LABORATORNÍ CVIČENÍ Z MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE

LABORATORNÍ CVIČENÍ Z MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE

Ivo Frébort a Petr Galuszka Katedra biochemie Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého Olomouc 2006

OBSAH: Úvod Pokyny pro práci v molekulárně biologické laboratoři Pokyny pro práci s GMO Laboratorní cvičení č.1 Mikroizolace plasmidové DNA z Escherichia coli a její restrikční analýza Laboratorní cvičení č.2 Detekce geneticky modifikovaných organismů v potravinách pomocí PCR Laboratorní úloha č.3 Genetická transformace kvasinek a její ověření pomocí měření aktivity rekombinantního enzymu Laboratorní úloha č.4 PCR screening vybraných genů z lambda FIX II genomové knihovny ječmene Laboratorní úloha č.5 Izolace RNA z rostin a následná RT-PCR vybraných genů Příloha

Pokyny pro práci v molekulárně biologické laboratoři 1) Během práce v laboratoři molekulární biologie musí být zavřená veškerá okna a dveře. 2) Osoba pracující v laboratoři musí být oblečená v pracovním plášti či jiném laboratorním oblečení a pokuď to situace vyžaduje musí mít rukavice a ochranné brýle. 3) V laboratoři je přísně zakázána konzumace jídel, pití, kouření, šňupání tabáku, aplikace kosmetických přípravku a skladování pití, jídel a tabákových výrobků. 4) Je zakázáno pipetovat ústy a doporučuje se používat především mechanické typy pipet. 5) Minimalizujte vznik aerosolu. 6) Používejte stříkačky, kanyly a jehly jen pokud to je absolutně nutné. 7) Po ukončení práce si vždy umyjte ruce. 8) Udržujte laboratoř uklizenou a čistou, na pracovním stole mějte jen materiál a pomůcky nutné k práci. Zásoby materiálu skladujte ve zvláštní místnosti. 9) Na práci se sterilním materiálem používejte vždy zapnutý flowbox. Po skončení práce ve flowboxu pusťte UV lampu. 10) Veškerou práci s karcinogenním ethidium bromidem provádějte ve vyhrazené místnosti či prostoru a chraňte se nitrilovými rukavicemi. 11) Při práci s RNA používejte vždy rukavice a speciálně označený materiál a pomůcky. Těchto věci označených značkou „RNase Free“ se nedotýkejte rukama. 12) Používané chemikálie a reagencie vracejte vždy na místo odkud jste je vzali. 13) Veškeré sklo umývejte jarovou vodou a poté oplachujte v destilované vodě.

Pokyny pro práci s GMO 1) opatření pro případ havárie a požáru, včetně havarijního plánu podle § 5 V případě požáru předměty, zasažené požárem je možno považovat za zbavené geneticky modifikovaných organismů. Po uhašení požáru osoby zodpovědné za likvidaci havárie týkající se GMO vyhledají na pracovišti pouze částečně poškozené kultury GMO a ty pak posléze schválenými postupy inaktivují. V případě vynášení předmětů mimo budovu vedoucí katedry rozhodne, které předměty nebudou vynášeny, pokud by mohly být kontaminovány geneticky modifikovanými organismy. V ostatních bodech se likvidace požáru nebo havárie řídí požárním a havarijním řádem. 2) povinnosti pracovníků při práci (dodržování pracovních postupů, postup sanitace prostorů a zařízení po ukončení pracovní činnosti, postup dekontaminace nástrojů, osobních a ochranných prostředků a oděvů). Postup sanitace prostorů a zařízení a postup dekontaminace nástrojů při ukončení pracovní činnosti se řídí podle charakteru činnosti a určuje jej vedoucí katedry. Ochranné oděvy, kontaminované geneticky modifikováni mikroorganismy, se budou prát jako infekční materiál. Totéž se vztahuje na ochranné pláště pro studenty poskytnuté přírodovědeckou fakultou. Samostatný sběr a oddělená, isolovaná přeprava do prádelny Olomouc adresa: Prádelna-mandlovna, Sovová Martina, Neředínská 55, 779 00 Olomouc. Používané ochranné rukavice pro jedno použití budou likvidovány s ostatním GMO odpadem. 3) systém a četnost kontrol prostoru, zařízení a ochranných opatření Kontroly budou prováděny proškolenými pracovníky paralelně s požární kontrolou s četností 4x ročně. Zápis o každé kontrole bude parafován vedoucím příslušné katedry. 4) povinnosti pracovníků při údržbě Pracovníci údržby jsou při údržbářských pracích v prostorách pro práci s GMO povinni dbát pokynů vedoucího katedry, v jejíchž prostorách údržbu provádějí. Pracovníci údržby jsou povinni při údržbářských pracích v prostorách pro práci s GMO používat pláště pro práci s rekombinovanou DNA (se značkou Biohazard), které není možno používat mimo laboratoře pro GMO. 5) zásady hygieny a bezpečnosti práce v souladu s ustanovením zvláštních právních předpisů Pracovníci mají povinnost používat v prostorách pro práci s rekombinovanou DNA pláště, včetně studentů. 6) způsob nakládání s odpady a kontaminovanými materiály a předměty, zejména postupy zneškodnění geneticky modifikovaného organismu a způsob kontroly jejich účinnosti Geneticky modifikované rostliny jsou likvidovány autoklávováním ve speciálních plastových pytlích. Geneticky modifikované bakterie jsou likvidovány autoklávováním nebo desinfekčním roztokem (chlornan sodný, chloramin, Ajatin Incidur v koncentracích doporučených výrobcem). 7) seznam povinných pracovních pomůcek a prostředků osobní ochrany s uvedením činností, ke kterým musí být používány

Ochranný plášť při práci v prostorech s GMO nesmí být nošen mimo prostory s rekombinovanou DNA. Gumové rukavice jsou používány při práci s mikroorganismy a s elektroforezou DNA. 8) zakázané činnosti na pracovišti V laboratořích a prostorách pro geneticky modifikované rostliny je zakázáno jíst, pít a kouřit. 9) zásady vedení pracovních protokolů Každá činnost s GMO musí být denně zapisována do pracovního protokolu s vyznačením data zápisu. Každý pracovník si vede svůj pracovní protokol. 10) zásady vedení evidence o provozu zařízení, prováděné sanitaci a kontrolách zabezpečovacích prvků Ke každému nákladnému investičnímu přístroji patří sešit, do kterého se zapisuje pracovník, datum a hodiny využití přístroje. Tamtéž se zapisují záznamy o prováděné sanitaci a kontrolách zabezpečovacích prvků. 11) opatření k zabránění vstupu nepovolaných osob Laboratorní prostory jsou rozděleny na laboratorní komplexy a funkční jednotky pracující s GMO a jsou označeny. Součástí laboratorního komplexu je i kultivační místnosti. Vstup do každé jednotky je možný pouze dveřmi, otevíratelnými klíčem. Klíče mají proškolení zaměstnanci, kteří umožní do prostor vstup proškoleným studentům PřF UP, kteří v rámci studia v jednotce pracují. Kultivační mistnosti a boxu jsou uzamčeny a na dveřích označeny značkou Biohazard. Pověření pracovníci do nich mají přístup pouze ve speciálních pláštích, označených značkou Biohazard, které jsou nošeny pouze v těchto prostorách. Pro běžné návštěvy jsou vyhrazeny klidové pracovny. 12) režim v laboratořích: V laboratořích se pracuje jak s mikrobiálními kulturami, tak s kulturami rostlin, ošetřenými geneticky modifikovanými (GM) bakteriemi Agrobacterium. Plazmidy jsou udržovány v kmenech bakterie Escherichia coli nebo kvasinek Saccharomyces cerevicae, Pichia pastoris. K vědeckým účelům se experimentuje s transgenní (GM) obsahují GM bakterie, rostlinnými pletivy a dále se sterilně i nesterilně kultivovanými transgenními (GM) rostlinami. Proto je třeba zachovávat pravidla, platná jak pro práci v mikrobiologických laboratořích, tak pro práci s transgenním rostlinným materiálem. Likvidace tekutých odpadů a GMO: Agarové a tekuté kultury je možno likvidovat až po autoklávování nebo jiném vhodném ošetření (např. u tekutých kultur po sterilizaci účinným desinfekčním prostředkem, např. roztokem chlornanu sodného, Incidur). Pevné odpady, obsahující GMO, jakož i nádoby a pomůcky, které přišly do kontaktu s GMO je nutno bezprostředně po manipulaci umístit do sterilizačních pytlů a poté inaktivovat v parním sterilizátoru. Odpadní vody, obsahující GMO je nutno vylévat do nádob s chloraminem či chlornanem sodným. V laboratořích není dovoleno jíst, pít a kouřit. V laboratořích kde se pracuje s GMO je nutno nosit plášť k této práci určený. Při práci s GMO budou používány ochranné rukavice. 13) režim v kultivačních místnostech: V kultivačních místnostech se pracuje s mikrobiálními kulturami, rostlinnými pletivy a s kulturami rostlinami, které obsahají vnesou cizorodou DNA. Tyto rostliny jsou kultivovány ve sterilních i nesterilních podmínkách. Proto je třeba zachovávat pravidla, platná jak pro práci v mikrobiologických laboratořích, tak

pro práci s transgenním rostlinným materiálem. Kultivační místnosti jsou označeny popisem „Zákaz vstupu nepovolaným osobám“. Vstup do těchto prostor je povolen jen v pracovním plášti. O likvidaci tekutých a pevných odpadů a odpadní vody platí totéž co pro práci v laboratořích. Přeprava geneticky modifikovaných rostlin do laboratoří a z kultivační místnosti se provádí jen v uzavřených nádobách. 14) přepravování GMO materiálu mezi jednotlivými prostorami, určenými pro práci s GMO na pracovišti PřF UP v Olomouci Přeprava bakteriálních kultur: bakteriální kultury ve skleněných nádobách je nutno dopravovat v uzavřených kontejnerech.Přeprava rostlin kultivovaných v půdě a obsahující semena, květy nebo části, schopné vegetativní reprodukce (výhony, oddenky, semena): Nutno dopravovat v uzavřených kontejnerech. Přeprava GMO mimo areál pracoviště PřF UP v Olomouci – Holice je možná jen v uzavřených kontejnerech. 15) ostatní zásady Se všemi transgenními rostlinami zacházet jako s potencionálně nebezpečným transgenním materiálem až do té doby než se bezpečně prokáže, že jím nejsou. Pokud jsou rostlinná pletiva, pěstována in vitro v suspenzích nebo agarových kulturách, kultivována společně s bakteriemi A. tumefaciens nebo obsahující bakterie, je třeba s nimi zacházet jako s bakteriálním materiálem. Musí se proto autoklávovat veškeré sklo a nástroje, které přišly do styku s tímto materiálem. Pracovníci by se měli převlékat, uchovávat protokoly po dobu 10-ti let, předběžně schvalovat pokusy a znát havarijní plán. Pokusy musí být řádně označeny a musí být zabráněno vstupu nepovolaným a neinformovaným osobám.

Laboratorní cvičení č.1 Mikroizolace plasmidové DNA z Escherichia coli a její restrikční analýza Teoretický úvod Baktérie Escherichia coli a další prokaryota obsahují kromě velké jaderné DNA (milióny nukleotidů), tzv. "genomu" jestě menší kruhové DNA nazývané plasmidy o velikosti řádově tisíců nukleotidů, které se velice často využívají při klonování a genetických manipulacích. Při těchto manipulacích a přípravě určitých fragmentů DNA se také často využívá enzymů štěpících DNA v určitém specifickém místě (specifické sekvenci), tzv. restrikčních endonukleas. Tyto enzymy jsou většinou připravovány z baktérií a označují se zkratkami a římskými číslicemi podle zdroje (např. EcoRI a EcoRV pocházejí z E. coli). Příklady restrikčních endonukleas:

BsaI GGTCTCnnnnn CCAGACnnnnn

EcoRI GAATTC CTTAAG

EcoRV GATATC CTATAG

HindIII AAGCTT TTCGAA

PstI CTGCAG GACGTC

SmaI

SphI

XbaI

CCCGGG GGGCCC

GCATGC CGTACG

TCTAGA AGATCT

Při separaci malých množství DNA a jejích fragmentů se dnes rutinně používá elektroforéza v agarosovém gelu, které se stala jednou ze základních technik molekulární biologie. Agarosa je součástí agaru, což je směs polysacharidů obsažených v některých mořských řasách. Vedle agarosy (rozvětvený polysacharid složený z D-galaktopyranosy a 3,6-dehydro-L-galaktopyranosy) obsahuje agar ještě rozvětvený polysacharid agaropektin. Vizualizace DNA se provádí většinou pomocí ethidium bromidu, který se interkaluje do zářezů ve šroubovici DNA a při ozáření UV světlem fluoreskuje. Je tak možné detekovat již po několikaminutové inkubaci množství od 5 ng DNA. S výhodou se toto barvení používá i při izolacích specifických fragmentů DNA při klonování neboť jeho vazba je reverzibilní. Ethidium bromid je ovšem kancerogenní látka a při práci s ní je nutno dodržovat zvýšená bezpečnostní opatření. Materiál a chemikálie •

LB-Amp médium (1% pepton, 0.5% kvasnicový extrakt 1%, NaCl, pH upraveno na 7.5 pomocí NaOH, autoklávováno), obsahujícím 100 µg/ml ampicilinu. Uchovávat při +4 oC.

•

Kultury E. coli obsahující plasmidy s Ampr genem rozpěstována na pevném médiu a Petriho misce.

•

Roztok P1 (50 mM Tris/HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, autoklávováno a přidáno 0.1 mg/ml Rnasy A

•

Roztok P2 (0.2 M NaOH, 1% SDS, autoklávováno)

•

Roztok P3 (3 M octan draselný pH 5.5, autoklávováno)

•

Isopropanol a 70 % ethanol vychlazený v mrazničce (-20oC)

•

TE pufr (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA)

•

1 % agarosa v 1x TAE pufru (0,04 M Tris-kyselina octová, 0,001 M EDTA)

•

Zásobní elektrodový pufr 10x TAE (0,4 M Tris-kyselina octová, 0,01 M EDTA, pH 8,0)

•

50 % glycerol, 50 mM EDTA pH 8, 0,125 % bromfenolová modř, 0,125 % xylenová violeť

•

10% Ethidium bromid

•

GeneRuler 1kb marker

•

UV spektrofotometr, křemenná kyveta

•

Mikrozkumavky 1,5 ml (eppendorfky)

•

Termoblok

•

Elektroforeza, horizontální elektroforetická komůrka, zdroj

•

AlphaDigiDoc, systém pro digitální fotodokumentaci gelů

•

Mikropipety, špičky

•

PC vybavené programem BioEdit

•

Inkubovaná třepačka 37oC, laboratorní mikrocentrifuga

Experimentální postupy 1.DEN

.

a) Napěstování bakteriální kultury nesoucí plasmid •

Do sterilní zkumavky napipetujeme 2 ml LB-Amp média a inokulujeme ho sterilním párátkem neznámou bakteriální kolonií nesoucí plastid s resistencí k ampicilinu (vydá vedoucí cvičení)

•

Kulturu necháme inkubovat přes noc při 37oC na třepačce.

