BIOLOGIE RÁNY Z. GROFOVÁ

BIOLOGIE RÁNY Z. GROFOVÁ

SOUHRN

KLÍÈOVÁ SLOVA

Procesy probíhající v ráně při hojení na sebe vzájemně navazují, ovlivňují se a podléhají poměrně složitému řízení. Obtížně se hojící a chronické rány, jejichž hojení neprobíhá podle základního schématu koagulace–zánět –proliferace–reparace, zůstávají obvykle po delší dobu ve fázi zánětu, což s sebou přináší dysregulace na různých úrovních. Hojení se účastní jak buněčné struktury (neutrofily, lymfocyty, mastocyty, monocyty, makrofágy, fibroblasty, keratinocyty, endotel), tak mediátory, tedy cytokiny s podtřídou růstových faktorů a proteázy, zejména skupina matrixových metaloproteáz a jejich tkáňových inhibitorů. Opakované trauma nebo ischemie vede ke zmnožení buněk, které ve větší míře produkují prozánětlivé cytokiny. Stoupá množství proteáz a objevuje se nedostatek inhibitorů. Tato nerovnováha prolonguje hojení, způsobuje odbourávání základní hmoty a umožňuje zmnožení bakterií, které dále proces zpomalují. Pochopení souhry faktorů může přispět k ovlivnění pochodů v ráně a k jejímu zhojení.

hojení ran cytokiny růstové faktory matrix metaloproteázy základní hmota kritická kolonizace

ABSTRACT

KEY WORDS

Wound biology. Wound healing processes create a very complex system of connected reactions which influence each other. Chronic and hard-to-heal wounds do not follow the basic pattern consisting of coagulation–inflammation–proliferation–reparation. They stay in the inflammatory phase for longer time. This condition can cause different levels dysregulations. Both cell structures (as neutrophils, lymphocytes, monocytes, macrophages, mastocytes, fibroblasts, keratinocytes, endothel) and mediators (as cytokines with the subgroup growth factors and proteases, esp. matrix metalloproteases plus their tissue inhibitors) are involved into the healing. Repetitive trauma or ischaemia leads to a presence of a higher number of cells producing more proinflammatory cytokines. Proteases amount increases concurrently with the lack of inhibitors. This dysbalance prolongs the healing itself. Intercellular matrix degradation speeds up while enhanced bacterial burden slows the healing down. Detailed understanding of factors coordination can help to influence the wound healing processes.

wound healing cytokines growth factors matrix metaloprotease intercellular matrix critical colonisation

ÚVOD

FAKTORY PODÍLEJÍCÍ SE NA HOJENÍ

Hojení ran je dynamický interaktivní proces. Probíhá podle relativně jednoduchého modelu, ale řízení procesu je složité. Současné znalosti této problematiky jsou již na dobré úrovni, mnohé se využívají prakticky. Normální hojení probíhá ve 4 základních fázích: hemostáza, zánět, reparace, remodelace. U akutní rány, jejíž hojení není tangováno, trvá celý proces zhruba 3 týdny. První fáze se účastní fibrin a destičky, dále nastupuje zánět se sekrecí mediátorů, které přitahují a aktivují makrofágy a fibroblasty, součástí jsou i neutrofily, mastocyty, T- a B-buňky. Proces reparace, kam řadíme epitelizaci a formaci granulační tkáně, obstarávají fibroblasty, keratinocyty, endotel. Během remodelace dochází ke kontrakci extracelulární matrix pomocí myofibroblastů. Matrix je reorganizována, je pomalu syntetizován a odbouráván kolagen. Touto přestavbou dojde ke zpevnění tkáně. Jizva však má jen 70 % pevnosti původní tkáně.

