___________________________________________________________________________
ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE FAKULTA TROPICKÉHO ZEMĚDĚLSTVÍ Katedra tropických a subtropických plodin a agrolesnictví
Laboratoř molekulární biologie
Laboratorní úlohy z molekulární biologie “Plant breeding and genetic resources conservation”
Praha 2012
___________________________________________________________________________
Poděkování Vytvoření těchto “Laboratorních úloh z molekulární biologie” bylo finančně podpořeno Fondem rozvoje vysokých škol v rámci projektu FRVŠ č. 1940/2012 “Vytvoření laboratorních úloh z molekulární biologie pro praktickou výuku v předmětu „Seed productionand plant breeding“.
___________________________________________________________________________
OBSAH 1 Pravidla bezpečnosti práce v Laboratoři molekulární biologie 2 Příprava roztoků 3 Metody izolace DNA 3.1 Izolace DNA pomocí Invisorb® Spin Plant Mini Kit (Invitek Company) 3.2 Izolace DNA pomocí metody CTAB 4 ISSR analýza 5 AFLP analýza 6 Metoda zpracování výsledků pomocí specializovaného softwaru
___________________________________________________________________________
1
Pravidla bezpečnosti práce
v Laboratoři molekulární biologie •
Před začátkem práce v laboratoři by studenti měli znát pravidla práce a bezpečnosti v Laboratoři molekulární biologie.
•
V laboratoři je zakázáno jíst, pít a kouřit.
•
Studenti musí mít pláště, přezůvky a rukavice.
•
Nepovolené experimenty jsou přísně zakázány.
•
Udržujte laboratoř čistou a uklizenou.
•
Zkontrolujte přístroje. Pokud je jakýkoliv problém s přístroji, nepoužívejte ho a informujte školitele.
•
Nepracujte se zapnutým UV zářením.
•
Pokud při používání část vybavení selže, okamžitě informujte školitele. Nikdy se nepokoušejte vyřešit problém sami, protože byste mohli zranit nejen sebe ale i ostatní.
•
Před odchodem z laboratoře po sobě ukliď pracovní plochu.
•
Před ochodem z laboratoře vypněte všechny elektrické přístroje a umyjte si ruce.
•
Pokud máte nějaké pochyby, zeptejte se školitele.
•
Pozorně čtěte etikety.
•
Nikdy přímo nepřičichávejte k látkám. Přečtěte si etiketu (pro zjištění obsahu). Nikdy neochutnávejte chemikálie!
•
Zjistěte, kde je v laboratoři umístěn hasicí přístroj a zdroj vody a jak je používat.
•
Zaměstnanci a studenti jsou povinni manipulovat jedovatými, těkavými a páchnoucími látkami výhradně v digestoři.
•
Používané chemikálie a reagencie vracejte vždy na místo, odkud jste je vzali.
•
Zvláštní opatrnosti je třeba dbát při manipulaci s otevřeným ohněm, hořlavinami, žíravinami a jedovatými látkami.
___________________________________________________________________________ •
Nehody nebo poranění hlaste ihned školiteli a v případě potřeby poskytněte okamžitě první pomoc.
•
Reagenční roztoky se odlévají z reagenčních lahví na straně odvrácené od signatury tak, aby se nepoškodil štítek na láhvi. Nečitelný nápis a s tím spojená případná záměna může mít nebezpečné následky.
•
Koncentrované kyseliny, zvláště kyselina sírová, se ředí vléváním kyseliny do vody. Kyselina se přilévá tenkým proudem a za stálého promíchávání roztoku skleněnou tyčinkou.
•
S látkami dráždivými, páchnoucími a jedovatými (např. chlor, chloroform, sirouhlík, aj.) a s látkami snadno vznětlivými (např. benzin, aceton, aj.) se musí pracovat v dobře odsávané a zapojené digestoři.
•
Toxický i netoxický odpad vyhazujte do nádob k tomu určených!
•
Všichni, kteří v laboratoři pracují, budou respektovat výše uvedená pravidla a budou se řádně zapisovat do prezenční knihy.