2.DEN

.

b) Mikroizolace plasmidové DNA •

1,5 ml podíl kultury inkubované přes noc přeneseme do mikrozkumavek, centrifugujeme při 5.000 g 1 min (separace buněk od média), médium odlijeme.

•

Přidáme 0,3 ml roztoku P1, bakteriální pelet suspendujeme pomocí vortexu.

•

Přidáme 0,3 ml roztoku P2, promícháme několikerým převrácením zkumavky, ponecháme stát 5 min při laboratorní teplotě.

•

Přidáno 0,3 ml roztoku P3, promícháme několikerým převrácením zkumavky, ponecháme stát 5 min na ledě.

•

Centrifugujeme při 13.000 – 21.000 g, 10 min, supernatant přelijeme do nových ependorfek.

•

Přidáme 0,6 ml isopropanolu (laboratorní teploty), centrifugujeme při 13.000 – 21.000 g, 20 min, supernatant odlijeme. Při vkládání ependorfek do centrifugy dbej orientace, jelikož často získáš neviditelný pelet.

•

Sraženinu DNA promyjeme 0,5 ml 70% ethanolu (-20oC), centrifugujeme při 13.000 – 21.000 g, 5 min, supernatant odlijeme, jeho zbytky odstředíme na dno mikrozkumavky a odpipetujeme. DNA ponecháme sušit 10 min ve flowboxu.

•

Sraženinu DNA resuspedujeme pipetováním v 0,03 ml TE.

c) Spektrální stanovení DNA Nukleové kyseliny absorbují záření v ultrafialové oblasti, maximum absorbance je při 260 nm. Při stanovení je nutné dbát na čistotu preparátu, protože ruší přítomnost proteinů (280 nm) a aromatických látek. Pokud je DNA preparát čistý, poměr A260/A280 dosahuje hodnoty 1.9. Při naší preparační metodě lze množství získané DNA přibližně vypočítat podle vztahu: cDNA (µg/ml) = 62.9 * A260 – 36.0 * A280 Do 1 cm křemenné kyvety napipetujeme vhodně zředěnou izolovanou DNA (10100x). Na stanovení koncentrace spotřebuj maximálně třetinu objemu vyizolované DNA. Měříme absorpční spektra vzorku v UV oblasti v rozsahu 200 - 340 nm proti TE pufru a odečteme absorbance při 280 a 260 nm. d) Restrikční analýza DNA Cílem je naučit se pracovat na PC s programem BioEdit na zpracovávání sekvencí nukleových kyselin a proteinů. Vedoucím cvičení budou poskytnuty DNA sekvence plasmidů a do nich naklonovaných genů (insertů) a úkolem studenta je navrhnout restrikční enzym(y) tak aby bylo možné z velikosti fragmentů určit o který ze tři možných genů naklonovaný do kterého ze dvou možných plasmidů se jedná v neznámem analyzovaném vzorku a popřípadě jak je gen v plasmidu orientovaný. Studenti mají k dispozici následující restrikční enzymy: BsaI, EcoRI, EcoRV, PstI, SmaI a XbaI a jejich optimální restrikční pufry. V případě potřeby štěpit dvěma či více enzymy současně se studenti seznámí se strategií pro tento typ analýz DoubleDigest firmy New England Biolab nebo firmy (http://www.neb.com/nebecomm/DoubleDigestCalculator.asp?) Fermentas (http://www.fermentas.com/doubledigest/index.html) a k dispozici jim bude univerzální restrikční pufr YTango®. Vlastní restrikční štěpení Do 1.5 ml ependorfky pipetujeme (v tomto pořadí): 2 µl pufr (optimálního pro danou restrikci) 1-10 µl izolovaného vzorku DNA (600-800 ng DNA) 7.8-16.8 µl vody pro PCR 0.2 µl vhodné restrikční endonukleasy Reakční směs (celkem 20 µl) inkubujeme 1-2 h při 37oC (v případě SmaI při při o 30 C).

e) Agarosová elektroforéza DNA •

Z rozpuštěné 1% agarosy v 1x TAE (uložena v inkubátoru na 65 oC) nalijeme asi 1 cm silnou vrstvu do horizontální elektroforetické komůrky. Agarosa se nalévá do prostoru ohraničeného postranními plastovými deskami na nosnou skleněnou desku. Ihned přidáme 40 µl 10% ethidium bromidu (POZOR KARCINOGEN, DBÁT BEZPEČNOSTNÍCH PŘEDPISŮ) a promícháme špičkou. Zhruba 1 cm od startu (katoda, černý kabel) zasadíme do agarosy hřeben tak aby zasahoval asi 0,8 cm do hloubky gelu. Gel ponecháme ztuhnout asi 30 min.

•

Odstraníme hřeben a postranní plastové desky a do komůrky nalijeme asi 200 ml elektrodového pufru 1 x TAE tak aby hladina splývala s agarosovým gelem.

•

Během tuhnutí gelu si připravíme vzorky: Ke vzorku DNA (20 µl) pipetujeme 5 µl denaturačního barviva a inkubujeme v termobloku při 65oC po dobu 10 min.

•

Jako standard použijeme 5 µL GeneRuler 1 kb firmy Fermentas.

•

Po inkubaci odstředíme vzorky na dno mikrozkumavek a pipetou opatrně naneseme jednotlivé vzorky do jamek na startu elektroforezy. Mezi nanášením jednotlivých vzorků, špičku pipety vyplachujeme v elektrodovém pufru přímo v komůrce. Pečlivě si zaznamenáme pořadí a polohu nanesených vzorků.

•

Elektroforetickou komůrku uzavřeme bezpečnostním víkem, připojíme ke zdroji napětí 120 V po dobu asi 30-40 minut. Průběh elektroforézy je možné sledovat podle pohybu pásů barviv ze vzorků.

•

Vypneme přívod proudu, odkryjeme víko a vyjmeme agarosový gel na nosném skle a pořídíme snímek digitální kamerou podle pokynů vedoucího cvičení. Používáme ochranné rukavice a dbáme předpisů pro práci s ethidium bromidem, který je obsažen v gelu.

Vyhodnocení výsledků Na základě pohyblivosti vzorku DNA je možné porovnáním se standardem metodou kalibrační křivky zjistit její velikost. Ta se udává v počtu nukleotidů obvykle označovaném jako kb (tzv. "kilobase pair"). 1/ Zjistěte obsah DNA v izolovaných preparátech. 2/ Určete velikost izolované plasmidové DNA na základě její elektroforetické pohyblivosti a velikosti jednotlivých naštípaných fragmentů 3/ Na základě získaných výsledku rozhodněte který plasmid jste izolovali a který ze tři možných genů a v jaké orientaci nesl. 4/ Zjistěte z literatury co znamenají zkratky ocDNA a cccDNA, uvedené u vzorového snímku DNA elektroforezy. 5/ Jak lze matematicky popsat závislost velikosti DNA na její elektroforetické pohyblivosti?

genomová DNA ocDNA cccDNA

1

1

2

2

3 3

M kbp 23,1 9,4 6,6 4,4 2,3 2,0

0,5 0,12

Obrázek 1. Agarorová elektroforéza DNA, barvení s ethidium bromidem. E. coli DH5α obsahující plasmid pAO101: 1) vzorek štěpený restrikční endonukleázou EcoRI, 2) vzorek štěpený restrikčními endonukleázami HindIII a PstI, 3) neštěpený vzorek, M) marker - DNA bakteriofágu λ štěpená HindIII.

Literatura Harwood A.J.: Basic DNA and RNA Protocols. Methods in Molecular Biology Vol.58, Humana Press Totowa, NJ, USA, 1996.

Obrázek 2. Mapy dvou klonovacích vektorů pYES2 (Invitrogen) a pDRIVE (Qiagen)

Obrázek 3. Sekvence genu AtCKX2 (GENBANK AF303978),HvCKX2 (AF540382) a gHvCKX2 (AF490591). AtCKX2 HvCKX2 gHvCKX2

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ATGGCTAATC TTCGTTTAAT GATCACTTTA ATCACGGTTT TAATGATCAC CAAATCATCA AACGGTATTA AAATTGATTT ACCTAAATCC CTTAACCTCA CAGTGAACCA CTACCCTGCT ACACGCCTTT CATCTTTCTC CTGAAAACCT CACCACTAAA CTTATTTATT CTTGACCTAC AGAAGAGCCA TGAGGCAATT CAGTGAACCA CTACCCTGCT ACACGCCTTT CATCTTTCTC CTGAAAACCT CACCACTAAA CTTATTTATT CTTGACCTAC AGAAGAGCCA TGAGGCAATT

AtCKX2 HvCKX2 gHvCKX2

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 CCCTCTCTAC CGATCCTTCC ATCATCTCCG CAGCCTCTCA TGACTTCGGA AACATAACCA CCGTGACCCC CGGCGGCGTA ATCTGCCCCT CCTCCACCGC ACTCCTGCAA TACCTGAAGC TGTTCCTGTT GCTAGGCCTT GGCGCAGTCA CTGCTGAGCA TGTGCTTAAA CATGATGTGC TTGCATCCCT GGGGACGCTC ACTCCTGCAA TACCTGAAGC TGTTCCTGTT GCTAGGCCTT GGCGCAGTCA CAGCTGAGCA TGTGCTTAAA CATGATGTGC TTGCATCCCT GGGGACGCTC


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 TGATATCTCT CGTCTCCTCC AATACGCCGC AAACGGAAAA AGTACATTCC AAGTAGCGGC TCGTGGCCAA GGCCACTCCT TAAACGGCCA AGCCTCGGTC CCCCTTGACG GGCATTTCAG CTTCCACGAC TTGTCTGCAG CTGCAATGGA CTTCGGCAAC CTCTCTAGCT TCCCGCCAGT CGCTGTGCTT CACCCAGGTT CCCCTTGACG GGCATTTCAG CTTCCACGAC TTGTCTGCAG CTGCAATGGA CTTCGGCAAC CTCTCTAGCT TCCCGCCAGT CGCTGTGCTT CACCCAGGTT


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 TCCGGCGGAG TAATCGTCAA CATGACGTGT ATCACTGACG TGGTGGTTTC AAAAGACAAG AAGTACGCTG ACGTGGCGGC CGGGACGTTA TGGGTGGATG CAGTGGCTGA CATTGCCACA ACCGTGAGGC ATGTGTTCTT GATGGGTGAG CACTCCGCGC TCACAGTGGC AGCTCGTGGG CATGGACACT CGCTATATGG CAGTGGCTGA CATTGCCACA ACCGTGAGGC ATGTGTTCTT GATGGGTGAG CACTCCGCGC TCACAGTGGC AGCTCGTGGG CATGGACACT CGCTATATGG


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 TGCTTAAGAA GACGGCGGAG AAAGGGGTGT CGCCGGTTTC TTGGACGGAT TATTTGCATA TAACCGTCCG AGGAACGTTG TCGAATGGTG GAATTGGTGG GCAGTCCCAG GCTGCTGGAG GGATTGTCAT CAGAATGGAA TCCCTTCGGA GTGTCAAAAT GCAGGTGCAT CCTGGTGCAT CACCCTATGT GGATGCCTCA GCAGTCCCAG GCTGCTGGAG GGATTGTCAT CAGAATGGAA TCCCTTCGGA GTGTCAAAAT GCAGGTGCAT CCTGGTGCAT CACCCTATGT GGATGCCTCA


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 TCAAGTGTTT CGAAACGGTC CTCTTGTTAG TAACGTCCTT GAATTGGACG TTATTACTGG GAAAGGTGAA ATGTTGACAT GCTCGCGACA GCTAAACCCA GGAGGCGAAC TCTGGATAAA TGTCTTGAAT AAGACGTTGA AGTATGGTTT GGCGCCGAAG TCATGGACAG ACTACCTCCA CCTTACGGTT GGGGGCACGT GGAGGCGAAC TCTGGATAAA TGTCTTGAAT AAGACGTTGA AGTATGGTTT GGCGCCGAAG TCATGGACAG ACTACCTCCA CCTTACGGTT GGGGGCACGT


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 GAATTGTTCT ATGGAGTGTT AGGAGGTTTG GGTCAATTTG GAATTATAAC GAGAGCCAGA ATTGTTTTGG ACCATGCACC TAAACGGGCC AAATGGTTTC TGTCAAATGC GGGCGTCAGC GGGCAGACAT TCCGGCATGG TCCACAGATC AGCAATGTGA ACGAATTGGA GATTGTGACT GGAAGAGGTG ATATTGTCAC TGTCAAATGC GGGCGTCAGC GGGCAGACAT TCCGGCATGG TCCACAGATC AGCAATGTGA ACGAATTGGA GATTGTGACT GGTATGAACT GGCCTTTATA


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 GGATGCTCTA CAGTGATTTC ACAACTTTTA CAAAGGACCA AGAACGTTTG ATATCAATGG CAAACGATAT TGGAGTCGAC TATTTAGAAG GTCAAATATT TTGCTCACCA GAACAGAACT CTGATCTCTT CCGTGCTGCT CTTGGTGGTC TGGGTCAGTT TGGCATCATT ACTCGGGCCA GGATCGCACT TGAGCCTGCT TTAAGTTGAT TTGAATAACT CGAAGAGTAA AGAATGTAGC TAACTTTGTA CCATGATTTT CAAATGCAGG AAGAGGTGAT ATTGTCACTT GCTCACCAGA


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 TCTATCAAAC GGTGTCGTTG ACACCTCTTT TTTCCCACCT TCAGATCAAT CTAAAGTCGC TGATCTAGTC AAGCAACACG GTATCATCTA TGTTCTTGAA CCACAAATGG TGAGGTGGAT AAGAGTTCTC TACTTAGATT TCATGAGCTT CACCGAGGAT CAGGAGATGC TTATTTCAGC AGAGAAGACC TTCGACTACA ACAGAACTCT GATCTCTTCC GTGCTGCTCT TGGTGGTCTG GGTCAGTTTG GCATCATTAC TCGGGCCAGG ATCGCACTTG AGCCTGCTCC ACAAATGGTA


