokolu nakreslíme několik kvasinkových buněk v různé fázi pučení. Jednu z nich prokreslíme podrobně, tj. s vnitřní strukturou. Výklad Kvasinky patří mezi jednobuněčné houby (Endomycetes), jejichž cytokineze probíhá pučením. Pučení je zvláštní způsob buněčného dělení. Jádro kvasinkové buňky se dělí mitoticky. Zaživa není patrné, jeho polohu však často prozrazuje koncentrické seskupení organel u jeho povrchu. Některé rody kvasinek jsou patogenní – vyvolávají u člověka onemocnění sliznic, pokožky nebo napadají vnitřní orgány. Nejčastěji izolovanou patogenní kvasinkou je Candida albicans. Kontrolní otázky 1. Která z fází interfáze má nejvíce proměnlivou délku a proč? 2. Jmenujte „kontrolní uzly“ buněčného cyklu. Ve kterých fázích jsou a co ovlivňují? 3. Rostou buňky během M fáze? 4. Z kolika chromatid se skládají chromozomy v G1 a v G2 fázi? Ve které fázi mitózy se z chromatid stávají dceřiné chromozomy? 5. Uveďte různé typy cytokineze, které znáte.

41

v20140903

10. Meióza a gametogeneze Studijní příprava Rozmnožování a sexuální proces. Diferenciace pohlaví. Rekombinace genetické informace při meióze. Meiotická segregace chromozomů. Průběh meiózy. Tvorba gamet – spermatogeneze a oogeneze. Oplození. Teoretický úvod Diploidní buňka u pohlavně se množícího organismu obsahuje dvě homologní sady chromozomů. Při pohlavním rozmnožování vznikají haploidní pohlavní buňky – gamety – které po oplození dávají vznik diploidní zygotě, z níž postupně vznikají všechny buňky nového jedince. Meióza je specializované buněčné dělení, v jehož důsledku vznikají haploidní gamety z diploidních prekurzorových buněk. Gameta má jen jeden chromozom každého typu, buď paternálního nebo maternálního původu. Rozchod paternálních a maternálních chromozomů do gamet během meiózy je náhodný, proto jsou v gametách obsaženy v různých náhodných kombinacích. Kromě toho jsou chromozomy v gametách rekombinovány, protože při synapsi homologních chromozomů na začátku meiózy dochází s vysokou pravděpodobností ke crossing-overu. Meióza je tedy hlavním zdrojem genetické variability jedinců, vznikajících pohlavním rozmnožováním. Meióza probíhá v zárodečném epitelu pohlavních orgánů: v semenotvorných kanálcích varlat a v korové vrstvě vaječníků. Buněčný cyklus takovéto zárodečné buňky (gametocyt prvního řádu) také začíná interfází s G1, S a G2 fází a dále pokračuje meiózou, zahrnující dvě rychle po sobě následující buněčná dělení, tzv. první a druhé meiotické dělení. Po jediné replikaci chromozomů tedy následuje dvojí dělení buňky. Proto jsou buňky vzniklé meiózou haploidní. První meiotické dělení označujeme jako heterotypické (pro některé základní odlišnosti od mitózy) a redukční (vznikají při něm z jedné buňky diploidní dvě buňky haploidní – tj. s redukovaným počtem chromozomů). Druhé meiotické dělení, které se shoduje s mitózou, nazýváme homeotypické, ekvační. Dlouhou a složitou první meiotickou profázi rozdělujeme podle morfologie chromozomů na pět stadií – leptoten, zygoten, pachyten, diploten a diakinezi. V leptotenu dochází ke zvětšování jader a je zahájena kondenzace chromozomů. Chromozomy jsou značně dlouhé a jemné, obtížně rozlišitelné. V zygotenu začíná synapse chromozomů – těsný kontakt homologních chromozomů. Každý pár homologních chromozomů vytváří bivalent, přichycený k jaderné membráně. V pachytenu je synapse téměř úplná, chromatidy se od sebe začínají vzdalovat, vznikají čtyřvláknové útvary – tetrády. Kondenzace chromozomů pokračuje – začínáme pozorovat chiazmata, místa proběhlého crossing-overu – výměny částí nesesterských chromatid, vedoucí k rekombinaci genů. V diplotenu končí synapse chromozomů, centromery chromozomů se od sebe začínají vzdalovat a chiazmata se posunují ke koncům chromozomů. Krátké, silné chromozomy se odpojují od jaderné memebrány. V diakinezi vrcholí terminalizace chiazmat, zaniká jaderná membrána, mizí jadérko a vytváří se dělicí vřeténko. V první meiotické metafázi se chromozomy soustřeďují v ekvatoriální rovině buňky, homologní chromozomy jsou ještě spojeny chiazmaty, ale jejich centromery již směřují k opačným pólům buňky. V první meiotické anafázi dochází k úplnému oddělení homologních chromozomů v tetrádě (jejich centromery se nedělí) a z každého páru je tažen zcela náhodně k jednomu pólu buňky chromozom 42 v20140903

