LABORATORNÍ CVIČENÍ Z MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE

Katedra biochemie Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého

LABORATORNÍ CVIČENÍ Z MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE

Mária Šmehilová Lenka Dzurová Ivo Frébort a Petr Galuszka

Olomouc 2014 34

(technická tiráž) Mgr. Mária Šmehilová, Ph.D. RNDr. Lenka Dzurová, Ph.D. prof. RNDr. Ivo Frébort, CSc., Ph.D. doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D.

Laboratorní cvičení z molekulární biologie Výkonný redaktor prof. RNDr. Zdeněk Dvořák, DrSc. et Ph.D. Odpovědná redaktorka Vendula Drozdová Technická redakce Návrh a grafické zpracování obálky Jiří Jurečka Vydala a vytiskla Univerzita Palackého v Olomouci Křížkovského 8, 771 47 Olomouc www.vydavatelstvi.upol.cz www.e-shop.upol.cz [email protected] 1. vydání Olomouc 2014 Ediční řada – Skripta ISBN 978-80-244-4039-2 Neprodejná publikace

č.z. 2014/180

(rub titulky) Oponenti: doc. Mgr. Martin Modrianský, Ph.D. Mgr. Jan Lochman, Ph.D.

Logo/projekt

1. vydání © Mária Šmehilová, Lenka Dzurová, Ivo Frébort, Petr Galuszka, 2014 © Univerzita Palackého v Olomouci, 2014 Neoprávněné užití tohoto díla je porušením autorských práv a může zakládat občanskoprávní, správněprávní, popř. trestněprávní odpovědnost. ISBN 978-80-244-4039-2

2

Předmluva Skripta byla vytvořena pro laboratorní cvičení z molekulární biologie, které je určeno studentům navazujícího studijního oboru biochemie. Je proto předpokladem, že studenti jsou již teoreticky obeznámeni s metodami molekulární biologie v rámci přednášek předcházejících tomuto cvičení. Skripta představují soubor základních experimentálních technik molekulární biologie, přičemž se jedná o cvičení velice pokročilé a náročné. V rámci cvičení se studenti naučí ovládat postupy v dnešní době široce používané v celé řadě různě orientovaných diagnostických laboratoří. Není proto pochyb, že toto cvičení tak přispěje ke zlepšení konkurenceschopnosti budoucích absolventů oboru biochemie nejen na trhu práce ale i při jejich potenciální další vědecké kariéře. Autoři skript se při sestavování úloh zaměřili na různorodost představovaných metod, které dohromady tvoří základní výbavu každého molekulárního biologa. Skripta studentům nabízí pět atraktivních úloh, kde aplikace vysvětlované metody vede k vyřešení konkrétního úkolu. Pro ilustraci, v úloze č. 3 se studenti naučí izolovat genomovou DNA z potravin, kterou pak následně ověří v PCR a díky tomu potvrdí nebo vyvrátí, zda-li se jedná o potravinu vyrobenou z produktů s obsahem geneticky modifikovaných organismů (GMO). Stejnou metodu lze aplikovat například na průkaz patogenů v zemědělských plodinách, potvrzení infekčního agens v krvi pacienta nebo identifikaci pachatele. Prioritou kolektivu autorů skript bylo zpracovat dané metody do co nejaktuálnější podoby a to proto, že molekulární biologie je oborem relativně mladým a rychle se vyvíjejícím. Studenti se tak například díky úloze č. 5 mají možnost naučit kvantifikovat DNA v reálném čase pomocí Real-time PCR na speciálním termocykléru s detektorem fluorescence, přičemž právě tato metoda přinesla obrovský progres v analýze nukleových kyselin. Na závěr každé úlohy jsou studentům nabídnuty otázky k zamyšlení a prohloubení získaných znalostí. Techniky molekulární biologie jsou v porovnání s jinými analytickými metodami zábavné, zkoumavé a tvořivé a my bychom chtěli studentům popřát hodně entusiasmu a podpořit jejich vlastní invenci neboť právě toto jsou hnadla pokroku.

V Olomouci 2014

Autoři:

Mgr. Mária Šmehilová, Ph.D. RNDr. Lenka Dzurová, Ph.D. Doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D. Prof. RNDr. Ivo Frébort, CSc., Ph.D.

3

Obsah Předmluva .......................................................................................................... 3 Obsah ................................................................................................................. 4 Pokyny pro práci v molekulárně biologické laboratoři ...................................... 5 Pokyny pro práci s GMO .................................................................................... 6 Laboratorní úloha č. 1........................................................................................ 9 Mikroizolace plasmidové DNA z Escherichia coli a její restrikční analýza Laboratorní úloha č. 2...................................................................................... 20 Detekce geneticky modifikovaných organismů v potravinách pomocí PCR Laboratorní úloha č. 3...................................................................................... 26 Genetická transformace kvasinek a ověření exprese pomocí měření aktivity rekombinantního enzymu Laboratorní úloha č. 4...................................................................................... 34 PCR screening vybraných genů z lambda FIX II genomové knihovny ječmene Laboratorní úloha č. 5...................................................................................... 42 Izolace RNA z rostlin a následná kvantitativní RT-PCR vybraných genů Vysvětlivky ...................................................................................................... 52 Přílohy ............................................................................................................. 53

4

Pokyny pro práci v molekulárně biologické laboratoři 1)

Během práce v laboratoři molekulární biologie musí být zavřená veškerá okna a dveře.

2)

Osoba pracující v laboratoři musí být oblečená v pracovním plášti či jiném laboratorním oblečení. Pokud to situace vyžaduje, musí mít rukavice a ochranné brýle.

3)

V laboratoři je přísně zakázána konzumace jídel, pití, kouření, šňupání tabáku, aplikace kosmetických přípravků a skladování pití, jídel a tabákových výrobků.

4)

Je zakázáno pipetovat ústy a doporučuje se používat především mechanické typy pipet.

5)

Minimalizujte vznik aerosolu.

6)

Po ukončení práce si vždy umyjte ruce.

7)

Udržujte laboratoř uklizenou a čistou. Na pracovním stole mějte jen materiál a pomůcky nutné k práci. Zásoby materiálu skladujte ve zvláštní místnosti.

8)

Na práci se sterilním materiálem používejte vždy zapnutý laminární box. Po skončení práce ve v laminárním boxu flowboxu pusťte UV lampu.

9)

Veškerou práci s karcinogenním ethidium bromidem provádějte ve vyhrazené místnosti či prostoru a chraňte se nitrilovými rukavicemi.

10) Při práci s RNA používejte vždy rukavice a speciálně označený materiál a pomůcky „RNase Free“. Takto označených věcí se nedotýkejte holýma rukama. 11) Používané chemikálie a reagencie vracejte vždy na místo odkud jste je vzali. 12) Veškeré sklo umývejte jarovou vodou a poté oplachujte v destilované vodě.

5

Pokyny pro práci s GMO 1) opatření pro případ havárie a požáru, včetně havarijního plánu V případě požáru předměty zasažené požárem je možno považovat za zbavené geneticky modifikovaných organismů. Po uhašení požáru osoby zodpovědné za likvidaci havárie týkající se GMO vyhledají na pracovišti pouze částečně poškozené kultury GMO a ty pak posléze schválenými postupy inaktivují. V případě vynášení předmětů mimo budovu vedoucí katedry rozhodne, které předměty nebudou vynášeny, pokud by mohly být kontaminovány geneticky modifikovanými organismy. V ostatních bodech se likvidace požáru nebo havárie řídí požárním a havarijním řádem (umístěným v každé GMO laboratoři). 2) povinnosti pracovníků při práci (dodržování pracovních postupů, postupů sanitace prostorů a zařízení po ukončení pracovní činnosti, postupů dekontaminace nástrojů, osobních a ochranných prostředků a oděvů). Postup sanitace prostorů a zařízení a postup dekontaminace nástrojů při ukončení pracovní činnosti se řídí podle charakteru činnosti a určuje jej vedoucí katedry. Ochranné oděvy, kontaminované geneticky modifikovanými mikroorganismy, se budou prát jako infekční materiál. Totéž se vztahuje na ochranné pláště pro studenty poskytnuté přírodovědeckou fakultou. Samostatný sběr a oddělená, isolovaná přeprava do prádelny Olomouc adresa: Prádelnamandlovna, Sovová Martina, Neředínská 55, 779 00 Olomouc. Používané ochranné rukavice na jedno použití budou likvidovány s ostatním GMO odpadem. 3) systém a četnost kontrol prostoru, zařízení a ochranných opatření Kontroly budou prováděny proškolenými pracovníky paralelně s požární kontrolou s četností 4x ročně. Zápis o každé kontrole bude parafován vedoucím příslušné katedry. 4) povinnosti pracovníků při údržbě Pracovníci údržby jsou při údržbářských pracích v prostorách pro práci s GMO povinni dbát pokynů vedoucího katedry, v jejíchž prostorách údržbu provádějí. Pracovníci údržby jsou povinni při údržbářských pracích v prostorách pro práci s GMO používat pláště pro práci s rekombinantní DNA (se značkou Biohazard), které není možno používat mimo laboratoře pro GMO. 5) zásady hygieny a bezpečnosti práce v souladu s ustanovením zvláštních právních předpisů Pracovníci, včetně studentů, mají povinnost používat v prostorách pro práci s rekombinantní DNA pláště. 6) způsob nakládání s odpady a kontaminovanými materiály a předměty, zejména postupy zneškodnění geneticky modifikovaného organismu a způsob kontroly jejich účinnosti Geneticky modifikované rostliny jsou likvidovány autoklávováním ve speciálních plastových pytlích. Geneticky modifikované bakterie jsou likvidovány autoklávováním nebo desinfekčním roztokem (chlornan sodný, chloramin, Ajatin Incidur v koncentracích doporučených výrobcem).

6

7) seznam povinných pracovních pomůcek a prostředků osobní ochrany s uvedením činností, ke kterým musí být používány Ochranný plášť při práci v prostorech s GMO nesmí být používán mimo prostory určené pro práci s rekombinantní DNA. Jednorázové gumové rukavice jsou používány při práci s mikroorganismy a s elektroforézou DNA. 8) zakázané činnosti na pracovišti V laboratořích a prostorách pro geneticky modifikované rostliny je zakázáno jíst, pít a kouřit. 9) zásady vedení pracovních protokolů Každá činnost s GMO musí být denně zapisována do pracovního protokolu s vyznačením data zápisu. Každý pracovník si vede svůj pracovní protokol. 10) zásady vedení evidence o provozu zařízení, prováděné sanitaci a kontrolách zabezpečovacích prvků Ke každému nákladnému investičnímu přístroji patří sešit, do kterého se zapisuje pracovník, datum a hodiny využití přístroje. Tamtéž se zapisují záznamy o prováděné sanitaci a kontrolách zabezpečovacích prvků. 11) opatření k zabránění vstupu nepovolaných osob Laboratorní prostory jsou rozděleny na laboratorní komplexy a funkční jednotky pracující s GMO a jsou označeny. Součástí laboratorního komplexu je i kultivační místnost. Proškolení zaměstnanci umožní do prostor vstup pouze proškoleným studentům PřF UP, kteří v rámci studia v jednotce pracují. Kultivační místnosti a boxy jsou uzamčeny a na dveřích označeny značkou Biohazard. Pověření pracovníci do nich mají přístup pouze ve speciálních pláštích, označených značkou Biohazard, které jsou nošeny pouze v těchto prostorách. Pro běžné návštěvy jsou vyhrazeny klidové pracovny. 12) režim v laboratořích V laboratořích se pracuje jak s mikrobiálními kulturami, tak s kulturami rostlin, ošetřenými geneticky modifikovanými (GM) bakteriemi Agrobacterium. Plasmidy jsou udržovány v kmenech bakterie Escherichia coli nebo kvasinek Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris. K vědeckým účelům se experimentuje s transgenními GM bakteriemi, rostlinnými pletivy a dále se sterilně i nesterilně kultivovanými transgenními (GM) rostlinami. Proto je třeba zachovávat pravidla platná jak pro práci v mikrobiologických laboratořích, tak pro práci s transgenním rostlinným materiálem. Likvidace tekutých odpadů a GMO: Agarové a tekuté kultury je možno likvidovat až po autoklávování nebo jiném vhodném ošetření (např. u tekutých kultur po sterilizaci účinným desinfekčním prostředkem, např. roztokem chlornanu sodného, Incidur). Pevné odpady, obsahující GMO, jakož i nádoby a pomůcky, které přišly do kontaktu s GMO je nutno bezprostředně po manipulaci umístit do sterilizačních pytlů a poté inaktivovat v parním sterilizátoru. Odpadní vody, obsahující GMO je nutno vylévat do nádob s chloraminem či chlornanem sodným. V laboratořích není dovoleno jíst, pít a kouřit. V laboratořích kde se pracuje s GMO je nutno nosit plášť k této práci určený. Při práci s GMO budou používány ochranné rukavice.

7

13) režim v kultivačních místnostech V kultivačních místnostech se pracuje s mikrobiálními kulturami, rostlinnými pletivy a s kulturami rostlin, které obsahují vnesenou cizorodou DNA. Tyto rostliny jsou kultivovány ve sterilních i nesterilních podmínkách. Proto je třeba zachovávat pravidla, platná jak pro práci v mikrobiologických laboratořích, tak pro práci s transgenním rostlinným materiálem. Kultivační místnosti jsou označeny popisem „Zákaz vstupu nepovolaným osobám“. Vstup do těchto prostor je povolen jen v pracovním plášti. O likvidaci tekutých a pevných odpadů a odpadní vody platí totéž, co pro práci v laboratořích. Přeprava geneticky modifikovaných rostlin do laboratoří a z kultivační místnosti se provádí jen v uzavřených nádobách. 14) přepravování GMO materiálu mezi jednotlivými prostorami, určenými pro práci s GMO na pracovišti PřF UP v Olomouci Přeprava bakteriálních kultur: bakteriální kultury ve skleněných nádobách je nutno dopravovat v uzavřených kontejnerech. Přeprava rostlin kultivovaných v půdě a obsahujících semena, květy nebo části, schopné vegetativní reprodukce (výhony, oddenky, semena): Nutno dopravovat v uzavřených kontejnerech. Přeprava GMO mimo areál pracoviště PřF UP v Olomouci – Holice je možná jen v uzavřených kontejnerech. 15) ostatní zásady Se všemi transgenními rostlinami zacházet jako s potencionálně nebezpečným transgenním materiálem až do té doby, než se bezpečně prokáže, že jím nejsou. Pokud jsou rostlinná pletiva, pěstována in vitro v suspenzích nebo agarových kulturách, kultivována společně s bakteriemi A. tumefaciens nebo obsahující bakterie, je třeba s nimi zacházet jako s bakteriálním materiálem. Musí se proto autoklávovat veškeré sklo a nástroje, které přišly do styku s tímto materiálem. Pracovníci by se měli převlékat, uchovávat protokoly po dobu 10-ti let, předběžně schvalovat pokusy a znát havarijní plán. Pokusy musí být řádně označeny a musí být zabráněno vstupu nepovolaným a neinformovaným osobám.