Hojení ran se účastní kromě neutrofilů také výše zmíněné mastocyty, monocyty a makrofágy [1]. Mastocyty jsou mononukleární buňky, které mají blízký vztah k lymfocytům. Zřídka jsou nalézány v krvi, vyskytují se zejména v pojivové tkáni v sousedství cév. Zvlášť hojné jsou u epitelových povrchů (dýchací ústrojí, zažívací trakt, kůže). Obsahují enzymy, receptory pro IgG, IgE, složky komplementu C3 a C5a. Jejich hlavní činností je fagocytóza. Jsou schopny améboidního pohybu. Monocyty tvoří skupinu fagocytujících buněk se shodným původem i shodnou funkcí. Řadíme mezi ně krevní monocyty, plicní a peritoneální makrofágy, Kuppferovy buňky jater, osteoklasty, histiocyty. Vznikají v kostní dřeni z kmenové buňky, putují krevním oběhem. Po 15–30 hodinách v krvi přisedají na cévní stěnu a krevní řečiště opouštějí diapedézou.

ÈES GER REV 2006; 4(3)

fáze hojení

157

BIOLOGIE RÁNY

DEVELOPMENT OF CHRONIC WOUND RELATION OF GROWTH FACTORS AND CYTOKINES

Opakované trauma nebo ischemie TNFα

IL-1β

proteáza

proteáza proteáza

proteáza

Prolongovaný intenzivnější zánět ↑ neutrofily, ↑ makrofágy, ↑mastocyty

↑ proteázy

↓ inhibitory

Růstový faktor

Obr. 1. Vztah růstových faktorů a cytokinů. ↑ ECM-degradace

↓ GF, migrace buněk

Chronická rána Schéma 1. Vývoj chronické rány. makrofágy

7 růstových faktorů

opakované trauma

158

Makrofágy jako jedna z podskupin jsou v procesu hojení velmi důležité. Produkují proinflamatorní cytokiny IL-1β a TNFα, chemokiny, proteázy a růstové faktory. Jsou schopny fagocytovat bakterie, odstraňovat drť. Jejich enzymy jsou cytotoxické. Působí proti reaktivním formám kyslíku i dusíku [1]. Hojení akutní rány probíhá ve zmíněných fázích a čase. Hojení rány chronické nebo obtížně se hojící je prolongováno a zůstává v zánětlivé fázi po různě dlouhou dobu. Klíčovými momenty jsou angiogeneze, novotvorba buněk (proliferace), tvorba mezibuněčné matrix, soužití s bakteriemi a kontrakce rány. Vlastní regulace hojení se účastní cytokiny a růstové faktory, proteázy (zejména matrixové metaloproteázy – MMP) a proti nim působící tkáňové inhibitory metaloproteáz (TIMP), dalšími účastníky jsou již jmenované buňky (neutrofily, makrofágy, mastocyty, fibroblasty, keratinocyty, endotel). Opakované trauma nebo ischemie tkáně vede samo o sobě k protrahovanému zánětu se zmnožením neutrofilů, makrofágů a mastocytů. Ty pak produkují ve zvýšené míře IL-1β a TNFα, které zánět udržují. Dalším krokem je stoupající množství proteáz a pokles jejich inhibitorů. Proteázy degradují extracelulární matrix. Nedochází k migraci buněk a je nedostatek růstových faktorů. Takovýmto způsobem je vlastně rána udržována ve fázi, kdy se jen obtížně hojí, pokud vůbec. V obtížně se hojící nebo chronické ráně dochází k dysregulaci normálních procesů a dysbalanci faktorů (schéma 1). Nadbytek proteáz není možno likvidovat nedostatečným množstvím tkáňových inhibitorů. Nadbytek zánětlivých cytokinů je provázen nedostatkem růstových faktorů. Růstové faktory mohou být