___________________________________________________________________________
2 Příprava roztoků Následující roztoky budou využity ve většině protokolů na cvičeních. Tudíž je důležité mít je připravené před začátkem práce na protokolech samotných. Obvykle již bývají v laboratoři připravené, pokud je to ale nutné, můžete si je snadno připravit samy. 1. ELEKTROFORÉZA Zásobní roztok 10x TBE1 pufr (2000 ml) 10x TBE pufr připravíte rozpuštěním 216 g Tris base v destilované vodě a přidáním 110 g kyseliny borité a 18,6 g EDTA2. Roztok přelijte do odměrného válce a doplňte destilovanou vodou do objemu 2000 ml. Upravte pH na 8,3. ! Láhev s roztokem musí být popsaná jménem roztoku, datem a koncentrací roztoku. ! Roztok neskladujte déle než 1 měsíc. Pracovní roztok 1x TBE pufr (1000 ml) Zředění 10x TBE → 1x TBE pufr Zřeďte 100 ml zásobního roztoku 10x TBE pufru v 900 ml destilované vodě (dH20). Jako alternativa k přípravě zásobního roztoku TBE v laboratoři může sloužit použití komerčního zásobního roztoku Rotiphorese ® Pufr 10 x TBE (Carl Roth, Germany). Pro přípravu 1x TBE je třeba zředit 100 ml 10x TBE v 900 ml dH2O.
1 2
TBE = Tris-borát-EDTA pufr EDTA = kyselina ethylendiamintetraoctová
___________________________________________________________________________ 2. IZOLACE DNA POMOCÍ CTAB 1 M TRIS (200 ml) Rozpusťte 24,2 g TRISu v 100 ml dH20 (v 250 ml kádince na míchačce). Přelijte do odměrného válce a doplňte dH20 na objem 200 ml. Upravte pH pomocí HCl na 8,0. Vysterilizujte roztok v autoklávu 20 minut při 120°C. Skladujte při pokojové teplotě. 0,5 EDTA (200 ml) Navažte 29,23 g EDTA, nasypte do 250 ml kádinky a přidejte 100 ml dH20. Míchadlem pečlivě zamíchejte a upravte na pH 8,0 přidáním 10 M roztoku NaOH (EDTA se rozpouští pouze při pH 8,0). Přelijte roztok do odměrného válce a doplňte dH20 do celkového objemu 200 ml. Vysterilizujte roztok v autoklávu 20 minut při 120°C. Skladujte při pokojové teplotě. 5 M NaCl (100 ml) 29,22 g NaCl rozpusťte ve 100 ml dH2O a pečlivě promíchejte (míchadlem). Roztok pufru TE (100 ml) Odpipetujte 1,0 ml 1 M TRIS (pH 8,0) do kádinky, přidejte 0,2 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) a 98,8 ml dH2O 98,8. Pečlivě promíchejte. Nesterilizuje se! Extrakční pufr CTAB
Zásobní roztok
100 ml
500 ml
1000 ml
1,4 M NaCl
5,0 M
28 ml
140 ml
280 ml
20 mM EDTA
0,5 M
4 ml
20 ml
40 ml
100 mM Tris
1,0 M
10 ml
50 ml
100 ml
6,00%
50 ml
250 ml
500 ml
8 ml
40 ml
80 ml
pH 8,0 3% w/v CTAB dH2O Nesterilizuje se!
___________________________________________________________________________
3 Metody izolace DNA Obě metody izolace DNA byly optimalizovány pro specifické vlastnosti jakonu (Smallanthus sonchifolius (Poepp. & Endl.) H. Robinson) a je jeho třech planých příbuzných (Polymnia canadensis, S. uvedalius and S. connatus). Tyto modifikace standardních postupů zajišťují vysoký výnos čisté DNA, bez přítomnosti sekundárních metabolitů (např. polyfenolů), které by mohly představovat problém v následných analýzách.