8

Laboratorní úloha č. 1 Mikroizolace plasmidové DNA z Escherichia coli a její restrikční analýza Cíl laboratorní úlohy Naučit se izolovat plasmidovou DNA, naučit se pracovat s DNA in silico za pomocí dostupného softwaru, naplánovat, nastavit a vyhodnotit restrikční analýzu plasmidové DNA. Očekávaný výsledek Identifikace plasmidu a genu v neznámém bakteriálním kmeni. Teoretický úvod Bakterie Escherichia coli stejně jako ostatní prokaryota obsahují kromě velké jaderné genomové DNA (milióny nukleotidů) ještě menší kruhové DNA nazývané plasmidy. Ty jsou mnohem menší, řádově tisíce nukleotidů a jejich uměle syntetizované napodobeniny se často využívají při klonování a genetických manipulacích. Při těchto manipulacích je často potřeba narušit kruhovou strukturu plasmidů tak, aby bylo možné do plasmidu integrovat další fragment DNA – nejčastěji gen z jiného organismu. Pro linearizaci plasmidů a obecně štípání uvnitř molekul DNA se využívá tzv. restrikčních enzymů neboli endonukleas. Ty jsou schopny štěpit na určitých pozicích DNA a to specificky, rozpoznávaje krátkou sekvenci po sobě jdoucích nukleotidů označovaných jako palindrom. Restrikčních endonukleas přitom existuje celá řada, pochází většinou z různých bakterií a každá z nich je specifická pro štípání jedinečné sekvence palindromu uvnitř DNA. Tyto enzymy jsou připravovány komerčně a označují se zkratkami a to kurzívou podle rodu a druhu původního organismu (bakterie), velkým písmenem podle kmene a římskou číslicí podle pořadí v organismu: např. EcoRI: Zkratka E co R I

Popis Escherichia coli RY13 první identifikovaný

Význam rod druh kmen pořadí identifikace

Restrikční endonukleasy se liší způsobem štípání dvouvláknové molekuly DNA a na základě toho je můžeme rozdělit do dvou skupin. První skupinu tvoří endonukleasy, které po štípání vytvářejí lepivé konce, což znamená, že jedno z vláken naštípané DNA je delší, přesahující přes druhé. Druhou skupinu pak tvoří endonukleasy, které vytvářejí tupé konce, kdy obě vlákna jsou naštípána na stejné pozici sekvence a konce jsou tedy stejně dlouhé, žádný nukleotid nepřesahuje dvouvláknovou DNA. Příklad vzniku lepivých konců:

EcoRI

GAATTC CTTAAG

po štípání

9

G CTTAA

AATTC G

Příklady restrikčních endonukleas:

BsaI GGTCTCnnnnn CCAGACnnnnn

EcoRI GAATTC CTTAAG

EcoRV GATATC CTATAG

HindIII AAGCTT TTCGAA

PstI CTGCAG GACGTC

SmaI

SphI

XbaI

CCCGGG GGGCCC

GCATGC CGTACG

TCTAGA AGATCT

Při separaci malých množství DNA a jejích fragmentů se dnes rutinně používá elektroforéza v agarosovém gelu, která se stala jednou ze základních technik molekulární biologie. Agarosa je součástí agaru, což je směs polysacharidů obsažených v některých mořských řasách. Vedle agarosy (rozvětvený polysacharid složený z D-galaktopyranosy a 3,6-dehydro-L-galaktopyranosy) obsahuje agar ještě rozvětvený polysacharid agaropektin. Vizualizace DNA se provádí většinou pomocí ethidium bromidu, který se interkaluje do zářezů ve šroubovici DNA a při ozáření UV světlem fluoreskuje. Již po několikaminutové inkubaci je pak možné detekovat DNA o množství od 5 ng. S výhodou se toto barvení používá i při izolacích specifických fragmentů DNA při klonování, protože vazba ethidium bromidu je reverzibilní. Jedná se ovšem o karcinogenní látku, a proto při práci s ní je nutné dodržovat zvýšená bezpečnostní opatření! Materiál a chemikálie 

LB-Amp médium (1% trypton, 0,5% kvasnicový extrakt, 1% NaCl, pH upraveno na 7,5 pomocí NaOH, autoklávováno, po ochlazení přidat ampicilin do výsledné koncentrace 100 g/ml). Uchovávat při +4°C.



Kultury E. coli obsahující plasmidy s Ampr genem (resistence vůči ampicilinu) rozpěstované na pevném LB-Amp médiu (Petriho misce)



Roztok P1 (50 mM Tris/HCl pH 8,0; 10 mM EDTA, autoklávováno a přidáno 0,1 mg/ml Rnasy A)



Roztok P2 (0.2 M NaOH, 1% SDS, autoklávováno)



Roztok P3 (3 M octan draselný, pH 5,5; autoklávováno)



Isopropanol 100%



Ethanol 70%, vychlazený v mrazničce, uchovávat při -20°C



TE pufr (10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1 mM EDTA)



Agarosa 1% v 1x TAE pufru (40 mM Tris-kyselina octová, 1 mM EDTA)



Zásobní elektrodový pufr 10x TAE (400 mM Tris-kyselina octová, 10 mM EDTA, pH 8,0)



Vzorkovací pufr (Loading buffer) 6x: 50 % glycerol, 50 mM EDTA pH 8,0; 0,125% bromfenolová modř, 0,125 % xylenová violeť



DNA standard GeneRuler 1 kb marker a DNA standard GeneRuler 100 bp marker



Ethidium bromid 10%

10

Vybavení a pomůcky 

UV spektrofotometr, křemenná kyveta, mikrozkumavky 1,5 ml (ependorfky), stojan na mikrozkumavky, sterilní párátka, termobloky 2x, elektroforéza: horizontální elektroforetická komůrka s hřebínky, zdroj, transiluminátor, AlphaDigiDoc software, systém pro digitální fotodokumentaci gelů; automatické mikropipety, špičky, PC vybavené programem BioEdit, inkubovaná orbitální třepačka 37°C, stolní pikofuga, stopky, vortex, chlazená mikrocentrifuga pro izolaci plasmidové DNA, mrazící stojánek -20°C.

Experimentální postupy 1. DEN a) Napěstování bakteriální kultury nesoucí plasmid 

Ve sterilních podmínkách laminárního boxu si do sterilní zkumavky napipetujeme 2 ml LB-Amp média, které inokulujeme sterilním párátkem neznámou bakteriální kolonií nesoucí plasmid s resistencí k ampicilinu (misku s neznámým kmenem vydá vedoucí cvičení). Každý student si připraví minimálně dvě kultury.



Kulturu inkubujeme přes noc při 37°C na třepačce při 160 rpm.

2. DEN b) Mikroizolace plasmidové DNA Následující izolace plasmidové DNA je založena na principu metody izolace nukleových kyselin pomocí lýze buněk (roztoky P1 a P2), vysrážení nežádoucích proteinů s následující neutralizací DNA pomocí roztoku P3 a precipitací pomocí isopropanolu. 

1,5 ml kultury inkubované přes noc přeneseme do mikrozkumavek, centrifugujeme při 5.000 g 5 min (separace buněk od média), médium odlijeme.



Přidáme 0,3 ml roztoku P1, bakteriální pelet resuspendujeme pomocí vortexu do úplné homogenizace.



Přidáme 0,3 ml roztoku P2, promícháme převrácením mikrozkumavky 6x, ponecháme stát 5 min při laboratorní teplotě.



Přidáme 0,3 ml roztoku P3, promícháme několikerým mikrozkumavky v ruce, ponecháme stát 5 min v ledové tříšti.



Centrifugujeme při 13.000 g, 4°C, 10 min, supernatant přelijeme do nových mikrozkumavek.



K supernatantu přidáme 0,6 ml isopropanolu, centrifugujeme při 14.000 g, 10 min, supernatant odlijeme. Při vkládání mikrozkumavek do centrifugy dbáme jejích orientace tak, abychom věděli, kde očekávat téměř neviditelný pelet plasmidové DNA. Přítomnost peletu ověříme překlopením obsahu mikrozkumavky, pelet na stěně mikrozkumavky mění lom světla jako povrchová nerovnost, což je často jediným příznakem jeho přítomnosti.



Sraženinu DNA promyjeme 0,5 ml 70% ethanolu (-20°C), čímž nám pelet nepatrně zbělá. Centrifugujeme při 14.000 g, 5 min, supernatant odlijeme, jeho zbytky odstředíme na dno mikrozkumavky a odpipetujeme. Dbáme 11

převrácením

dokonalého odpipetování veškerých zbytků ethanolu. Pelet DNA ponecháme sušit 10-15 min v laminárním boxu. 

Sraženinu DNA resuspendujeme pipetováním v 20 µl TE pufru.

c) Spektrální stanovení DNA Nukleové kyseliny absorbují záření v ultrafialové oblasti, maximum absorbance je při 260 nm. Při stanovení je nutné dbát na čistotu preparátu, protože ruší přítomnost proteinů (280 nm) a aromatických látek. Pokud je DNA preparát čistý, poměr A260/A280 dosahuje hodnoty 1,9. Při naší preparační metodě lze množství získané DNA přibližně vypočítat podle vztahu (vyplývajícího z Lambert Beerova zákona se započtením korekce čistoty): cDNA (g/ml) = 62.9 * A260 – 36.0 * A280 * 100 Do 0,1 cm křemenné kyvety napipetujeme vhodně zředěnou izolovanou DNA (10-100x). Na stanovení koncentrace spotřebujeme maximálně třetinu objemu izolované DNA. Měříme absorpční spektra vzorku v UV oblasti v rozsahu 200 - 340 nm proti TE pufru a odečteme absorbance při 280 a 260 nm. d) Restrikční analýza DNA Cílem je nejprve se naučit pracovat se sekvencemi nukleových kyselin in silico (bude provedeno vedoucím cvičení hromadně před začátkem laboratorního cvičení). Úkolem studenta v této úloze je navrhnout restrikční analýzu tak, aby bylo možné z velikosti fragmentů po elektroforéze určit, o který ze šesti možných kombinací plasmidů s genem se jedná a popřípadě jak je gen v plasmidu orientovaný. Studenti mají k dispozici následující restrikční enzymy: BsaI, EcoRI, EcoRV, PstI, SmaI a XbaI a jejich příslušné reakční pufry. Enzymy je nutné během pipetování reakcí udržovat neustále při teplotě -20°C pro uchování jejich aktivity – použij mrazicí stojánek! Samotné plánování restrikční analýzy spočívá v citlivém zvážení veškerých podmínek, které musí být splněny pro úspěšnost analýzy. To zahrnuje ideální objem reakce, vhodnou koncentraci správného pufru, ideální koncentraci DNA, množství použitých enzymů případně jejich vzájemný poměr při štípání více enzymy naráz. Rovněž doba štípání hraje v analýze roli. Pozor, ne všechny restrikční endonukleasy štěpí při 37°C. V případě potřeby štěpit dvěma či více enzymy současně se studenti seznámí se strategií pro tento typ analýz v on-line aplikacích firem vyrábějících restrikční enzymy, DoubleDigest (New England Biolabs) nebo Thermo Scientific, a k dispozici jim bude univerzální restrikční pufr YTango®. Příprava reakce: Do 0,5 ml ependorfky pipetujeme (v tomto pořadí): 2,0 μl x μl x μl 0,3 μl

pufru (optimálního pro danou restrikci) izolovaného vzorku DNA (0,8-2,0 μg DNA) vody pro PCR do celkového objemu 20 μl vhodné restrikční endonukleasy (během v mrazícím stojánku!)

pipetování

uchovávat

Reakce inkubujeme 2 h nebo přes noc při 37°C (v případě SmaI při 30°C). Pro naše potřeby není nutné enzymy inaktivovat.

12

TIP: Enzymy jsou skladovány v glycerolu, při pipetování je nutné dbát postupu pro pipetování viskózních roztoků!!! e) Agarosová elektroforéza DNA 

Poskládáme si vnitřní část horizontální elektroforetické komůrky, utěsníme kraje a připravíme si potřebný hřebínek pro vytvoření jamek v gelu.



Do Erlenmayerovy baňky si odlijeme 50 ml 1% agarosy v 1x TAE (uložena v inkubátoru na 65°C), přidáme 40 μl 10% ethidium bromidu (POZOR KARCINOGEN, DBÁT BEZPEČNOSTNÍCH PŘEDPISŮ, POUŽÍT NITRILOVÉ RUKAVICE, PRACOVAT V ZAPNUTÉ DIGESTOŘI!!!) a dobře promícháme. Pracujeme rychle, agarosa začíná tuhnout při 50°C.



Do připravené komůrky nalijeme asi 0,5 cm vrstvu agarosy s ethidiem, cca 1 cm od čela komůrky vložíme hřebínek a ujistíme se, že hřebínek zasahuje minimálně polovinou výšky zubů do vrstvy nalité agarosy. Gel ponecháme ztuhnout asi 20 min.



Během tuhnutí gelu si připravíme vzorky: Ke vzorku DNA (20 l) pipetujeme 5 l vzorkovacího pufru.



Po ztuhnutí gelu opatrně odstraníme hřebínek a postranní plastové desky a připravený gel na podnosu vložíme do elektroforetické vany.



Nalijeme cca 200 ml elektrodového pufru 1x TAE tak, aby hladina splývala s agarosovým gelem. Do připravených jamek pipetujeme standardy a vzorky.



Jako první pipetujeme standard, použijeme 5 μl DNA GeneRuler 1 kb marker.



Pipetujeme 15 μl každého vzorku. Nezapomeneme si zaznamenat pořadí a polohu nanesených vzorků.



Jako poslední pipetujeme druhý standard, 5 μl markeru DNA 100bp GeneRuler.



Elektroforetickou komůrku uzavřeme bezpečnostním víkem, připojíme ke zdroji napětí 120 V po dobu 30 minut. Průběh elektroforézy je možné sledovat podle pohybu pásů barev obsažených ve vzorkovacím pufru, přičemž spodní pás odpovídá DNA o velikosti 300 bp a horní 3000 bp.



Vypneme zdroj, odpojíme elektrody, odkryjeme víko a vyjmeme agarosový gel pomocí plastového podběráku. Přeneseme na UV transiluminátor a pořídíme snímek digitální kamerou podle pokynů vedoucího cvičení. Používáme ochranné rukavice a dbáme předpisů pro práci s ethidium bromidem, který je obsažen v gelu!

Uchovávání získaného materiálu Pokud nepokračujeme v experimentu týž den, zamrazíme DNA při -20°C. Po ukončení laboratorní úlohy veškerý zbylý transgenní materiál a zbylou DNA zlikvidujeme dle pokynů o nakládání s GMO.

13

Vyhodnocení výsledků Na základě pohyblivosti vzorku DNA v elektroforéze je možné porovnáním se standartem metodou kalibrační křivky (použijeme software) zjistit její velikost. Ta se udává v počtu nukleotidů, obvykle označovaném jako kb (tzv. "kilo base pair"). 1) Zjistěte koncentraci DNA ve vašich vzorcích. 2) Určete velikost izolované plasmidové DNA na základě její elektroforetické pohyblivosti a velikosti jednotlivých naštípaných fragmentů (ilustruje Obr. 1). 3) Na základě získaných výsledků a s pomocí informací získaných z obrázků 2 až 5 rozhodněte, který plasmid jste izolovali a který ze tří možných genů a v jaké orientaci nesl. 4) Zjistěte z literatury, co znamenají zkratky ocDNA a cccDNA, uvedené u vzorového snímku DNA elektroforézy (Viz. Obr. 1). 5) Jak lze matematicky popsat závislost velikosti DNA na její elektroforetické pohyblivosti? Obrázek 1. Agarosová elektroforéza DNA, barvení ethidium bromidem. DNA izolovaná z E. coli DH5 nesoucí plasmid pAO101: 1) vzorek štěpený restrikční endonukleasou EcoRI, 2) vzorek štěpený restrikčními endonukleasami HindIII a PstI, 3) nenaštěpený vzorek, M) marker - DNA bakteriofága  štěpená HindIII.

genomová DNA

1

1

2

2

ocDNA cccDNA

3 3

M kbp 23,1 9,4 6,6 4,4 2,3 2,0

0,5 0,12

14

Obrázek 2. Mapy dvou klonovacích vektorů pYES2 (Invitrogen) a pDRIVE (Qiagen) s vyznačenou klonovací kazetou obsahující specifická místa pro klonovací restrikční enzymy (multiple cloning site). Sekvence plasmidů jsou dostupné v databázi GenBank, případně na stránkách uvedených firem.

