Praktická cvičení z biologie Letní semestr

Univerzita Palackého v Olomouci Ústav biologie, Lékařská fakulta

Praktická cvičení z biologie Letní semestr

Olomouc 2014

Podpořeno projektem EU: Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci, reg. č. CZ.1.07/2.2.00/28.0088

© kolektiv autorů, Ústav biologie LF UP Olomouc

2

v20150212

Obsah 1.

2.

3.

4.

Vrozené chromozomové aberace .............................................................................................. 7 1.1

Doplňte schéma normální meiozy .................................................................................................... 9

1.2

Doplňte schéma meiotické nondisjunkce ....................................................................................... 10

1.3

Rýhovací dělení zygoty a blastomer .............................................................................................. 13

1.4

Mitotická nondisjunkce .................................................................................................................. 13

1.5

Doplňte schémata ukazující mitotickou nondisjunkci chromozomů ............................................. 14

1.6

Doplňte schéma normální meiozy a následné fertilizace ............................................................... 15

1.7

Robertsonova translokace .............................................................................................................. 16

1.8

Vyvážená translokace chromozomů 14 a 21 .................................................................................. 17

Mutace u lidských chorob ....................................................................................................... 18 2.1

Genové mutace ............................................................................................................................... 18

2.2

Numerické a strukturní aberace chromozomů ............................................................................... 19

2.3

Patologické karyotypy u vrozených vývojových vad..................................................................... 21

2.4

Patologický karyotyp u nádorových onemocnění .......................................................................... 24

2.5

Lidské metafázní chromozomy: trvalé preparáty ........................................................................... 24

2.6

Příprava cytogenetického preparátu pro zjištění ploidie buněk ..................................................... 24

Mendelovská dědičnost ............................................................................................................ 26 3.1

Dědičnost barvy očí........................................................................................................................ 28

3.2

Dědičnost monogenně založeného onemocnění ............................................................................ 28

3.3

Cherubinismus ............................................................................................................................... 29

3.4

Anodoncie (chybění zubů) ............................................................................................................. 29

3.5

Torus palatinus ............................................................................................................................... 29

3.6

Fenylketonurie ............................................................................................................................... 29

3.7

Dědičnost srpkovité anémie ........................................................................................................... 29

3.8

Beta talasemie ................................................................................................................................ 29

3.9

Dědičnost barvy očí a levorukosti u člověka ................................................................................. 29

3.10

Dědičnost krevně skupinového systému AB0 ................................................................................ 30

3.11

Dědičnost Rh faktoru ..................................................................................................................... 30

3.12

Příklady snadno zjistitelných znaků u člověka s jednoduchou mendelovskou dědičností ............. 31

Gonozomální dědičnost a rodokmeny .................................................................................... 33 Dědičnost znaku vázaného na pohlaví ........................................................................................................ 34 4.1

Dědičnost hemofilie ....................................................................................................................... 34

4.2

Dědičnost daltonismu ..................................................................................................................... 34

4.3

Dědičnost deficitu G6PD ............................................................................................................... 34

4.4

Fosfátový diabetes.......................................................................................................................... 35

Rozbor rodokmenů – genealogická metoda ................................................................................................ 36 4.5

Rozbor rodokmenů ......................................................................................................................... 38

3

v20150212

4.6

5.

Sestavte rodokmen podle rodinné anamnézy ................................................................................. 40

Vazba genů a mapování chromozomů ................................................................................... 41 I. Genová vazba při zpětném křížení .......................................................................................................... 46 5.1

Testovací křížení ............................................................................................................................ 46

5.2

Testovací křížení ............................................................................................................................ 46

5.3

Vazba genů u drozofily .................................................................................................................. 46

II. Genová vazba u člověka ........................................................................................................................ 47 5.4

Zjišťování genové vazby v rodině.................................................................................................. 47

5.5

Rh faktor a eliptocytóza ................................................................................................................. 48

5.6

Daltonismus a hemofilie A............................................................................................................. 48

5.7

Asociace znaků .............................................................................................................................. 48

III. Lokalizace lidských genů pomocí somatické hybridizace .................................................................... 49

6.