otcovský a ke druhému mateřský, každý stále tvořený dvěma sesterskými chromatidami. Je to okamžik redukce počtu chromozomů na polovinu a náhodné meiotické segregace chromozomů. Krátká první meiotická telofáze zakončuje první meiotické dělení, zaniká při ní dělicí vřeténko, okolo částečně dekondenzovaných chromozomů u pólů se vytvoří jaderné membrány a uvnitř dceřiných jader vznikají jadérka. Cytokinezí vznikají dvě haploidní dceřiné buňky s polovičním počtem chromozomů. Obsahují však stejné množství DNA jako diploidní buňky, protože chromozomy jsou dvouchromatidové. Mezi prvním a druhým meiotickým dělením je krátká interkineze nebo buňky přecházejí přímo do profáze druhého meiotického dělení, které je shodné s mitózou. Začíná krátkou profází s kondenzací chromozomů, v níž zaniká jaderná membrána a vzniká dělicí vřeténko. Druhá meiotická metafáze a anafáze probíhají rychle za sebou. Teprve v této druhé anafázi se rozdělují centromery chromozomů, k pólům se rozcházejí jednotlivé chromatidy – budoucí dceřiné chromozomy. V krátké telofázi se vytvoří jaderné membrány a buňky se podruhé rozdělí. Z jednoho diploidního gametocytu tímto dvojím dělením vznikají čtyři haploidní buňky, z nichž čtvrtina (při oogenezi), nebo všechny (při spermatogenezi) se stávají zralými funkčními gametami. Cíl cvičení 1. rozlišení jednotlivých fází meiózy a spermatogeneze 2. ověření účinku cytostatika na tyto procesy Velmi dobrý objekt pro pozorování meiózy jsou trvalé roztlakové preparáty získané z varlat sarančete vrzavého, s velkými meiotickými chromozomy. Účinek cytostatik budeme pozorovat na histologických řezech lidských varlat.

10.1 Meióza a spermatogeneze u sarančete Pomůcky Trvalé preparáty buněk varlat sarančete (saranče vrzavé – Psophus stridulus L.), barvené Giemsou; mikroskop; soubor fotografií meiózy druhu Chothippus parallelus (2n = 17, X0). Postup Při vyhledávání jednotlivých stadií spermatogeneze a fází meiózy se studenti průběžně orientují také podle sady fotografií s popisem, kterou mají k dispozici. Vhodná stadia vyhledávají malým zvětšením, detaily prohlížejí objektivem 40× zvětšujícím. Nalezená stadia nakreslí. Výsledek Výsledkem jsou obrázky fází meiózy s popisem, nakreslené podle preparátu. Výklad Karyotyp sarančete vrzavého: samec 23 X0, samice 24 XX. Rozlišení jednotlivých stadií spermatogeneze a meiózy: 1. Mitóza spermatogonií – profáze, metafáze (párové chromozomy blíže u sebe, možno zjistit počet chromozomů, karyotyp 23 X0, foto 1a), anafáze, telofáze → spermatocyt I. řádu (primární spermatocyt) 2. Meióza I – redukční dělení, heterotypické dělení Profáze I: leptoten – minimální spiralizace, sotva znatelná vlákna chromozomů (foto 1b). Zygoten – synapse homologních chromozomů → bivalenty; X chromozom výrazněji zbarvený než heterochromatin autozomů. Je patrná spiralizace chromozomů (foto 1c, d). 43