15

Obrázek 3. Sekvence genu AtCKX2 (GenBank kód: AF303978), HvCKX2 (AF540382) a gHvCKX2 (AF490591). Uvedené kódy genů použijte pro získání sekvencí genů z databáze GenBank. AtCKX2 HvCKX2 gHvCKX2

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ATGGCTAATC TTCGTTTAAT GATCACTTTA ATCACGGTTT TAATGATCAC CAAATCATCA AACGGTATTA AAATTGATTT ACCTAAATCC CTTAACCTCA CAGTGAACCA CTACCCTGCT ACACGCCTTT CATCTTTCTC CTGAAAACCT CACCACTAAA CTTATTTATT CTTGACCTAC AGAAGAGCCA TGAGGCAATT CAGTGAACCA CTACCCTGCT ACACGCCTTT CATCTTTCTC CTGAAAACCT CACCACTAAA CTTATTTATT CTTGACCTAC AGAAGAGCCA TGAGGCAATT

AtCKX2 HvCKX2 gHvCKX2

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 CCCTCTCTAC CGATCCTTCC ATCATCTCCG CAGCCTCTCA TGACTTCGGA AACATAACCA CCGTGACCCC CGGCGGCGTA ATCTGCCCCT CCTCCACCGC ACTCCTGCAA TACCTGAAGC TGTTCCTGTT GCTAGGCCTT GGCGCAGTCA CTGCTGAGCA TGTGCTTAAA CATGATGTGC TTGCATCCCT GGGGACGCTC ACTCCTGCAA TACCTGAAGC TGTTCCTGTT GCTAGGCCTT GGCGCAGTCA CAGCTGAGCA TGTGCTTAAA CATGATGTGC TTGCATCCCT GGGGACGCTC


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 TGATATCTCT CGTCTCCTCC AATACGCCGC AAACGGAAAA AGTACATTCC AAGTAGCGGC TCGTGGCCAA GGCCACTCCT TAAACGGCCA AGCCTCGGTC CCCCTTGACG GGCATTTCAG CTTCCACGAC TTGTCTGCAG CTGCAATGGA CTTCGGCAAC CTCTCTAGCT TCCCGCCAGT CGCTGTGCTT CACCCAGGTT CCCCTTGACG GGCATTTCAG CTTCCACGAC TTGTCTGCAG CTGCAATGGA CTTCGGCAAC CTCTCTAGCT TCCCGCCAGT CGCTGTGCTT CACCCAGGTT


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 TCCGGCGGAG TAATCGTCAA CATGACGTGT ATCACTGACG TGGTGGTTTC AAAAGACAAG AAGTACGCTG ACGTGGCGGC CGGGACGTTA TGGGTGGATG CAGTGGCTGA CATTGCCACA ACCGTGAGGC ATGTGTTCTT GATGGGTGAG CACTCCGCGC TCACAGTGGC AGCTCGTGGG CATGGACACT CGCTATATGG CAGTGGCTGA CATTGCCACA ACCGTGAGGC ATGTGTTCTT GATGGGTGAG CACTCCGCGC TCACAGTGGC AGCTCGTGGG CATGGACACT CGCTATATGG


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 TGCTTAAGAA GACGGCGGAG AAAGGGGTGT CGCCGGTTTC TTGGACGGAT TATTTGCATA TAACCGTCCG AGGAACGTTG TCGAATGGTG GAATTGGTGG GCAGTCCCAG GCTGCTGGAG GGATTGTCAT CAGAATGGAA TCCCTTCGGA GTGTCAAAAT GCAGGTGCAT CCTGGTGCAT CACCCTATGT GGATGCCTCA GCAGTCCCAG GCTGCTGGAG GGATTGTCAT CAGAATGGAA TCCCTTCGGA GTGTCAAAAT GCAGGTGCAT CCTGGTGCAT CACCCTATGT GGATGCCTCA


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 TCAAGTGTTT CGAAACGGTC CTCTTGTTAG TAACGTCCTT GAATTGGACG TTATTACTGG GAAAGGTGAA ATGTTGACAT GCTCGCGACA GCTAAACCCA GGAGGCGAAC TCTGGATAAA TGTCTTGAAT AAGACGTTGA AGTATGGTTT GGCGCCGAAG TCATGGACAG ACTACCTCCA CCTTACGGTT GGGGGCACGT GGAGGCGAAC TCTGGATAAA TGTCTTGAAT AAGACGTTGA AGTATGGTTT GGCGCCGAAG TCATGGACAG ACTACCTCCA CCTTACGGTT GGGGGCACGT


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 GAATTGTTCT ATGGAGTGTT AGGAGGTTTG GGTCAATTTG GAATTATAAC GAGAGCCAGA ATTGTTTTGG ACCATGCACC TAAACGGGCC AAATGGTTTC TGTCAAATGC GGGCGTCAGC GGGCAGACAT TCCGGCATGG TCCACAGATC AGCAATGTGA ACGAATTGGA GATTGTGACT GGAAGAGGTG ATATTGTCAC TGTCAAATGC GGGCGTCAGC GGGCAGACAT TCCGGCATGG TCCACAGATC AGCAATGTGA ACGAATTGGA GATTGTGACT GGTATGAACT GGCCTTTATA


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 GGATGCTCTA CAGTGATTTC ACAACTTTTA CAAAGGACCA AGAACGTTTG ATATCAATGG CAAACGATAT TGGAGTCGAC TATTTAGAAG GTCAAATATT TTGCTCACCA GAACAGAACT CTGATCTCTT CCGTGCTGCT CTTGGTGGTC TGGGTCAGTT TGGCATCATT ACTCGGGCCA GGATCGCACT TGAGCCTGCT TTAAGTTGAT TTGAATAACT CGAAGAGTAA AGAATGTAGC TAACTTTGTA CCATGATTTT CAAATGCAGG AAGAGGTGAT ATTGTCACTT GCTCACCAGA


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 TCTATCAAAC GGTGTCGTTG ACACCTCTTT TTTCCCACCT TCAGATCAAT CTAAAGTCGC TGATCTAGTC AAGCAACACG GTATCATCTA TGTTCTTGAA CCACAAATGG TGAGGTGGAT AAGAGTTCTC TACTTAGATT TCATGAGCTT CACCGAGGAT CAGGAGATGC TTATTTCAGC AGAGAAGACC TTCGACTACA ACAGAACTCT GATCTCTTCC GTGCTGCTCT TGGTGGTCTG GGTCAGTTTG GCATCATTAC TCGGGCCAGG ATCGCACTTG AGCCTGCTCC ACAAATGGTA


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000 GTAGCCAAGT ATTATGATGA TCCCAATCTC CCCATCATCA GCAAGGTTAT TGACACATTA ACGAAAACAT TAAGTTACTT GCCCGGGTTC ATATCAATGC TTGAAGGTTT CGTTATCATA AACAGAACAG GCATCCTAAA CAACTGGAGG TCATCGTTCA ATCCACAGGA CCCAGAGCGG GCTAGCCGGT TCGAAACAGA AATCGCGAGA ACTCATCTGT GACAACCCCA TGCTAGTACA TCTTAGTAAG CATATGCTCA TGAGTTCATT GGATGTACAA TAGGTGAGGT GGATAAGAGT


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100 ACGACGTGGC CTACTTCGAT TTCTTGAACC GTGTACATGT CGAAGAAAAT AAACTCAGAT CTTTGGGATT ATGGGAACTT CCTCATCCTT GGCTTAACCT CAGAAAAGTG CTCTTCTGCC TCGAGATGAC AAAGAACTTC AACCCTGAAG AAGCTGACAT CATGGAACAG GAGGTCCATG CACTACTATC TCAACTTAGA TCTCTACTTA GATTTCATGA GCCTCACCGA GGATCAGGAG ATGCTTATTT CAGCAGAGAA GACCTTCGAC TACATTGAAG GTTTCGTTAT CATAAACAGA


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 CTACGTTCCT AAATCTCGGA TTCTCGATTT TCATAACGGT GTTGTCAAAG ACATTCTTCT TAAGCAAAAA TCAGCTTCGG GACTCGCTCT TCTCTATCCA TACACACCAG CCTCCTTATT CCACACGGAC GTCACTTACA TTGAGTTCTT GGATAGGGTG CACTCCTCTG AGATGAAGCT GAGAGCTAAG GGCTTGTGGG ACAGGCATCC TAAACAACTG GAGGTCATCG TTCAATCCAC AGGACCCAGA GCGGGCTAGC CGGTTCGAAA CAGACAGAAA AGTGCTCTTC TGCCTCGAGA


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300 ACAAACCGGA ATAAATGGGA CAATCGTATG TCGGCGATGA TACCAGAGAT CGATGAAGAT GTTATATATA TTATCGGACT ACTACAATCC GCTACCCCAA AAGTCCCACA CCCATGGCTT AATCTCATCA TACCAAGAAG CACTATCCAT ACATTTGCAG AGCAGGTCTT TGGGAAAATC CTCGAAGATA ACAACAATGG TGACAAAGAA CTTCAACCCT GAAGAAGCTG ACATCATGGA ACAGGTAAGC CGACGATTAA TCCTTGTGTT ACTAAAGATG TTTATGTATG AAGTGCTATC


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1310 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 AGGATCTTCC AGAAGTGGAG AGCGTTAACG AGAAGATAAT TAGGTTTTGC AAGGATTCAG GTATTAAGAT TAAGCAATAT CTAATGCATT ATACTAGTAA TCCCATATTG CTCTACCCAG TGAAGAAGTC CAGATGGGAC AACCGAACGT CAGTGGTCAT ACCAGATGAG GAAGTTTTCT ACCTGGTGGG ATTCCTATCC AGGTGGCCTG AGTGGTTGAA TTCCATATGT ATATGTGTTT ACAGGAGGTC CATGCACTAC TATCTCAACT TAGATACACA CCAGCCTCCT TATTCCACAC

16


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 1490 1500 AGAAGATTGG ATTGAGCATT TTGGATCAAA ATGGGATGAT TTTTCGAAGA GGAAAGATCT ATTTGATCCC AAGAAACTGT TATCTCCAGG GCAAGACATC TCGGCGATAG GCCCCCACAG CATCGAACAT ACATTGAACC TGAACAACCA GATAATAGAG TTCTCTAACA AAGCAAGTAT TGGGGTGAAG CAATATCTTC GGACGTCACT TACATTGAGT TCTTGGATAG GGTGCACTCC TCTGAGATGA AGCTGAGAGC TAAGGGCTTG TGGGAAGTCC CACACCCATG GCTTAATCTC


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600 TTTTGA.... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... CAAACTACAC CACAGAACCC GAGTGGAAGG CCCACTATGG GGCTAGGTGG GACGCATTTC AACAGAGGAA AAACACCTAT GACCCCCTGG CAATCCTAGC ATCATACCAA GAAGCACTAT CCATACATTT GCAGAGCAGG TCTTTGGGAA AATCCTCGAA GATAACAACA ATGGTCCCAT ATTGCTCTAC CCAGTGAAGA


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 1690 1700 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... TCCAGGACAG AAAATATTTC AAAAGAAACC AGCATCACTA CCCTTGTCCT CGTTACAGTA CCTACTGTAA AAAATATATA TGTGGAGCAA TATGTCTATG AGTCCAGGTA AGTTAGCTAA TGTCCCGTAA TAACAAATCC CATTCAGAAA CTATTATACA CCACGCCATA GTGTTGCCAA GTGAATGATT CATCTTGTTT


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... TTAGTATGGA ACTATAGTCG CTTTGCAAAA GATAACGAAC TGCAGCGTGA AGGACACTGT ACAGAGTAGT GACTATTAGT AGTGGTGATG CTCAAAATAC CATGCAGATG GGACAACCGA ACGTCAGTGG TCATACCAGA TGAGGAAGTT TTCTACCTGG TGGGATTCCT ATCCTCGGCG ATAGGCCCCC ACAGCATCGA


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1810 1820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 1900 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... TTTTAGCACT GAGATCAATG AAGATCAGC. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ACATACATTG AACCTGAACA ACCAGATAAT AGAGTTCTCT AACAAAGCAA GTATTGGGGT GAAGCAATAT CTTCCAAACT ACACCACAGA ACCCGAGTGG


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... AAGGCCCACT ATGGGGCTAG GTGGGACGCA TTTCAACAGA GGAAAAACAC CTATGACCCC CTGGCAATCC TAGCTCCAGG ACAGAAAATA TTTCAAAAGA


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... AACCAGCATC ACTACCCTTG TCCTCGTTAC AGTACCTACT GTAAAAAATA TATATGTGGA GCAATATGTC TATGTTAGTA TGGAACTATA GTCGCTTTGC


....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 2110 2120 2130 2140 2150 2160 2170 2180 2190 2200 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... AAAAGATAAC GAACTGCAGC GTGAAGAACA CTGTACAGAG TAGTGACTAT TAGTAGTGGT GATGCTCAAA ATACTTTTAG CACTGAGATC AATGAAGATC

... AtCKX2 HvCKX2 gHvCKX2

... ... AGC

17

Obrázek 4. Sekvence klonovací kazety vektoru pDRIVE (Qiagen) s vyznačenými restrikčními místy. (Poznámka: všechny tři geny byly do vektoru naklonovány pomocí TA klonování).

18

Obrázek 5. Sekvence klonovací kazety vektoru pYES2 (Invitrogen) s vyznačenými restrikčními místy (Poznámka: v případě genů HvCKX2 a gHvCKX2 byly do vektoru překlonovány z vektoru pDRIVE pomocí restrikčních enzymů SphI a HindIII, v případě genu AtCKX2 byl gen do vektoru naklonován pomocí restrikčního enzymu KpnI).

Literatura 

Harwood A.J. (1996). Basic DNA and RNA Protocols. Methods in Molecular Biology Vol.58, Humana Press Totowa, NJ, USA.