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000 GTAGCCAAGT ATTATGATGA TCCCAATCTC CCCATCATCA GCAAGGTTAT TGACACATTA ACGAAAACAT TAAGTTACTT GCCCGGGTTC ATATCAATGC TTGAAGGTTT CGTTATCATA AACAGAACAG GCATCCTAAA CAACTGGAGG TCATCGTTCA ATCCACAGGA CCCAGAGCGG GCTAGCCGGT TCGAAACAGA AATCGCGAGA ACTCATCTGT GACAACCCCA TGCTAGTACA TCTTAGTAAG CATATGCTCA TGAGTTCATT GGATGTACAA TAGGTGAGGT GGATAAGAGT


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100 ACGACGTGGC CTACTTCGAT TTCTTGAACC GTGTACATGT CGAAGAAAAT AAACTCAGAT CTTTGGGATT ATGGGAACTT CCTCATCCTT GGCTTAACCT CAGAAAAGTG CTCTTCTGCC TCGAGATGAC AAAGAACTTC AACCCTGAAG AAGCTGACAT CATGGAACAG GAGGTCCATG CACTACTATC TCAACTTAGA TCTCTACTTA GATTTCATGA GCCTCACCGA GGATCAGGAG ATGCTTATTT CAGCAGAGAA GACCTTCGAC TACATTGAAG GTTTCGTTAT CATAAACAGA


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 CTACGTTCCT AAATCTCGGA TTCTCGATTT TCATAACGGT GTTGTCAAAG ACATTCTTCT TAAGCAAAAA TCAGCTTCGG GACTCGCTCT TCTCTATCCA TACACACCAG CCTCCTTATT CCACACGGAC GTCACTTACA TTGAGTTCTT GGATAGGGTG CACTCCTCTG AGATGAAGCT GAGAGCTAAG GGCTTGTGGG ACAGGCATCC TAAACAACTG GAGGTCATCG TTCAATCCAC AGGACCCAGA GCGGGCTAGC CGGTTCGAAA CAGACAGAAA AGTGCTCTTC TGCCTCGAGA


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300 ACAAACCGGA ATAAATGGGA CAATCGTATG TCGGCGATGA TACCAGAGAT CGATGAAGAT GTTATATATA TTATCGGACT ACTACAATCC GCTACCCCAA AAGTCCCACA CCCATGGCTT AATCTCATCA TACCAAGAAG CACTATCCAT ACATTTGCAG AGCAGGTCTT TGGGAAAATC CTCGAAGATA ACAACAATGG TGACAAAGAA CTTCAACCCT GAAGAAGCTG ACATCATGGA ACAGGTAAGC CGACGATTAA TCCTTGTGTT ACTAAAGATG TTTATGTATG AAGTGCTATC

AtCKX2 HvCKX2

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1310 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 AGGATCTTCC AGAAGTGGAG AGCGTTAACG AGAAGATAAT TAGGTTTTGC AAGGATTCAG GTATTAAGAT TAAGCAATAT CTAATGCATT ATACTAGTAA TCCCATATTG CTCTACCCAG TGAAGAAGTC CAGATGGGAC AACCGAACGT CAGTGGTCAT ACCAGATGAG GAAGTTTTCT ACCTGGTGGG ATTCCTATCC

gHvCKX2

AGGTGGCCTG AGTGGTTGAA TTCCATATGT ATATGTGTTT ACAGGAGGTC CATGCACTAC TATCTCAACT TAGATACACA CCAGCCTCCT TATTCCACAC


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 1490 1500 AGAAGATTGG ATTGAGCATT TTGGATCAAA ATGGGATGAT TTTTCGAAGA GGAAAGATCT ATTTGATCCC AAGAAACTGT TATCTCCAGG GCAAGACATC TCGGCGATAG GCCCCCACAG CATCGAACAT ACATTGAACC TGAACAACCA GATAATAGAG TTCTCTAACA AAGCAAGTAT TGGGGTGAAG CAATATCTTC GGACGTCACT TACATTGAGT TCTTGGATAG GGTGCACTCC TCTGAGATGA AGCTGAGAGC TAAGGGCTTG TGGGAAGTCC CACACCCATG GCTTAATCTC


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600 TTTTGA.... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... CAAACTACAC CACAGAACCC GAGTGGAAGG CCCACTATGG GGCTAGGTGG GACGCATTTC AACAGAGGAA AAACACCTAT GACCCCCTGG CAATCCTAGC ATCATACCAA GAAGCACTAT CCATACATTT GCAGAGCAGG TCTTTGGGAA AATCCTCGAA GATAACAACA ATGGTCCCAT ATTGCTCTAC CCAGTGAAGA


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 1690 1700 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... TCCAGGACAG AAAATATTTC AAAAGAAACC AGCATCACTA CCCTTGTCCT CGTTACAGTA CCTACTGTAA AAAATATATA TGTGGAGCAA TATGTCTATG AGTCCAGGTA AGTTAGCTAA TGTCCCGTAA TAACAAATCC CATTCAGAAA CTATTATACA CCACGCCATA GTGTTGCCAA GTGAATGATT CATCTTGTTT


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... TTAGTATGGA ACTATAGTCG CTTTGCAAAA GATAACGAAC TGCAGCGTGA AGGACACTGT ACAGAGTAGT GACTATTAGT AGTGGTGATG CTCAAAATAC CATGCAGATG GGACAACCGA ACGTCAGTGG TCATACCAGA TGAGGAAGTT TTCTACCTGG TGGGATTCCT ATCCTCGGCG ATAGGCCCCC ACAGCATCGA


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1810 1820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 1900 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... TTTTAGCACT GAGATCAATG AAGATCAGC. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ACATACATTG AACCTGAACA ACCAGATAAT AGAGTTCTCT AACAAAGCAA GTATTGGGGT GAAGCAATAT CTTCCAAACT ACACCACAGA ACCCGAGTGG


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... AAGGCCCACT ATGGGGCTAG GTGGGACGCA TTTCAACAGA GGAAAAACAC CTATGACCCC CTGGCAATCC TAGCTCCAGG ACAGAAAATA TTTCAAAAGA


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... AACCAGCATC ACTACCCTTG TCCTCGTTAC AGTACCTACT GTAAAAAATA TATATGTGGA GCAATATGTC TATGTTAGTA TGGAACTATA GTCGCTTTGC


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 2110 2120 2130 2140 2150 2160 2170 2180 2190 2200 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... AAAAGATAAC GAACTGCAGC GTGAAGAACA CTGTACAGAG TAGTGACTAT TAGTAGTGGT GATGCTCAAA ATACTTTTAG CACTGAGATC AATGAAGATC

... AtCKX2 HvCKX2 gHvCKX2

... ... AGC

Obrázek 4. Sekvence klonovací kazety vektoru pDRIVE s vyznačenými restrikčními místy. (Poznámka: všechny tři geny byly do vektoru naklonovány pomocí TA strategie)

Obrázek 5. Sekvence klonovací kazety vektoru pYES2 s vyznačenými restrikčními místy (Poznámka: v případě genů HvCKX2 a gHvCKX2 byly do vektoru překlonovány z vektoru pDRIVE pomocí restrikčních enzymů SphI a HindIII, v případě genu AtCKX2 byl do vektoru naklonován pomocí restrikčního enzymu KpnI.)

Laboratorní cvičení č.2 Detekce geneticky modifikovaných organismů v potravinách pomocí PCR Teoretický úvod Důležitým aspektem studia biochemie je získat zkušenosti s novými metodikami molekulární biologie, které mohou být využity v biotechnologickém průmyslu. Detekce geneticky modifikovaných organismů je typickým příkladem, který má široké uplatnění v zemědělství a potravinářství. Názory na geneticky modifikované organismy jsou v současné době rozporuplné nejen mezi laickou veřejností, ale i mezi vědeckou komunitou. Geneticky modifikované rostliny mohou například vést ke zvýšení výnosů prostřednictvím zvýšené rezistence k chorobám a škůdcům. Na druhou stranu, mohou takovéto organismy ohrožovat životní prostředí svojí umělou vysokou rezistencí a možným rozšířením do přírody. Sekundární efekty na životní prostředí a na lidstvo mohou být dlouhodobé a lze je zatím jen velmi těžko odhadovat. Toto je hlavním důvodem proč v některých zemích lobující skupiny prosadily důslednou kontrolu produkce geneticky modifikovaných rostlin a snaží se zamezit jejich širšímu používání. V Evropských zemích, přítomnost geneticky modifikovaných organismů v potravinách musí být uvedena. Proto tedy výrobci potravin musí mít jistotu, že geneticky modifikované organismy nejsou přítomny v jejich surovinách, pokud uvádějí na trh výrobek jako neobsahující geneticky modifikované organismy. S ohledem na to že metodika detekce geneticky modifikovaných organismů v potravinách musí být spolehlivá a rychlá, byly využity metodiky molekulární biologie pro PCR protokol, který může být jednak využit v kontrolních laboratořích a jednak použit pro výuku studentů. V tomto experimentu je použito PCR (polymerase chain reaction) k určení zdali předložený vzorek obsahuje geneticky modifikované organismy. Tato technika může být použita také k jiným účelům například v soudní medicíně, či paleontologii. PCR probíhá ve třech fázích: 1) tepelná denaturace dvouvláknové DNA, 2) navázání primerů na specifické sekvence ochlazením a 3) narůstání řetězců DNA prodlužováním primerů. Tyto tří kroky jsou nazývány jeden cyklus a PCR je založena na opakování takovéhoto cyklu, při němž dochází k exponenciálnímu nárůstu (2n, kde n je počet cyklů) množství specifického úseku DNA ohraničené primery. To znamená že po 30 cyklech je tento úsek amplifikován více než 109 x a může být snadno detekován na elektroforetickém gelu. Pro tento experiment, primery byly navrženy tak aby detekovaly dva typy genů. První sada primerů amplifikuje endogenní rostlinné geny, gen chloroplastu, sojového lektinu a kukuřičného aktinu. To slouží k potvrzení přítomnosti rostlinné a specificky sojové či kukuřičné DNA ve vzorku. Druhá sada primerů amplifikuje sekvence které nejsou normálně v rostlinách, ale jsou vneseny genetickou transformací. V tomto případě jsou těmito cizími úseky DNA konstitutivně aktivní 35S promoter viru květákové mozaiky (35S CaMV) a terminátor genu nopalin syntetasy (NOS) z Agrobacterium tumefaciens. Pokud kterákoliv z těchto sekvencí je amplifikována, ukazuje to že cílová DNA je transgenní. Všechny povolené geneticky upravené zemědělské plodiny byly transformovány s konstrukty obsahujícími jeden nebo oba tyto prvky. PCR primery byly navrženy tak aby pásy detekované na agarosovém gelu měly různou pohyblivost (viz Tab. 1) a byly tak snadno odlišitelné.

Tabulka 1. Primery použité pro PCR detekci geneticky modifikovaných rostlin. Úsek DNA

Orientace, název

rostlinný pozitivní, CP3 chloroplast negativní, CP4 sojový lektin pozitivní, LEC1 negativní, LEC2 kukuřičný pozitivní ACTfw aktin negativní ACTrev 35S pozitivní, CaMV1 promoter negativní, CaMV2 NOS pozitivní, NOS A terminátor negativní, NOS D

Sekvence

5’-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3’ 5’-GGGGATAGAGGGACTTGAAC-3’ 5’-GCCCTCTACTCCACCCCCATCC-3’ 5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG-3’ 5´-AGCAACTGGGATGACATGGAGAAAA-3´ 5´-CCTGTTCATAATCAAGGGCAACGTA-3´ 5’-GAAGGTGGCTCCTACAAATGCC-3’ 5’-GTGGGATTGTGCGTCATCCC-3’ 5’-GAATCCTGTTGCCGGTCTTGCG-3’ 5’-GCGGGACTCTAATCATAAAAACCC-3’

Velikost pásu (bp) 530 118 551 199 127

Materiál a chemikálie • • • • • • • • • • • • • • • • • •

Roztok S1 (10 mM MgCl2, 10 mM Tris/HCl pH 7,5, 0,5% Triton X-100, autoklávováno). Roztok S2 (1% SDS, autoklávováno) směs fenol/chloroform/isoamylalkohol (25:24:1, pH 8,0) isopropanol, 70 % ethanol vychlazený v mrazničce (-20oC) mikrozkumavky 1,5 ml (ependorfky) TE pufr (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) Primery dle Tab. 1 (0,01 mM), Taq polymerasa, dNTP mix, PCR pufr, PCR zkumavky Termocykler (Biometra) 3 % agarosa v 1x TAE pufru (0,04 M Tris-kyselina octová, 0,001 M EDTA) Zásobní elektrodový pufr 10x TAE (0,4 M Tris-kyselina octová, 0,01 M EDTA, pH 8,0) 50 % glycerol, 50 mM EDTA pH 8, 0,125 % bromfenolová modř, 0,125 % xylenová violeť 10% Ethidium bromid DNA marker (GeneRuler 5Obp nebo λ DNA naštípaná restrikčním enzymem PstI) Termoblok Elektroforeza, horizontální elektroforetická komůrka, zdroj AlphaDigiDoc, systém pro digitální fotodokumentaci gelů Mikropipety, špičky Inkubovaná třepačka 37oC, laboratorní mikrocentrifuga

Experimentální postupy 1.DEN SE SMĚSÍ FENOL/CHLOROFORM/ISOAMYLALKOHOL PRACUJ VŽDY V ZAPNUTÉ DIGESTOŘI!!!

.

a) Extrakce DNA z rostlinného materiálu: •

K neznámým vzorkům 0,1 g rostlinné mouky (dodá vedoucí cvičení) přidáme 0,45 ml S1 a 0,25 ml S2 protřepeme 10 min na třepačce, centrifugujeme při 14.000 g, 5 min, supernatant přelijeme do čisté mikrozkumavky.

•

Přidáme 0,7 ml směsi fenol/chloroform/isoamylalkohol (25:24:1, pH 8,0), vortexujeme 15 sec. a centrifugujeme při 14.000 g, 5 min, horní vodnou fázi přepipetujeme do čisté mikrozkumavky.

•

Přidáme stejný objem isopropanolu (0,3-0,7 ml), vortexujeme 15 sec. a necháme stát 2 min. na stole.

•

Centrifugujeme při 14.000 g, 10 min, pokojová teplota, supernatant odlijeme.

•

Precipitát promyjeme 0,5 ml 70% ethanolu (-20oC), centrifugujeme při 14.000 g, 5 min, supernatant odlijeme, zbytky odstředíme na dno mikrozkumavky a odpipetujeme, ponecháme sušit 10 min ve flowboxu.