v20140903

Pachyten – pokračující spiralizace chromozomů, proto jsou bivalenty kratší a silnější, je patrné rozlišení chromozomů na dvě chromatidy (vznik tetrád); X chromozom je silněji spiralizován (foto 1e). Diploten – vzájemné oddalování homologních chromozomů, jsou patrná chiasmata, je možné zjistit vtah mezi délkou chromozomů a počtem chiasmat, a také průměrný počet chiasmat v jedné buňce, případně rozdělit chromozomy na tři kategorie podle délek a zjistit u nich počty chiasmat (foto 1f, 5). Diakineze – oddalování centromerických oblastí homologních chromozomů v bivalentech od sebe, terminalizace chiasmat, maximální spiralizace bivalentů umístěných u jaderné membrány; je možno zjistit počet bivalentů (11+X). Pozor – chromozom X nevytváří bivalent. Je možno se pokusit o určení počtu chromozomů. (foto 2a). Metafáze I – lokalizace chiasmat v ekvatoriální rovině, centromery směřují k pólům (foto 2b). Anafáze I – charakteristický obraz, kdy se rozcházejí homologní chromozomy složené ze dvou chromatid, které jsou dobře patrny. Je možné zjistit počet (n) a zastoupení jednotlivých typů chromozomů (pozor, k jednomu pólu jde navíc X chromozom (foto 2c, d). Telofáze I – telofázní shluky chromozomů, vznik spermatocytů II. řádu (sekundární spermatocyty) (foto 3a). 3. Meióza II – ekvační dělení, homeotypické dělení Profáze II a prometafáze II – zřetelná dvojitá struktura chromozomů, chromozom X je silně spiralizován (foto 3b1, b2). Metafáze II – patrný haploidní počet dvouchromatidových chromozomů, sestavení centromer do ekvatoriální roviny (foto 3c1, c2). Anafáze II – rozchod dceřiných chromozomů k pólům, je možno ověřit haploidní počet chromozomů, které jsou jednochromatidové (foto 4a,b). Telofáze II a konec meiózy se vznikem dvou spermatid. 4. Spermatida – dva typy, buď s chomozomem X nebo bez chromozomu X. 5. Spermatozoid – spermiohistogeneze, různá stadia vývoje spermií. Poznámka Příprava preparátů (studenti neprovádějí) Samci sarančat jsou hned po chycení 2 hod fixováni v acetalkoholové fixáži (1 díl ledové kyseliny octové a 3 díly 96% etanolu) a vloženi do 70% etanolu. Z takto předfixovaných sarančat vypreparujeme varlata, která preparační jehlou částečně roztrháme a vložíme je na 30 minut do čerstvé acetalkoholové fixáže. Vzorky promýváme 5 minut vodou a 3 min hydrolyzujeme (60°C v 1 M HCl). Po hydrolýze vložíme část varlete na čisté podložní sklíčko do kapky vody a provedeme roztlak. Při roztlaku postupujeme tak, že přes vzorek položíme ve vodě namočený proužek celofánu. Vezmeme zkumavku a pomocí zkumavky mírným tlakem valivým pohybem vzorek roztlačíme (pouze jednou). Vzorek s celofánem necháme zaschnout. Po zaschnutí celofán sám odpadne. Sklíčko s roztlačenými buňkami barvíme Giemsou 10-20 min (roztok Giemsy ředíme destilovanou vodou 1:9 obj. a zfiltrujeme). Po barvení vzorek opláchneme vodou, přikápneme glycerin, přiklopíme krycí sklíčko a pozorujeme. Fixáž i Giemsu připravujeme čerstvě.

44

v20140903

10.2 Spermatogeneze u člověka Pomůcky Trvalé preparáty histologických řezů semennými kanálky varlat člověka, barvené hematoxylineosinem nebo Feulgenovou reakcí; mikroskop Postup Preparáty prohlédneme malým zvětšením, při velkém zvětšení se pokusíme najít a zakreslit jednotlivá stadia spermatogeneze. Nové generace semenných buněk postupují od periferie (membrana propria) k lumen kanálku. Poblíž membrana propria nacházíme spermatogonie, směrem k lumen potom primární a sekundární spermatocyty; spermatidy (drobnější buňky se sytě zbarveným jádrem) a spermatozoidy se nacházejí uprostřed kanálku. Výsledek Zakreslíme schematický průřez kanálkem a popíšeme jednotlivé buňky.