3.1
Izolace DNA pomocí Invisorb® Spin Plant Mini Kit (Invitek Company, Německo)
Materiál a přístroje Čerstvé listy jakonu, sterilní rukavice, sterilní mikrozkumavky, termoblok, sterilní špičky, pipety, elektrický zdroj, kolonky (Prefilter, Spin Filter), 2,0 ml sběrné zkumavky (Receiver Tubes), centrifuga,vortex, třecí miska s tloučkem, špachtle, analytické váhy, nádoba na tekutý dusík. Chemikálie Lyzační pufr (Lysis Buffer P), proteináza K (Proteinase K), promývací pufry (Wash Buffer I, Wash Buffer II), eluční pufr (Elution Buffer D), vázací purf (Binding Buffer P), tekutý dusík, čistý etanol, ddH2O. PRACOVNÍ POSTUP Nejprve musí být rozpuštěna Proteináza K, protože je prodávána lyofilizovaná. Přidejte do zkumavky k Proteináze K 1 ml ddH2O a důkladně zamíchejte. Rozpuštěná Proteináza K se musí skladovat při -20°C!! Promývací pufr I (Wash Buffer I) se musí naředit 30 ml čistého etanolu. Promývací pufr II (Wash Buffer II) se musí naředit 42 ml čistého etanolu. Na lahvičkách obou pufrů zašktněte čtvereček značící přidání etanolu a napište datum. Potřebné množství elučního pufru (Elution Buffer D) se musí předehřát na 65°C.
___________________________________________________________________________ • Homogenizace materiálu Homogenizujte okolo 1 cm2 (vstupní množství může být větší, záleží na
•
dostupnosti rostlinného materiálu) čerstvých listů tloučkem v třecí misce za použití tekutého dusíku dokud nebudete mít jemný prášek. •
Převeďte 60-120 mg homogenizovaného materiálu do 1,0 ml mikrozkumavky (vychlazené v tekutém dusíku).(Navažte 120-180 mg rostlinného materiálu, pokud obsahuje hodně vody).
•
Mikrozkumavky s rostlinným materiálem vložte okamžitě do nádoby s tekutým dusíkem.
•
Do tekutého dusíku namočte rovněž sterilní špachtli.
• Lýza materiálu •
Vložte homogenizovaný rostlinný materiál do 1,5 ml zkumavky.
•
Přidejte 400 µl lyzačního pufru (Lysis Buffer P) a 20 µl proteinázy K (Proteinase K) a lehce promíchejte.
•
Nechte inkubovat 30 minut (nebo déle) při 65°C (je doporučeno inkubovat v termobloku za stálého míchání). Během inkubace si připravte kolonky (Prefilter) do 2,0 ml sběrných zkumavek (Receiver Tube).
• Filtrace •
Přeneste lyzační směs na kolonku a centrifugujte 1 minutu při 12 000 rpm.
•
Vyhoďte kolonky.
•
Přidejte 200 µl vázacího pufru P (Binding Buffer P) a důkladně promíchejte.
• Navázání DNA •
Umístěte novou kolonku (Spin Filter) do 2,0 ml sběrných zkumavek, přeneste suspenzi na kolonku a inkubujte 1 minutu při pokojové teplotě.
•
Centrifugujte 1 minutu při 12 000 rpm, odstraňte filtrát a umístěte kolonky znovu do 2,0 ml sběrných zkumavek.
___________________________________________________________________________ • Promytí I •
Přidejte 550 µl promývacího pufru (Wash Buffer I) a centrifugujte 1 minutu při 12 000 rpm.
•
Odstraňte filtrát a kolonku umístěte zpět do 2,0 ml sběrné zkumavky.
• Promytí II •
Přidejte 550 µl promývacího pufru (Wash Buffer II) a centrifugujte 1 minutu při 12 000 rpm.
•
Odstraňte filtrát a umístěte kolonku zpět do 2,0 ml sběrné zkumavky.
•
Tento krok opakujte ještě jednou.