•

Sraženinu DNA resuspedujeme pipetováním v 0.03 ml TE.

b) PCR •

Pro detekci jednotlivých fragmentů DNA nastavíme PCR pro každou z pěti sad primerů viz tabulka 1

•

Do 0,2 ml PCR zkumavky pečlivě pipetujeme (v PCR boxu) reagencie v tomto pořadí: 17,5 µl vody pro PCR 2,5 µl 10x PCR pufru 0,5 µl dNTP mix (každý 10 mM) 1,0 µl pozitivního primeru na stěnu mikrozkumavky 1,0 µl negativního primeru na stěnu mikrozkumavky 2,0 µl DNA matrice 0,5 µl Taq polymerasy

• • •

Zvortexujeme a krátkou centrifugací dopravíme všechny reagencie na dno zkumavek Současně s amplifikaci DNA z neznámého vzorku nastavte ke každé PCR negativní kontrolu, do které místo DNA matrice pipetujeme vodu Na termocykleru nastavíme PCR program: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

•

Počáteční denaturace 94oC, 7 min Denaturace 94oC, 30 sec Navázání primerů (annealing) 60oC, 30 sec Růst řetězce (elongace) 72oC, 1 min Kroky 2-4 opakovat 40x Koncová elongace 72oC, 10 min Chlazení 4oC

Program necháme proběhnout a zatím si připravíme agarosovou elektroforezu.

c) Agarosová elektroforeza DNA •

Pod dohledem vedoucího cvičení nebo laborantky rozpustíme 3% agarosu (v 1x TAE) v mikrovlnné troubě a nalijeme asi 1 cm silnou vrstvu do horizontální elektroforetické komůrky. Agarosa se nalévá do prostoru ohraničeného postranními plastovými deskami na nosnou skleněnou desku. Ihned přidáme 40 µl 10% ethidium bromidu (POZOR KARCINOGEN) a promícháme špičkou. Zhruba 1 cm od startu (katoda, černý kabel) zasadíme do agarosy hřeben tak aby zasahoval asi 0,8 cm do hloubky gelu. Gel necháme ztuhnout asi 30 min.

•

Odstraníme hřeben a postranní plastové desky a do komůrky nalijeme asi 200 ml elektrodového pufru 1 x TAE tak aby hladina splývala z agarosovým gelem.

•

Během tuhnutí gelu si připravíme vzorky: K PCR produktu (25 µl) pipetujeme 5 µl denaturačního barviva a inkubujeme v termobloku při 65oC po dobu 10 min.

•

Po inkubaci odstředíme vzorky na dno mikrozkumavek a pipetou opatrně naneseme jednotlivé vzorky do jamek na startu elektroforezy. Mezi nanášením jednotlivých vzorků, špičku pipety vyplachujeme v elektrodovém pufru přímo v komůrce. Pečlivě si zaznamenáme pořadí a polohu nanesených vzorků. Do jedné z jamek neopomeneme nanést DNA marker (5 µL 50bp GeneRuler nebo λ DNA naštípaná restrikčním enzymem PstI).

•

Elektroforetickou komůrku uzavřeme bezpečnostním víkem, připojíme ke zdroji napětí 120 V po dobu 20-30 minut. Průběh elektroforezy je možné sledovat podle pohybu pásů barviv ze vzorků.

•

Vypneme přívod proudu, odkryjeme víko a vyjmeme agarosový gel na nosném skle a pořídíme snímek digitální kamerou podle pokynů vedoucího cvičení.

Vyhodnocení výsledků 1/ Porovnáme výsledek elektroforezy s Obr.2 a z kalibrační křivky markeru určíme přítomnost a velikost jednotlivých PCR produktů. Porovnáme s očekávanou velikostí dle Tab. 1.

Obr.6 Výsledky PCR pro vzorky obsahující normální a transgenní rostliny (sója).

2/ Vyhodnoťte který z předložených vzorků obsahuje transgenní rostliny a jaké? 3/ Proč se pro PCR používá DNA polymeráza z termofilních organismů? 4/ Zdůvodněte proč v případě primerů CP3 a CP4 by jste měli vždy u každé rostliny dostat pozitivní výsledek a v případě primerů pro kukuřičný aktin nikdy nezamplifikujete aktin sójový? Literatura: Thion, L., Vosse, C., Couderc, B., Erard, M., Clemençon, B. (2002) Detection of genetically modified organisms in food by DNA extraction and PCR amplification. Biochem. Mol. Biol. Edu. 30, 51-55.

Laboratorní úloha č.3 Genetická transformace kvasinek a její ověření pomocí měření aktivity rekombinantního enzymu Teoretický úvod Až donedávna mohly být studovány jen proteiny, které jsou v buňce přítomny v relativně velkém množství. Pro detailní studium proteinu včetně eventuální krystalizace a určení trojrozměrné struktury je třeba alespoň 0,1 g čistého proteinu. Pokud se tedy protein vyskytuje v zastoupení kolem 1%, je nutné začít jeho purifikaci z několika set gramů buněk. Avšak většina z mnoha tisíců proteinů eukaryotní buňky včetně těch, které jsou pro život zcela nezbytné tvoří jen zlomek tohoto zastoupení a je velice obtížné, ne-li nemožné získat byť jen několik mikrogramů čistého proteinu. Proto bylo velkým přínosem zavedení klonovacích technik a genového inženýrství, neboť s jejich pomocí lze připravit velké množství i těch nejvzácnějších proteinů. Po tvorbu proteinů byly zkonstruovány speciální, tzv. expresní vektory, které obsahují vhodné regulační sekvence a promoter pro daný organismus (baktérie, kvasinky, kultury hmyzích nebo savčích buněk) v těsné blízkosti místa do kterého je vklonován insert s kódující sekvencí. Promoter spolu s regulačními sekvencemi zajišťuje produkci velkého množství mRNA, která slouží k proteosyntese. Protože se vektory s každým buněčným dělením replikují, vzniká populace buněk schopná vytvořit velké množství rekombinantního proteinu.

Obrázek 7. Příprava rekombinantního proteinu.

Pomocí těchto technik bylo vyprodukováno mnoho buněčných proteinů v množstvích, která byla dostatečná pro detailní strukturní a funkční studie. Navíc v dnešní době jsou tyto technologie využívány pro produkci mnoha proteinů používaných v medicíně, jako například insulin a plášťové proteiny virů používané při očkování. V našem experimentu připravíme rekombinantní enzym cytokinindehydrogenasu (1.5.99.12) z Arabidopsis thaliana, který katalyzuje odbourávání rostlinných hormonů cytokininů: CH3

CH3 HN CH2 CH C

N

CH2 CH C

CH3

N

N

N

N

HN

N H

CH3

N H

N

Isopentenyladenin Aox

FAD

CKX

el. akceptor Ared

FADH2 CH3

NH2

N CH CH C N

N

CH3 + O CH CH C

N Adenin

N H

CH3

+ H2O

N

N N

CH3

N H

3-Methyl-2-butenal

Obrázek 8. Katalytická reakce cytokinindehydrogenasy. Pro expresi genu cytokinindehydrogenasy AtCKX2 v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae použijeme přenosový vektor (shuttle vector) mezi E. coli a kvasinkami. Tento vektor byl připraven klonováním v E. coli a obsahuje Amp R gen pro selekci na základě rezistence baktérie vůči antibiotiku ampicilinu. Pro reprodukci v kvasinkách obsahuje tento vektor replikační signál (2 micro) a pro selekci gen URA3 který umožní kvasinkám autotroficitu na uracil. Jedině transformanty nesoucí tento gen budou tedy schopny se množit na médiu neobsahujícím uracil. Pro expresi genu AtCKX2, byl použit silný konstitutivní kvasinkový promoter PMA1 a ADH terminátor. Transformaci kvasinek provedeme dvěma způsoby pomocí tepelného šoku při 42 oC v přítomnosti octanu lithného, polyethylenglykolu (PEG) a nosné jednovláknové DNA (ss-DNA) a elektroporačně. Exprimovaný gen obsahuje peptidovou signální sekvenci, která způsobuje jeho vylučování kvasinkami do růstového média. Expresi proteinu lze tedy snadno ověřit měřením aktivity cytokinindehydrogenázy v médiu, pro kterou se využívá interakce vznikajícího 3-methyl-2-butenalu s p-aminofenolem v kyselém prostředí, kde dochází k tvorbě Schiffovy báze absorbující při 352 nm.

HindIII

PMA1 promotor Pst I

Amp R

CKX2

pDR197-CKX2

BamHI

7.9 kb

ADH terminator Sph I

URA3 EcoRV

2micro

Obrázek 9. Schéma cytokinindehydrogenasy.

expresního

vektoru

pro

přípravu

rekombinantní

Materiál a chemikálie • • • • • • • • • • • • • • • • •

•

Kultura 100 ml E. coli obsahující plasmid pDR197-AtCKX2 na Petriho misce s pevným LB médiem LB médium (1% pepton, 0,5% kvasnicový extrakt 1%, NaCl, pH upraveno na 7,5 pomocí NaOH, autoklávováno) obsahujícím 100 µg/ml ampicilinu. Roztok P1 (50 mM Tris/HCl pH 8,0, 10 mM EDTA, autoklávováno a přidáno 0,1 mg/ml Rnasy A Roztok P2 (0,2 M NaOH, 1% SDS, autoklávováno) Roztok P3 (3 M octan draselný pH 5,5, autoklávováno) isopropanol, 70 % ethanol vychlazený v mrazničce (-20oC) TE pufr (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) Médium YPAD (1% trypton, O,5% kvasnicový extrakt, 1% NaCl, 0,2 mg/ml adeninu, autoklávováno, po ochlazení na cca 50 oC přidána 2% glukosa). Uchovávat při 4oC. Kultura 1,5 ml Saccharomyces cerevisiae 23344c ura- na Petriho misce s pevným YPAD médiem uchovávána při 4oC. 0,1 M octan lithný, autoklávováno 1 M octan lithný, autoklávováno polyethylenglykol (PEG) MW 3350 (50% w/v), autoklavováno ss-DNA (salmon sperm DNA, 2 mg/ml). Uchováváno při –20 oC. 1M sorbitol, autoklávováno 1M dithiotreitol, sterilizováno filtrem 100% glycerol, autoklavováno YNB-Glc médium pro selekční agarové desky (0,68% yeast nitrogen base w/o amino acids – Difco, 2% agar autoklavováno, po ochlazení na cca 50 oC přidat 2% glukosu sterilizovanou přes mikrobiální filtr – Sartorius). Uchovávat při 60 oC. Médium YNB-Glc-KPB (0,68% yeast nitrogen base w/o amino acids – Difco, 0,15M fosfátový pufr, autoklavováno, po ochlazení na cca 50 oC přidána 2% glukosa sterilizovaná přes mikrobiální filtr – Sartorius). Uchovávat při +4 oC.

• • • • • • • • • • • •

10 mM isopentenyladenin v DMSO. Uchovávat při +4 oC. 0,3 mM TRIS/HCl, pH 8,0 5 mM DCPIP (dichlorofenol indofenol) ve vodě, Uchovávat při +4 oC. 40% kyselina trichloroctová 2% p-aminofenol v 6% kyselině trichloroctové UV spektrofotometr, křemenná kyveta Termoblok Inkubované třepačky 30 a 37oC, inkubátory 30 a 37oC. Mikrozkumavky 1,5 ml (ependorfky), centrifugační kyvety 50 ml. Chlazená laboratorní centrifuga, laboratorní mikrocentrifuga elektroporátor Mikropipety, špičky, sterilní Erlenmayerovy baňky


.

a) Příprava kultury E.coli TOP10F nesoucí shuttle vektor s naklonovaným rekombinatním vektorem •

Inokulujeme 20 mL LB media s ampicilinem v 250 ml Erlenmayerově baňce jednou kolonií E.coli nesoucí vektor pDR-AtCKX2 a necháme růst přes noc při 37ºC.

b) Příprava kompetentních buněk kvasinek •

Kulturu 1,5 ml Saccharomyces cerevisiae 23344c ponecháme růst v YPAD médiu přes noc při 30 oC. 2.DEN

ura-

z jedné

kolonie

.

•

Přes noc narostenou kulturu kvasinek zředíme na OD600 0,1 do 30 ml YPAD média a necháme růst dalších 3-5 hodin (do OD600 cca 0,3).

•

Zbytek kvasinkové kultury uchováme do 5 dne v uzavřené zkumavce v lednici. Zkumavku popiš svými iniciálami.

c) Makroizolace plasmidu pDR197 CKX2 z E. coli •

Použijeme 20 ml připravené kultury E. coli nesoucí plasmid pDR197-AtCKX2 v LB-Amp médiu.

•

Centrifugujeme ve sterilních 50 mL falkonkách na 2.360 g, 4 min (centrifuga ROTANTA), resuspendujeme vortexováním ve 2 ml P1.

•

Přidáme 2 ml roztoku P2, promícháme několikerým převrácením falkonky, ponecháme stát 5 min při laboratorní teplotě.

•

Přidáme 2 ml roztoku P3, promícháme několikerým převrácením zkumavky, ponecháme stát 10 min na ledě.

•

Centrifugujeme při 2.360 g, 5 min, 4 oC (centrifuga ROTANTA) , supernatant i s případnými nečistotami přepipetujeme v aliquotech do čistých sterilních ependorfek a dočista centrifugujeme na centrifuze Jouan při 21.000 g 10 minut, 4 oC.

•

Přidáme 0.7 objemového podílu isopropanolu (laboratorní teploty, např. k 0.9 mL supernatantu 0.6 mL isopropanolu), centrifugujeme při 21.000 g, 10 min, 4 oC, supernatant odlijeme. Při vkládání ependorfek do centrifugy dbej orientace, jelikož často získáš neviditelný pelet.

•

Sraženinu promyjeme s 1 ml 70% ethanolu (-20 oC), centrifugujeme při 21.000 g, 5 min, 4 oC, supernatant odlijeme, zbytky odstředíme na dno ependorfky a odpipetujeme, ponecháme sušit 10 min ve flowboxu.

•

Sraženinu DNA resuspedujeme postupným pipetováním v 0,01 – 0,05 ml sterilní vody (záleží na výtěžku tzn. limitu rozpustnosti DNA, jde o to dostat maximálně koncentrovaný roztok, proto pokud tušíš, že došlo ke ztrátám začni pelety rozpouštět v 10 mikrolitrech a pak pokud dojde k nasycení, roztok začne pěnit, přidej vodu).

•

Centrifugujeme při 13.000 g, 2 min, supernatant přeneseme do nové ependorfky a uložíme při 4 oC.