10.3 Vliv cytostatika na spermatogenezi Pomůcky Trvalý preparát histologického řezu semennými kanálky varlat člověka, který byl dlouhodobě léčen cytostatiky (řez barvený Feulgenovou reakcí); mikroskop Postup Preparát prohlížíme postupně malým a velkým zvětšením. Nález srovnáme s nálezem v předchozím úkolu. Výsledek srovnání zapíšeme. Nekreslíme. Poznámka Léčba cytostatiky zastavuje buněčnou proliferaci. Inhibuje rozmnožování nádorových buněk, ale současně zastavuje i meiózu (gamety se nediferencují). Po léčbě cytostatiky dochází u některých pacientů k nevratné zástavě gametogeneze (zůstávají poté neplodní). U jiných pacientů se naopak může spermatogeneze obnovit po skončení léčby (v závislosti na typu použitého cytostatika). Pacientům je možno nabídnout autokryokonzervaci spermií před zahájením chemoterapeutické léčby. Kontrolní otázky: 1. Ve které fázi meiotického dělení dochází k rekombinaci chromozomů, kdy dochází k redukci jejich počtu a kdy k jejich segregaci? 2. Co je to bivalent? Z kolika chromatinových vláken se skládá? Co je to synaptonemální komplex? 3. Kolik bivalentů vzhledem k počtu chromozomů vytváří buňka v zygotenu? 4. Co jsou to chiasmata? Kdy dochází k jejich terminalizaci? 5. Uveďte dva hlavní zdroje genetické variability gamet v meióze. 6. Uveďte stadia spermatogeneze člověka. Které buňky jsou diploidní a které haploidní? 7. Proč tato stadia nenacházíme v semenných kanálcích člověka, který byl léčen cytostatiky?

45

v20140903

11. Buněčná diferenciace a apoptóza Teoretický úvod Celý mnohobuněčný organismus se vyvíjí z jediné buňky – zygoty (oplozeného vajíčka). Somatické buňky v jednom organismu tak nesou stejnou genetickou informaci. Přesto se buňky různých tkání liší svojí strukturou i funkcí – jsou diferencované. Jako diferenciace se označuje proces, při kterém ke specializaci buněk dochází. Je důležité si uvědomit, že buňka nese identickou genetickou informaci ve všech stadiích buněčné diferenciace. Odlišné specializace buněk je dosaženo tím, že v různých typech buněk jsou exprimovány různé geny – jedná se o tzv. diferenciální (specifickou) genovou expresi (tj. expresi různých genových skupin). Různé typy buněk tak vytváří různé proteinové produkty a v průběhu procesu diferenciace získávají buňky konkrétní, specializované vlastnosti. Termínem konečná (terminální) diferenciace se označuje pozdní fáze diferenciačního procesu, konec vývojové dráhy. Terminálně diferencované buňky jsou vysoce specializované, schopné plnit konkrétní funkce v organizmu. V průběhu ontogeneze můžeme u člověka pozorovat buněčnou diferenciaci na těchto úrovních: 

rýhování vajíčka a raná embryogeneze (vznik trofoblastu a embryoblastu; vznik zárodečných listů)



vývoj orgánů a diferenciace buněk tkání (embryonální vývoj)



po narození: hematopoéza, obnova buněk (epitely), spermatogeneze

Aktivace kaspázových proteáz, indukce apoptózy V průběhu prenatálního vývoje dochází k výrazným změnám embrya a plodu; některé tkáně nebo buňky během tohoto vývoje také zanikají (blána spojující prsty; neurony, které nenavázaly funkční synapse, atd.). Dále v průběhu života opotřebené buňky některých tkání zanikají a jsou nahrazovány novými. Existují 2 základní typy buněčné smrti, které se liší v základních charakteristikách: apoptóza a nekróza. Apoptóza je fyziologická buněčná smrt, která je řízena samotnou umírající buňkou. Apoptóza se vyskytuje jako nedílná součást embryogeneze, ontogenetického vývoje a diferenciace buněk u živočichů. Podílí se na udržování homeostáze ve tkáních, hraje nezastupitelnou roli při vývoji imunitního systému. Apoptotické buňky nezpůsobují zánět v okolní tkáni a jsou okolními buňkami pohlcovány. Apoptóza se vyznačuje charakteristickou kondenzací jádra i celé buňky. Ke kondenzaci a viditelné fragmentaci jádra dochází v důsledku aktivace endonukleáz, které nevratně štěpí jadernou DNA na fragmenty o definované délce. Tento biochemický znak se používá jako jedno z kritérií na odlišení apoptózy od nekrózy, neboť při nekróze je jaderná DNA relativně málo degradována. Klíčovou roli v procesu apoptózy u živočichů hrají kaspázy (cysteinové proteázy), jež jsou v procesu apoptózy aktivovány. Kaspázy mají vyhraněnou substrátovou specifitu – štěpí sekvenci proteinu za zbytkem kyseliny asparagové. Jejich fyziologickými substráty jsou strukturní proteiny jádra i cytoplazmy, regulační proteiny aj. Předpokládá se, že štěpení těchto proteinů pak vede k charakteristické morfologii apoptotických buněk. Kaspázy jsou syntetizovány jako neaktivní proenzymy a v této formě jsou přítomny v buňkách. Jsou aktivovány proteolytickým štěpením na velkou a malou podjednotku (aktivní enzym se pak skládá ze dvou větších a dvou menších podjednotek). Aktivace kaspáz je do značné míry prostudována u savčích buněk, rozeznáváme tři mechanizmy: s přímou účastí mitochondrií, prostřednictvím extracelulárních receptorů a granzymem B (granzym B je serinová proteáza vylučovaná cytotoxickými T-lymfocyty). Jako protiklad apoptózy se obvykle uvádí nekróza, což je termín používaný pro nefyziologickou a „pasivní“ buněčnou smrt. Charakteristickým morfologickým rysem nekrózy je bobtnání 46