19

Laboratorní úloha č. 2 Detekce geneticky modifikovaných organismů v potravinách pomocí PCR Cíl laboratorní úlohy Naučit se izolaci DNA z potravin a surovin a analyzovat vzorky pomocí PCR s klasickou end-point detekcí v agarosové elektroforéze. Studenti si mohou donést k analýze vlastní vzorky potravin obsahující sóju anebo kukuřici. Očekávaný výsledek Zjistit přítomnost GMO ve vzorcích potravin. Teoretický úvod Důležitým aspektem studia biochemie je získat zkušenosti s novými metodikami molekulární biologie, které mohou být využity v biotechnologickém průmyslu. Detekce geneticky modifikovaných organismů (GMO) je typickým příkladem, který má široké uplatnění v zemědělství a potravinářství. Názory na geneticky modifikované organismy jsou v současné době rozporuplné nejen mezi laickou veřejností, ale i mezi vědeckou komunitou. Geneticky modifikované rostliny mohou například vést ke zvýšení výnosů prostřednictvím zvýšené resistence k chorobám a škůdcům. Na druhou stranu, mohou takovéto organismy ohrožovat životní prostředí svojí umělou vysokou resistencí a možným rozšířením do přírody. Sekundární efekty na životní prostředí a na lidstvo mohou být dlouhodobé a lze je zatím jen velmi těžko odhadovat. Toto je jedním z hlavních důvodů, proč v některých zemích lobující skupiny prosadily důslednou kontrolu produkce geneticky modifikovaných rostlin a snaží se zamezit jejich širšímu používání. V Evropských zemích musí být přítomnost geneticky modifikovaných organismů v potravinách v současné době uvedena. Výrobci tak musí garantovat, že geneticky modifikované organismy nejsou přítomny v jejich surovinách, pokud uvádějí na trh výrobek deklarovaný jako GMO free. Kromě spolehlivosti detekce GMO v surovinách je kladen důraz i na rychlost průkazu. Proto jsou v referenčních laboratořích využívány metody molekulární biologie, konkrétně PCR (Polymerázová řetězová reakce, z anglického Polymerase Chain Reaction) se specifickými primery detekujícími standardně používané transgeny. V tomto experimentu je použito PCR k určení v analyzovaných vzorcích. PCR probíhá ve třech fázích:

přítomnosti

GMO

1) tepelná denaturace dvouvláknové DNA, 2) navázání/nasednutí primerů na specifické sekvence ochlazením (annealing) 3) narůstání řetězců DNA prodlužováním primerů (elongace). Tyto tří kroky představují jeden cyklus a PCR je založena na opakování takovéhoto cyklu, při němž dochází k exponenciálnímu nárůstu (2n, kde n je počet cyklů) množství specifického úseku DNA ohraničeného primery. To znamená, že po 30 cyklech je tento úsek amplifikován více než 109x a může být snadno detekován v elektroforéze na agarosovém gelu.

20

K detekci GMO v analyzovaných vzorcích budou používány primery specificky navržené pro detekci dvou typů genů - rostlině vlastních a cizorodých transgenů. Rostlině vlastní geny jsou detekovány jako kontrola přítomnosti rostlinné DNA. Pro tyto účely se nejčastěji používají tzv. endogenní geny (housekeeping genes). V našem případě budou použity primery pro následující geny: konzervovaný gen pro tRNA-leucinu kódovaný na chloroplastové DNA, gen sojového lektinu a kukuřičného aktinu. Druhá sada primerů amplifikuje sekvence, které se v rostlinách normálně nevyskytují, ale jsou vnášeny genetickou transformací. V našem případě jsou těmito cizími transgeny DNA konstitutivně aktivní 35S promotor viru květákové mozaiky (35S CaMV) a terminátor genu nopalin syntetasy (NOS) z Agrobacterium tumefaciens. Pokud je kterákoliv z těchto sekvencí amplifikována, znamená to, že vzorek obsahuje cizorodý transgen, GMO. Všechny povolené geneticky upravené zemědělské plodiny byly transformovány s konstrukty obsahujícími jeden nebo oba tyto prvky. PCR primery byly navrženy tak, aby pásy detekované na agarosovém gelu měly různou pohyblivost (velikost, viz. Tab. 1) a byly tak snadno odlišitelné. Tabulka 1. Primery použité pro PCR detekci geneticky modifikovaných rostlin. Velikost (bp)

Gen

Primery

Sekvence (5’-3’)

Chloroplastová DNA

CP3fw CP4rev

CGAAATCGGTAGACGCTACG GGGGATAGAGGGACTTGAAC

530

Sojový lektin

LEC1fw LEC2rev

GCCCTCTACTCCACCCCCATCC GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG

118

Kukuřičný aktin

ACTfw ACTrev

AGCAACTGGGATGACATGGAGAAAA CCTGTTCATAATCAAGGGCAACGTA

101

35S promotor

CaMV1fw CaMV2rev

GAAGGTGGCTCCTACAAATGCC GTGGGATTGTGCGTCATCCC

199

NOS terminátor

NOS_Afw NOS_Drev

GAATCCTGTTGCCGGTCTTGCG GCGGGACTCTAATCATAAAAACCC

127

Materiál a chemikálie  Roztok S1 (10 mM MgCl2, 10 mM Tris/HCl pH 7,5; 0,5% Triton X-100, autoklávováno)  Roztok S2 (1% SDS, autoklávováno)  Směs fenol/chloroform/isoamylalkohol (25:24:1, pH 8,0)  Isopropanol 100%  Ethanol 70%, vychlazený v mrazničce (-20oC)  TE pufr (10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1 mM EDTA)  Primery dle Tab. 1 (10 µM)  Taq DNA polymerasa  10 mM dNTP mix  10x PCR pufr

21

 Agarosa 3% v 1x TAE pufru (40 mM Tris-kyselina octová, 1 mM M EDTA, pH 8,0)  Zásobní elektrodový pufr 10x TAE (400 mM Tris-kyselina octová, 10 mM EDTA, pH 8,0)  Vzorkovací pufr (Loading buffer) 6x: 50 % glycerol, 50 mM EDTA pH 8,0; 0,125 % bromfenolová modř, 0,125 % xylenová violeť  Ethidium bromid 10%  DNA standard GeneRuler 50 bp marker a DNA standard GeneRuler 100 bp marker nebo λ DNA naštípaná restrikčním enzymem PstI Vybavení a pomůcky  Mikrozkumavky 1,5 ml (ependorfky), PCR mikrozkumavky, PCR stripy s víčky, stojánky, PCR box, termoblok, chladící stojánek pro PCR, mrazící stojánek (20°C), termocyklér (Biometra), elektroforéza: horizontální elektroforetická komůrka s hřebínky, zdroj, AlphaDigiDoc software, systém pro digitální fotodokumentaci gelů; automatické mikropipety, špičky, stolní pikofuga, stopky, vortex, chlazená mikrocentrifuga pro izolaci DNA. Experimentální postupy 1. DEN a) Extrakce DNA z rostlinného materiálu Pro izolaci genomové DNA z potravin bude použita základní metoda pro izolaci nukleových kyselin využívající směsi fenol/chloroformu/isoamylalkoholu. Ten, jako nepolární rozpouštědlo rozděluje buněčný lyzát na dvě fáze, přičemž nukleové kyseliny přecházejí do horní, vodné, ze které jsou v dalším kroku vysráženy koncentrovaným ethanolem. 

V třecí misce pomocí tloučku homogenizujeme připravený materiál na prach (vlastní vzorky, nebo dodá vedoucí cvičení).



K 0,1 g vzorku přidáme 450 µl roztoku S1 a 250 µl roztoku S2, necháme protřepávat 10 min na třepačce, centrifugujeme při 14.000 g 5 min při laboratorní teplotě a supernatant přelijeme do čisté mikrozkumavky.



Přidáme 700 µl směsi fenol/chloroform/isoamylalkohol (25:24:1, pH 8,0; těsně před odebráním směs protřepeme, SE SMĚSÍ PRACUJ VŽDY V ZAPNUTÉ DIGESTOŘI!!!), vortexujeme 15 s a centrifugujeme při 14.000 g 5 min, horní vodnou fázi přepipetujeme do čisté mikrozkumavky.



Přidáme stejný objem isopropanolu (300 - 700 µl) jako byl objem horní vodní fáze, vortexujeme 15 s a necháme stát 2 min při laboratorní teplotě.



Centrifugujeme při 14.000 g 10 min, supernatant odlijeme.



Precipitát promyjeme 500 µl 70% ethanolu (-20°C), centrifugujeme při 14.000 g 5 min, supernatant odlijeme, zbytky odstředíme na dno mikrozkumavky a odpipetujeme, ponecháme sušit 10-15 min v laminárním boxu.



Sraženinu DNA resuspedujeme pipetováním v 30 µl TE pufru.

22

b) PCR 

Pro detekci jednotlivých fragmentů DNA nastavíme PCR pro každou z pěti sad primerů viz. Tab. 1. Nezapomeneme napipetovat kontrolní reakce pro každý set primerů, a to bez templátové DNA, kterou nahradíme vodou!



Do 0,2 ml PCR zkumavek na chladícím stojánku pro PCR pečlivě pipetujeme (v PCR boxu) následující reagencie v tomto pořadí: 17,5 2,5 0,5 1,0 1,0 2,0 0,5

μl μl μl μl μl μl μl

vody pro PCR 10x PCR pufru dNTP mix pozitivního (fw) primeru jako kapku na stěnu mikrozkumavky negativního (rev) primeru jako kapku na stěnu mikrozkumavky vzorku DNA Taq DNA polymerasy (udržovat v mrazicím stojánku při -20°C !!!)



Vortexujeme a krátkou centrifugací dopravíme všechny reagencie na dno zkumavek.



Na termocykléru nastavíme následující program pro PCR: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.



Počáteční denaturace 94°C, 7 min Denaturace 94°C, 30 sec Navázání primerů (annealing) 60°C, 30 sec Růst řetězce (elongace) 72°C, 1 min Kroky 2-4 opakovat 40x Koncová elongace 72°C, 10 min Chlazení 10°C, 10 min

Vzorky vložíme do termocykléru pro amplifikaci a v mezičase si připravíme agarosovou elektroforézu.

TIP: Taq DNA polymerasa je uchovávána jako každý enzym molekulární biologie v pufru o vysoké koncentraci glycerolu. Při pipetování proto dbáme doporučení pipetování viskózních roztoků. PCR je vysoce citlivá metoda, kterou je možno odhalit již 1 molekulu DNA ve vašem vzorku. Dbáme proto zvýšené opatrnosti pro zamezení vzájemné kontaminace vzorků a chemikálií. c) Agarosová elektroforéza DNA 







Do připravené komůrky nalijeme asi 0,8 cm vrstvu agarosy s ethidiem, cca 1 cm od čela komůrky vložíme hřebínek a ujistíme se, že hřebínek zasahuje minimálně polovinou výšky zubů do vrstvy nalité agarosy. Gel ponecháme ztuhnout, cca 20 min.



Během tuhnutí gelu si připravíme vzorky: Ke vzorkům po PCR (25 l) pipetujeme 5 l vzorkovacího pufru.



Po ztuhnutí gelu opatrně odstraníme hřebínek a postranní plastové desky a připravený gel na podnosu vložíme do elektroforetické vany. 23



Nalijeme cca 200 ml elektrodového pufru 1x TAE tak, aby hladina splývala s agarosovým gelem.



Do připravených jamek pipetujeme standardy a vzorky.



Jako první pipetujeme standard, použijeme 5 μl DNA 100 bp GeneRuler marker.






Jako poslední pipetujeme druhý standard, 5 μl markeru DNA 50 bp GeneRuler.







Uchovávání získaného materiálu Pokud nepokračujeme v experimentu týž den, zamrazíme DNA při -20°C. Po ukončení laboratorní úlohy veškerý zbylý transgenní materiál a zbylou DNA zlikvidujeme dle pokynů o nakládání s GMO.

24

Vyhodnocení výsledků 1) Porovnáme výsledek elektroforézy s Obr. 6 a z kalibrační křivky markeru určíme přítomnost a velikost jednotlivých PCR produktů. Porovnáme s očekávanou velikostí dle Tab. 1.

Obrázek 6. Výsledky PCR pro vzorky obsahující původní a transgenní rostliny (sója). 2) Vyhodnoťte, který z předložených vzorků obsahuje transgenní rostliny a jaké? 3) Proč se pro PCR používá DNA polymerasa z termofilních organismů? 4) Zdůvodněte, proč byste v případě primerů CP3 a CP4 měli vždy u každé rostliny dostat pozitivní výsledek a v případě primerů pro kukuřičný aktin nikdy neamplifikujete aktin sójový? 5) Zamyslete se, proč jsou na vzrovém obrázku „čmouhy“ (anglicky smears) a zda-li je něco podobného pozorovatelné rovněž na vašem gelu a proč?

Literatura 

Thion L. et al. (2002). Detection of genetically modified organisms in food by DNA extraction and PCR amplification. Biochem. Mol. Biol. Edu. 30, 51-55.

25

Laboratorní úloha č. 3 Genetická transformace kvasinek a ověření exprese pomocí měření aktivity rekombinantního enzymu Cíl laboratorní úlohy Naučit se pracovat s kvasinkami, transformovat cizorodou DNA do hostitelského organismu, připravit rekombinantní enzym v expresním systému, měřit spektrofotometricky enzymovou aktivitu. Očekávaný výsledek Příprava stabilní transgenní linie kvasinek Pichia pastoris nadexprimující aktivní rekombinantní protein. Teoretický úvod Až donedávna mohly být studovány jen proteiny, které jsou v buňce přítomny v relativně velkém množství. Pro detailní studium proteinu včetně krystalizace a určení trojrozměrné struktury je třeba alespoň 0,1 g čistého proteinu což je v drtivé většině nereálně obrovské množství. Pokud se totiž protein vyskytuje v zastoupení kolem 1%, je nutné začít jeho purifikaci z několika set gramů buněk. Většina z mnoha tisíců proteinů eukaryotní buňky včetně těch, které jsou pro život zcela nezbytné, však tvoří jen zlomek tohoto zastoupení a je velice obtížné, ne-li nemožné, získat byť jen několik mikrogramů čistého proteinu. Možnost přípravy většího množství rekombinantního proteinu pomocí klonovacích technik genového inženýrství tak byla revolucí v biochemii proteinů. Pro produkci proteinů byly zkonstruovány speciální tzv. expresní vektory, které jsou dnes již komerčně běžně dostupné v celé řadě speciálních variant. Obecně tyto vektory (plasmidy) obsahují vhodné regulační sekvence a promotor pro daný organismus (bakterie, kvasinky, kultury hmyzích nebo savčích buněk). Za sekvenci promotoru se pak v těsné blízkosti vnáší (klonuje) sekvence genu pro protein našeho zájmu. Připravené vektory pro expresi jsou vnášeny do hostitelských buněk pomocí transformace. Promotor společně s regulačními sekvencemi zajišťuje produkci velkého množství mRNA pro proteosyntézu našeho proteinu v hostitelském organismu. Protože se vektory s každým buněčným dělením replikují, vzniká populace buněk schopná vytvořit velké množství rekombinantního proteinu (Viz. Obr. 7). Pomocí technik molekulární biologie je v dnešní době připravována celá řada enzymů používaných v medicíně (jako například insulin nebo plášťové proteiny virů používané při očkování) nebo potravinářství (rekombinantní chymotrypsin používaný v sýrařství).

26

Obrázek 7. Schéma přípravy rekombinantního proteinu.

V této laboratorní úloze připravíme rekombinantní enzym polyaminoxidasu (PAO; EC 1.5.3.14) z kukuřice. Rostlinné polyaminoxidasy katalyzují katabolickou oxidaci polyaminů sperminu a spermidinu za tvorby 1,3-diaminopropanu, peroxidu vodíku a příslušných aminoaldehydů.

spermidin + O2 + H2O → 1,3-diaminopropan + 4-aminobutanal + H2O2

Obrázek 8. Katalytická reakce polyaminoxidasy (PAO) se substrátem spermidinem.