•

Do 1 cm křemené kyvety napipetujeme vhodně zředěnou izolovanou DNA (1001000x). Měříme absorpční spektra vzorku v UV oblasti v rozsahu 200 - 340 nm proti sterilní vodě. Koncentraci DNA vypočítáme ze vztahu: cDNA (µg/ml) = 62.9 * A260 – 36.0 * A280

d) Chemická transformace kvasinek Všechny centrifugace prováděj v řádně vychlazené centrifuze (4 oC). •

Sterilní YNB agar z jedné zásobní baňky (v lednici) rozpustíme v mikrovlnné troubě a ve flowboxu rozlijeme na 6-8 Petriho misek a necháme ztuhnout.

•

Použijeme kulturu Saccharomyces cerevisiae 23344c ura- po 2-4 hodinách růstu (OD600 cca 0,3).

•

Centrifugujeme při 3.000 g, 5 min (v 50 mL falkonkách, centrifuga ROTANTA), resuspendujeme ve 20 ml ledové vody.

•

Centrifugujeme při 3.000 g, 5 min, resuspendujeme v 1 ml 0,1 M octanu lithného a přeneseme do sterilní ependorfky.

•

Centrifugujeme při 14.000 g, 15 s, odstraníme supernatant resuspendujeme v 0,5 ml 0,1 M octanu lithného vortexováním.

•

0,05 ml podíly přeneseme do dvou vychlazených ependorfek.

•

Centrifugujeme při 14.000 g, 15 s, odpipetujeme supernatant.

•

Přidáme v tomto v tomto pořadí (!):

•

240 µl PEG MW 3350

•

36 µl 1 M octanu lithného

•

50 µl ss-DNA

pipetou,

•

1-5 µl DNA pro transformaci (cca 2 µg)

•

32 µl vody

•

Suspendujeme pipetováním, inkubujeme při 30 oC 20 min, dále při 42 oC 30 min.

•

Centrifugujeme při 14.000 g, resuspendujeme v 1 ml sterilní vody.

•

Centrifugujeme při 14.000 g, 15 s, odpipetujeme supernatant, resuspendujeme v 0,2 ml média YNB-Glc, inkubujeme s třepáním 1 h při 30 oC.

•

Rozetřeme na pevné půdy YNB-Glc po 100 µl alikvotech, inkubujeme při 30 oC.

•

Po 2-3 dnech spočítáme kolonie, inokulujeme kapalné kultury vybraných kolonií v 1,5 ml YNB-Glc-KPB pH 7.2.

15

s,

odpipetujeme

supernatant,

e) Příprava elektrokompetentních buněk Saccharomyces cerevicae (provede vedoucí cvičení) •

Kulturu 1,5 ml Saccharomyces cerevisiae 23344c ura- z jedné kolonie ponecháme růst v YPAD médiu přes noc při 30 oC.

•

Druhý den přeneseme 1 ml kultury do 500 ml YPAD média a v 2L Erlenmayerově baňce necháme růst přes noc při 30 oC do OD600 = 1,5.

•

Kulturu centrifugujeme (4.000 g, 5 min., 4oC) a rozsuspendujeme v 80 ml sterilní vody.

•

Kulturu přelijeme do sterilní Erlenmayerovy baňky a přidáme 10 ml 10x TE pufru a 10 ml 1M octanu lithného a necháme třepat 45 min při 30 oC.

•

Přidáme 2,5 ml 1M dithiotreitolu a třepeme dalších 15 minut.

•

Přidáme 500 ml vychlazené vody a centrifugujeme (4.000 g, 5 min., 4oC)

•

Supernatant odlijeme a pelet rozpustíme ve 200 ml vychlazené vody, centrifugujeme (4.000 g, 5 min., 4oC), celkem opakujeme 3x

•

Po třetí centrifugaci pelet rozpustíme ve 30 ml 1M vychlazeného sorbitolu a znovu centrifugujeme (4.000 g, 5 min., 4oC).

•

Pelet rozsuspendujeme v nejmenším možném množství 1M sorbitolu a naředíme sorbitolem aby výsledné OD600 bylo 200.

•

Přidáme vychlazený glycerol do finální koncentrace 15%, rozpipetujeme po 50 µl do vychlazených mikrozkumavek a okamžitě zamrazíme na -70 oC.

f) Elektroporace kvasinek (provádí studenti) •

Zamraženou mikrozkumavku s elektrokompetentními kvasinkami vyndáme z mrazícího boxu a necháme roztát na ledu (5-10 min.).

•

Centrifugujeme v důkladně vychlazené centrifuze (1-2 oC) 2 min při 5.000 g.

•

Supernatant odstraníme a pelet resuspendujeme v 1 ml předem řádně vychlazeného 1M sorbitolu (30 minut na -20 oC).

•

Centrifugaci a rozsuspendování ještě dvakrát zopakujeme.

•

Mikrozkumavku s kvasinkami stále udržujeme na ledu.

•

Poslední pelet rozsuspendujeme v 80 µl 1M sorbitolu.

•

Přidáme 1 µl izolované plasmidové DNA a zamícháme špičkou pipety.

•

Transformační směs přepipetujeme na dno předem vychlazené elektroporační cely.

•

Celu důkladně osušíme a vložíme do elektroporátoru nastaveného na 1.500 kV.

•

POZOR! Udělíme elektropuls a do cely okamžitě pipetujeme 300 µl 1M sorbitolu (předem připravený ve sterilní ependorfce) a buňky rozuspendujeme. V případě nesprávně vymyté kyvety či kontaminace DNA solí hrozí nebezpečí zranění vystřelením víčka např. do oka, proto dbej opatrnosti a při udělení elektropulsu raději uskoč.

•

Pokud byl elektroimpuls kratší než 4 ms nebo došlo ke vzniku elektrického oblouku, elektroporaci opakujeme s novou elektroporační celou a novou alikvotou kvasinek, snížíme množství přidávané plasmidové DNA na 0,5 µl a kvasinky důkladně promyjeme 1M vychlazeným sorbitolem.

•

Kvasinky po elektrošoku rozuspendované v sorbitolu rozetřeme hokejkou na YNB selekční agarové plotny a dáme do inkubátoru na 30 oC.

•

Po 2-3 dnech spočítáme kolonie.

5.DEN

.

•

1,5 ml YNB-Glc-KPB média, pH 7.2, ve sterilních zkumavkách inokulujeme jednotlivými koloniemi kvasinek po chemické a elektrotransformaci (2x2), dvě další zkumavky inokulujeme netransformovanýma kvasinkama a do jedné kultury inokulované netransformovanou kvasinkou přidáme 10 µl 100 mM uracilu.

•

Všechny zkumavky necháme inkubovat dva dny na třepačce při 30 (exprimuje se rekombinační enzym).

7.DEN g)

oC

. Měření aktivity rekombinantního enzymu

•

Po 2-3 dnech změříme aktivitu cytokinindehydrogenasy v médiu vybraných transformantů.

•

Kultury kvasinek přeneseme do 1,5 ml ependorfek.

•

Centrifugujeme při 5.000 g, 5 min.

•

K 0,1 a 0,01 ml supernatantu z každé nastavené exprese v mikrozkumavkách přidáme 0,30 ml pufru TRIS/HCl pH 8,0; 0,06 ml 5 mM DCPIP a 0,03 ml 10 mM isopentenyladeninu a doplníme vodou na celkový objem 0,6 ml. Ke každému vzorku připravíme blank, který bude obsahovat všechny komponenty kromě isopentenyladeninu, který nahradíme čistým DMSO.

•

Inkubujeme 30 min při 37 oC.

•

Enzymovou reakci zastavíme přidáním 0,3 ml 40% kyseliny trichloroctové. Tvorbu Schiffovy báze iniciujeme přidáním 0,2 ml 2% p-aminofenolu (v 6% kyselině trichloroctové).

•

Reakční směs centrifugujeme 5 min. při 14.000 g.

•

Měříme absorbanci při 352 nm proti blanku. Odečítáme celá spektra v rozsahu 500-300 nm případné nejasnosti konzultujeme s vedoucím cvičení.

Vyhodnocení výsledků 1/ Vypočítáme aktivitu cytokinindehydrogenasy v nkat (nmol vznikajícího 3methyl-2-butenalu za sekundu) produkované kvasinkami v 1 ml média. Schiffova báze vznikající z 3-methyl-2-butenalu a p-aminofenolu má ε352 = 15.2 mM-1cm-1. 2/ Porovnáme účinnost elektro a chemické transformační metody. 3/ Co je to PMA1 promoter? 4/ Proč není možné získat rekombinantní cytokinindehydrogenasu z kvasinek pěstovaných v YPAD médiu? Literatura Agatep P., Kirkpatrick R.D., Parchaliuk D.L., Woods R.A., Gietz R.D. (1998) Transformation of Saccharomyces cerevisiae by the lithium acetate/single stranded DNA/polyethylene glycol (LiAc/ss-DNA/PEG) protocol. Technical Tips Online (http://tto.trends.com).On line. Frébort I., Šebela M., Galuszka P., Werner T., Schmülling T., Peč P. (2002) Cytokinin oxidase/dehydrogenase assay: optimized procedures and applications. Anal. Biochem. 306, 1-7. Ausubel, F.M. et al. (1990) Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates, New York.

Laboratorní úloha č.4 PCR screening vybraných genů z lambda FIX II genomové knihovny ječmene Teoretický úvod V poslední době se pro hledání konkrétních genů daného organismu začalo využívat jejich DNA knihoven. DNA knihovna je soubor fragmentů DNA příslušného organizmu naklonovaný do určitého vektoru. Podle původu DNA lze knihovny dělit na dva základní typy: genomové knihovny – představují soubor fragmentů získaných štěpením celého genomu a cDNA knihovny připravené z fragmentu cDNA získaných zpětnou transkripci mRNA izolované z buněk určité tkáně v daném vývojovém stádiu organismu. Jeden organizmus proto může mít pouze jednu genomovou knihovnu kdežto cDNA knihoven lze připravit mnoho typů. Dalším kritériem pro klasifikaci DNA knihoven pak může být použitý typ klonovacího vektoru. Při konstrukci genomových knihoven závisí výběr vektoru na velikosti genomu. Plasmidy jako vektor se používají hlavně pro virové genomy, jelikož umožňují nést pouze krátké fragmenty cizorodé DNA. Pro konstrukci knihoven eukaryotických organizmů se nejčastěji používají vektory odvozené od bakteriofága lambda a kosmidy, případně umělé kvasinkové a bakteriální chromosomy (YAC, BAC) s velkou klonovací kapacitou. V závislosti na použitém vektoru je pak plasmidová nebo kosmidová knihovna tvořená suspenzí bakterií, fágová knihovna suspenzí fágových částic a knihovna YAC souborem kvasinkových kmenů. Důležitou charakteristikou každé genomové knihovny je její velikost, která udává minimální počet klonů, který zaručuje, že v ní bude obsažen celý genom. Velikost knihovny určitého organizmu lze vypočítat podle vzorců, do nichž je dosazována průměrná velikost inzertů použitého vektoru, celková velikost genomu a faktor vyjadřující pravděpodobnost s jakou bude knihovna obsahovat celý genom. Např. genomová knihovna člověka, jehož genom má velikost 2,8x109 bp, připravená pomocí bakteriofága lambda jako vektoru s průměrnou velikostí klonovaných fragmentů 20 kb, musí obsahovat alespoň 6,5x105 klonů, aby bylo s 99% pravděpodobností zaručeno, že nese celý genom.

Obrázek 10. Konstrukce genomové knihovny v substitučním vektoru bakteriofága

2

Lambda FIX II vektor patří mezi substituční vektory, u nichž cizorodá DNA nahrazuje střední úsek genomu bakterofága, který je z něj restrikčnímu endonukleasami před vložením cizorodé DNA vyštěpen (obr.1). Klonovací kapacita vektoru je mezi 9-23 kb. Systém lambda FIX II využívá selekce založené na citlivosti k inhibici profágem P2 hostitele. Lambda fágy obsahující aktivní geny red a gam nejsou schopný růst na hostitelském kmeni obsahující P2 lysogeny. Lambda fágy bez těchto genů rostou na P2 lysogenních kmenech, jako je např. kmen E.coli XL1-Blue MRA (P2). Red a Gam geny jsou situovány v substitučním středním fragmentu fágova genomu, proto divoký typ lambda FIX II fága nemůže růst na bakteriálních buňkách XL1-Blue MRA (P2). Po vložení fragmentů genomu cílového organismu se fág stává Red-/Gam-. Proto pěstování knihovny na XL1-Blue MRA (P2) kmeni selektuje pouze rekombinantní fágy a umožňuje tak množit a používat knihovnu aniž by docházelo ke ztrátám insertů. Nedoporučuje se však knihovnu přepěstovávat více než jednou, jelikož pomaleji rostoucí klony (ty s většími inserty) mohou být v knihovně výrazně potlačeny. Komerčně získaná lambda FIX II genomová knihovna z ječmene byla připravená z genomové DNA izolované z etiolovaných listů osmidenních semenáčku Hordeum vulgare varieta Igri. Izolovaná DNA byla před vložením do vektoru naštípána restrikční endonukleasou Sau3A I.