5.8

Lokalizace genů kódujících enzymy .............................................................................................. 49

5.9

Lokalizace HLA a P lokusů ........................................................................................................... 49

5.10

Vybrané lokusy lidského genomu .................................................................................................. 49

Nemendelovská dědičnost........................................................................................................ 51 I. Interakce nealelních genů ....................................................................................................................... 51 I. A) Epistáze.............................................................................................................................................. 51 6.1

Recesivní epistáze u člověka: Bombay fenotyp u krevních skupin ............................................... 51

I. B) Geny duplicitní .................................................................................................................................. 52 6.2

Duplicitní geny: dědičnost barvy pokožky u člověka .................................................................... 52

II. Multifaktoriální dědičnost ..................................................................................................................... 53 II. A) Kvantitativní znaky .......................................................................................................................... 53 II. B) Diskrétní neboli kvalitativní znaky / nemoci .................................................................................... 53 Heritabilita a genetické studium dvojčat ..................................................................................................... 54 6.3

Vrozená luxace kyčelního kloubu .................................................................................................. 55

6.4

Hypertenzní nemoc ........................................................................................................................ 55

6.5

Schizofrenie ................................................................................................................................... 55

6.6

Prořezávání zubů ............................................................................................................................ 55

6.7

Osm nemocí ................................................................................................................................... 56

III. Mitochondriální dědičnost.................................................................................................................... 57 6.8

7.

8.

Nakreslete rodokmen ..................................................................................................................... 57

Genová kontrola metabolismu ................................................................................................ 58 7.1

Metabolizmus fenylalaninu ............................................................................................................ 59

7.2

Trávení laktózy .............................................................................................................................. 60

7.3

Deficit glukóza-6-fosfátdehydrogenázy ......................................................................................... 60

7.4

Familiární hypercholesterolemie (FH) ........................................................................................... 61

7.5

Diabetes mellitus ............................................................................................................................ 61

Genetika populací .................................................................................................................... 63 4 v20150212

I. Běžné sňatky ........................................................................................................................................... 65 I. A) Autozomální geny v populaci ............................................................................................................ 65 8.1

Dědičnost barvy očí........................................................................................................................ 65

8.2

Dědičnost Rh-faktoru ..................................................................................................................... 65

8.3

Cystická fibróza (CF) – mukoviscidóza ......................................................................................... 65

8.4

Fenylketonurie (PKU) .................................................................................................................... 65

8.5

Další autozomálně recesivní choroby ............................................................................................ 65

8.6

Srpkovitá anemie............................................................................................................................ 66

8.7

Dens caninus .................................................................................................................................. 66

8.8

Izolovaný rozštěp patra – palatoschisis .......................................................................................... 66

8.9

Trema ............................................................................................................................................. 66

I. B) X-vázané geny v populaci.................................................................................................................. 66 8.10

Daltonismus ................................................................................................................................... 66

8.11

Hemofilie ....................................................................................................................................... 66

8.12

Deficit glukóza-6-fosfát-dehydrogenázy (G6PD) .......................................................................... 66

II. Inbríding, příbuzenské sňatky, koeficient inbrídingu ............................................................................. 67 II. A) Koeficient inbrídingu (F).................................................................................................................. 68 II. B) Koeficient příbuznosti (Rxy) ............................................................................................................. 69 8.13

Vypočítejte koeficient inbrídingu .................................................................................................. 69

8.14

Inbríding a autozomálně recesivně dědičné onemocnění ............................................................... 69

9.