27

Pro expresi genu PAO v kvasinkách Pichia pastoris použijeme přenosový expresní vektor mezi E. coli a P. pastoris. To znamená, že vektor obsahuje regulační sekvence spolu s geny pro resistenci pro kvasinky i bakterie zároveň. V našem případě se jedná o gen resistence k bleomycinovému typu antibiotika – zeocinu. Pro expresi genu MPAO je použit silný konstitutivní kvasinkový promotor GAP (pro enzym glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasu) a terminátor AOX1 (pro enzym alkoholoxidasa 1) (Viz. Obr. 9). Transformaci kvasinek provedeme linearizovaným plasmidem metodou elektroporace, po které dojde k integraci linearizované DNA do genomu hostitele v procesu homologní rekombinace (Viz. Obr.10). Lokalizaci peptidu na úrovni buněčných organel zajišťuje signální peptid obsažený přirozeně v sekvenci genu. Pro přípravu rekombinantních enzymů je vhodné zvážit způsob/místo exprese pro další purifikaci. Ideálním způsobem je exprimovat protein ven z buňky, do růstového média. To je možné v případě přirozeně se vyskytujícího sekrečního signálního peptidu. Ten však obsahuje naprosté minimum proteinů. Sekvenci pro sekreční signální peptid je však možné zahrnout do expresního vektoru a gen našeho proteinu vklonovat tak, aby byl ve stejném čtecím rámci se signálním peptidem a tudíž byla jeho exprese řízena ven z buňky. V našem případě je pro tento účel použit tzv. -faktor z kvasinky Saccharomyces cerevisiae vylučovaný kvasinkami do růstového média. Úspěšnou expresi proteinu lze tedy snadno ověřit měřením enzymové aktivity rekombinantní PAO přímo v médiu. Pro tu se využívá jednoduchá spektrofotometrická metoda stanovení založená na oxidaci aminoantipyrinu křenovou peroxidasou a tvorbě následného barevného aduktu. Oxidace křenovou peroxidasou je podmíněna přítomností peroxidu vodíku, který se vytváří v primární reakci působením enzymu polyaminoxidasy.

Obrázek 9. Schéma rekombinantní PAO.

expresního

vektoru

28

pGAPZ

(Invitrogen)

pro

přípravu

Obrázek 10. Schéma principu homologní rekombinace expresního vektoru do genomu kvasinky Pichia pastoris. Materiál a chemikálie 

P. pastoris kmen X-33 (Invitrogen)



Plasmidová DNA pGAPZ-MPAO, 10 g



YPD médium (1% kvasnicový extrakt, 2% pepton, 2% D-glukosa)



YPD médium expresní (1% kvasnicový extrakt, 2% pepton, 2% D-glukosa, 50 mM Tris-HCl, pH 7,2)



YPDS médium pevné pro selekci na zeocinu (1% kvasnicový extrakt, 2% pepton, 2% D-glukosa, 2% agar, 1 M sorbitol, 100 g/ml zeocin)



1M sorbitol, autoklávováno



Deionizovaná voda, autoklávováno



QIAquick Gel Extraction Kit, pufr PB



Premix AAP/DCHBS (30 ml 0,2 M fosfátový pufr pH 6,5; 0,5 ml 6 mM aminoantipyrine; 0,5 ml 66 mM DCHBS; 1,0 ml křenová peroxidasa-6 mg/50 ml ve vodě)



50 mM spermidin



Restrikční endonukleasa BlnI 29


UV spektrofotometr, kyvety, křemenná kyveta, termoblok, stopky, inkubované třepačky a inkubátory 30 a 37oC, mikrozkumavky 1,5 ml (ependorfky), stojánky, chlazená mikrocentrifuga, stolní pikofuga, elektroporátor, kyvety, ultraúzké Pasteurovy pipety, chladicí box na led, drcený led, automatické mikropipety, špičky, sterilní falkonky 50 ml, mrazící stojánek -20°C.

Experimentální postupy 1. DEN a) 

Linearizace plasmidu pGAPZ-MPAO Plasmidovou DNA pGAPZ-MPAO ponecháme štěpit restrikční endonukleasou BlnI přes noc při 37ºC. K linearizaci použijeme 10 g DNA, 0.2 l enzymu BlnI a 5 l pufru vhodného pro danou reakci. Výsledný objem reakční směsi doplňte na 50 l sterilní deionizovanou vodou.

TIP: BlnI je skladována v glycerolu, při pipetování je nutné dbát postupu pro pipetování viskózních roztoků!!! Enzym udržujte při pipetování při -20°C v mrazícím stojánku pro udržení aktivity enzymu!!! b) Příprava kompetentních buněk kvasinek 

20 µl ze suspenze kultury P. pastoris X-33 (připraví vedoucí cvičení) pěstované přes noc zaočkujeme do 2 ml YPD média ve čtyřech zkumavkách a ponecháme kultivovat přes noc při 30°C na třepačce při 200 rpm.

2. DEN 

Ráno před začátkem práce dáme chladit sterilní vodu a 1 M sorbitol do polystyrenové krabice s ledem.



Ze suspenze kultury P. pastoris X-33 pěstované přes noc sterilně odebereme vhodný objem a na spektrofotometru stanovíme OD600. Optimální hodnota OD600 by se měla pohybovat v rozmezí 1,3-1,5. Pokud je hodnota nižší, ponecháme kulturu inkubovat ještě další hodinu a měření zopakujeme.

c) Purifikace plasmidu pGAPZ-MPAO 

Před purifikací plasmidové DNA nejprve ověříme, že opravdu došlo k linearizaci DNA působením enzymu BlnI. Odebereme 1 l z reakční směsi, která byla ponechána přes noc při 37ºC, a vzorek analyzujeme na 1% agarosovém gelu spolu s vhodným DNA standardem (viz ostatní úlohy).



Pokud došlo k linearizaci plasmidu, je možno přistoupit k purifikaci DNA; k přečistění DNA použijeme dodaný QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen), který využívá principu izolace nukleových kyselin pomocí schopnosti vazby na silikát.



K reakční směsi obsahující linearizovaný plasmid přidáme pětinásobek objemu pufru PB (250 l) a promícháme.



Vložíme jednu centrifugační kolonku QIAquick do připravené 2 ml mikrozkumavky (součást kitu) a naneseme vzorek do středu centrifugační kolonky.



Centrifugujeme na stolní centrifuze při 14.000 g po dobu 60 sekund. 30



DNA se zachytí na silikátové vrstvě centrifugační kolonky; proteklou frakci na dně mikrozkumavky odstraníme.



Kolonku promyjeme pufrem PE; pipetujeme 750 l do středu kolonky a následně centrifugujeme 60 sekund při 14.000 g.



Proteklou frakci opět odstraníme, vrátíme kolonku do stejné mikrozkumavky a znovu centrifugujeme 60 sekund.



Připravíme si novou 1,5 ml mikrozkumavku, u které ustřihneme víčko a to vyhodíme. Po skončení centrifugace v předchozím kroku vložíme centrifugační kolonku do připravené 1,5 ml mikrozkumavky a kolonku zcentrifugujeme ještě jednou naprázdno (zbavíme se tak veškerých zbytků ethanolu z pufru PE).



Připravíme si novou 1,5 ml mikrozkumavku, u které rovněž ustřihneme víčko (které si ponecháme!). Po skončení centrifugace v předchozím kroku vložíme centrifugační kolonku do připravené 1,5 ml mikrozkumavky.



Provedeme eluci DNA: přímo do středu centrifugační kolonky (špička je nad středem membrány, ale nedotýká se!) pipetujeme 10 l zahřáté sterilní deionizované vody nebo EB pufru (v inkubátoru na 65°C), ponecháme inkubovat 1 min a stáčíme při 14.000 g 2 minuty.



Centrifugační kolonku odstraníme, mikrozkumavku s eluční frakcí obsahující plasmidovou DNA popíšeme, uzavřeme víčkem a necháme chladit na led.

d) Příprava buněk Pichia pastoris pro elektroporaci Všechny centrifugace prováděj v řádně vychlazené centrifuze (4°C), POZOR, prodlevy v procesu vedou ke snížení účinnosti transformace! Pokud je OD600 kultury pěstované přes noc vyšší než 1,5 je třeba zvýšit opakování následujících promývacích kroků. 

Kultury P. pastoris X-33 pěstované přes noc přelijeme do 2 ml sterilních mikrozkumavek a centrifugujeme při 750 g, 5 min a pelety resuspendujeme ve 2 ml vychlazené vody (na ledu).



Centrifugaci opakujeme a pelety resuspendujeme v 2 ml vychlazené vody.



Znovu centrifugujeme a pelety resuspendujeme v 2 ml vychlazeného 1 M sorbitolu.



Centrifugujeme naposledy a pelety tentokrát rozpustíme v 80 µl vychlazeného 1 M sorbitolu, ponecháme chladit na ledu po celou dobu experimentu.

e) Elektroporace kvasinek Nejprve si necháme na ledové tříšti vychladit elektroporační cely. Pak jako první otestujeme připravené elektrokompetentní buňky. Pokud je koncentrace buněk příliš vysoká nebo se v roztoku nachází příliš mnoho nečistot (hlavně solí!), při elektroporaci dojde ke vzniku elektrického oblouku (charakteristické "střílení") a k transformaci nedojde. V tomto případě je nutné znovu opakovaně promývat buňky 1 M sorbitolem (Viz. Poslední bod předchozí části) a případně snížit jejich množství. Při zkratu může dojít i k vystřelení víčka cely a hrozí nebezpečí zranění např. oka, proto dbej opatrnosti a při udělení elektropulzu chraň svůj zrak!

31



80 l připravených elektrokompetentních buněk přepipetujeme na dno předem vychlazené elektroporační cely. Pro každou transformaci použijeme vždy novou vychlazenou celu.



Připravíme si novou sterilní 1,5 ml mikrozkumavku, do které napipetujeme 300 μl 1M sorbitolu a zároveň si vybalíme ultraúzkou Pasteurovu pipetu.



Celu důkladně osušíme (papírovým ručníčkem) a vložíme do elektroporátoru nastaveného na 1.500 kV. Udělíme pulz a výsledek konzultujeme s vedoucím cvičení. Pokud jsou hodnoty pulzu dostatečné (ideální je 5 ms), je možno přistoupit k vlastní transformaci buněk. V opačném případě znovu promýváme buňky ledovým 1 M sorbitolem a znovu otestujeme hodnoty elektropulzu.



K transformaci buněk použijeme dvě množství připravené linearizované DNA: 1 l a 5 l. Nejprve provedeme transformaci s nižším množstvím, a pokud budou hodnoty pulzu dostatečné, transformaci zopakujeme s vyšším množstvím DNA.



80 l připravených elektrokompetentních buněk přepipetujeme na dno předem vychlazené elektroporační cely a k buňkám přidáme zvolené množství linearizované plasmidové DNA, důkladně promícháme špičkou a ponecháme inkubovat 5 min na ledu.



Celu důkladně osušíme, vložíme do elektroporátoru a provedeme pulz při 1.500 kV.



POZOR! Okamžitě po proběhnutí elektropulzu napipetujeme do cely připravených 300 μl 1 M sorbitolu a jemně promícháme pipetováním. Buňky v sorbitolu přeneseme zpět do mikrozkumavky.



Inkubujeme při 30°C 1-2 hod bez třepání.



Buňky rozetřeme tyčinkou ve tvaru L (hokejkou) na YPDS selekční agarové Petriho misky se zeocinem v množstvích 80, 120 a 200 μl. Pro selekci použijeme transformaci s větším množstvím plasmidové DNA (pokud byla úspěšná).



YPDS Petriho misky inkubujeme při 30°C 3 dny.

5. DEN 

Pro proteinovou expresi použijeme expresní YPD médium, pH 7.2. Ve sterilních zkumavkách inokulujeme 1,5 ml média jednotlivými koloniemi kvasinek po transformaci (3 kolonie = 3 zkumavky) a dvě další zkumavky inokulujeme netransformovanými kvasinkami.



Všechny zkumavky necháme inkubovat dva dny na třepačce při 30°C exprimuje se rekombinantní enzym.

7. DEN f) Měření aktivity rekombinantního enzymu Po 2-3 dnech změříme aktivitu PAO v médiu vybraných transformantů. 

Kultury kvasinek přeneseme do 1,5 ml mikrozkumavky.



Centrifugujeme při 5.000 g, 5 min, supernatant použijeme pro stanovení enzymové aktivity.



Nastavíme měření počáteční rychlosti na spektrofotometru, použijeme následující hodnoty: vlnová délka 515 nm, doba měření 300 sekund, počáteční 32

čas 10 sekund, čas jednoho cyklu 15 sekund. Rychlost bude stanovena v časovém rozmezí 10-150 sekund. 

Provedeme měření počáteční rychlosti reakce ve spektrofotometrické kyvetě: k 0,1 ml supernatantu z každé nastavené exprese v mikrozkumavkách přidáme 1,55 ml premixu AAP/DCHBS. Důkladně promícháme a odečteme pozadí (BLANK).



Enzymovou reakci iniciujeme přidáním 50 mM spermidinu: stiskneme tlačítko START a do kyvety okamžitě přidáme 35 μl substrátu, promícháme pipetováním.



Měříme rychlost reakce v daném časovém rozmezí (10-150 sekund), případné nejasnosti konzultujeme s vedoucím cvičení.

Uchovávání získaného materiálu Misky a tekuté kultury s kvasinkami uchováváme po inkubaci v lednici při 4°C. Po ukončení laboratorní úlohy veškerý zbylý transgenní materiál a zbylou DNA zlikvidujeme dle pokynů o nakládání s GMO.

Vyhodnocení výsledků 1) Vypočítáme aktivitu PAO v nkat (nmol vznikajícího produktu za sekundu) exprimované kvasinkami v 1 ml média. Barevný adukt, který stanovujeme, má ε515 = 2,6.104 M-1cm-1. 2) Co je to GAP promotor, jmenujte aspoň jeden další konstitutivní promotor, který by se dal využít v expresním systému Pichia pastoris? Jaké jiné typy promotorů by šlo v tomto systému použít? 3) Navrhněte postup, metodu, jak by se dala potvrdit integrace linearizovaného plasmidu do genomu kvasinky?

Literatura 

Cona A. et al. (2006). Flavin-containing polyamine oxidase is a hydrogen peroxide source in the oxidative response to the protein phosphatase inhibitor cantharidin in Zea mays, L. J Exp Bot. 57(10), 2277-2289.



Ausubel F.M. et al. (1990). Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates, New York.



Artiss J.D. & Entwistle W.M. (1981). The application of a sensitive uricase– peroxidase couple reaction to a centrifugal fast analyser for the determination of uric acid. Clinica Chimica Acta 116, 301–309.