•
Nakonec odstraňte filtrát a centrifugujte 2 minuty při 12 000 rpm, abyste odstranili zbytky etanolu.
• Eluce DNA •
Umístěte kolonku do nové 1,5 ml sběrné zkumavky a přidejte 100 µl předehřátého elučního pufru (Elution Buffer D3 ).
3
•
Inkubujte 3 minuty (až 10-25 minut) při pokojové teplotě.
•
Centrifugujte 1 minutu při 10 000 rpm.
•
Vyhoďte kolonku a získanou DNA skladujte při -20°C.
DNA může být také rozpuštěna v menším nebo větším objemu elučního pufru D (závisí
na očekávaném výnosu genomické DNA). Dávejte ale pozor, minimální objem pro eluci je 50 μl. Pokud očekáváte velké množství DNA, objem eluce může být zvýšen na 100-200 μl.
___________________________________________________________________________
3.2
Izolace DNA pomocí metody CTAB
Materiál a přístroje Listy jakonu v silikagelu, sterilní rukavice, sterilní mikrozkumavky, sterilní homogenizátor, sterilní špičky, pipety, termoblok, multivortex, analytické váhy, centrifuga, elektrický zdroj, tekutý dusík, nádoba na tekutý dusík. Chemikálie CTAB (pH 9), chloroform/IAA4 (24:1), isopropanol, 70% etanol, tekutý dusík. Než začnete •
Dejte isopropanol a 70% etanol do mrazáku a chloroform/IAA (24:1) do lednice!
•
Předehřejte si vodní lázeň nebo inkubátor na 65°C.
PRACOVNÍ POSTUP •
Navažte ±100 mg rostlinného materiálu a umístěte jej do mikrozkumavky a dejte ihned do tekutého dusíku.
•
Namražte v tekutém dusíku homogenizátor (stačí konec, kterým se bude homogenizovat).
•
Homogenizujte rostlinný materiál v mikrozkumavce s použitím homogenizátoru.
•
Přidejte 400 µl extrakčního pufru CTAB (pH 9) a lehce míchejte 2 minuty.
•
Inkubujte na termobloku při 65°C po dobu cca 30-60 minut, občas lehce promíchejte.
•
Vychlaďte centrifugu na 4°C a mikrozkumavky nechte zchladnout na pokojovou teplotu.
•
Přidejte 150 µl vychlazeného roztoku chloroform/IAA (24:1) a zamíchejte. Pracujte v digestoři!
4
•
Míchejte 10 minut (lehce míchejte na multivortexu).
•
Centrifugujte 5,5 minuty při 4°C při maximální rychlosti.
•
Připravte si nové mikrozkumavky a popište je. IAA = Isoamylalkohol (3-Methyl-1-butanol)
___________________________________________________________________________ • Odpipetujte 150 µl supernatantu do nových a popsaných mikrozkumavek, přidejte 150 µl ledového isopropanolu (pracujte v digestoři) a dobře promíchejte. Vložte na 5 minut do mrazáku. •
Centrifugujte 5 minut při maximální rychlosti.
•
Odpipetujte supernatant (např. do kádinky) a přidejte do zkumavek 200 µl 70% etanolu.
•
Centrifugujte 1 minutu při nejvyšších otáčkách.
•
Odpipetujte supernatant a nechte vysušit DNA pelety (pelety změní barvu z bílé na transparentní) – cca ±10-15 minut.
•
Rozpusťte pelety ve 100 µl destilované H20 (přes noc při 4°C nebo 15 minut při 65°C) nebo v TE pufru při 65°C.
ČIŠTĚNÍ DNA Chemikálie: 3M octan sodný, 100 % a 70 % etanol, destilovaná voda Do 1,5 ml mikro zkumavky přidejte 20 μl DNA a 2 μl octanu sodného (3M). Přidejte 50 μl 100 % ethanolu a promíchejte. Dejte na 30 minut do -80°C. Centrifugujte 10 minut při 13 000 otáčkách. Vylejte supernatant, přidejte 500 μl 70% ethanol a promíchejte. Centrifugujte. Vylejte supernatant, vysušte DNA pelet (okolo 15 min) a rozpusťte v destilované H2O.