Obrázek 11. Princip hybridizace kolonií plasmidové knihovny s radioaktivně značenou DNA sondou. Pro vyhledávání konkrétních genů v knihovně existuje několik způsobů. Nejčastěji se využívají DNA sondy. Ty mohou být připravené přepisem mRNA z tkáně, v níž dochází k silné expresi hledaného genu. Fragment této DNA je pak označen buď radioaktivně, nebo fluorescenčně a použit jako hybridizační sonda. Popřípadě může být jako základ pro sondu použita sekvence DNA genu příbuzného organizmu. Řada genů vyznačujících se stejnou funkcí obsahuje konzervativní sekvence s vysokým stupněm homologie. Lze také využít synteticky připravených oligonukleotidů odvozených ze sekvence aminokyselin proteinu, kodóvaného hledaným genem. Vzhledem k degeneraci genetického kódu je obvykle třeba použít několika alternativních sekvencí dohromady tzv. degenerované oligonukleotidy. Rozpěstováním knihovny na Petriho miskách a následnou hybridizaci s DNA sondou po přenesení plaku či bakteriální kolonie na vhodnou membránu lze pak vybrat konkrétní klon mající v inzertu hledaný gen (obr.2). Fágovou částici či plasmid rostoucí na vybrané kolonii lze pak namnožit, lambda DNA či plasmidovou DNA vyizolovat a odsekvenovat. Alternativní cestou pro hledání konkrétního genu je pak amplifikace genové DNA pomocí PCR, kde je jako matrice použitá lambda DNA izolovaná z rekombinatních bakteriofágů dané knihovny. Pokud známe 5´ a 3´ konce genu, lze na základě jejich sekvence navrhnout nedegenerované oligonukleotidy (primery) a jednou amplifikací získat celý gen. Většinou však známe pouze

3

část sekvence, pak lze pro amplifikaci využít specifických primerů odpovídajících sekvenci T3 a T7 promoterů bakteriofága v kombinaci s jedním genově specifickým primerem. Výsledkem je často nespecifická amplifikace, selekci lze pak provést následnou odstupňovanou tzv. nested PCR, kdy se použije pro amplifikaci genově specifický primer vzdálený několik desítek bází od prvního primeru ve směru amplifikace. Amplifikovaný úsek však může dosahovat délky až 23 kb (velikost inzertu) je pak proto vhodné pro PCR používat speciálně upravené rekombinatní Taq DNA-polymerasy v tzv. LA-PCR ( z angl. long and accurate) systému. Materiál a chemikálie • genomická knihovna z ječmene v lambda FIX II vektoru – zásobní titr, uchovávat na -80°C. • 50 mL přes noc napěstované kultury bakterií E.coli XL1-blue MRA (P2) • NZY agar (1,0% NZ amin, 0,5% kvasnicový extrakt, 0,2% MgSO4, 0,5% NaCl a 1,5% agar, pH 7.5) • SM médium (50 mM Tris/HCl, pH 7.5, 0.1 M NaCl, 0.01 M MgSO4.7H2O, 0.01% želatina) • LB médium (1,0% trypton, 1,0% NaCl, 0,5% kvasničný extrakt, pH 7,0) • 10 mM MgSO4.7H2O • NZY Top agar (1,0% NZ amin, 0,5% kvasnicový extrakt, 0,2% MgSO4, 0,5% NaCl a 0,7% agarosa, pH 7.5) • 30% roztok polyethylenglykolu 6000 s 3M NaCl • Rnasa A, chloroform, DMSO (dimethyl sulfoxid) • PCR reagencie: PCR voda, 10x PCR pufr, dNTP mix, primery reverse a forward, Taq DNA polymerasa. • 5x TBE pufr (45 mM Tris báze, 45 mM kyselina boritá, 12,5 mM EDTA) • 30% akrylamid + 0,8% N, N´-methylenbisakrylamid • TEMED, persíran amonný • vzorkovací pufr (1% SDS, 0,1% bromfenolová modř, 0,1% xylenová modř, 20% glycerol) • barvící směs ethidium bromidu (tři kapky do 100 mL vody) • 1 kb DNA marker • Petriho misky ∅ 90 mm a ∅ 150 mm, sterilní mikrozkumavky 1,5 mL, 0,5 mL, 0,2 mL, sterilní skleněné zkumavky, sterilní kultivační baňky a sterilní centrifugační kyvety • flowbox, mikrovlnná trouba, inkubátor 37°C a 30°C, vortex, centrifuga, třepačka, ledová lázeň, termocykler, skla na vertikální elektroforezu, termoblok, elektroforetická komůrka, zdroj napětí, transluminátor, AlphaDigiDoc - systém pro digitální fotodokumentaci gelů, automatické pipety a špičky, Hamiltonova pipeta, rukavice, spektrofotometr, kyveta. Experimentální postupy 1. DEN a)

.

Příprava hostitelského kmene E.coli XL1-blue MRA (P2)

• Na LB agarosovou plotnu sterilní kličkou rozetřeme E.coli XL1-blue MRA (P2) ze zamražené zásobní mikrozkumavky • Inkubujeme přes noc při 37ºC (připraveno vedoucím cvičení, v lednici).

4

• Další den inokulujeme 15 mL LB media s 0.2% maltosou a 10 mM MgSO4 jednou kolonií E.coli XL1-blue MRA (P2) a necháme růst přes noc při 30ºC. • Pěstování na 30°C zajišťuje že buňky nedorůstají do stacionární fáze a neumírají. Bakteriofág je totiž schopen adheze na mrtvé buňky stejně dobře jako na živé a snižoval by se tím titr. 2.DEN

.

• Narostlou kulturu zcentrifugujeme 10 min. při 2000 x g. • Opatrně odlijeme medium a buňky jemně rozsuspendujeme v 10 mL 10 mM MgSO4. Nevortexujeme. • Buňky naředíme na OD600=0,5 pomocí 10 mM MgSO4 a rozdělíme po 200 µL do sterilních mikrozkumavek. b)

Stanovení titru bakteriofága obsahujícího genomovou knihovnu

•

Připravíme si plotny s pevnou půdou NZY agaru pro kultivaci plaků rekombinatního lambda fága na lysogenním kmenu E.coli XL1-blue MRA (P2).

•

Pod dohledem vedoucího cvičení si v mikrovlnné troubě rozpustíme NZY agar v zásobní láhvi.

•

Ve flowboxu si nachystáme 5 sterilních Petriho misek a po ochlazení na zhruba 60°C na ně vlijeme NZY agar, tak aby kompaktně pokryl dno.

•

Po ztuhnutí agaru plotny převrátíme a dáme vyschnout do zadní části flowboxu, tak že horní část misky nepatrně nadzvedneme. Pracujeme ve sterilních podmínkách!

•

Připravíme si ředící řadu bakteriofága.

•

Nachystáme si 5 0.5mL mikrozkumavek do první napipetujeme 18 µL SM media a přidáme 2 µL zásobního titru bakteriofága.

•

Do dalších zkumavek pak pipetujeme 18 µL SM media a přenášíme vždy 2 µL roztoku z předchozí mikrozkumavky. Vytvoříme tím řádu 5 roztoků bakteriofága vždy s desetkrát nižší koncentrací.

•

Podíl 10 µL z každé mikrozkumavky pak přeneseme do nové čisté a sterilní a přidáme 200 µL bakteriálních buněk lysogenního kmene XL1-blue MRA (P2) rozsuspendovaných v 10 mM MgSO4 a naředěných na OD600 = 0.5.

•

Buňky s fágem pak necháme inkubovat 15 minut při 37°C za mírného třepání.

•

Mezitím si rozpustíme v zásobní láhvi NZY Top agar v mikrovlnné troubě a necháme ho zchladit na zhruba 50°C.

•

Do pěti sterilních zkumavek si napipetujeme 2.5 mL NZY Top agaru a přidáme bakterie s fágem, rychle rozmícháme a lijeme na NZY agarové plotny.

•

Opatrným krouživým pohybem rozlijeme agar kompaktně po celé ploše a necháme ztuhnout.

•

Po ztuhnutí plotny obrátíme a inkubujeme přes noc při 37°C.

5

c)

PCR amplifikace vybraného genu

•

Jako templáty pro PCR použijeme zbylých 8 µL ředící řady amplifikované genomové knihovny, kterou předem povaříme 5 min. v termobloku nebo termocykleru.

•

Povařením narušíme kapsidu bakteriofága a umožníme tak jeho DNA kontaktu s ostatními reagenciemi v PCR zkumavce.

•

Nastavíme si sedm x dvě PCR reakce pro pět různých koncentrací templátu (bakteriofága), zásobní titr knihovny a negativní kontrolu bez templátu.

•

Do 0,2 ml PCR zkumavek uložených v chladicím stojánku pečlivě pipetujeme (v PCR boxu) reagencie v tomto pořadí: 16,50 µl PCR vody 2,50 µl 10x PCR pufru 0,50 µl dNTP mix (každý 10 mM) 0,50 µl pozitivního primeru, primery pipetujeme na stěnu zkumavky 0,50 µl negativního primeru 4,00 µl DNA matrice (1/ zásobní roztok bakteriofága, 2/ 10x 3/ 100x 4/ 1.000x 5/ 10.000 6/ 100.000x ředěn 7/ voda, vše povařeno)

•

Reakci zahájíme přídavkem 0,50 µl Taq DNA polymerasy, zkumavku krátce zvortexujeme, dopravíme její obsah na dno mikrocentrifugací a okamžitě vložíme do vyhřátého termocykleru.

•

Na termocykleru předem nastavíme PCR program: 1. 2. 3. 4. 4. 5. 6.

Počáteční denaturace 94oC, 3 min Denaturace 94oC, 30 sec Navázání primerů (annealing) x oC, 30 sec Růst řetězce (elongace) 72 oC, 1 min Kroky 2-4 opakovat 40x Koncová elongace 72oC, 10 min Chlazení 4oC

•

Provedeme tzv. „hot start“, který zabraňuje nespecifické navázání primeru na matrici během počátečního vyhřívání termocykleru. PCR zkumavky uchováváme v chladicím stojánku až do doby, kdy je termocykler vyhřán na počáteční 3 min denaturaci při 94oC, poté otevřeme víko a opatrně vložíme PCR zkumavky.

•

Teplotu annelingu zvolíme podle Tm použitých primerů.

•

PCR Program necháme proběhnout a zatím si připravíme elektroforézu v akrylamidovém nebo 2% agarosovém gelu. Jako marker použijeme λ DNA naštípanou PstI restrikčním enzymem.

Sekvence použitých primerů: pro gen aktinu: 5´-AGC AAC TGG GAT GAC ATG GAG AAA A-3´

Tm= 64 oC

negativní ACTrev 5´-CCT GTT CAT AAT CAA GGG CAA CGT A-3´

Tm= 64 oC

pozitivní ACTfw

6

pro gen tRNA-Leu: pozitivní CP3

5’-CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG-3’

Tm= 54 oC

negativní CP4

5’-GGG GAT AGA GGG ACT TGA AC-3’

Tm= 52 oC

d) Elektroforeza DNA v akrylamidovém gelu •

Sestavíme si skla na vertikální elektroforezu a odzkoušíme si jejich těsnost nalitím vody do prostoru mezi skly. Pokud skla těsní vodu vylijeme a prostor mezi nimi vysušíme filtračním papírem.

•

Do 100 mL baňky si připravíme akrylamidový gel: 30 mL vody, 10 mL 5x TBE pufr, 10 mL 30% akrylamidu, 42 µl TEMEDu, jednu špachtli persíranu amonného. Intenzivně zamícháme a okamžitě lejeme mezi skla zhruba 1/2 cm pod okraj. Zasuneme hřebínek a necháme ztuhnout.

•

Po ukončení PCR pipetujeme ke každé PCR reakci 15 µl vzorkovacího pufru, zvortexujeme a zahřejeme 10 min. při 75oC.

•

Ze ztuhlého gelu vytáhneme hřebínek, odstraníme ze skel ochranou gumu a skla s gelem vložíme do elektroforetické komůrky do které předem nalijeme TBE pufr (naředit!). Pufrem zalijeme i horní katodový prostor.

•

Po inkubaci vzorky naneseme pomocí Hamiltonovy pipety do jamek. Do jedné jamky nezapomeneme přidat i 10 µl DNA markeru.

•

Elektroforetickou komůrku uzavřeme bezpečnostním víkem, připojíme ke zdroji napětí na konstantních 30 mA a necháme běžet elektroforézu až první modř dosáhne anodového konce gelu. (cca 90 min).

•

Vypneme přívod proudu, odejmeme víko a vyjmeme skla z gelem. Opatrně odstraníme horní sklo pomocí špachtle a gel jemným proudem vody odlepíme od spodního skla. Poté i se spodním sklem vložíme do barvící lázně ethidium bromidu. Chráníme se modrými nitrilovými rukavicemi, které na rozdíl od běžných latexových nepropouštějí ethidium bromid. V barvící lázní ponecháme 5 min. a poté gel přeneseme do lázně s čistou vodou. Gel opatrně přeneseme ze spodního skla na UV část transluminátoru a pod dohledem vedoucího cvičení zhotovíme digitální fotografii.

e) Amplifikace genomové knihovny (vzhledem k časové náročnosti provede předem vedoucí cvičení) Příprava hostitelského kmene E.coli XL1-blue MRA (P2) •

Na LB agarosovou plotnu sterilní kličkou rozetřeme E.coli XL1-blue MRA (P2) ze zamražené zásobní mikrozkumavky.

•

Inkubujeme přes noc při 37ºC.

•

Další den inokulujeme 50 mL LB media s 0.2% maltosou a 10 mM MgSO4 jednou kolonií E.coli XL1-blue MRA (P2) a necháme růst přes noc při 30ºC.

•

Narostlou kulturu zcentrifugujeme 10 min. při 2000 x g.

•

Opatrně odlijeme medium a buňky jemně rozsuspendujeme v 15 mL 10 mM MgSO4. Nevortexujeme.

•

Buňky naředíme na OD600= 0,5 pomocí 10 mM MgSO4 a rozdělíme po 600 µL do sterilních mikrozkumavek.

7

Příprava titru bakteriofága •

Stanovíme titr bakteriofága (viz výše).

•

Naředíme zásobní roztok bakteriofága tak aby 10 µL obsahovalo 5 x 104 pfu (viz vyhodnocení). Na ředění použijeme SM médium.

Rozpěstování knihovny •

Připravíme si 20 sterilních Petriho misek o průměru 150 mm obsahujících NZY agar.

•

20 podílu naředěného bakteriofága po 10 µL (5 x 104 pfu) přidáme do mikrozkumavek obsahující 600 µL hostitelských buněk.

•

Mikrozkumavky inkubujeme 15 min. při 37ºC.

•

Roztopíme NZY Top agar a zchladíme ho na zhruba 48ºC. Postupně pipetujeme do sterilních zkumavek 6 mL roztopeného agaru a obsah mikrozkumavek s bakterifágem a hostitelskými buňkami a po rychlém zvortexování ihned rovnoměrně rozléváme na NZY agarové plotny.

•

Po ztuhnutí otočíme a inkubujeme 6-8 hodin při 37ºC dokud se nezačnou tvořit viditelné plaky. Hlídáme, aby plaky nevyrostly více než do průměru 1 mm a nezačaly se vzájemně překrývat.

•

Každou plotnu zalijeme 8 mL SM média a za mírného třepání na třepačce v lednici necháme bakteriofágy difundovat přes noc do média.

•

Ráno médium odsajeme sterilní pipetou a desky spláchneme dalšími 2 mL média, které přidáme ke zbytku.

•

K suspenzi bakteriofága přidáme chloroform do konečné koncentrace 5%, zvortexujeme a inkubujeme 15 min. při pokojové teplotě.

•

Zbytky buněk a agaru odstraníme centrifugaci 10 min. při 500 x g

•

Supernatant přelijeme do čisté sterilní baňky, pokud není čirý provedeme předešlé dva kroky znovu.

•

K supernatantu přidáme Rnasu A (0.1 mg/mL) a inkubujeme 1/2 hod. při 37ºC.

•

Poté přidáme k suspenzi bakteriofága vychlazený roztok 30% polyethylenglykolu tak aby konečná koncentrace byla 5% a inkubujeme na ledu 1 hod.

•

Po hodině zcentrifugujeme fágové částice 10 min. při 10.000 x g.