Genetická prognostika ............................................................................................................. 71 9.1

Albinismus ..................................................................................................................................... 74

9.2

Cystická fibróza (CF, mukoviscidóza) ........................................................................................... 74

9.3

Myopatie ........................................................................................................................................ 74

9.4

Fenylketonurie ............................................................................................................................... 74

9.5

Choroba podmíněná XD ................................................................................................................ 75

9.6

Hemofilie ....................................................................................................................................... 75

9.7

Hluchota ......................................................................................................................................... 75

9.8

Marfanův syndrom (arachnodaktylie) ............................................................................................ 75

9.9

Hemolytická sférocytární anémie .................................................................................................. 75

9.10

Hemofilie ....................................................................................................................................... 75

9.11

Barvoslepost (daltonismus) ............................................................................................................ 75

9.12

Katarakta ........................................................................................................................................ 76

9.13

Porucha zubní skloviny .................................................................................................................. 76

9.14

Inbríding a autozomálně recesivně dědičné onemocnění ............................................................... 76

9.15

Downův syndrom ........................................................................................................................... 76

10.

Genová kontrola imunity..................................................................................................... 77

I. Charakteristika polymorfismu HLA systému ......................................................................................... 78 10.1

Stanovení teoretického počtu haplotypů ........................................................................................ 79

5

v20150212

Stanovení teoretického počtu genotypů ......................................................................................... 79

10.2

II. Rozbor segregace HLA alel v rodinách................................................................................................. 80 10.3

Určení genotypu ............................................................................................................................. 81

10.4

Genotypy v rodinách ...................................................................................................................... 81

10.5

Paternitní spor ................................................................................................................................ 81

III. Výběr dárce pro transplantace .............................................................................................................. 82 10.6

Fenotypy kompatibilních dárců...................................................................................................... 82

10.7

Vhodnost dárcovství....................................................................................................................... 82

IV. HLA asociace ....................................................................................................................................... 83 10.8

Relativní riziko vzniku choroby ..................................................................................................... 83

V. Studium HLA genetické struktury populace .......................................................................................... 84 10.9

Určení četnosti genotypu z haplotypových četností ....................................................................... 84

10.10

Určení četnosti fenotypu z haplotypových četností ....................................................................... 84

11.

Molekulární genetika I ........................................................................................................ 87

11.1

DNA diagnostika............................................................................................................................ 91

11.2

Sekvenování DNA ......................................................................................................................... 91

11.3

PCR reakce ..................................................................................................................................... 91

11.4

Restrikční analýza .......................................................................................................................... 91

11.5

Analýza přítomnosti mutace IVS-1-I (G→A) ß-globinového genu ............................................... 91

11.6

Analýza přítomnosti mutace V617F genu JAK2 ........................................................................... 92

11.7

PCR detekce mutace u dědičného onemocnění.............................................................................. 92

11.8

Analýza přítomnosti fúzního genu ................................................................................................. 92

11.9

Paternitní spor ................................................................................................................................ 93

11.10

Doplňte tabulku .............................................................................................................................. 93

12.

Molekulární genetika II: Proteiny, aplikace v medicíně .................................................. 94

I. Využití detekce proteinů v diagnostice ................................................................................................... 94 II. Využití proteinů v terapii....................................................................................................................... 95