dokonce destruovány nadbytkem proteáz a zánětlivých cytokinů (obr. 1). Malá mitogenní aktivita zapadá do obrazu obtížného hojení. Za nejdůležitější mediátory považujeme proteázy, cytokiny a růstové faktory [2]. Cytokiny jsou produkty buněk, rozdělují se do několika skupin: monokiny, lymfokiny, interferony, interleukiny, kolonie stimulující faktory a růstové faktory (GF). Růstové faktory mají polypeptidovou strukturu. Mohou působit endokrinně, exokrinně či autokrinně, buněčná odpověď je zprostředkována specifickými receptory. Po aktivaci receptoru dochází ke tvorbě komplexu polypeptid – receptor, které dále působí. K inaktivaci efektu pak dojde endocytózou komplexů. Klinické účinky růstových faktorů jsou četné, patří mezi ně efekty angiogenní, osteogenní, regulace základních hojivých procesů, chemotaxe, proliferace, tvorba extracelulární matrix. Těsný vztah k hojení ran má následujících 7 růstových faktorů [3,4]: 1. destičkový (PDGF) ovlivňující fibroblast, hladký sval, stimulující chemotaxi , mitogenezi a angiogenezi 2. růstový faktor vaskulárního endotelu (VEGF) 3. bazický fibroblastový (bFGF), působí na vaskulární endotel a fibroblast, pracuje v synergii s VEGF 4. epidermální (EGF) vliv na keratinocyty, produkci fibronektinu 5. transformující růstový faktor alfa (TGFα) s účinkem na epiteliální buňky 6. transformující růstový faktor beta (TGFβ) s účinkem na monocyty, též zvyšuje syntézu kolagenu a elastinu a inhibitorů metaloproteáz, snižuje kolagenázy 7. inzulinu podobný růstový faktor 1 (insulin-like, IGF-1) působí na endotel, hladký sval, fibroblast. Byly nalezeny další růstové faktory účastnící se hojení. Mezi ně patří například:

ÈES GER REV 2006; 4(3)

BIOLOGIE RÁNY

IGF-1 Endotel IGF-1 bFGF VEGF

PDGF

bFGF Hladký sval IGF-1 PDGF

EFFECT OF GROWTH FACTORS ON FIBROBLAST

fibroblast

FGF-7

Destičky PDGF

FGF-10 T-buňky

Obr. 4. Působení růstových faktorů na fibroblast.

Obr. 2. Výskyt růstových faktorů.

TGF alfa

kolagen kolagenázy MMP-1,-8, MMP-13,-18

EGF KGF

denaturovaný kolagen

1. keratinocytový růstový faktor (KGF) ovlivňující podle názvu keratinocyty a také epitel. Tento růstový faktor je významný v ose proliferace–diferenciace–přežití–migrace, reguluje geny pro peroxiredoxin, a tím nepřímo likvidaci aktivních forem kyslíku, peroxidu vodíku, organických peroxidů a xenobiotik. 2. fibroblastové růstové faktory 7 a 10 (FGF-7, FGF-10) působící zejména na fibroblasty, jejich produkce je regulována T-buňkami. 3. fibroblastový růstový faktor 22 (FGF-22) ovlivňuje zejména keratinocyty. Pokud bychom chtěli působení růstových faktorů popsat podle cílových buněk, lze říci, že destičky jsou řízeny PDGF, hladký sval PDGF a IGF-1, endotel IGF-1, VEGF a bFGF. Na keratinocyty působí TGFα, KGF, EGF a FGF-22. Fibroblast je pod vlivem IGF-1, PDGF, bFGF, FGF-7, FGF-10 [12] (obr. 2, 3, 4). Dalšími důležitými mediátory při hojení ran jsou proteázy, enzymy štěpící bílkoviny přítomné ve všech exsudátech ran. Hrají klíčovou úlohu. Klasifikují se podle struktury aktivního místa na metaloproteázy, serinové, cysteinové a asparagové proteázy. Jsou produkovány v různých

EFFECT OF GROWTH FACTORS ON KERATINOCYTES DEGRADATION OF COLAGEN BY MATRIX METALLO− PROTEASES

FGF 22

Obr. 3. Působení růstových faktorů na keratinocyty.