•

Důkladně odstraníme supernatant, kyvetu necháme několik minut dnem vzhůru, a pelet rozsuspendujeme přibližně v 1 mL SM média.

•

K takto připravené přepěstované knihovně přidáme chloroform do konečné koncentrace 0,3% a DMSO do konečné koncentrace 7% a zamrazíme na -80ºC.

3.DEN

.

Vyhodnocení výsledků 1/ Stanovení titru genomové knihovny: Poté co nám narostou plaky na plotnách, vybereme vhodnou plotnu a spočteme na ní celkový počet plaků. Lze si pomoci rozdělením prostoru plotny na několik sektorů. Podle následujícího vzorce pak spočteme hodnotu pfu (plaque forming unit):

8

pfu/mL = počet plaků na plotně x faktor ředění / objem knihovny rozetřený na plotnu v mL 2/ Určete při jak velké koncentraci virových částic (pfu) lze ještě detekovat v knihovně geny pro ječmenný aktin a tRNA. 3/ Pomocí DNA markeru a softwaru AlphaDigiDoc 1206 určete velikost amplifikovaných úseků genů a hodnotu ověřte v databázi GenBank na Internetu. 4/ Proč se pro rozpěstování knihovny použilo právě 20 Petriho misek? Literatura Sambrook, J. et al. (2001) „Molecular Cloning: A laboratory Manual“ Third Ed., Vol. 1, pp. 2.69 – 2.81. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Ausubel, F.M. et al. (1990) „Current Protocols in Molecular Biology“. Greene Publishing Associates, New York. Alberts, B. et al. (1998) „Essential Cell Biology“, Garland Publishing, New York. Rozsypal, S. a kol. (2002) „Úvod do molekulární biologie“, třetí vydání, díl čtvrtý, Grafex, Blansko.

Laboratorní cvičení č.5 Izolace RNA z rostlin a následná RT-PCR vybraných genů Teoretický úvod Reverzně přepisovaná PCR je metoda používaná pro amplifikaci cDNA (ssDNA komplementární ke specifické RNA). Pomocí RT-PCR se nejčastěji amplifikují a následně klonují 5´ a 3´ konce mRNA (tzv. EST klony, expressed sequence tag) nebo cDNA knihovny, využívané pro hledání nových genů. RT-PCR může být taky velmi snadno adaptována pro identifikace mutací a polymorfismu v přepisovaných genových sekvencích a nebo pro kvantifikaci exprese jednotlivých genů, když je množství izolované mRNA malé a nedostačující pro techniku Northern blotu. Prvním krokem RT-PCR je vždy enzymová konverze mRNA nebo celkové do jednovláknové cDNA kdy je deoxyribonukleotidový primer hybridizován s RNA a rětězec DNA následně prodloužen RNA-dependentní DNA polymerasou (EC 2.7.7.49, reverzní transkriptasa). Druhým krokem pak je klasická PCR se dvěma genově specifickými primery , pro kterou je jako templát využita RT reakcí vzniklá cDNA. Deoxyribonukleotidové primery použity pro přepis cDNA mohou být trojího typu: • oligo(dT) primer, který se specificky váže na polyA konec, který je přítomen v 98% procentech všech zralých eukaryotických mRNA a RT reakcí pak vzniká cDNA obsahující informací celé mRNA. • genově specifický primer, který hybridizuje pouze s jednou konkrétní mRNA nebo příbuznou skupinou mRNA. Genově specifické primery, jak negativní tak pozitivní, pro následující PCR pak samozřejmě musí ležet „upstream“ od použitého primeru pro RT. Pokud to lze, doporučuje se také navrhnout každý primer, jak negativní tak pozitivní, tak aby ležely každý na jiném exonu. Touto strategií lze pak velice jednoduše při vyhodnocení PCR rozlišit mezi správnou RT-PCR amplifikací a amplifikací, která vznikla na podkladě kontaminující genomové DNA, která se často v izolovaným RNA vzorcích nachází. • náhodné hexanukleotidové primery (random hexamers) jsou schopny se vázat a zahajovat syntézu cDNA na mnoha místech podél celého RNA templátu. Jedná se o směs krátkých šestinukleotidových fragmentů, ve kterých jsou vygenerovány všechny možnosti kombinací čtyř nukleotidů (A,G,C,T). Používá se především pokud je templát mRNA extrémně dlouhý (přes 3.000bp) nebo když má cílová mRNA komplikovanou sekundární strukturu. Ve většině případů je cílem vytvořit čím jak nejdelší cDNA a proto se pro navržení genově specifického primeru nejčastěji využívá nekódující sekvence 3´konce. Druhou nejlepší volbou je pak použití nespecifického oligo(dT) primeru. Pokud oba pokusy selžou přichází na řadu random hexamer primery. Nejrychlejším způsobem provedení RT-PCR je jednozkumavková reakce s genově specifickým primerem pro RT, kdy po proběhnutí RT reakce se pouze přidá druhý genově specifický primer a termostabilní polymerasa a nechá se proběhnout PCR. Nejčastějším problémem RT-PCR je izolace kvalitní RNA. Jednovláknová molekula RNA je daleko méně stabilnější než DNA a proto je i její životnost velice limitována. Navíc specifické RNA endonukleasy (RNasy) jsou velice aktivní enzymy, které pracují v široké škále pH a teplot bez přítomnosti kofaktoru a jsou přítomny téměř všude (např. na lidských dlaních). Během izolace a při následné RT reakci je proto nutno vzorek RNA před vlivem těchto enzymů chránit dodržováním specifických podmínek manipulace a používáním pouze speciálně ošetřeného skla a plastiku, viz Laboratorní řád molekulárně-biologické laboratoře. Přesto často

dochází k degradaci a fragmentaci mRNA populace a to hlavně od 5´konce, který není tak dobře chráněn a stabilizován polyA sekvencí jako 3´konec. A u některých genů je proto velice těžké získat a amplifikovat genetickou informaci jejich počátku. Pokud chceme pomocí RT-PCR kvantifikovat sílu exprese jednotlivých genů, tzn. zjistit množství molekul mRNA přepisovaných pro specifické geny zastoupených v populaci mRNA izolované z určitého ontogenetického stádia organismu či specifické tkáně či pletiva, je nutné společně se specifickou amplifikaci kvantifikovaného genu provést současně amplifikaci genu srovnávacího. Jako srovnávací geny se nejčastěji používají tzv. „house-keeping“ geny. Jsou to geny kódující proteiny které jsou v organismech esenciální a zastoupeny ve všech stádiích života organismu ve všech tkáních či pletivech. Tyto geny jsou vždy exprimovány pod konstitutivními promotery, tzn. že jejich exprese je za všech podmínek stejná a nebývá ničím ovlivňována. Nejčastěji používaným srovnávacím genem v rostlinné říši je gen kódující aktin. Klíčovým enzymem RT-PCR je reverzní transkriptasa, enzym objeven roku 1970 jako hlavní katalytická jednotka RNA virů, které s jeho pomocí přepisují svou genetickou informaci z RNA do DNA, která se pak začleňuje do genomu jejich hostitele. V současné době se v molekulární biologii využívají reverzní transkriptasy ze tři zdrojů: •

AMV RT enzym izolovaný z viru ptačí myeloblastosy (avian myeloblastosis virus), kromě RT aktivity, má ještě RNasa H aktivitu, která může rozštěpit delší fragmenty RNA templátů, optimální teplota enzymu je 42°C.

•

MoMLV RT enzym z Molonyho viru myší leukemie (Moloney strain of murine leukemia virus), jeho aktivita RNasy H je daleko slabší, jeho teplotní optimum je při 37°C, proto není moc vhodný pro templáty se složitou sekundární strukturou. Komerčně dostupné jsou i mutované verze obou enzymů, které mají inhibovanou RNasovou aktivitu a vyšší teplotní stabilitu (do 50°C), jsou proto vhodnější pro delší RNA templáty se složitou sekundární strukturou.

•

Termostabilní Tth DNA polymerasa vykazuje aktivitu reverzní transkriptasy v přítomnosti Mn2+ iontů a je proto využívaná hlavně tak kde je třeba provádět rutinní a rychlé RT-PCR, jelikož pro oba kroky stačí jediný enzym a obě reakce běží současně. Její nevýhoda je krátká délka syntetizovaných cDNA (do 2kb) a nemožnost využití oligo(dT) a random hexamer primerů, protože ty mají nízkou teplotu hybridizace a při optimální teplotě enzymu a PCR netvoří stabilní RNADNA hybrid.

Materiál a chemikálie •

RNA extrakční pufr (8 M guanidin/HCl, 20 mM MES, pH 7,0, 20 mM EDTA, 50 mM 2-merkaptoethanol, neautoklávovat – chaotropický roztok)

•

směs fenol/chloroform/isoamylalkohol (25:24:1, pH 4,8)

•

1 M octová kyselina (autoklávováno)

•

absolutní ethanol

•

3 M octan sodný, pH 5,2 (autoklávováno)

•

RNase free voda autoklavováno)

•

100 mM DTT (sterilizováno filtrem)

(deionizovaná

voda

s 0,1%

diethyl

pyrokarbonátem,

•

10 mM dNTP mix, 5x pufr pro M-MLV reverzní transkriptasu,10x PCR pufr

•

50 µM oligo(dT) primer, 10 µM genově specifické primery

•

M-MuLV reverzní transkriptasa, Taq polymerasa

•

10x TAE pufr (0,4 M Tris-kyselina octová, 0,01 M EDTA, pH 8,0)

•

10x nanášecí pufr (50 % glycerol, 50 mM EDTA pH 8, 0,125 % bromfenolová modř, 0,125 % xylenová violeť)

•

10% Ethidium bromid, DNA marker 50 bp a 1kb GeneRuler, 2% agarosa v 1xTAE pufru

•

kapalný dusík

•

rostlinný materiál – huseníček (Arabidopsis), kukuřice, ječmen

•

nádoba na kapalný dusík, třecí miska s tloučkem, termocykler Biometra, termoblok na 37°C UV spektrofotometr, laboratorní centrifuga a pikofuga, křemenná kyveta, mikropipety, mikrozkumavky 1,5-0,5-0,2 ml, špičky s filtrem, horizontální elektroforetická komůrka, zdroj nápětí, AlphaDigiDoc, systém pro digitální fotodokumentaci gelů

Obrázek 12. Princip RT-PCR reakce s využitím genově specifického primeru, oligo(dT) primeru nebo random hexamer primerů.

Tabulka 2. Genově specifické primery pro amplifikací několika genů z huseníčku, kukuřice a ječmene. Úsek DNA

název

Sekvence

Tm (°C)

Velikost pásu (bp) Genomová kontaminace

Arabidopsis thaliana cytokinin oxidasa/ AtCKX1fw dehydrogenasa 1 AtCKX1rev cytokinin oxidasa/ AtCKX2fw dehydrogenasa 2 AtCKX2rev cytokinin oxidasa/ AtCKX3fw dehydrogenasa 3 AtCKX3rev cytokinin oxidasa/ AtCKX4fw dehydrogenasa 4 AtCKX4rev cytokinin oxidasa/ AtCKX5fw dehydrogenasa 5 AtCKX5rev cytokinin oxidasa/ AtCKX6fw dehydrogenasa 6 AtCKX6rev cytokinin oxidasa/ AtCKX7fw dehydrogenasa 7 AtCKX7rev aktin ARAactfw ARAactrev Zea mays aktin ACTfw ACTrev cytokinin oxidasa/ ZmCKX1fw dehydrogenasa 1 ZmCKX1r cytokinin oxidasa/ ZmCKX2fw dehydrogenasa 2 ZmCKX2r cytokinin oxidasa/ ZmCKX3fw dehydrogenasa 3 ZmCKX3r cytokinin oxidasa/ ZmCKX4fw dehydrogenasa 4 ZmCKX4r lakasa 1 lac1fw lac1r lakasa 2 lac2fw lac2r Hordeum vulgare aktin ACTfw ACTrev α-amylasový ATI1 inhibitor ATI2 cytokinin oxidasa/ CKX28 dehydrogenasa 1 CKX30 cytokinin oxidasa/ CKX13 dehydrogenasa 2 CKX14 cytokinin oxidasa/ CKX57 dehydrogenasa 4 CKX58 cytokinin oxidasa/ CKX59 dehydrogenasa 5 CKX60

5´-GAAGTCGTAACCTGTTCTGAGAAGCG-3´ 5´-AGAATCGCTAGAGGGTCGTAGGCTTG-3´ 5´-CGGATGCTCTACAGTGATTTCACAAC-3´ 5´-CGGTTTGTTGGATAGAGAAGAGCGAG-3´ 5´-AAACGGACGGTGTAGATTTCTTAG-3´ 5´-ATAGCGGCAGACATCCGATCATTCCA-3´ 5´-TCTATGGAGTTTTAGGAGGTTTGG-3´ 5´-CATAAACCCTGGAGCGAAACCTAGAG-3´ 5´-GCACGAATCTCTCTCGAACCAGCTC-3´ 5´-CGCTGACGAAGAAGACGACGACG-3´ 5´-TGTGGATTCCCCTGCTCCATATGTTG-3´ 5´-ACCCTGTCCAAGAATGCTTCATATG-3´ 5´-TGGCTAGTAAGTCAGAAGAACGAG-3´ 5´-GAGCTACCATTTTCTCTACCGAAG-3´ 5´-GCCATCCAAGCTGTTCTCTC-3´ 5´-GGTGGTGCAACGACCTTAAT-3´

65 66 63 65 59 65 59 65 66 66 61 65 61 61 59 57

919 1196 508 631 486 656 385 1128 893 2018 647 966 600 2074 606 692

5´-AGCAACTGGGATGACATGGAGAAAA-3´ 5´-CCTGTTCATAATCAAGGGCAACGTA-3´ 5´-ATCCTGCAGGGCACCGACAT-3´ 5´-CCGCGCCAGGTAGGTCTTGT-3´ 5´-ACGTGATGCTGCGTGAGCT-3´ 5´-GTGTAGAACACCTCGTC-3´ 5´-ACGAGGAGGTGTTCTACC-3´ 5´-GGATTACGTTACGAGTCGG-3´ 5´-GCACACCTCTGAGTTGAAACT-3´ 5´-TGAATGTGCAATGCTGCC-3´ 5´-CTACAACCTGGTGGACCC-3´ 5´-GCTGCATACTCCCACCCAAT-3´ 5´-ACCAAGCTGTACCCGCTCA-3´ 5´-AACTGGATGACCGCCCA-3´

64 64 62 63 59 53 56 57 58 54 58 59 59 55

480 560 245 345 346 ? 310 ? 283 ? 218 ? 230 ?