6

v20150212

1. Vrozené chromozomové aberace Studijní příprava Mitóza, meioza, chromozomy.

Teoretický úvod Eukaryontní chromozomy jsou strukturní jednotky genetické informace, tvořené dvouvláknovou DNA a asociovanými proteiny. Ve světelném mikroskopu jsou viditelné pouze v průběhu dělení buňky (mitózy a meiozy), kdy musí být zajištěno rovnoměrné rozdělení genetické informace do buněk dceřiných. Většina buněk v lidském organizmu je diploidních (2n) a obsahuje 46 chromozomů. Každý chromozom se v těchto buňkách vyskytuje dvakrát, vytváří se tzv. pár homologních chromozomů (např. dva chromozomy 15). Říkáme, že buňka obsahuje 2 sady chromozomů.Výjimku tvoří chromozomy X a Y v somatických buňkách mužského těla – tyto jsou zde přítomny pouze v jediné kopii. Chromozomy odlišných párů nazýváme nehomologní (např. chromozom 2 a 17). Somatické buňky, které jsou diploidní, se dělí mitózou. Výsledkem meiozy, čili redukčního dělení, jsou pohlavní buňky neboli gamety, které jsou haploidní (n). Gamety obsahují pouze 1 sadu chromozomů (tj. 23 chromozomů). V průběhu 1. meiotického dělení dochází k segregaci párů homologních chromozomů, vytvořené gamety pak obsahují z každého páru homologních chromozomů pouze jeden. Chromozomové abnormality mohou být buď strukturní nebo numerické. Strukturní chromozomové aberace mění tvar a strukturu chromozomů a budou předmětem příštího praktika. Numerické chromozomové aberace označované také jako genomové mutace mění počet chromozomů v buňce. V některých případech dochází v důsledku strukturní aberace chromozomu i k aberaci numerické, to znamená, že se mění počet chromozomů v buňce (příklad Robertsonova translokace – centrická fúze viz. 1.7). Terminologie: euploidie ... přesný násobek sady chromozomů (n, 2n, 3n, 4n, ...) diploidní – 2n (2 sady chromozomů; somatické buňky) haploidní – n (1 sada chromozomů; gamety) Numerické aberace polyploidie – buňky obsahují více sad chromozomů (triploidie – 3n, tetraploidie – 4n, atd.) aneuploidie – změna počtu jednotlivých chromozomů monozomie – ztráta chromozomu 2n-1 (45) trizomie – přítomnost nadbytečného chromozomu 2n+1 (47) Chromozomové abnormality vznikají nejčastěji v průběhu života jedince v buňkách somatických a jsou příčinou vzniku nádorových onemocnění. Předmětem dnešního praktika budou vrozené chromozomové aberace, které vznikají v průběhu tvorby gamet nebo v průběhu rýhovacích dělení zygoty a jsou příčinou vzniku vrozených vývojových vad. Nejčastější příčinou aneuploidií je meiotická nondisjunkce, kdy dochází k poruše oddělení páru chromozomů během jednoho ze dvou meiotických dělení, většinou v průběhu prvního z nich (Obr. 1). Většina aneuploidií je letálních, trizomie jsou častější než monozomie. Postnatálně slučitelné se životem jsou pouze tři nemozaikové trizomie autozomů a trizomie pohlavních chromozomů: 7

v20150212

Trizomie autozomů: trizomie 21 – Downův syndrom

47,XX,+21 nebo 47,XY,+21

trizomie 18 – Edwardsův syndrom

47,XX,+18 nebo 47,XY,+18

trizomie 13 – Pataův syndrom

47,XX,+13 nebo 47,XY,+13

Trizomie pohlavních chromozomů: 47,XXX 47,XXY – Klinefelterův syndrom 47,XYY – syndrom dvou chromozomů Y Jediná monozomie celého chromozomu slučitelná se životem je monozomie pohlavního chromozomu X: 45,X – Turnerův syndrom Tyto odchylky se vyskytují alespoň u 3-4% všech klinicky rozpoznatelných těhotenství a jsou spojeny s vážnými poruchami fyzického nebo mentálního vývoje. Výjimkou je syndrom dvou chromozomů Y (47,XYY), která ve většině případů není asociována s vážnými poruchami ani mentální retardací. Nondisjunkce se může objevit také při mitotickém dělení po vzniku zygoty. Jestliže k ní dojde v časné fázi rýhovacího dělení (od 2-buněčného stadia zygoty), je výsledkem klinicky významný mozaicismus, to je situace, kdy jsou v těle jedince přítomné různé buněčné populace lišící se počtem chromozomů (viz. 1.4; 1.5). Obr. 1. Pro zjednodušení je znázorněn jen 1 pár homologních chromozomů. A) ND v 1. meiotickém dělení B) ND ve 2. meiotickém dělení pár homologních chromozomů

pár homologních chromozomů

S-fáze

fáze

– porucha separace páru homol. chromozomů – všechny gamety jsou abnormální

– porucha separace sesterských chromatid 1 z páru homol. chromozomů

– výsledkem je trizomie nebo monozomie

– 1/2 gamet je normálních 8

v20150212

1.1

Doplňte schéma normální meiozy

Zakreslete segregaci chromozomů a chromatid v průběhu spermatogeneze, doplňte jejich počty.

pár homologních chromozomů (např. 21)

S-fáze

1. meiotické dělení


Kolik chromozomů má vajíčko? Kolik chromozomů má zygota?