ÈES GER REV 2006; 4(3)

INCIDENCE OF GROWTH FACTORS

Gelatinázy MMP-2, -9

další růstové faktory

Obr. 5. Štěpení kolagenu matrixovými metaloproteázami.

buňkách (granulocytech, keratinocytech, fibroblastech) v proaktivní nebo latentní formě a pro plné působení musí být aktivovány. Tkáňové inhibitory naopak působení proteáz omezují. Rovnováha mezi tvorbou a degradací tkáně je dána poměrem proteáz a jejich inhibitorů. Narušení rovnováhy při nadbytku proteáz a nedostatku inhibitorů udržuje pak ránu v chronicitě. Navíc nadbytek proteáz, jak již uvedeno výše, destruuje růstové faktory [13]. Nejzajímavější z hlediska hojení ran jsou matrixové metaloproteázy (MMP) [5]. Jedná se o podtřídu 17 známých zinek-dependentních endopeptidáz. Přítomnost zinku v molekule je nutná pro správnou funkci enzymu. Jsou syntetizovány jako inaktivní zymogeny a aktivují se odštěpením malého fragmentu. Jejich řízená aktivace je nezbytná, jinak by docházelo k nekontrolovanému štěpení vlastních bílkovin. Optimálně fungují za fyziologické-

další mediátory hojení

159

BIOLOGIE RÁNY

MIGRATION OF KERATINOCYTES IS ENABLED BY MATRIX METALLO− PROTEASES INFECTIOUS CONTINUUM IN THE WOUND

MMP-3 (Stromelyzin 1)

kolonizace kolagen

klasifikace enzymů

role bakterií

extracelulární matrix

160

kontaminace sterilita

MMP-10 (stromelyzin 2)

kolagen

kyselina hyaluronová

infekce 105 kritická kolonizace

keratinocyty

Schéma 2. Matrixové metaloproteázy umožňují migraci keratinocytů.

ho pH. Degradují 1 nebo více proteinů extracelulární matrix. Proteolytická aktivita je inhibována tkáňovými inhibitory (TIMP) [13]. Dřívější názvy nerozlišovaly jednotlivé enzymy, dnes je klasifikace podrobnější, číselná. Proteázy, které odštěpují jednotlivá vlákna kolagenu I od sebe (dříve kolagenázy), se dnes označují jako MMP-1, MMP-8, MMP-13 a MMP-18. Ty, které dále štěpí takto denaturovaná kolagenní vlákna na gelatin (dříve gelatinázy), jsou dnes MMP-2 a MMP-9 (obr. 5). Keratinocyty jsou povzbuzovány MMP-3 (dříve stromelyzinem 1) k proliferaci. Samy pak produkují MMP-10 (dříve stromelyzin 2), tato proteáza pak společně s MMP-1 umožňuje keratinocytům migrovat skrze kolagen (schéma 2). Kolagen IV štěpí metaloelastáza matrilyzin. Matrixové metaloproteázy jsou aktivovány též membránovými proteázami. Pokud nejsou přítomny enzymy v nadbytku a nepřevažuje-li destrukce, je jejich role v hojení ran významná. V kapilárách degradují bazální membránu obklopující kapilární endotel, a tím vlastně usnadňují angiogenenzi. Během závěrečné fáze hojení jsou MMP produkovány myofibroblasty, napomáhají přeměně a kontrakci aktinu těchto buněk, čímž dochází ke zmenšování rány kontrakcí ranné matrix. Tkáňové inhibitory jsou známy jako TIMP-1, -2, -3, -4. Popisujeme-li ránu a složitý proces hojení, musíme zmínit též základní hmotu – extracelulární matrix [6], v níž vlastně děje probíhají. Základní hmota je tvořena glykosaminoglykany, což jsou nevětvené polysacharidy obsahující deriváty uronových kyselin a hexosaminovými zbytky. Některé sloučeniny se nacházejí jako roztoky o vazké a slizovité konzistenci, která způsobuje jejich vysokou viskozitu a elasticitu.