v20140903

mitochondrií i celých buněk, jež končí rozpadem všech buněčných struktur a organel. Nekróza postihuje skupiny buněk a v okolní tkáni způsobuje zánět.

11.1 Rýhování zygoty a vývoj zárodku Pomůcky Suspenze vyvíjejících se vajíček škrkavky prasečí (Ascaris suum) ve 4% roztoku formaldehydu; mikroskopické potřeby Postup Připravíme preparát z nepříliš husté suspenze vajíček Ascaris suum. Prohlížíme nejprve při použití 10× zvětšujícího objektivu, vyhledáváme různá stadia vývoje zárodku ve vajíčku a všímáme si rýhování. Při větším zvětšení zakreslíme a popíšeme stadium nerýhované zygoty a stadia po prvním a druhém rýhovacím dělení, dále blastulu, stadium gastruly, případně i vyvinutou larvu. Stadium nerýhované zygoty kreslíme se všemi vaječnými obaly, ostatní stadia zakreslujeme bez obalů. Jednotlivá vývojová stadia porovnáme s fotografiemi vývojových stadií, které jsou vystaveny jako demonstrace. Výklad Rýhování vajíček Ascaris suum je totální, ekvální – jsou to vajíčka holoblastická s malým množstvím žloutku (vajíčka obsahující mnoho žloutku jsou meroblastická, dělí se parciálně). Vajíčka škrkavek jsou determinační, mozaiková – jedna ze dvou prvních blastomer se vyvíjí v reprodukční systém a druhá ve všechny ostatní části těla. (U indeterminačních, regulačních zygot jsou blastomery zárodku až do pozdních fází rýhování pluripotentní). Vajíčka škrkavek jsme získali z děloh dospělých samic. Škrkavka prasečí parazituje u prasat. Její životní cyklus je stejný jako u škrkavky dětské (Ascaris lumbricoides), která parazituje u člověka. Dospělé škrkavky žijí v tenkém střevě svého hostitele, kde samice kladou vajíčka, která se stolicí dostávají do vnějšího prostředí, kde se rýhují. Po spolknutí rozrýhovaného vajíčka v invazivním stadiu (tzn. schopném vyvolat onemocnění) je vajíčko v žaludku zbaveno obalů a larvy pronikají stěnou tenkého střeva do krevních kapilár, do jater a přes srdce do plic. Zde larvy rostou a aktivně se pohybují, což postiženého nutí ke kašli. Jsou-li larvy vykašlány a znovu polknuty, dostávají se přes žaludek do tenkého střeva, kde dospívají. Poznámka V dělohách samic se vajíčka nerýhují, zde se tedy nacházejí ve stadiu zygoty. K vývoji dochází až ve vnějším prostředí, při 80-100 % relativní vzdušné vlhkosti, asi 24°C a za přítomnosti kyslíku. Prostředím pro vývoj je i 4% formaldehyd, ve kterém vajíčka zůstávají živá. Vajíčka obsahující pohyblivou larvu po prvním svlékání jsou invazivní a jsou-li polknuta, mohou vyvolat onemocnění i u člověka (až po plicní stadium). Vajíčka v nižších vývojových fázích nejsou patogenní. Po cvičení je nutné umýt si ruce.