9

v20150212

1.2

Doplňte schéma meiotické nondisjunkce

Na schématech jsou příklady aberantní gametogeneze, kde v určitém stadiu došlo k nondisjunkci (ND) chromozomů A) Ch. 21, B) Ch. Y. Doplňte počty chromozomů, počty chromozomů spermií resp. vajíček a zygot vzniklých oplozením. Uveďte název syndromu, k jehož vzniku může dojít po splynutí takto vzniklé abnormální gamety s normální gametou. A) ND chromozomu 21 ve druhém meiotickém dělení při oogenezi


S-fáze



ND

potenciální oocyty

+

+

+

+ spermie

potenciální zygoty

10

v20150212

B) ND chromozomů X v prvním meiotickém dělení při oogenezi

chromozomy X

S-fáze


ND

2. meiotické dělení potenciální oocyty

+

+

+

+ normální spermie


11

v20150212

C) ND chromozomu Y ve 2. meiotickém dělení při spermatogenezi

chromozomy X + Y

S-fáze


ND

2. meiotické dělení + spermiogeneze

spermie

+

+

+

+ oocyty


Spermatogeneze: proces vývoje spermií ze spermatogonií; zahrnuje mitotické dělení spermatogonií, meiozu a následnou přeměnu spermatid na spermie. Spermiogeneze: haploidní část spermatogeneze (přeměna spermatid na spermie). Dochází k přestavbě a kondenzaci jádra, vzniká akrozom a bičík, je redukován objem cytoplazmy.

12

v20150212

Rýhovací dělení zygoty a blastomer

1.3

Předpokládejme normální rýhovací dělení zygoty – doplňte počty chromozomů v jednotlivých buňkách. zygota

1. rýhovací dělení


1.4

Mitotická nondisjunkce

Mitotická nondisjunkce je poruchou separace sesterských chromatid jednoho z páru homologních chromozomů. Jeden chromozom se rozdělí normálně – sesterské chromatidy se v anafázi oddělí a putují k opačným pólům a tedy do 2 dceřiných buněk. U druhého chromozomu vstupují obě chromatidy do jedné dceřiné buňky. Výsledkem jsou pak 2 dceřiné buňky s odlišným počtem chromozomů (jedna má 47 a druhá 45 chromozomů), který se liší i od normálního počtu chromozomů v buňce mateřské (46).


46

S-fáze

ND během mitózy 47

45

V důsledku mitotické nondisjunkce, která postihne jednotlivou buňku několikabuněčného embrya, vznikají tzv. mozaikovité typy vrozených vývojových vad, např. Downova syndromu. Důležité je, že jen část buněk v těle má trizomii 21, ostatní jsou euploidní (viz 1.5A). Postižený jedinec má mírnější klinické projevy ve srovnání s nemozaikovým typem, kdy všechny buňky v těle mají trizomii 21. 13

v20150212

1.5

Doplňte schémata ukazující mitotickou nondisjunkci chromozomů

Na schématech je zachyceno rýhování oplozeného vajíčka, kdy v některém z rýhovacích dělení došlo k nondisjunkci (ND) A) Ch. 21 a B) Ch. X . Doplňte chromozomovou výbavu blastomer. A) Nondisjunkce chromozomu 21 ve druhém rýhovacím dělení zygota

46 1. rýhovací dělení


ND

B) Nondisjunkce chromozomu X ve třetím rýhovacím dělení zygota

46




ND

1. Jaký je důsledek mitotické nondisjunkce? 2. Který syndrom způsobí mitotická nondisjunkce v příkladu A) a B)? 3. Jaký lze očekávat výsledek vyšetření X-chromatinu u těchto jedinců?