Graf. Infekční kontinuum v ráně. Jednou z těchto sloučenin je kyselina hyaluronová, která má i další zajímavé vlastnosti. Může být dokonce použita jako náhradní matrix. Sama o sobě stimuluje formaci extracelulární matrix a jejím hlavním přínosem je udržování vlhkého prostředí v ráně. Kyselina hyaluronová [6] se vyznačuje nesmírnými hygroskopickými vlastnostmi. Je to přirozená složka pojiva, vyskytuje se mimo jiné v synoviální tekutině, ve sklivci, ale i v pouzdrech patogenních bakterií. Chemicky je to kyselina D-glukuronová s N-acetyl-D-glukosaminem, která může pevně vázat kationty sodné, draselné a vápenaté. Tato rigidní molekula je vysoce hydratovaná jednovláknová šroubovice. V roztoku zaujímá objem až 1 000krát větší proti stavu za sucha. Patří mezi biologické tlumiče nárazů a mazadla. Degraduje se hyaluronidázou. Tento enzym obsahují i bakterie. Lze říci, že odpovídá za jejich invazivitu [6]. Bakterie hrají důležitou roli v modulaci všech procesů hojení ran [7,8]. Je to další faktor, který může hojení zpomalit. Chronická nebo obtížně se hojící rána setrvává ve fázi prolongovaného zánětu. Bakterie prodlužují hojení přímo, nebo nepřímo. Omezují proliferaci a migraci fibroblastů i ostatních buněk včetně endotelu, keratinocytů, lymfocytů, makrofágů, stimulují také MMP. Nepřímo působí prostřednictvím produkce krátkých mastných kyselin (SCFA), které jsou jednak zdrojem energie pro další bakterie, jednak SCFA ovlivňují proliferaci, migraci a remodelaci. Některé bakterie produkují endotoxin, který stimuluje produkci TNFα. Opět se projevuje důležitost obnovení rovnováhy. Specifické rody bakterií nalezené v hloubce tkáně jsou spojeny s chronicitou. Bakterie si vzájemně připravují podmínky. Aerobní bakterie spotřebují kyslík, sníží redox potenciál, a tím vytvoří příznivé prostředí pro anaeroby. Dále produkují vitamín K a sukci-

ÈES GER REV 2006; 4(3)

BIOLOGIE RÁNY

nát, což jsou nutrienty důležité pro anaeroby. Bakteriální denzita povrchu rány je nezávislý prediktor obtížného hojení rány [9]. Počet druhů bakterií, kvantitativní nálož i konkrétní kmeny bakterií jsou cenné informace. Vyskytují-li se v ráně více než 4 druhy bakterií, vzrůstá pravděpodobnost zhoršeného hojení. Podle kvantity se popisuje infekční kontinuum v ráně. Rána je sterilní jen krátký okamžik, velmi rychle se kontaminuje bakteriemi z okolí. Kontaminace představuje asi množství 102. Další stupeň je kolonizace [10] rány, tedy asi 103–104 bakterií. Kontaminace ani kolonizace ránu neohrožuje, jedná se o normální stav. Rozlišujeme však ještě 1 stupeň před vlastní infekcí rány, a to je kritická kolonizace [11], což představuje 105 bakterií. Kritická kolonizace hojení zpomaluje [15]. Není odpověď na jinak správnou terapii, nejsou přítomny nové buňky, změní se charakter exsudátu nebo barva granulací, objeví se zápach nebo bolest. Časné lokální ošetřování kritické kolonizace může za-

bránit infekci. Kritická kolonizace může vysvětlit některé případy obtížného hojení. Ránu považujeme za infikovanou, teprve když se šíří do okolí nebo se projevují celkové příznaky (graf) [15].

ZÁVÌR Cytokiny a růstové faktory, matrixové metaloproteázy, tkáňové inhibitory, buňky, základní hmota i bakterie, to všechno jsou hráči, na nichž závisí výsledek utkání. Dobrý trenér postaví hráče tak, aby rozložení sil a schopností vedlo k vítězství jeho mužstva. U hojení ran jde často o nerovný zápas, proto co nejlepší porozumění složitým mechanizmům posílí naše možnosti jak změnit nehojící se ránu na hojící a vyhrát.