33

Laboratorní úloha č. 4 PCR screening vybraných genů z lambda FIX II genomové knihovny ječmene Cíl laboratorní úlohy Naučit se pracovat s genomovou knihovnou, namnožit ji za použití bakteriofága, stanovit titr bakteriofága, identifikovat vybrané geny v připravené genomové knihovně pomocí PCR. Očekávaný výsledek Potvrzení přítomnosti vybraných genů v genomové (Hordeum vulgare) namnožené pomocí bakteriofága lambda.

knihovně

ječmene

Teoretický úvod V poslední době se pro hledání konkrétních genů daného organismu začalo využívat jejich DNA knihoven. DNA knihovna je soubor fragmentů DNA příslušného organismu naklonovaný do určitého vektoru. Podle původu DNA lze knihovny dělit na dva základní typy: genomové knihovny - představují soubor fragmentů získaných štěpením celého genomu a cDNA knihovny připravené z fragmentu cDNA získaných zpětnou transkripcí mRNA izolované z buněk určité tkáně v daném vývojovém stádiu organismu. Jeden organismus proto může mít pouze jednu genomovou knihovnu kdežto cDNA knihoven lze připravit mnoho typů. Dalším kritériem pro klasifikaci DNA knihoven pak může být použitý typ klonovacího vektoru. Při konstrukci genomových knihoven závisí výběr vektoru na velikosti genomu. Plasmidy jako vektor se používají hlavně pro virové genomy, jelikož umožňují nést pouze krátké fragmenty cizorodé DNA. Pro konstrukci knihoven eukaryotických organismů se nejčastěji používají vektory odvozené od bakteriofága lambda a kosmidy, případně umělé kvasinkové a bakteriální chromosomy (YAC, BAC) s velkou klonovací kapacitou. V závislosti na použitém vektoru je pak plasmidová nebo kosmidová knihovna tvořená suspenzí bakterií, fágová knihovna suspenzí fágových částic a knihovna YAC souborem kvasinkových kmenů. Důležitou charakteristikou každé genomové knihovny je její velikost, která udává minimální počet klonů, který zaručuje, že v ní bude obsažen celý genom. Velikost knihovny určitého organismu lze vypočítat podle vzorců, do nichž je dosazována průměrná velikost insertů použitého vektoru, celková velikost genomu a faktor vyjadřující pravděpodobnost s jakou bude knihovna obsahovat celý genom. Např. genomová knihovna člověka, jehož genom má velikost 2,8x109 bp, připravená pomocí bakteriofága lambda jako vektoru s průměrnou velikostí klonovaných fragmentů 20 kb, musí obsahovat alespoň 6,5x105 klonů, aby bylo s 99% pravděpodobností zaručeno, že nese celý genom.

34

Obrázek 11. Konstrukce genomové knihovny v substitučním vektoru bakteriofága Lambda FIX II vektor patří mezi substituční vektory, u nichž cizorodá DNA nahrazuje střední úsek genomu bakteriofága, který je z něj restrikčními endonukleasami před vložením cizorodé DNA vyštěpen (Viz. Obr. 11). Klonovací kapacita vektoru je mezi 9-23 kb. Systém lambda FIX II využívá selekce založené na citlivosti k inhibici profágem P2 hostitele. Lambda fágy obsahující aktivní geny red a gam nejsou schopný růst na hostitelském kmeni obsahující P2 lysogeny. Lambda fágy bez těchto genů rostou na P2 lysogenních kmenech, jako je např. kmen E. coli XL1-Blue MRA (P2). Red a Gam geny jsou situovány v substitučním středním fragmentu fágova genomu, proto divoký typ lambda FIX II fága nemůže růst na bakteriálních buňkách XL1-Blue MRA (P2). Po vložení fragmentů genomu cílového organismu se fág stává Red-/Gam-. Proto pěstování knihovny na XL1-Blue MRA (P2) kmeni selektuje pouze rekombinantní fágy a umožňuje tak množit a používat knihovnu aniž by docházelo ke ztrátám insertů. Nedoporučuje se však knihovnu přepěstovávat více než jednou, jelikož pomaleji rostoucí klony (ty s většími inserty) mohou být v knihovně výrazně potlačeny. Komerčně získaná lambda FIX II genomová knihovna z ječmene byla připravená z genomové DNA izolované z etiolovaných listů osmidenních semenáčků Hordeum vulgare varieta Igri. Izolovaná DNA byla před vložením do vektoru naštípána restrikční endonukleasou Sau3A I. 35

Obrázek 12. Princip hybridizace kolonií plasmidové knihovny s radioaktivně značenou DNA sondou. Pro vyhledávání konkrétních genů v knihovně existuje několik způsobů. Nejčastěji se využívají DNA sondy. Ty mohou být připravené přepisem mRNA z tkáně, v níž dochází k silné expresi hledaného genu. Fragment této DNA je pak označen buď radioaktivně, nebo fluorescenčně a použit jako hybridizační sonda. Popřípadě může být jako základ pro sondu použita sekvence DNA genu příbuzného organismu. Řada genů vyznačujících se stejnou funkcí obsahuje konzervativní sekvence s vysokým stupněm homologie. Lze také využít synteticky připravených oligonukleotidů odvozených ze sekvence aminokyselin proteinu, kódovaného hledaným genem. Vzhledem k degeneraci genetického kódu je obvykle třeba použít několika alternativních sekvencí dohromady tzv. degenerované oligonukleotidy. Rozpěstováním knihovny na Petriho miskách a následnou hybridizací s DNA sondou po přenesení plaku či bakteriální kolonie na vhodnou membránu lze pak vybrat konkrétní klon mající v insertu hledaný gen (Viz. Obr. 12). Fágovou částici či plasmid rostoucí na vybrané kolonii lze pak namnožit, lambda DNA či plasmidovou DNA izolovat a sekvenovat. Alternativní cestou pro hledání konkrétního genu je pak amplifikace genové DNA pomocí PCR, kde je jako matrice použitá lambda DNA izolovaná z rekombinantních bakteriofágů dané knihovny. Pokud známe 5´ a 3´ konce genu, lze na základě jejich sekvence navrhnout nedegenerované oligonukleotidy (primery) a jednou amplifikací získat celý gen. Většinou však známe pouze část sekvence a v takovém případě pak lze pro amplifikaci využít specifických primerů odpovídajících sekvenci T3 a T7 promotorů bakteriofága v kombinaci s jedním genově specifickým primerem. Výsledkem je často nespecifická amplifikace. Selekci lze pak provést následnou odstupňovanou tzv. nested PCR, kdy se použije pro amplifikaci genově specifický primer vzdálený několik desítek bází od prvního primeru ve směru amplifikace. Amplifikovaný úsek však může dosahovat délky až 23 kb (velikost insertu), v takovém případě je pak vhodné pro PCR používat speciálně upravené rekombinantní Taq DNA polymerasy v tzv. LA-PCR (LA - long and accurate).

36

Materiál a chemikálie 

Genomová knihovna z ječmene v lambda FIX II vektoru – zásobní titr, uchováván při -80C



Bakteriální kultura E. coli XL1-blue MRA (P2) rozpěstovaná na LB agarové plotně



NZY agar (1,0% NZ amin, 0,5% kvasnicový extrakt, 0,2% MgSO4, 0,5% NaCl a 1,5% agar, pH 7,5)



SM médium (50 mM Tris/HCl, pH 7,5; 0,1 M NaCl, 0,01 M MgSO4.7H2O, 0,01% želatina)



LB médium (1,0% trypton, 1,0% NaCl, 0,5% kvasnicový extrakt, pH 7,0)



10 mM MgSO4.7H2O



NZY Top agar (1,0% NZ amin, 0,5% kvasnicový extrakt, 0,2% MgSO4, 0,5% NaCl a 0,7% agar, pH 7,5)



Roztok polyethylenglykolu 6000 30% s 3M NaCl



RNasa A



Chloroform



DMSO (dimethyl sulfoxid)



PCR reagencie: PCR voda, 10x PCR pufr, dNTP mix, primery pozitivní (fw) a negativní (rev), Taq DNA polymerasa



Agarosa 3% v 1x TAE pufru (40 mM Tris-kyselina octová, 1 mM M EDTA, pH 8,0)



Zásobní elektrodový pufr 10x TAE (400 mM Tris-kyselina octová, 10 mM EDTA, pH 8,0)



Vzorkovací pufr (Loading buffer) 6x: 50% glycerol, 50 mM EDTA pH 8,0; 0,125% bromfenolová modř, 0,125% xylenová violeť



Ethidium bromid 10%



DNA standard GeneRuler 50 bp marker a DNA standard GeneRuler 100 bp marker


Petriho misky  90 mm a  150 mm, sterilní mikrozkumavky 1,5 ml, 0,5 ml, 0,2 ml, sterilní skleněné zkumavky 10 ml, sterilní kultivační baňky a sterilní centrifugační kyvety, mikrovlnná trouba, inkubátor 37C a 30C, mrazící stojánek -20°C, chladící PCR stojánek, třepačka, elektroforéza, horizontální elektroforetická komůrka s hřebínky, zdroj, stolní pikofuga, stopky, vortex, chlazená mikrocentrifuga pro izolaci DNA, ledová lázeň, termocykler, termoblok, transluminátor, AlphaDigiDoc (systém pro digitální fotodokumentaci gelů), automatické pipety a špičky, Hamiltonova pipeta, spektrofotometr, kyveta.

37

Experimentální postupy 0. DEN (provede vedoucí cvičení) a) Příprava hostitelského kmene E. coli XL1-blue MRA (P2) Pracujeme sterilně v laminárním boxu! 

Na LB agarovou Petriho misku sterilní kličkou rozetřeme ze zamražené zásobní mikrozkumavky E. coli XL1-blue MRA (P2).



Inkubujeme přes noc při 37ºC (připraveno v lednici).

1. DEN b) Příprava hostitelského kmene E. coli XL1-blue MRA (P2) Pracujeme sterilně v laminárním boxu! 

Z LB agarové Petriho misky inokulujeme sterilní kličkou jednu kolonii E. coli XL1-blue MRA (P2) do 2 ml LB média s 0,2% maltosou a 10 mM MgSO4 a necháme růst přes noc při 30ºC na třepačce 150 rpm.



Pěstování na 30C zajišťuje, že buňky nedorůstají do stacionární fáze a neumírají. Bakteriofág je totiž schopen adheze na mrtvé buňky stejně dobře jako na živé a snižoval by se tím titr.

2. DEN 

Narostlou kulturu přelijeme do 2 ml mikrozkumavky a centrifugujeme 10 min při 2.000 g.



Opatrně odlijeme medium a buňky jemně suspendujeme ve 2 ml 10 mM MgSO4. Nevortexujeme!



Buňky naředíme na OD600=0,5 pomocí 10 mM MgSO4 a rozdělíme po 200 μl do 5 sterilních mikrozkumavek.

c) Stanovení titru bakteriofága obsahujícího genomovou knihovnu 

Připravíme si Petriho misky s pevnou půdou NZY agaru pro kultivaci plaků rekombinantního lambda fága na lysogenním kmeni E. coli XL1-blue MRA (P2).



Pod dohledem vedoucího cvičení si v mikrovlnné troubě rozpustíme NZY agar v zásobní láhvi.



V laminárním boxu si nachystáme 5 sterilních Petriho misek a po ochlazení na zhruba 60C na ně nalijeme NZY agar, tak aby kompaktně pokryl dno.



Po ztuhnutí agaru Petriho misky dáme vyschnout do zadní části laminárního boxu, tak že víko misky nepatrně nadzvedneme. Pracujeme sterilně!



Připravíme si ředící řadu bakteriofága.



Nachystáme si pět 0,5 ml mikrozkumavek do první napipetujeme 18 l SM média a přidáme 2 l zásobního titru bakteriofága.

38



Do dalších mikrozkumavek pak pipetujeme 18 L SM média a přenášíme vždy 2 l roztoku z předchozí mikrozkumavky. Vytvoříme tím řádu 5 roztoků bakteriofága vždy s desetkrát nižší koncentrací.



Podíl 10 l z každé mikrozkumavky pak přeneseme do nové čisté a sterilní mikrozkumavky a přidáme 200 l bakteriálních buněk lysogenního kmene XL1-blue MRA (P2) suspendovaných v 10 mM MgSO4 a naředěných na OD600=0,5.



Buňky s fágem pak necháme inkubovat 15 minut při 37C za mírného třepání.



Mezitím si rozpustíme v zásobní láhvi NZY Top agar v mikrovlnné troubě.



Do pěti sterilních skleněných 10 ml zkumavek si napipetujeme 2,5 ml horkého NZY Top agaru a poté, co se agar ochladí přibližně na 50°C (poznáme tak, že na zkumavce jsme schopni udržet ruku) přidáme bakterie s fágem, rychle rozmícháme a okamžitě naléváme na NZY agarové Petriho misky.



Opatrným krouživým pohybem rozlijeme agar kompaktně po celé ploše a necháme ztuhnout.



Po ztuhnutí Petriho misky obrátíme a inkubujeme přes noc při 37C.

d) PCR amplifikace vybraného genu 

Jako templáty pro PCR použijeme zbylých 8 l ředící řady amplifikované genomové knihovny, kterou předem povaříme 5 min v termobloku při teplotě 95°C.



Povařením narušíme kapsidu bakteriofága a umožníme tak jeho DNA kontakt s ostatními reagenciemi v PCR zkumavce.



Nastavíme si dvě řady po sedmi PCR reakcích: pro pět různých koncentrací templátu (bakteriofága), zásobní titr knihovny a negativní kontrolu bez templátu.



Do 0,2 ml PCR zkumavek na chladicím PCR stojánku pečlivě pipetujeme (v PCR boxu) reagencie v tomto pořadí: 15,00 μl PCR vody 2,50 μl 10x PCR pufru 0,50 μl 10 mM dNTP mix 1,00 μl fw primeru, primery pipetujeme na stěnu zkumavky 1,00 μl rev primeru 4,00 μl DNA templátu z ředící řady bakteriofága



Reakci zahájíme přídavkem 1 μl Taq DNA polymerasy (pozor, enzym udržujeme během pipetování v mrazícím stojánku!), PCR zkumavku krátce vortexujeme, stočíme a okamžitě vložíme do vyhřátého termocykléru s následujícím PCR programem: 1. Počáteční denaturace 94°C, 3 min 2. Denaturace 94°C, 30 s 3. Navázání primerů (annealing) x °C, 30 s 4. Růst řetězce (elongace) 72°C, 1 min 8. Kroky 2-4 opakovat 30-35x 9. Koncová elongace 72°C, 10 min 10. Chlazení 10°C, 3 min

39



Provedeme tzv. „Hot Start“, který zabraňuje nespecifickému navázání primerů na templát během počátečního vyhřívání termocykléru. PCR zkumavky uchováváme v chladicím stojánku až do doby, kdy je termocyklér zahřátý na počáteční 3 min denaturace při 94°C, poté otevřeme víko a opatrně vložíme PCR zkumavky.



Teplotu annealingu zvolíme podle Tm použitých primerů.

Sekvence použitých primerů: pro gen rRNA 18S podjednotky ribosomu: pozitivní 18srrRNAfw negativní 18srrRNArev

5´-CCA TCC CTC CGT AGT TAG CTT CT-3´ 5´-CCT GTC GGC CAA GGC TAT ATA C-3´

Tm= 62°C Tm= 62°C

pro gen tRNA-leucinu: pozitivní CP3 negativní CP4



5’-CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG-3’ 5’-GGG GAT AGA GGG ACT TGA AC-3’

Tm= 59°C Tm= 59°C

Během PCR si připravíme elektroforézu v 3% agarosovém gelu.

e) Agarosová elektroforéza DNA 







Do připravení komůrky nalijeme asi 0,8 cm vrstvu agarosy s ethidiem, cca 1 cm od čela komůrky vložíme hřebínek a ujistíme se, že hřebínek zasahuje minimálně polovinou výšky zubů do vrstvy nalité agarosy. Gel ponecháme ztuhnout, cca 30 min.



Během tuhnutí gelu si připravíme vzorky: Ke vzorkům po PCR (25 l) pipetujeme 5 l vzorkovacího pufru.



Po ztuhnutí gelu opatrně odstraníme hřebínek a postranní plastové desky a připravený gel na podnosu vložíme do elektroforetické vany.



Nalijeme cca 200 ml elektrodového pufru 1x TAE tak, aby hladina splývala s agarosovým gelem.



Do připravených jamek pipetujeme standardy a vzorky.



Jako první pipetujeme standard, použijeme 5 μl DNA 100 bp GeneRuler marker.






Jako poslední pipetujeme druhý standard, 5 μl markeru DNA 50 bp GeneRuler.