14

v20150212

1.6

Doplňte schéma normální meiozy a následné fertilizace

Do prázdných kroužků zakreslete chromozomy, do čtverců doplňte počet chromozomů.

chr. 13 chr. 21 S-fáze


2. meiotické dělení + spermiogeneze

normální spermie

+

+

+

+ oocyty


15

v20150212

1.7

Robertsonova translokace

Robertsonova translokace, neboli centrická fúze, je příkladem strukturní aberace chromozomů, která zároveň vede i k aberaci numerické. Dlouhá raménka 2 akrocentrických chromozomů se spojí a vytvoří jeden chromozom. Dochází tedy k redukci počtu chromozomů na 45. Nosič Robertsonovy translokace je fenotypově normální. Problémy nastávají v průběhu meiozy – ovlivněná je segregace chromozomů a následně mohou vznikat i gamety s abnormálním počtem chromozomů (22) nebo nebalancované gamety obsahující jeden normální chromozom (21 nebo 13) a jeden translokovaný chromozom 13;21. Po oplození těchto gamet pak vznikají abnormální zygoty (monozomické nebo s translokační trizomií). Nebezpečí Robertsonovy translokace tedy spočívá v možném postižení potomků rodičů, kteří jsou nositeli této fúze. chr. 13

45

chr. 21 S-fáze translokovaný chr. 13;21

3 možnosti segregace chromozomů v průběhu 1. meiotického dělení A)

B)


+

+

C)


+

+

16


+

+

v20150212

1.8

Vyvážená translokace chromozomů 14 a 21

Jeden z rodičů je nositelem vyvážené translokace dlouhých ramének chromozomu 21 na dlouhá raménka jednoho z chromozomů 14. Uveďte jakým způsobem budou segregovat chromozomy do gamet. Doplňte možné typy gamet a zygot, které vzniknou po splynutí těchto gamet s normálními partnerskými gametami. Do prázdných kroužků zakreslete chromozomy, do čtverců doplňte počet chromozomů. Jaké je riziko postižení dítěte? chr. 14 chr. 21 S-fáze translokovaný chr. 14;21

3 možnosti segregace chromozomů v průběhu 1. meiotického dělení

A)


B)

C)


+


normální spermie


Kontrolní otázky: 1. Které trizomie celého chromozomu jsou slučitelné se životem? Která monozomie celého chromozomu není letální? Uveďte názvy zmíněných syndromů. 2. Co je výsledkem nondisjunkce chromozomů při mitotickém dělení? 3. Kolik chromozomů má nositel Robertsonovy translokace a uveďte, jaké má klinické příznaky? 4. Uveďte typy Downova syndromu, podle mechanizmu vzniku trizomie.

17

v20150212

2. Mutace u lidských chorob Studijní příprava Mutageneze, transkripce, translace, genetický kód, karyotyp.

Teoretický úvod Mutace jsou změny genetické informace (DNA), které mohou vést ke vzniku genetických patologických stavů. Rozdělení mutací A) podle kauzální příčiny – spontánní (bez známé exogenní příčiny) – indukované (působením fyzik., chem. nebo biol. mutagenů) B) podle charakteru – genové mutace – strukturní aberace chromozomů – genomové mutace (numerické aberace chromozomů) C) podle druhu buněk, ve kterých mutace nastává: – gametické: při vzniku gamet, přenáší se na potomstvo a jsou pak přítomny v každé buňce narozeného potomka – somatické: v některé somatické buňce organizmu, mutace se přenáší pouze na její dceřiné buňky (např. vznik nádoru), mutace se nepřenášejí na potomstvo postiženého