___________________________________________________________________________
4 ISSR analýza Materiál a přístroje Sterilní rukavice, sterilní mikrozkumavky, termocykler, sterilní špičky, analytické váhy, Erlenmayerova
baňka,
pipety,
elektroforéza,
elektrický
zdroj,
mikrovlnná
trouba,
transiluminátor. Chemikálie DNA jakonu (2-5 ng/μl), PPP Master Mix s přidaným barvivem (Top Bio Czech Republic), H2O (sterilní, bez nukleáz, destilovaná), BSA5, ISSR primery (Tabulka 3, primery s nejlepšími výsledky), agarosa, 1x TBE pufr, SYBR Safe®, DNA žebřík (DNA Ladder 100 bp). Tabulka 3: Seznam použitých ISSR primerů (The University of British Columbia Biotechnology Laboratory, Kanada). Primer Sekvence Teplota nasedání UBC 810
(GA)8T
52°C
UBC 814
(CT)8A
51°C
UBC 826
(AC)8C
54°C
UBC 834
(AG)8YT
51°C
UBC 835
(AG)8YC
48°C
UBC 841
(GA)8YC
48°C
UBC 856
(AC)8YA
52°C
Než začnete •
Připravte si ISSR primery na koncentraci 10nmol: zřeďte 10 μl ISSR primeru (zásobní roztok) v 90 μl dH2O.
5
BSA = bovine serum albumine = Hovězí sérový albumin
___________________________________________________________________________ PRACOVNÍ POSTUP 1. PCR (výsledný objem 20 μl/jedna reakce) •
Rozpusťte při pokojové teplotě chemikálie, včetně DNA (nebo rukou nebo v termobloku).
•
Před použitím krátce zcentrifugujte
•
Popište každou mikrozkumavku jménem vzorku (případně i jménem majitele).
•
Jestli budete používat více jak jeden vzorek, připravte si zvlášť premix (bez DNA). Podle počtu vzorků (pro každých 10 vzorků se přidá 1 reakce jako rezerva).
•
Objem 1 reakce: 7,3 μl H2O 10 μl MasterMix (2x koncentrovaný) 0,5 μl vybraného primeru 0,2 μl BSA
•
Premix krátce promíchejte a centrifugujte. Rozpipetujte 18 μl premixu do každé mikrozkumavky (0,2 ml).
•
Přidejte do mikrozkumavek 2 μl vzorku DNA, krátce promíchejte a centrifugujte (pro odstranění bublin ve směsi).
•
Vložte je do termocykleru a spusťte program pro ISSR primery: 1) Denaturace
94°C / 5 min
2) 40x opakování
94°C / 1 min specifická teplota podle vybraného primeru / 1 min 72°C / 2 min
3) Finální extenze
72°C / 10 min
4) Uchovávání
4°C / napořád
___________________________________________________________________________ 2. Příprava 2% agarózového gelu pro elektroforézu •
Na analytických vahách odvažte 2 g agarosy a vsypte do Erlenmeyerovy baňky.
•
Přidejte do baňky 100 ml 1x TBE pufru.
•
Krouživým pohybem obsah baňky zamíchejte, vložte do mikrovlnné trouby a zahřívejte, dokud směs není kompletně tekutá a transparentní (bez kousků agarosy).
•
Pečlivě si připravte formu na gel s hřebínkem.
•
Zchladťe opatrně Erlenmeyerovu baňku i s obsahem pod tekoucí vodou (musí být možné dotknout se baňkou předloktí), aby se neroztavila forma na gel.
•
Přidejte do baňky s agarosou 1µl SYBR Safe® a dobře zamíchejte (v případě potřeby můžete použít ethidiumbromid, DyeRed…).
•
Opatrně vlijte obsah baňky do formy na gel.