5´-AGCAACTGGGATGACATGGAGAAAA-3´ 5´-CCTGTTCATAATCAAGGGCAACGTA-3´ 5´-ATCCGGGCAGATCGATGA-3´ 5´-GCTTTTCGGACCAATCT-3´ 5´-CCTCATCCCTGGCTCAACGTGCTCGTGC-3´ 5´-CGGGGAGAGCAGCTTCTTGGGGTCGTAC-3´ 5´-GCACCCTATCCAAGAACTCAATGTAAGTGA-3´ 5´-GATTGTCATCAGAATGGAATCCCTTCGGAG-3´ 5´-CCTGGAACCCATGATTGCCTCCAAAG-3´ 5´-CTTCGGGGCGAGGTGGGAGACATTT-3´ 5´-CCAAGCAGTACCTGCCCAACCACAAG-3´ 5´-TGACTACATAGTTGCATGGACGCGACG-3´

64 64 55 50 72 72 65 67 69 71 71 70

495 575 200 200 412 493 750 1012 359 480 389 ?


.

SE SMĚSÍ FENOL/CHLOROFORM/ISOAMYLALKOHOL PRACUJ VŽDY V ZAPNUTÉ DIGESTOŘI!!! a) Izolace mRNA •

Pracujeme vždy v rukavicích pouze na vytyčeném místě, používáme pouze speciálně ošetřené sklo a plastik a špičky na automatické pipety s filtrem!

•

Ve třecí misce zhomogenizujeme na prach 0,5-1,0 g rostlinného materiálu (dodá vedoucí cvičení) pomocí kapalného dusíku.

•

Do sterilní mikrozkumavky přesně odvážíme 0,3 g zmrzlého rostlinného prachu a přidáme 650 µl RNA extrakčního pufru, vortexujeme a necháme 5 minut na ledu.

•

Centrifugujeme (14.000 g, 10 min., 4°C) a supernatant odpipetujeme do nové mikrozkumavky.

•

Přidáme 720 µl směsi fenol/chloroform/isoamylalkohol, vortexujeme 15 sec a centrifugujeme (14.000 g, 10 min., 4°C).

•

Do nové mikrozkumavky opatrně odpipetujeme horní vodnou fázi a přidáme 120 µl 1 M kyseliny octové a 550 µl absolutního ethanolu.

•

Inkubujeme 30 minut v mrazícím boxu na -75°C .

•

Centrifugujeme (14.000 g, 15 min., 4°C) a supernatant odlejeme

•

Pelet promyjeme dvakrát 0,5 ml 3M octanem sodným, vždy stočíme a reprecipitujeme (14.000 g, 5 min., 4°C).

•

Nakonec promyjeme 70% vychlazeným ethanolem, stočíme (14.000 g, 5 min., 4°C), supernatant odlijeme, zbytky supernatantu krátce stočíme na pikofuze a opatrně odsajeme mikropipetou, pelet necháme 10 minut vyschnout ve flowboxu.

•

Pelet rozpustíme v 15 µl RNase-free vody a zamrazíme na -75°C, pokud budeme ihned pokračovat s RT reakcí necháme na ledu.

b) Spektrální stanovení RNA •

Odebereme 5 µl z celkové vyizolované RNA a vhodně naředíme do kyvety (100x), měříme absorbanci na 260 a 280 nm.

•

Pokud je RNA preparát čistý, poměr A260/A280 dosahuje hodnoty 2.1

•

Přibližnou koncentraci RNA určíme z jednoduché úměry, pokud je A260=1 pak je v kyvetě 40 µg/ml RNA.

c) Reverzní transkripce •

Do malé mikrozkumavky pipetujeme 1-2,5 µg celkové RNA (maximálně v objemu 5 µl) a přidáme 0,5 µl 50 µM oligo(dT) primeru, doplníme celkový objem vodou na 6,5 µl a špičkou pipety zamícháme, necháme inkubovat 5 minut v inkubátoru na 70°C.

•

Ochladíme na ledu a ke vzorku připipetujeme 2 µl 5x koncentrovaného pufru pro M-MVL reverzní transkriptasu, 1,0 µl dNTP mixu.

•

Mikrozkumavku krátce zvortexujeme a inkubujeme 5 minut v inkubátoru na 37°C.

•

Ke vzorku připipetujeme 0,5 µl M-MVL reverzní transkriptasy (100 jednotek), krátce zvortexujeme a krátce stočíme v pikofuze.

•

Inkubujeme 60-90 minut v inkubátoru na 37°C, probíhá reverzní transkripce do cDNA.

•

Vzniklou cDNA zamrazíme na -20°C, nebo uložíme na led a pokračujeme v RT-PCR.

krátce

stočíme

v pikofuze,

d) RT-PCR •

Jako templáty pro PCR použijeme 1 µl RT reakce, kterou jsme předem dvakrát naředili ultra-čistou PCR vodu.

•

Pro každou dvojicí primerů dle tabulky si nastavíme 2 PCR reakce, vzorek a kontrolu, kde místo RT reakce použijeme jako templát izolovanou, nepřepsanou RNA (vhodně naředěnou tak aby množství v 1 µl odpovídalo množství RNA, které bylo původně v 1 µl RT reakce).

•

Do 0,2 ml PCR zkumavek uložených v chladicím stojánku pečlivě pipetujeme (v PCR boxu) reagencie v tomto pořadí: 16,75 2,50 1,25 0,50 1,00 1,00 1,00

µl µl µl µl µl µl µl

PCR vody 10x PCR pufru DMSO dNTP mix (každý 10 mM) pozitivního primeru, primery pipetujeme na stěnu zkumavky negativního primeru cDNA templátu

•

Reakci zahájíme přídavkem 1,00 µl Taq DNA polymerasy, zkumavku krátce zvortexujeme, dopravíme její obsah na dno mikrocentrifugací a okamžitě vložíme do vyhřátého termocykleru.

•

Pipetování si můžeme usnadnit přípravou tzv. premixu, kdy do 1,5 ml mikrozkumavky na ledu pipetujeme všechny komponenty PCR včetně Taq polymerasy v násobku počtu vzorků které budeme mít (plus jeden či dva navíc, kompenzace chyby pipetování), premix pak rozpipetujeme v chladícím stojánku po 22 µl a připipetujeme pouze konkrétní dvojici primeru (2 µl) a vhodný templát (1 µl).

•

Na termocykleru Biometra předem nastavíme PCR program:

1. 2. 3. 4. 4. 5. 6.

Počáteční denaturace 94oC, 3 min Denaturace 94oC, 30 sec Navázání primerů (annealing) x oC, 30 sec Růst řetězce (elongace) 72 oC, 2 min Kroky 2-4 opakovat 45x Koncová elongace 72oC, 10 min Chlazení 4oC

•

Pro odlišné teploty annelingu jednotlivých vzorků využijeme možnosti nastavení teplotního gradientu (poradí vedoucí cvičení).

•

Teplotu annelingu zvolíme podle Tm použitých primerů.

•

Provedeme tzv. „hot start“, který zabraňuje nespecifické navázání primeru na matrici během počátečního vyhřívání termocykleru. PCR zkumavky uchováváme v chladicím stojánku až do doby, kdy je termocykler vyhřán na počáteční 3 min denaturaci při 94oC, poté otevřeme víko a opatrně vložíme PCR zkumavky.

•

PCR Program necháme proběhnout a zatím si připravíme elektroforézu v 2% agarosovém gelu. Jako marker použijeme v jedné jamce 50 bp GeneRuler a v další 1kb GeneRuler.

d) Agarosová elektroforeza DNA •

Pod dohledem vedoucího cvičení nebo laborantky rozpustíme 2% agarosu (v 1x TAE) v mikrovlnné troubě a nalijeme asi 1 cm silnou vrstvu do horizontální elektroforetické komůrky. Agarosa se nalévá do prostoru ohraničeného postranními plastovými deskami na nosnou skleněnou desku. Ihned přidáme 40 µl 10% ethidium bromidu (POZOR KARCINOGEN) a promícháme špičkou. Zhruba 1 cm od startu (katoda, černý kabel) zasadíme do agarosy hřeben tak aby zasahoval asi 0,8 cm do hloubky gelu. Gel necháme ztuhnout asi 30 min.

•

Odstraníme hřeben a postranní plastové desky a do komůrky nalijeme asi 200 ml elektrodového pufru 1 x TAE tak aby hladina splývala z agarosovým gelem.

•

Během tuhnutí gelu si připravíme vzorky: K PCR produktu (25 µl) pipetujeme 5 µl denaturačního barviva a inkubujeme v termobloku při 65oC po dobu 10 min.

•

Po inkubaci odstředíme vzorky na dno mikrozkumavek a pipetou opatrně naneseme jednotlivé vzorky do jamek na startu elektroforezy. Mezi nanášením jednotlivých vzorků, špičku pipety vyplachujeme v elektrodovém pufru přímo v komůrce. Pečlivě si zaznamenáme pořadí a polohu nanesených vzorků. Do jedné z jamek neopomeneme nanést DNA marker (λ DNA naštípaná restrikčním enzymem PstI).

•

POZOR: Vzorky kontroly a vzorku nanášíme vždy do sousedních jamek!!!

•

Elektroforetickou komůrku uzavřeme bezpečnostním víkem, připojíme ke zdroji napětí 120 V po dobu 20-30 minut. Průběh elektroforezy je možné sledovat podle pohybu pásů barviv ze vzorků.

•

Vypneme přívod proudu, odkryjeme víko a vyjmeme agarosový gel na nosném skle a pořídíme snímek digitální kamerou podle pokynů vedoucího cvičení.

Vyhodnocení výsledků 1) Na základě pohyblivosti vzorku DNA a DNA standardů určete velikosti jednotlivých amplifikovaných fragmentů. 2) Expresi kterých genů se vám v daném rostlinném pletivu podařilo prokázat a které naopak exprimovány nebyly. 3) Proč se jako templát v kontrolní PCR použila nepřepsaná RNA? Výsledky této kontroly vyhodnoťte. 4) U všech genů, které se vám podařilo detekovat ve vzorku z kukuřice určete relativní míru exprese vzhledem ke srovnávacímu aktinovému genu. Využijte k tomu analysis tool programu AlphaDigiDoc (poradí vedoucí cvičení). Literatura Sambrook, J. et al. (2001) „Molecular Cloning: A laboratory Manual“ Third Ed., Vol. 2, pp. 8.46 – 8.65. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Logemann, J. et al. (1987) „Improved Method for Isolation of RNA from Plant Tissues“. Anal Biochem 163, 16-20.

PŘÍLOHY λ DNA MARKERY λ DNA (48.5 kbp) naštípaná restrikčním enzymem StyI

1% agarosa v TAE 11 fragmentů: 19.329, 7.743, 6.223, 4.254, 3.472, 2.690, 1.882, 1.489, 925, 421, 74 bp λ DNA (48.5 kbp) naštípaná restrikčními enzymy HindIII a EcoRI

1% agarosa v TAE 13 fragmentů: 21.226, 5.148, 4.973, 4.268, 3.530, 2.027, 1.904, 1.584, 1.375, 947, 831, 564, 125 bp

λ DNA (48.5 kbp) naštípaná restrikčním enzymem PstI

1.5% agarosa v TAE 29 fragmentů: 11.501, 5.077, 4.749, 4.507, 2.838, 2.556, 2.459, 2.443, 2.140, 1.986, 1.700, 1.159, 1.093, 805, 514, 468, 448, 339, 264, 247, 216, 211, 200, 164, 150, 94, 87, 72, 15 bp λ DNA (48.5 kbp) naštípaná restrikčním enzymem PstI 100bp žebřík

λ DNA PstI

3% agarosa v TAE Příprava markeru: Do mikrozkumavky pipetujeme 50 µL λDNA (25 µg), 34 µL vody, 10 µL vhodného restrikčního pufru, 1 µL 0,01% BSA a 5 µL restrikčního enzymu. Necháme štípat přes noc, poté inaktivujeme reakci 10 min při 65°C a přidáme 100 µL TE pufru a 30 µL 10x nanášecího pufru.

GeneRuler™ 50bp DNA Ladder

GeneRuler™ 1kb DNA Ladder

POUŽIVANÉ KMENY E.COLI A SACCHAROMYCES CEREVICAE Escherichia coli TOP10F´ Genotyp: F' (tetR), mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC), Φ80 ∆lac ∆M15, lacIq, deoR, recA1, araD139, ∆(ara, leu) 7697, galU, galK, rpSL (strR) endA1 Escherichia coli XL1-Blue MRA (P2 lysogen) Genotyp: ∆(mcrA)183 ∆ (mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi- gyrA96 relA1 Saccharomyces cerevisiae 23344c uraGenotyp: MATa ura3-52/ MATα ura3-52

VYSVĚTLIVKY: F´ episom je potřebný pro produkci ssDNA kóduje protein tvořící tzv. pilus na vnější membráně E.coli tetR gen pro tetracyklinový represor, kmen roste na tetracyklinu mcrA, mcrBC, a mrr mutace v těchto genech zaručuje možnost klonování i methylované genomové DNA lacZ∆M15 element potřebný pro komplementaci β-galaktosidasy pro blue/white screening na miskách s X-gal, je vložený na profágové částici Φ80 ∆lacX74 kóduje lac represor, který brání expresi z lac operonu, dereprese probíhá pomocí IPTG deoR umožňuje příjem velkých plasmidu (přes 10kb) recA1 zabraňuje rekombinaci mezi plasmidovou a bakteriální DNA endA1 deficience endonukleasy I zaručuje kvalitní izolaci plasmidové DNA rpSL (strR) gen pro rezistenci ke streptomycinu lacIq produkuje lacZ represor negativně regulující transkripci z lacZ promotoru. zrušení přídavkem IPTG galK, galU mutace v genu pro galaktokinasu, blokuje metabolismus galaktosy araD139, ∆(ara, leu) 7697 mutace v ara operonu, blokuje metabolismus arabinosy supE44 supresor amber (UAG) mutace thi- mutace v genu metabolizující thiamin, kmen na minimálním médiu neroste bez thiaminu gyrA96 mutace v genu DNA gyrasy, způsobuje rezistenci k antibiotiku - kyselině naxilové relA mutace umožňující syntézu RNA bez navazující proteosyntézy MATα/MATa diploidní kmen schopný pohlavního rozmnožování ura3-52 mutace v genu podílející se na biosyntéze uracilu, kvasinka neroste na minimálním médiu bez uracilu P2 lysogen slouží pro lysogenní selekci, kmen může být napaden pouze bakteriofágem s genotypem red/gam-, tzn. bakteriofágen nesoucí fragment genomové knihovny, nikoli wild-typovým

LABORATORNÍ CVIČENÍ Z MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE

Recommend Documents