40







Uchovávání získaného materiálu Veškerý zbylý transgenní materiál a zbylou DNA zlikvidujeme dle pokynů o nakládání s GMO.

Vyhodnocení výsledků 1) Stanovení titru genomové knihovny: Poté co nám narostou plaky na Petriho miskách, vybereme vhodnou Petriho misku a spočteme na ní celkový počet plaků. Lze si pomoci rozdělením prostoru Petriho misky na několik sektorů. Podle následujícího vzorce pak spočteme hodnotu pfu (plaque forming unit): pfu/ml = N x f/ d - kde N je počet plaků na Petriho misce - kde f je hodnota ředění pro přepočet na ml, čili jaký objem knihovny fágového lyzátu, který byl na Petriho misku použit - d je hodnota ředění zásobní knihovny fágového lyzátu 2) Určete při jak velké koncentraci virových částic (pfu) lze ještě detekovat v knihovně geny pro ječmennou 18srRNA a tRNA leucinu. 3) Pomocí DNA markeru a softwaru AlphaDigiDoc 1206 určete velikost amplifikovaných úseků genů a hodnotu ověřte v databázi GenBank na internetu. 4) Proč se pro rozpěstování knihovny používá ředění v několika koncentracích?

Literatura 

Sambrook J. et al. (2001). Molecular Cloning: A laboratory Manual, Third Ed., Vol. 1, pp. 2.69 – 2.81. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.



Ausubel F.M. et al. (1990). Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, New York.



Alberts B. et al. (1998). Essential Cell Biology, Garland Publishing, New York.



Rozsypal S. a kol. (2002). Úvod do molekulární biologie, třetí vydání, díl čtvrtý, Grafex, Blansko.

41

Laboratorní úloha č. 5 Izolace RNA z rostlin a následná kvantitativní RT-PCR vybraných genů Cíl laboratorní úlohy Naučit se izolaci RNA, přepis do DNA, nastavit experiment pro real-time qPCR, detekovat expresi genů, analyzovat expresní profil. Očekávaný výsledek Stanovení exprese vybraných genů v kukuřici v odpovědi na aplikovaný cytokinin. Teoretický úvod Reverzně přepisovaná polymerasová řetězová reakce (neboli RT-PCR) je metoda používaná pro amplifikaci cDNA (jednovláknová, tzv. single stranded - ssDNA, komplementární ke specifické RNA). Pomocí RT-PCR se nejčastěji amplifikují a následně klonují 5´ a 3´ konce mRNA (tzv. EST klony, expressed sequence tag) nebo cDNA knihovny, využívané pro hledání nových genů. RT-PCR může být také velmi snadno adaptována pro identifikace mutací a polymorfismu v přepisovaných genových sekvencích anebo pro kvantifikaci exprese jednotlivých genů, když je množství izolované mRNA malé a nedostačující pro techniku Northern blotu. Prvním krokem RT-PCR je vždy enzymová konverze RNA nebo specifické mRNA do jednovláknové cDNA kdy je deoxyribonukleotidový primer hybridizován s RNA a řetězec DNA následně prodloužen RNA-dependentní DNA polymerasou (EC 2.7.7.49, reverzní transkriptasou). Druhým krokem pak je klasická PCR se dvěma genově specifickými primery, pro kterou je jako templát využita RT reakcí vzniklá cDNA. Deoxyribonukleotidové primery pro RT mohou být trojího typu (Viz. Obr. 13): 

Oligo(dT) primer, který se specificky váže na polyA konec, který je přítomen v 98% procentech všech zralých eukaryotických mRNA. RT reakcí pak vzniká cDNA obsahující kompletní informaci mRNA.



Genově specifický primer, který hybridizuje pouze s jednou konkrétní mRNA nebo příbuznou skupinou mRNA. Genově specifické primery pro následující PCR pak musí samozřejmě ležet uvnitř přepsané sekvence po RT. Pokud je to možné, doporučuje se také navrhnout každý primer (negativní i pozitivní) tak, aby ležely každý na jiném exonu. Touto strategií lze pak velice jednoduše při vyhodnocení PCR rozlišit mezi správnou RT-PCR amplifikací a amplifikací, která vznikla na podkladě kontaminující genomové DNA, která se často v RNA vzorcích nachází.



Náhodné hexanukleotidové primery (random hexamers) jsou schopny se vázat a zahajovat syntézu cDNA na mnoha místech podél celého RNA templátu. Jedná se o směs krátkých šestinukleotidových fragmentů, ve kterých jsou vygenerovány všechny možnosti kombinací čtyř nukleotidů (A,G,C,T). Používá se především, pokud je templát mRNA extrémně dlouhý (přes 3.000 bp) nebo když má cílová mRNA komplikovanou sekundární strukturu.

42

Ve většině případů je cílem vytvořit co nejdelší cDNA a proto se pro navržení genově specifického primeru nejčastěji využívá nekódující sekvence 3´ konce. Druhou volbou je použití nespecifického oligo(dT) primeru. Pokud oba přístupy selžou, přichází na řadu použití random hexamer primerů. Nejrychlejším způsobem provedení RT-PCR je tzv. jednozkumavková reakce s genově specifickým primerem pro RT, kdy po proběhnutí RT reakce se pouze přidá druhý genově specifický primer a termostabilní polymerasa a pokračuje se s PCR. Nejčastějším problémem RT-PCR je izolace kvalitní RNA. Jednovláknová molekula RNA je daleko méně stabilní než DNA a proto je i její životnost velice limitována. Navíc všudypřítomné RNA endonukleasy (RNasy), které RNA likvidují, jsou velice aktivní enzymy, které pracují v široké škále pH, teplot, a to i bez přítomnosti kofaktoru. Během izolace a při následné RT reakci je proto nutno vzorek RNA před vlivem těchto enzymů chránit dodržováním specifických podmínek manipulace a používáním pouze speciálně ošetřeného skla a plastiku, viz Laboratorní řád molekulárně-biologické laboratoře (Nutno mít na paměti, že největším zdrojem RNas jsme my sami! Proto pracujeme v rukavicích, kterými se nedotýkáme naší pokožky!). Přesto často dochází k degradaci a fragmentaci mRNA populace a to hlavně od 5´ konce, který není tak dobře chráněn a stabilizován polyA sekvencí jako 3´ konec. U některých genů je proto velice těžké získat a amplifikovat genetickou informaci jejich počátku.

Obrázek 13. Princip RT-PCR reakce s využitím genově specifického primeru, oligo(dT) primeru nebo random hexamer primerů. 43

Klíčovým enzymem RT-PCR je reverzní transkriptasa, enzym sloužící jako hlavní katalytická jednotka RNA virů, které s jeho pomocí přepisují svou genetickou informaci z RNA do DNA pro její následné začlenění do genomu napadeného hostitele. V současné době se v molekulární biologii využívají reverzní transkriptasy ze tři zdrojů: 

AMV RT: enzym izolovaný z viru ptačí myeloblastosy (avian myeloblastosis virus). Kromě RT aktivity, má enzym navíc RNasa H aktivitu, která může rozštěpit delší fragmenty RNA templátů. Optimální teplota enzymu je 42°C.



MoMLV RT: enzym z Molonyho viru myší leukémie (Moloney strain of murine leukemia virus). Aktivita RNasy H je daleko slabší, jeho teplotní optimum je nižší (37°C), proto není příliš vhodný pro templáty se složitou sekundární strukturou.

Komerčně dostupné jsou i mutované verze obou enzymů, které mají inhibovanou RNasovou aktivitu a vyšší teplotní stabilitu (do 50°C). Tyto rekombinantní enzymy jsou proto vhodnější pro RT delších RNA templátů se složitou sekundární strukturou. 

Termostabilní Tth DNA polymerasa: vykazuje aktivitu reverzní transkriptasy v přítomnosti Mn2+ iontů a je proto využívaná hlavně tam, kde je třeba provádět rutinní a rychlé RT-PCR. Pro oba kroky totiž stačí jediný enzym a obě reakce běží současně. Nevýhodou tohoto enzymu je krátká délka syntetizovaných cDNA (do 2 kb) a nemožnost využití oligo(dT) a random hexamer primerů z důvodu jejich nízké teploty hybridizace (při optimální teplotě enzymu a PCR se tak netvoří stabilní RNA-DNA hybrid).

Pomocí RT-PCR lze kvantifikovat míru exprese jednotlivých genů, tzn. zjistit množství molekul jejich specifické mRNA zastoupené v populaci mRNA izolované z určitého ontogenetického stádia organismu, specifické tkáně či pletiva. Nutností je ovšem společně se specifickými geny analyzovat i expresi genu srovnávacího neboli referenčního. Jako srovnávací geny se nejčastěji používají tzv. provozní (housekeeping) geny. Jsou to geny kódující proteiny, které jsou v organismech esenciální, tzn. zastoupeny ve všech stádiích života organismu ve většině tkání či pletiv. Tyto geny jsou vždy exprimovány pod konstitutivními promotory, což znamená, že jejich exprese je za všech podmínek stejná a nebývá ničím ovlivňována. Nejčastěji používanými srovnávacími geny v rostlinné říši jsou geny kódující strukturní protein β-aktin, nebo klíčový enzym glykolýzy glyceraldehyd 3-fosfátdehydrogenasu (GAPDH). Pro kvantifikaci genové exprese se dříve používalo (vedle metody Northern blotu) semikvantitativní RT-PCR, kdy se na agarosovém gelu vizuálně porovnávaly intenzity amplifikovaných produktů vůči produktům provozního genu v jednotlivých vzorcích. V současnosti jsou tyto metody intenzivně nahrazovány PCR s odečtem produktu v reálném čase. Aby bylo možno kvantitativně odečítat signál DNA vznikajícího produktu, přidává se ke vzorku fluorescenční barvivo a to ve dvou různých formách – nespecificky nebo specificky. V prvním případě je barvivo přítomno v premixu pro PCR kdy nespecificky interkaluje s jakoukoli dvouřetězcovou DNA včetně predominantního amplikonu. Nejčastěji používaným nespecifickým fluorescenčním barvivem je tzv. SybrGreen, se kterým budeme pracovat v této úloze. V druhém případě je barvivo vázáno na specifickou sondu komplementární k amplikonu, ze které se uvolňuje fluorescence po rozštěpení 5´-3´exonukleasovou aktivitou termostabilní DNA polymerasy po specifickém navázání na templát. DNA specifických sond se používá celá řada a jakkoli se od sebe strukturně liší, fungují 44

všechny na stejném principu využívajícím exonukleasové aktivity termostabilní DNA polymerasy používané v kvantitativní RT-PCR. Nejčastěji používanými sondami jsou pak sondy TaqMan. V případě chemismu SybrGreen vzniká fluorescence v přímé úměře na množství vznikajícího amplikonu. Ta je však detekovatelná pouze během denaturační fáze každého amplifikačního cyklu, kdy je z dvoušroubovice vlivem vysoké teploty fluorescence uvolněna díky oddělení obou vláken amplikonu od sebe. Odečet uvolňované kumulující se fluorescence umožňuje speciální typ termocykléru (tzv. real-time termocyklér), do kterého jsou kromě standardního termobloku nainstalovány i excitační lampy a detekční zařízení (fotodiody nebo CCD kamera) umožňující indukci a detekci fluorescenčního signálu. Software termocykléru vyhodnocuje vznikající fluorescenci v jednotlivých zkumavkách v závislosti na počtu cyklů. U výsledných křivek se určují tak zvané Ct (treshold cycle) hodnoty, což je počet cyklů, kdy křivka překročí limit detekce fluorescence. Vzájemným porovnáním Ct hodnot mezi sledovanými vzorky pro studovaný gen a gen provozní pak lze získat relativně přesný údaj o změně exprese genů ve studovaném vzorku vůči vzorku kontrolnímu. Existuje pak řada metod pro vyhodnocení míry exprese, kdy nejjednodušší je vyhodnocení metodou tzv. deltadelta Ct :

R=2

–ΔΔCt

Kde  Ct =  Ct vzorek -  Ct kontrola  Ct = Ct studovaný gen - Ct gen provozní

Výsledná míra exprese sledovaných genů je pak vyjádřena jako násobek hodnoty exprese kontrolního vzorku. Předpokladem úspěšného použití této vyhodnocovací metody je shodná efektivita amplifikace všech používaných primerů. Výhodou použití chemismu SybrGreen oproti DNA specifickým sondám je možnost analýzy denaturačních křivek, která nám umožňuje posoudit i kvalitu vzniklých amplikonů. Jednoduše řečeno, dva různé amplikony (vznikající současně v jednom vzorku) lišící se od sebe počtem párů bazí a jejich zastoupením v sekvenci potřebují ke své denaturaci různě vysokou teplotu. A právě tato rozdílná teplota vypovídá o kvalitě vzorku. Analýza denaturační křivky následuje po skončení cyklování PCR, kdy již reakce obsahuje veškeré množství vzniklého produktu (amplikonu). Poté následuje fáze, ve které je reakce postupně po mírných přírůstcích zahřívána v rozsahu teplot předpokládaných pro denaturaci amplikonu. Při zahřátí reakce na teplotu denaturace amplikonu dochází k oddělení DNA vláken a tím k uvolnění fluorescence. Při této teplotě tak vzniká maximum v množství uvolněné fluorescence odpovídající kvalitě amplikonu. Jednomu amplikonu náleží vždy pouze jedna teplota denaturace a proto, pozorujeme-li ve vzorku více maxim detekované fluorescence, vypovídá to např. o nespecifitě použitých primerů, kdy dochází ke vzniku více produktů. Materiál a chemikálie



Směs fenol/chloroform (5:1, pH 4,8)



RNA extrakční reagencie TriReagent (Ambion)



1 M octová kyselina (autoklávováno) 45



Absolutní ethanol, 70% ethanol, 100% isopropanol



Chloroform



7,5 M chlorid litný s 50 mM EDTA, pH 8,0



3 M octan sodný, pH 5,2 (autoklávováno)



RNase free voda autoklavováno)



100 mM DTT (sterilizováno filtrem)



10 mM dNTP mix



5x pufr pro M-MLV reverzní transkriptasu,10x PCR pufr



50 μM oligo(dT) primer



M-MuLV reverzní transkriptasa, Taq DNA polymerasa



1,2 μM směs pozitivního (fw) a negativního (rev) primeru specifických pro daný gen



2x SybrGreen qPCR směsi obsahující koktejl všech potřebných komponent (včetně polymerasy) v optimální koncentraci



Kapalný dusík s termonádobou



Rostlinný materiál – kukuřice (Zea mays)



10 μM N6-benzyladenin s přídavkem smáčedla Silwett77 (finální koncentrace 0,05%) v rozprašovači

(deionizovaná

voda

s 0,1%

diethyl

pyrokarbonátem,


Třecí misky s tloučkem, termocyklér StepOnePlus (Life-technologies), termoblok, UV spektrofotometr, křemenná kyveta, chlazená mikrocentrifuga, stolní pikofuga, vortex, stopky, chladící PCR stojánek, automatické mikropipety, špičky s filtrem, PCR, chladící destička, kovová špachtle, mikrozkumavky 1,5 ml, PCR stripy, stojánky, mrazící stojánek -20°C.

Experimentální postupy (1. DEN) Eventuálně provede vedoucí cvičení a) Příprava biologického vzorku 

V kultivačním boxu na pěstování rostlin si vybereme dva květináče se semenáčky kukuřice a označíme si je jako kontrolu a vzorek.