11.2 Měření aktivity kaspázy-3 Chemikálie, biologický materiál PBS (Phosphate buffered saline; izotonický roztok NaCl pufrovaný fosfátovým pufrem); Lyzační pufr: 50 mM HEPES, pH 7,2; 5 mM dithiotreithol (DTT); 0,5 % Triton X-100; Směs inhibitorů proteáz; Pufr pro měření aktivity: 20 mM HEPES, pH 7,2; 5 mM dithiotreithol; 2 mM EGTA; Substrát: 1mM acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-methyl kumarin (Ac-DEVD-AMC) 47

v20140903

Buňky K562: nádorová buněčná linie odvozená z myeloidní leukémie s Filadelfským chromosomem. Buňky jsou volně rostoucí v médiu. Postup Indukce apoptózy: K buněčné suspenzi přidáme cytotoxické agens (0,5 μM Glivec) a inkubujeme přes noc. Příprava cytoplazmatického lyzátu: Přibližně 5×106 buněk inkubovaných přes noc v přítomnosti Glivecu sedimentujeme ve zkumavce centrifugací (1500 ot/min, 5 min. při lab. teplotě), sediment resuspendujeme v 1 ml PBS pufru a znovu sedimentujeme centrifugací za stejných podmínek. Supernatant odsajeme pipetou a sedimentu resuspendujeme ve 100 μl lyzačního pufru a zkumavku inkubujeme na ledu 15 minut za občasného protřepávání. Lyzát přečistíme sedimentací (18 000 ot/min, 5 min při 4°C). Jako kontrolu použijeme buňky kultivované ve standardním médiu, jež zpracujeme stejným způsobem (viz výše). Měření aktivity kaspázy-3: Do tří zkumavek napipetujeme 200 μl pufru pro měření aktivity kaspázy-3. Do každé pak přidáme 10 μl substrátu. Reakci iniciujeme přídavkem 50 μl buněčného lyzátu. Do první zkumavky přidáme lyzát z buněk kultivovaných za normálních podmínek (kontrola), do druhé lyzát z buněk inkubovaných v přítomnosti Glivecu a do třetí pak místo lyzátu destilovanou vodu (blank). Zkumavky inkubujeme 45-60 min při laboratorní teplotě. Následně napipetujeme 200 µl z každé zkumavky do mikrotitrační destičky. U každého vzorku změříme fluorescenci: excitační vlnová délka 360 nm, emisní vlnová délka 465 nm. Aktivitu kaspázy vyjádříme v bezrozměrných jednotkách jako intenzitu fluorescence (osa Y). Od hodnot fluorescence obou vzorků buněk odečteme hodnotu blanku. Vypočteme kolikrát se zvýšila aktivita kaspázy-3 u buněk kultivovaných v přítomnosti Glivecu proti kontrole.

11.3 Pozorování morfologických změn u apoptotických buněk Chemikálie, biologický materiál: buňky K562 (viz výše), acetoorcein Postup: Indukce apoptózy: K buněčné suspenzi přidáme cytotoxické agens (0,5 μM/ml Glivec) a inkubujeme přes noc. Barvení buněk: K buněčné suspenzi (50 μl) neovlivněných i ovlivněných buněk přikápneme acetoorcein a necháme inkubovat 5 min při laboratorní teplotě. Obarvené buňky naneseme na podložní sklíčko, přikryjeme krycím sklíčkem, přebytek tekutiny odsajeme a pozorujeme při největším možném zvětšení. Všímáme si změny velikosti a tvaru buněk, zejména se však zaměříme na morfologické změny v jádře buněk kultivovaných v přítomnosti Glivecu. Pozorování zakreslíme. Kontrolní otázky: 1. Proč vzniká v okolí nekrotických buněk zánět, zatímco v případě apoptotických buněk ne? 2. Vyjmenujte nejdůležitější funkce mitochondrií. 3. Jaký je rozdíl mezi zygotami determinačními (mozaikovými) a indeterminačními (regulačními)?

48

v20140903

12. Biologie krve. Krevní elementy Teoretický úvod Krvetvorba (hematopoéza), proces tvorby a obnovy krevních buněk, je příkladem diferenciace, která probíhá v průběhu celého života jedince. V průběhu hematopoézy diferencuje hematopoetická kmenová buňka do všech krevních řad. Hematopoéza se vyznačuje neustálou obnovou, kdy různé skupiny krevních buněk jsou obměňovány různou rychlostí. Např. červené krvinky mají životnost 120 dnů; některé T-lymfocyty až několik let. S diferenciací krevních buněk jsme se poprvé setkali ve cvičení o buněčných kulturách, kdy jsme pozorovali kolonie krevních buněk rostoucí na polotekutém (metylcelulózovém) médiu.