LITERATURA 1. Bier OG, da Silva WD, Goetze D, Mota I. Základy imunologie. Praha: Avicenum 1984: 19–21, 60–62. 2. Masopust J. Požadování a hodnocení biochemických vyšetření. Praha: Karolinum 1998: 502–512.

infekční kontinuum

kritická kolonizace

BIOLOGIE RÁNY

3. Leaper D, Paggi B. Growth Factors and Interactive Dressings in Wound Repair. EWMA Journal 2002; 2(2): 17–23. 4. Falanga V. Growth factors and chronic wounds: the need to understand the microenvironment. J Dermatol 1992; 19(11): 667–672. 5. Schultz GS, Mast BA. Molecular analysis of the environment of healing and chronic wounds: cytokines, proteases and growth factors. Wounds 1998; 10(Suppl F): 1–9. 6. Voet D, Voetová JG. Biochemie. Praha: Victoria Publishing 1995: 20, 281, 284. 7. Greenwood D, Slack RCB, Pentharer JF et al. Lékařská mikrobiologie. Praha: Grada Publishing 1999: 119, 149–150, 570, 580, 633. 8. Poustecká L. Anaerobní infekce tkání s porušenou trofikou, Mezioborová spolupráce v léčbě ran a kožních defektů. Listopad 2004, Pardubice. 9. European Wound Management Association (EWMA). Position document: Identifying criteria for wound infection. London: MEP 2005. 10. Ayton M. Wound care: wounds that won’t heal. Nurs Times 1985; 81(Suppl 46): 6–19. 11. Davis E. Education, microbiology and chronic wounds. J Wound Care 1998; 7(6): 272–274.

12. Robson MC. The role of growth factors in the healing of chronic wounds. Wound Repair Regen 1997; 5: 12–17. 13. Yager DR, Chen SM, Ward SI et al. Ability of chronic wound fluids to degrade peptide growth factors is associated with increased levels of elastase activity and diminished levels of proteinase inhibitors. Wound Repair Regen 1997; 5: 23–32. 14. Greenhalgh DG, Hummel RP, Albertson S et al. Synergistic actions of platelet-derived growth factor and the insulin-like growth factors in vivo. Wound Repair Regen 1993; 1: 69–81. 15. Bowler PG, Duerden BI, Armstrong DG. Wound microbiology and associated approaches to wound management. Clin Microbiol Rev 2001; 14: 244–269. do redakce doručeno dne 30. 3. 2006 přijato k publikaci dne 15. 5. 2006

MUDR. ZUZANA GROFOVÁ NUTRIÈNÍ A DIETOLOGICKÉ ODDÌLENÍ, KRAJSKÁ NEMOCNICE, PARDUBICE [email protected]

MUDR. ZUZANA GROFOVÁ (1961) Promovala na LF UK Hradec Králové (1987). Složila atestaci 1. stupně v oboru vnitřní lékařství (1990) a specializační atestace v oboru geriatrie a gerontologie (1993), v oboru klinická biochemie (1. stupně, 2000) a získala funkční specializaci v oboru Umělá výživa a intenzivní metabolická péče (1998). Připravuje doktorskou disertační práci na téma její Mikrobiální osídlení obtížně se hojících ran při aplikaci komplexu kyseliny hyaluronové s jódem. Od doby, kdy se specializovala na geriatrii, pracovala nejprve jako zástupkyně primáře Geriatrického centra v Pardubicích (1995–1997), později jako vedoucí lékařka Nutričního a dietologického oddělení a zástupkyně pro klinickou medicínu Oddělení klinické biochemie a diagnostiky Krajské nemocnice Pardubice (1997–doposud). Působila jako externí učitelka Univerzity Pardubice, nyní již pracuje jako asistentka Ústavu zdravotnických studií Univerzity Pardubice, kde vyučuje obory Klinická výživa I a II., přednáší kurz Clinical Nutrition I na Turku Polytechnik, v Salo ve Finsku (od 2005). Problematice obtížně se hojících ran se věnuje řadu let, zejména z pohledu adekvátní výživy.

162

ÈES GER REV 2006; 4(3)