•
Jakmile gel ztuhne (po 15-20 minutách), vytáhněte opatrně hřeben a gel vložte do elektroforetické vany elektroforézy. Pokud je to potřeba, přidejte 1x TBE pufr do elektroforézy (gel musí být celý ponořen).
3. Elektroforéza •
První zdířku nechte prázdnou a od druhé nanášejte vzorky produktu PCR (5 μl).
•
Při pipetování vzorků dávejte pozor na protržení gelu špičkou pipety.
•
Do první a poslední zdířky napipetujte 2 μl DNA žebříku (ladder).
•
Vanu elektroforézy zakryjte víkem a připojte kabely. VŽDY DÁVEJTE POZOR NA POZICI KONTAKTŮ (červený – černý).
•
Nastavte elektrický zdroj na 55 V a 110 mA.
•
Pokud je vše zkontrolováno a dobře zapojeno, zdroj může být zapnut.
•
Bublinky vycházející z drátu ponořeného v pufru v elektroforéze signalizují, že elektroforéza je správně zapojena.
•
Po třech hodinách vypněte elektrický zdroj (jako kontrola slouží pozice první frakce barviva přidaného v Master mixu, která by měla být blízko konce gelu).
•
Nejdříve zapněte bílé světlo a správně umístěte gel v transiluminátoru. Poté nahraďte bílé světlo UV zářením a gel vyfotografujte.
___________________________________________________________________________
5 AFLP analýza Chemikálie: DNA jakonu (100-500 ng) – pokud možno co nejkoncentrovanější, všechny vzorky naředit na stejnou koncentraci AFLP® Core Reagent Kit (Invitrogen™, Life Technologies Česká republika s.r.o.) (složení kitu v Tabulce 1), AFLP® Pre-amp Primer Mix I (Invitrogen, Life Technologies Česká republika s.r.o.), TE pufr, sterilní dH2O, RedTaq polymeráza (Sigma Aldrich, Česká republika), MseI primer (5 pmol/µl), EcoRI primer (1 pmol/µl) (Tabulka 2), dNTPs, agaróza, 1x TBE pufr, Ethidium bromid, DNA žebřík (DNA Ladder 100bp), nanášecí barva (Loading Dye). Tabulka 1: Složení kitu AFLP® Core Reagent Kit
___________________________________________________________________________ Tabulka 2: Seznam AFLP primerů (Integrated DNA Technologies, USA). Název primeru
Sekvence (5’ – 3’)
MseI – AAA MseI – AAT MseI – AAG MseI – CAA MseI – CAC MseI - CAG MseI – CAT MseI – CTA MseI – CTC MseI – CTG MseI - CTT
GATGAGTCCTGAGTAAAAA GATGAGTCCTGAGTAAAAT GATGAGTCCTGAGTAAAAG GATGAGTCCTGAGTAACAA GATGAGTCCTGAGTAACAC GATGAGTCCTGAGTAACAG GATGAGTCCTGAGTAACAT GATGAGTCCTGAGTAACTA GATGAGTCCTGAGTAACTC GATGAGTCCTGAGTAACTG GATGAGTCCTGAGTAACTT
EcoRI
GACTGCGTACCAATTCACG
Materiál a přístroje sterilní rukavice, mikrozkumavky, pipety, termocykler, termoblok, sterilní špičky, analytické váhy, odměrný válec, elektroforéza, centrifuga, vortex, elektrický zdroj, nádoba na led, led, transiluminátor Než začnete •
Navlékněte si sterilní rukavice.
•
Všechny chemikálie, včetně DNA jsou skladovány při -20°C. Vyndejte je z mrazničky a nechte roztát při pokojové teplotě. (Pokud spěcháte, můžete je ohřát rukou nebo v inkubátoru. Všechny ampulky a zkumavky by měly být před použitím lehce zcentrifugovány). !!Enzymy musí být vyjmuty z mrazáku těsně před použitím!!
•
Než chemikálie roztají, připravte si sterilní PCR mikrozkumavky. Manipulujte s nimi pouze ve sterilních rukavicích.
•
Popište každou mikrozkumavku jménem vzorku, případně jménem majitele.