Hematopoetická kmenová buňka je nediferencovaná krevní buňka, jejíž diferenciací vznikají charakteristické krevní řady (někdy označované také jako krevní linie). Tzv. progenitorové kmenové buňky jsou již do určité míry diferencované, patří už k určité krevní řadě, ale mají schopnost ještě dále diferencovat. Kmenové buňky a progenitory se v dospělosti nacházejí hlavně v kostní dřeni. V periferní krvi dominují již terminálně (koncově) diferencované krevní elementy: granulocyty (několik podtypů), monocyty, trombocyty (krevní destičky), erytrocyty (červené krvinky), B a T lymfocyty a některé další vzácnější krevní buňky. Specifickou formou diferenciace se vyznačuje proces tvorby krevních destiček (tzv. megakaryopoéza). Zrání megakaryocytů se vyznačuje tzv. endomitózou, tedy množením jaderného materiálu bez dělení buňky (vznikají polyploidní buňky). Následně dochází k syntéze řady nových proteinů (většinou glykoproteinové povahy), které vytvářejí v cytoplazmě krevní destičky. Ty se následně uvolňují přímým rozpadem megakaryocytů. Poruchy diferenciace u lidských chorob Kancerogeneze je proces hromadění genetických a buněčných změn vedoucích k rozvoji zhoubných nádorů. Označuje se také jako proces maligní transformace (viz výklad v kapitole věnované kultivaci savčích buněk a buněčným liniím). Kancerogeneze je závislá na souhře těchto genetických změn, ke kterým musí postupně dojít v jediné buňce. Součástí procesu maligní transformace bývá i porucha diferenciace, která se většinou projevuje jako zástava (blok) 49

v20140903

terminální diferenciace. Typickým příkladem choroby, která se vyznačuje neschopností určitého buněčného typu (tkáně) terminálně diferencovat, jsou akutní leukémie. Podle typu hematopoetického progenitoru, ve kterém dojde k bloku diferenciace, rozlišujeme akutní leukémie myeloidní nebo lymfoidní. Jedním z možných léčebných postupů je opětné navození terminální diferenciace diferenciačními látkami, které aktivují expresi diferenciačních genů. Některé z těchto látek se používají v léčbě akutních leukémií, jiné (jako např. adenin) se teprve testují experimentálně.

12.1 Odečet krevního diferenciálu

Jak jste se již seznámili v praktiku věnovaném buněčnému cyklu, průtoková cytometrie je technika pro rychlé měření optických vlastností jednotlivých částic nebo buněk, které procházejí snímacím místem. Tato skutečnost se využívá v hematologii pro automatické určení krevního diferenciálu. Rozptyl světla odpovídá velikosti a granularitě (denzitě) procházejících buněk nebo částic. Přístroj zaznamenává počet buněk ve vzorku krve a zároveň identifikuje jednotlivé krevní elementy; např. lymfocyty jsou malé a denzní buňky, naopak granulocyty jsou buňky větší s vyšší denzitou. Kromě toho je tento přístroj schopný změřit i obsah hemoglobinu v erytrocytech. V praktiku budou demonstrovány krevní diferenciály zdravých jedinců a pacientů s různými poruchami krvetvorby.

12.2 Krevní nátěry Materiál Nátěry periferní krve několika zdravých i nemocných jedinců, barvené tzv. barvením GiemsaRomanowski. Postup V krevních nátěrech periferní krve se pokusíte identifikovat základní krevní elementy. Použijte zvětšení 400×. Nakreslete hlavní typy krevních buněk.

12.3 Pozorování kolonií krevních buněk na polotuhém médiu

Dělící se a diferencující buňky v polotuhém médiu mají omezený pohyb, vytvářejí proto kolonie (kolonie = potomstvo jedné dělící se buňky, klon). U krevních buněk můžeme pozorovat hemoglobinizované kolonie červených krvinek a kolonie různých typů bílých krvinek. Materiál Metylcelulózové kultivační médium, hematopoetické (=krvetvorné) růstové faktory, prekurzory lidských krevních buněk izolované z periferní krve. Plastové misky s kulturami lidských krevních buněk Postup Prekurzory lidských krevních buněk byly smíchány s metylcelulózovým médiem a do kultury byly přidány hematopoetické růstové faktory, které umožnily růst a diferenciaci krevních prekurzorů do jednotlivých krevních buněčných typů. Kolonie krevních buněk rostly na miskách v polotuhém kultivačním médiu v inkubátoru při teplotě 37°C a v 5% CO2 atmosféře po dobu 10 až 14 dnů. Při zvětšení 100× (10× zvětšujícím objektivem) budeme pozorovat různé typy kolonií krevních buněk.