Na rostlinu označenou jako vzorek aplikujeme zhruba ze vzdálenosti 15 cm z rozprašovače 10 μM roztok cytokininu (N6-benzyladenin), rozprašování aplikujeme 3x po sobě ve 3-minutových intervalech.



Takto ošetřené rostliny kultivujeme do následujícího dne.

(2. DEN) Eventuálně provede vedoucí cvičení b) Homogenizace biologického vzorku 

Připravíme si termonádobu s dusíkem pro homogenizaci a nádobu s tekutým dusíkem pro uchovávání homogenizovaných vzorků. 46



Z připravených rostlin odebereme přibližně 2 gramy listů, rozetřeme ve třecí misce na prach za pomoci tekutého dusíku a navážíme na analytických vahách pomocí vymražené kovové špachtle do 1,5 ml vymražených mikrozkumavek po 100 mg. (homogenizovaný vzorek nesmí rozmrznout! Vzorky po homogenizaci ihned uložíme do tekutého dusíku!)

1. DEN S KAPALINOU TRI-REAGENT™ PRACUJ VŽDY V ZAPNUTÉ DIGESTOŘI!!! CHRÁNÍME RNA PŘED DEGRADACÍ VŠUDYPŘÍTOMNÝCH RNas POUŽÍVÁNÍM RUKAVIC!!! NEDOTÝKAT SE VLASTNÍ POKOŽKY!!!DBÁT ČISTOTY PRÁCE!!! c) Izolace RNA Pro izolace RNA bude použita metoda založená na principu extrakce nukleových kyselin pomocí lyzačního a zároveň stabilizačního činidla Tri-Reagent a následné extrakci pomocí fenol/chloroformu. 

Ke vzorkům rychle přidáme 10-násobek (w/v) Tri-Reagentu.



Intenzivně vortexujeme po dobu 5 minut při laboratorní teplotě.



Centrifugujeme 5 minut při 14.000 g ve vychlazené centrifuze a supernatant kvantitativně přeneseme do nových 2 ml mikrozkumavek.



Přidáme pětinu objemu chloroformu (0,2 ml/1,0 ml) a pořádně promícháme (vortex) a necháme inkubovat 10 minut při laboratorní teplotě.



Centrifugujeme 10 minut při 14.000 g ve vychlazené centrifuze a horní vodnou fázi opatrně přeneseme do nové mikrozkumavky.



Přidáme 0,5 ml isopropanolu na 1 ml výchozího množství Tri-reagentu, 10 s vortexujeme a necháme 10 minut stát při laboratorní teplotě.



Centrifugujeme 8 minut při 14.000 g ve vychlazené centrifuze a supernatant opatrně odlijeme do odpadu. Před odlitím zkontrolujeme přítomnost pelety.



K peletě přidáme 1 ml 75% etanolu, mikrozkumavku protřepeme a 5 minut centrifugujeme při 8.000 g.



Opatrně odlijeme etanol, stopy etanolu ze stěn mikrozkumavky stočíme na pikofuze a zbytky odebereme pipetou tak, abychom neporušili peletu.



Peletu necháme vyschnout v laminárním boxu a rozpustíme v 45 μl RNase free vody. V tomto kroku by bylo možné stanovit koncentraci izolované RNA. Ta však může být kontaminována zbytky DNA a proto je nutné tuto kontaminující genomovou DNA nejprve ze vzorků odstranit inkubací s enzymem DNasaI.

d) Ošetření RNA DNasouI 

K připraveným reakcím přidáme 5 μl 10x DNase pufru a 2 μl DNasy, promícháme a necháme inkubovat 30 minut při 37°C.

TIP: Enzymy molekulární biologie jsou skladovány v glycerolu, při pipetování je nutné dbát postupu pro pipetování viskózních roztoků!!! Enzymy udržujeme při pipetování při -20°C pro udržení jejich aktivity!!! e) Přečištění RNA vzorku pomocí chloridu lithného  Ke vzorkům RNA ošetřených DNasouI přidáme polovinu objemu 7,5 M chloridu litného.

47

 Na 30 minut uložíme vzorky do mrazicího boxu na -20°C, poté 30 minut centrifugujeme při 14.000 g.  Supernatant opatrně odlijeme do odpadu. Před odlitím zkontrolujeme přítomnost pelety.  K peletě přidáme 1 ml 75% etanolu, mikrozkumavku protřepeme a 5 minut centrifugujeme na 8.000 g.  Opatrně odlijeme etanol, stopy etanolu ze stěn mikrozkumavky stočíme na pikofuze a zbytky odebereme pipetou tak abychom neporušili peletu.  Peletu necháme vyschnout v laminárním boxu a rozpustíme ve 20 μl RNase free vody. f) Spektrální stanovení RNA 

Odebereme 1 μl z celkové izolované RNA a vhodně naředíme do kyvety (5-10x), měříme absorbanci na 260 a 280 nm.



Pokud je RNA preparát čistý, poměr A260/A280 dosahuje hodnoty 2,1.



Přibližnou koncentraci RNA určíme z jednoduché úměry, pokud je A260=1 pak je v kyvetě 40 μg/ml RNA.

g) Reverzní transkripce 

Dbáme na to, aby ve všech připravovaných vzorcích pro kvantitativní RT-PCR bylo stejné výchozí množství RNA.



Pro každý vzorek současně připravíme kontrolu, kde všechny komponenty kromě vstupního množství RNA nahradíme Rase-free vodou, kontrolní vzorky držíme na ledové tříšti, nebo zamražené na -20°C až do nastavování kvantitativní PCR reakce.



Do malé mikrozkumavky pipetujeme 1-2,5 μg celkové RNA (maximálně v objemu 6 μl) a přidáme 0,5 μl 50 μM oligo(dT) primeru, doplníme celkový objem vodou na 6,5 μl a špičkou pipety zamícháme. Inkubujeme 5 minut při 70°C.



Ochladíme na ledu a ke vzorku přidáme 2 μl 5x koncentrovaného pufru pro MMVL reverzní transkriptasu a 1,0 μl dNTP mixu.



Mikrozkumavku krátce vortexujeme a krátce stočíme v pikofuze, inkubujeme 5 minut v inkubátoru na 37°C.



Ke vzorku přidáme 0,5 μl M-MVL reverzní transkriptasy (100 jednotek/μl), krátce vortexujeme a krátce stočíme v pikofuze.



Inkubujeme 90 minut v inkubátoru na 37°C, probíhá reverzní transkripce.



Reakci inaktivujeme zahřáním na 70°C po dobu 10 minut. Vzniklou cDNA zamrazíme na -20°C, nebo uložíme na ledovou tříšť a pokračujeme v kvantitativním RT-PCR.

48

3. DEN h) Kvantitativní PCR 

Seznámíme se se softwarem StepOne v.2.0 na PC stanici připojené k real-time termocykléru StepOnePlus a s pomocí vedoucího cvičení si vytvoříme nový experiment pro SYBR Green chemismus.

Tabulka 2. Genově specifické primery pro SYBR Green chemismus pro kvantifikaci vybraných genů metabolismu a percepce cytokininů u kukuřice. Gen Cytokininový receptor 1 Regulátor cytokininové odpovědi 1 Regulátor cytokininové odpovědi 7 Aktin 2 Elongační faktor 1

Název

Sekvence (5’-3’)

ZmHK1rt_fw ZmHK1rt_rev ZmRR1rt_fw ZmRR1rt_rev

GGCTGCACTCAAGAAGTATGGT CCTCAAACCCGTCCATCTCT TGGATGGATTTGAAGCCACAA TCTCCACGTTCTATTTGCTCATTT

ZmRR7rt_fw ZmRR7rt_rev ZmACTrt_fw ZmACTrt_rev EFrt_fw EFrt_rev

CAGAGGATCAGCAGATGCCTAA CCTTGGTCTTGAGTGGCTTGA CGACAACCTGATGAAGATCCTTACT GCAACGTAGGCAAGTTTTTCCTT GCTTCACGTCCCAGGTCATC GGGCATAGCCATTGCCTATC

Tm (°C) 81,6 81,5 80,7 80,1 79,6



V experimentu si zadáme potřebný počet vzorků a počet genů (target), které chceme detekovat (4), z čehož dvě reakce budou pro endogenní kontrolu (Aktin 2 a elongační faktor 1). Každou reakci provedeme ve třech technických replikátech. Pro každý vzorek a každou kombinaci primerů (target) nastavíme negativní reakci s RNA nepřepsanou do cDNA (netřeba dělat replikáty). Pro každou kombinací primerů nastavíme navíc negativní reakci s vodou jako templátem. Pokud máme dva biologické vzorky, nastavíme celkem 36 reakcí.



cDNA i kontrolní nepřepsanou RNA z předchozího kroku vhodně naředíme tak, aby nám její množství stačilo na všechny reakce.



Do stripů nebo PCR destičky nepipetujeme reakce v následujícím složení: Celkový objem 10,0 μl cDNA (RNA) 2,5 μl 1,2 μM směs primerů 2,5 μl 2x SybrGreen qPCR směs 5,0 μl



Stripy nebo PCR destičku správně uzavřeme, obsah krátce centrifugujeme, umístíme do bloku real-time termocykléru a spustíme amplifikaci.



Průběh reakce sledujeme v analytickém okně softwaru a po skončení vyhodnotíme.

Uchovávání získaného materiálu Po ukončení laboratorní úlohy veškerý zbylý materiál zlikvidujeme dle laboratorního řádu.

49

Vyhodnocení výsledků 1) V softwaru StepOne převeďte amplifikační křivky do logaritmické podoby a zkontrolujte proložení „threshold“ přímek tak, že procházejí lineární oblastí všech amplifikačních křivek. 2) Odečtěte výsledné Ct hodnoty pro všechny vzorky a zapište si je. 3) Metodou delta delta Ct vypočítejte změnu exprese jednotlivých genů v rostlině, na kterou byl aplikován cytokinin oproti rostlině kontrolní. 4) Pokud jste vzorky amplifikovali v chemismu SYBRGreen, zkontrolujte denaturační křivky produktů a porovnejte získané denaturační teploty s teplotami v tabulce 3. 5) Zamyslete se a zhodnoťte fyziologický význam reakce rostliny (změny exprese sledovaných genů) na exogenní aplikaci hormonu. 6) Předpokládejte, že jste dostali u sledovaného genu hodnotu Ct vzorku přesně o tři jednotky vyšší než u kontroly. Kolikrát se změnila exprese genu ve vzorku oproti kontrole za předpokladu, že Ct hodnoty provozního genu vzorku i kontroly měly stejné Ct? 970

980

990

1000

1010

1020

1030

1040 ZmEF1

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| CCTGCCAAGG AGGCTGCCAG CTTCACGTCC CAGGTCATCA TCATGAACCA CCCTGGGCAG ATAGGCAATG GCTATGCCCC 1050

1060

1070

1080

1090

1100

1110

1120 ZmEF1

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AGTGCTGGAC TGCCACACCT CCCACATCGC TGTCAAGTTT GCTGAGCTCA TTACCAAGAT CGACAGGCGC TCTGGCAAGG 1130

1140

1150

1160

1170

1180

1190

1200 ZmEF1

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AGCTTGAGAA GGAGCCAAAG TTCCTGAAGG ACGGTGATGC TGGTATGGTG AAGATGATAC CCACCAAGCC TATGGTGGTG 1210

1220

1230

1240

1250

1260

1270

1280 ZmEF1

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| GAGACATTCT CCGCGTTTCC TCCCCTTGGT AGGTTTGCTG TCCGCGACAT GAGGCAGACA GTTGCTGTTG GAGTCATCAA

ZmEF1

1290 1300 1310 1320 1330 1340 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| .... GAGTGTGGAG AAGAAGGACC CGACCGGCGC CAAGGTGACC AAGGCGGCCG CCAAGAAGAA ATGA

Obrázek 14: Příklad navržení primerů a TaqMan próby pro kvantitativní PCR pro provozní gen kódující elongační faktor 1. Zobrazená je pouze 3´-terminální část ORF genu, tučně a dvojitě podtrženy jsou pozice forward a reverse primerů, místo nasednutí TaqMan próby je šedě zvýrazněno. Literatura 

Sambrook J. et al. (2001). Molecular Cloning: A laboratory Manual. Third Ed., Vol. 2, pp. 8.46 – 8.65. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.



Logemann J. et al. (1987). Improved Method for Isolation of RNA from Plant Tissues. Anal Biochem 163, 16-20.

50



Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems Reagent Guide, manuál Applied Biosystems (2008), http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/ generaldocuments/cms_046739.pdf



TRI Reagent® Solution RNA/DNA/Protein Isolation Reagent, manuál Ambion (2008), http://www.ambion.com/techlib/prot/bp_9738.pdf

51

Vysvětlivky F´ episom je potřebný pro produkci ssDNA, kóduje protein tvořící tzv. pilus na vnější membráně E. coli tetR gen pro tetracyklinový represor, kmen roste na tetracyklinu mcrA, mcrBC, a mrr mutace v těchto genech zaručuje možnost klonování i methylované genomové DNA lacZΔM15 element potřebný pro komplementaci β-galaktosidasy pro blue/white screening na miskách s X-gal, je vložený na profágové částici Φ80 ΔlacX74 kóduje lac represor, který brání expresi z lac operonu, dereprese probíhá pomocí IPTG deoR umožňuje příjem velkých plasmidu (přes 10kb) recA1 zabraňuje rekombinaci mezi plasmidovou a bakteriální DNA endA1 deficience endonukleasy I zaručuje kvalitní izolaci plasmidové DNA rpSL (strR) gen pro resistenci ke streptomycinu lacIq produkuje lacZ represor negativně regulující transkripci z lacZ promotoru, zrušení přídavkem IPTG galK, galU mutace v genu pro galaktokinasu, blokuje metabolismus galaktosy araD139, Δ(ara, leu) 7697 mutace v ara operonu, blokuje metabolismus arabinosy supE44 supresor amber (UAG) mutace thi- mutace v genu metabolizující thiamin, kmen na minimálním médiu neroste bez thiaminu gyrA96 mutace v genu DNA gyrasy, způsobuje resistenci k antibiotiku - kyselině naxilové relA mutace umožňující syntézu RNA bez navazující proteosyntézy MATα/MATa diploidní kmen schopný pohlavního rozmnožování ura3-52 mutace v genu podílející se na biosyntéze uracilu, kvasinka neroste na minimálním médiu bez uracilu P2 lysogen slouží pro lysogenní selekci, kmen může být napaden pouze bakteriofágem s genotypem red/gam-, tzn. bakteriofágen nesoucí fragment genomové knihovny, nikoli wild-typovým Mut+ (methanol utilization +) zachovány oba geny pro alkohol oxidasu (AOX1 a AOX2), schopný růst na médiu, které má jako jediný zdroj uhlíku methanol

52

Přílohy λ DNA standardy: GeneRuler™ DNA ladders (Thermo Scientific)

50 bp

100 bp

1 kb

Používané kmeny Escherichia coli a Pichia pastoris Escherichia coli TOP10F´ Genotyp: F' (tetR), mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), Φ80 Δlac ΔM15, lacIq, deoR, recA1, araD139, Δ(ara, leu) 7697, galU, galK, rpSL (strR) endA1 Escherichia coli XL1-Blue MRA (P2 lysogen) Genotyp: Δ(mcrA)183 Δ (mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi- gyrA96 relA1 Pichia pastoris X-33Genotyp: wild type/MutS (Invitrogen)

53

LABORATORNÍ CVIČENÍ Z MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE

Recommend Documents