___________________________________________________________________________ PRACOVNÍ POSTUP A. Restrikce •
Využijte část kitu AFLP® Core Reagent Kit I a připravte si premix. Obvykle se na 10 vzorků přidává 1 rekce jako rezerva (tj. na 10 vzorků bude objem každé chemikálie vynásoben 11).
•
Výsledný objem jedné reakce bude 25 μl, takže na jednu reakci bude potřeba: 100-500 ng vzorku DNA (max. objem 18 µl) 5 μl reakčního pufru 2 μl mix enzymů EcoRI/Mse I Sterilní H2O na doplnění výsledného objemu
•
Zamíchejte premix, centrifugujte a rozpipetujte do 0,2 ml mikrozkumavek.
•
Přidejte vzorek DNA, lehce promíchejte a krátce centrifugujte (abychom se vyhnuli bublinám).
•
Vložte do termocykleru a spusťe program: 1) Štěpení
37°C / 2 hours
2) Inaktivace enzymů
70°C / 15 min
!!Dejte okamžitě na led!! B. Ligace adaptorů •
Využijte část kitu AFLP® Core Reagent Kit I a připravte premix (znovu přidat na 10 vzorků 1 rekci jako rezervu). Pro jeden vzorek (25 µl) bude potřeba: 24 µl roztok Adapter/Ligation 1 µ T4 DNA Ligáza
•
Promíchejte směs a krátce centrifugujte (abychom se vyhnuli bublinám).
•
Přidejte 25 µl směsi do vzorků po restrikci z předchozího kroku (část A. Restrikce), takže výsledný objem reakce bude 50µl. Použijte čistou špičku pro každý vzorek!!
•
Vložte mikrozkumavky do termocykleru a spusťte program pro Ligaci: 1) Ligace adaptorů na 2 hodiny při 20°C.
•
Po inkubaci by mělo být provedeno ředění 1:10, takže napipetujte 10 µl produktu po restrikci/ligaci (R/L) a zřeďte v 90 µl TE pufru. Tuto směs můžete uchovávat při 20°C.
___________________________________________________________________________ • Úspěšnost restrikce/ligace otestujeme na gelu. Připravte 1.8 % agarosový gel (1x TBE pufru obarvený ethidiumbromidem, kvůli jeho lepší rozlišovací schopnosti) a naneste do zdířek okolo 3 µl produktu obarvených 1,5µl nanášecího barviva. Napipetujte 2 µl DNA žebříku do prvního volného slotu. Po 30 minutách by měl být vidět na gelu „smear“ restrikčních fragmentů – jasné znamení, že DNA byla restrikčními enzymy dobře naštípána. C. Preselektivní amplifikace •
Použijte kit AFLP® Pre-amp Primer Mix I a DNA polymerázu (RedTaq Polymerase, Sigma Aldrich, Česká republika).
•
Připravte premix. Jedna reakce bude mít výsledný objem 51 µl: Pre-amp primer mix
40 µl
10x reakční pufr
5 µl
RedTaq DNA Polymeráza
1 µl
•
Přidejte 5 µl zředěného R/L produktu.
•
Směs promíchejte, rozpipetujte a krátce centrifugujte (pro vyhnutí se bublin ve směsi).
•
Vložte do termocykleru a spusťte program pro preselektivní amplifikaci: 1) 1x Denaturace
94°C / 2 min
2) 20x cyklus:
94°C / 1 min 56°C / 30 sec 72°C / 2 min
•
3) Finální extenze
72°C / 10 min
4) Uchovávání
4°C / napořád
Úspěšnost preselektivní amplifikace otestujeme na agarózovém gelu stejně jako v části B. Výsledkem by měl být znovu “smear”, nicméně tentokrát s několika viditelnými bandy (produkty pre-amplifikační PCR reakce).
•
Nařeďte produkt 1:50 v TE pufru (3 µl produktu + 147µl TE pufru) a krátce promíchejte.
•
Směs může být uchovávána při -20°C.