50

v20140903

12.4 Indukce diferenciace nádorových buněk linie K562 Materiál: buňky buněčné linie K562; adenin, pufr PBS (izotonický roztok NaCl pufrovaný fosfáty; pH 7,4), barvící roztok benzidinu (2 mg benzidinu jsme rozpustili v 1 ml 0,5 M kyseliny octové a přidali 30 µl H2O2). Benzidin je činidlo, které tvoří modrou sraženinu po oxidaci hemoglobinu hemovou skupinou v přítomnosti peroxidu vodíku. Postup 1. Indukce diferenciace: K buněčné suspenzi (buňky K562 v tekutém kultivačním médiu) jsme přidali adenin (výsledná koncentrace adeninu v médiu: 0,5 mM) a inkubovali 3-5 dnů při standardních podmínkách. Jako kontrolu jsme použili buňky bez přídavku adeninu. 2. Barvení buněk: Přibližně 2×106 buněk bude centrifugováno (1500 ot/min, 5 min) a buňky budou resuspendovány v 1 ml PBS a opět centrifugovány. Po odsátí PBS bude buněčný pelet resuspendován a k 50 µl přečistěné buněčné suspenze přidáme 10 µl barvícího roztoku benzidinu. Směs promícháme a inkubujeme 5 min při laboratorní teplotě. 3. Počítání benzidin-pozitivních buněk. V preparátu budeme počítat procento modře obarvených buněk a srovnáme s kontrolou. Modré buňky jsou erytroidní buňky exprimující hemoglobin. Upozornění Benzidin je toxický a má karcinogenní účinky. Kontrolní otázky 1. Jaký je poměr červených a bílých krvinek v periferní krvi a proč? 2. Jakou jedinečnou vlastností z hlediska buněčného dělení a replikace se vyznačují megakaryocyty? 3. Jaký by byl rozdíl mezi krevním nátěrem periferní krve a krevním nátěrem kostní dřeně u dospělého člověka? 4. Jaký typ krevních buněk převládá v nátěru u pacienta s akutní leukemií? 5. Ze kterého krevního progenitoru je odvozena buněčná linie K562, jestliže buňky K562 mohou být diferencovány do fenotypu červené krevní řady?

51

v20140903

13. Onkogeny a tumor-supresorové geny (prezentace studentů) Doporučená témata pro referáty  protoonkogeny a tumor-supresorové geny 

etiologie nádorů, genetická podstata zhoubného bujení



léčba nádorových onemocnění



mutagenní faktory vnějšího prostředí a vznik nádorů



poruchy diferenciace a/nebo apoptózy ve vztahu k onemocněním



imunitní systém a nádorová onemocnění



leukémie o např. chronická myeloidní leukémie, Bcr/Abl, inhibitory kináz, ... o typy leukémií, jejich progrese a možnosti léčby

Další doporučená témata  šest nejčastějších nádorových onemocnění představuje téměř polovinu všech nově diagnostikovaných nádorů ve světě: o karcinom plic o karcinom prsu (např. i geny BRCA1, BRCA 2) o karcinom žaludku o kolorektální karcinom o karcinom jater o karcinom děložního čípku Vybrané odkazy http://www.onkologickecentrum.cz/downloads/prirucky/brca1-brca2.pdf http://www.hpv.cervix.cz/charakteristika-viru.html http://www.gynet.cz/?page=9&msgid=52 http://www.hpb.cz/index.php?pId=05-2-04 http://www.biotox.cz/toxikon/mikromycety/aflatox.php dále: materiály na internetu – pouze z důvěryhodných webů (např. weby institucí – nemocnic, onkologických center, ústavů, ...) časopisy v knihovně LF UP, ... Seznam použitých zdrojů Na konci prezentace bude uveden seznam všech použitých zdrojů.

52

v20140903

© kolektiv autorů, Ústav biologie LF UP Olomouc Praktická cvičení z biologie 2012

Skriptum pro zimní semestr 1. ročníku Určeno pro studenty oborů Všeobecné lékařství, Zubní lékařství

53

v20140903

54

v20140903