___________________________________________________________________________ D. Selektivní amplifikace •
Finální objem jedné reakce bude 98 µl. Prosím uvědomte si, že postupujeme dle doporučeného protokolu, v optimální situaci by se pracovalo v desetkrát menších objemech z důvodu úspory materiálu.
•
Pro jednu reakci budeme potřebovat: 10x Reakční pufr
10 µl
Sterilní voda
51 µl
MseI primer (5 pmol/µl)
5 µl
EcoRI primer (1 pmol/µl)
5 µl
dNTPs
2 µl
RedTaq Polymeráza
2 µl
!!Nezapomeňte mít polymerázu v mrazáku do poslední chvíle před použitím!! •
Přidejte 23 µl zředěného Pre-Amp produktu
•
Vložte mikrozkumavky do do termocykleru a spusťte program pro selektivní amplifikaci: 1) 1x
94°C / 2 min 65°C / 30 sec 72°C / 2 min
2) 8x Touch down:
94°C / 1 min 64°C / 30 sec (každý cyklus klesá o 1°C) 72°C / 1 min
3) 23x cyklus:
94°C / 1 min 56°C / 30 sec 72°C / 3 min
•
3) Final extension
60°C / 30 min
4) Uchovávání
4°C / forever
Produkt selektivní amplifikace je vyzualizován s použitím automatického sekvenátoru. Vzorky by měly být přesrážené pomocí formamidu, nebo ponechány, jak jsou, a poslány do sekvenační laboratoře.
___________________________________________________________________________ • V sekvenční laboratoři je k produktu přidán fluorescenčně značený žebřík (např. GeneScan-ROX-500). Slouží jako vnitřní standard ke každému vzorku, aby bylo později možné určit délku každého AFLP fragmentu a srovnat ji s délkou fragmentů v jakémkoliv jiném běhu sekvenátoru.
___________________________________________________________________________
6 Metoda zpracování výsledků pomocí specializovaného softwaru Pro zpracování výsledků byl použit uživatelsky příjemný a nenáročný program Darwin 5.0 (Perrier X. and Jacquemoud-Collet, 2006). Obě metody produkují dominantní markery, takže nejlepší způsob hodnocení je skórování přítomnosti (1) nebo nepřítomnosti (0) bandu. Ze všech dat je vytvořena binární matice, která je přeměněna na .txt formát vyžadovaného programem Darwin 5.0. Otevřete program Darwin 5.0 •
Soubor (File)→ Importovat data matice (Import data matrix)
•
Jednoduchá data (Single data) → Uložit data jako… (Save Data as…)
•
Soubor bude uložen pod stejným jménem jako vstupní soubor, ale ve formátu .var
•
Vyberte Odlišnost (“Dissimilarity“) → Spočítej z jednoduchých dat (“Calculate From Single Data“)→ Nahrát soubor .var
•
Ulož odlišnost jako (“Save dissimilarity as…“) → soubor bude uložen ve formátu .dis
•
Změňte počet jednotek (vynechte první dvě čísla).
___________________________________________________________________________ • Vyberte koeficient “Dice” nebo “Jaccard” (záleží, jestli chcete výstup ve formě odlišnosti nebo podobnosti) → OK
•
Vyberte Stavba stromu (“Tree construction“)→ Shluková metoda (“Neighbour Joining“)
•
Nahrajte soubor .dis → Uložte soubor (“Save tree as…“) → soubor bude uložen jako .arb
•
Zaškrtněte “UnWeighted Neighbour-Joining”
•
Vyberte Identifikátory → Nahrát soubor .don (byl vytvořen automaticky)
•
Zaškrtněte Zobrazit po dokončení (“Display when done“) → OK
___________________________________________________________________________
Nyní mate jako výsledek Neighbour Joining Tree. Použitím horních ikon můžete změnit jednak zobrazení stromu (“Tree representation“), tak i přidat identifikátory (“Identification and illustration”).
Tree representation
Identification and illustration
___________________________________________________________________________
Poznámky