2.1

Genové mutace

Genové mutace postihují jeden nebo více nukleotidů jednoho genu a neprojeví se proto v morfologii chromozomu. K jejich odhalení slouží techniky molekulární biologie, o kterých uslyšíte na konci letního semestru. Genové mutace dělíme na:  bodové mutace  delece  inzerce Bodové mutace Tyto mutace postihují jediný nukleotid v rámci sekvence DNA – dochází k záměně jediného nukleotidu za jiný. Podle toho, jestli dochází/nedochází k ovlivnění aminokyselinového složení proteinu, hovoříme buď o tiché mutaci (vzniká triplet, který kóduje stejnou AMK); nebo o mutaci, která mění smysl – missense mutace (vzniká triplet, který kóduje jinou AMK) anebo o tzv. stop mutaci – nonsense mutace, která vede ke zkrácení proteinu (vzniká triplet, který kóduje STOP kodon). A) tichá mutace – nedochází ke změně AMK v sekvenci proteinu Např. kodon TCT kóduje AMK serin. Serin je ale kódován i kodony TCA, TCG a TCC. Záměna třetího nukleotidu kodonu TCT v sekvenci DNA za jakýkoli jiný nukleotid proto neovlivní sekvenci aminokyselin v proteinu.

18

v20150212

B) missense mutace – dochází k změně AMK v sekvenci proteinu Záměna nukleotidu vede ke tvorbě kodonu, který kóduje jinou AMK. Vytváří se tedy protein s jiným AMK složením. Příklad: Srpkovitá anémie. Záměna A za T (17. nukleotid) v beta globinovém genu vede k záměně šesté AMK: kys. glutamová je zaměněna za valin (triplet GAG kódující kys. glutamovou se mění na triplet GTG kódující valin). Vytváří se tak abnormální hemoglobin se změněnými vlastnostmi, který je zodpovědný za vznik tohoto onemocnění.

C) nonsense mutace – dochází ke zkrácení proteinu Záměna nukleotidu vede ke tvorbě STOP kodonu (TAA, TAG, TGA). Dochází tedy k předčasnému ukončení syntézy proteinu. Příklad: Cystická fibróza. Jednou ze známých mutací způsobujících cystickou fibrózu je záměna nukleotidu č. 1609 v genu CFTR (T je zaměněn za C). Místo původního kodonu pro glutamin (CAG) tak vzniká STOP kodon (TAG). Výsledkem je nefunkční protein, který má místo 1480 AMK pouze prvních 493 AMK.

Delece a inzerce Tyto mutace představují ztrátu resp. přidání jednoho nebo několika nukleotidů do DNA sekvence genu. V důsledku toho může dojít k posunu čtecího rámce při vytváření proteinu a označujeme je pak jako tzv. frameshift mutace (mutace způsobující posun čtecího rámce).

2.2

Numerické a strukturní aberace chromozomů

Numerické a strukturní aberace chromozomů postihují celé chromozomy resp. jejich větší části a tedy nejčastěji i více genů současně. Jsou velmi časté u vrozených vývojových defektů a maligních onemocnění. Aberace mohou být vizualizované pomocí různých cytogenetických technik, které umožní vyhodnocení karyotypu. Karyotyp je organizované zobrazení metafázních chromozomů, specifické pro daný druh. Poskytuje informace o počtu a morfologii chromozomů, konstituci pohlavních chromozomů a případně o chromozomových abnormalitách. Lidský karyotyp somatických buněk je složen z 22 párů autozomů a 1 páru gonozomů. Zápis karyotypu se řídí mezinárodně platnými pravidly (ISCN). Jako první se udává počet chromozomů, za ním se uvádí konstituce pohlavních chromozomů: 46,XX nebo 46,XY. U patologických karyotypů pak následuje zápis chromozomové abnormality, a to zkratka aberace a číslo chromozomu, který je aberací postižený: 47,XX,+21 (zápis Downova syndromu, trizomie chromozomu 21).

19

v20150212

Numerické aberace  polyploidie  aneuploidie: o monozomie o trizomie o hyperdiploidie – nespecificky zvýšený počet chromozomů (neřadí se sem specifické trisomie jako např. Downůw syndrom, Klinefelterův syndrom a další) Strukturní aberace Mění tvar a strukturu chromozomů. Předpokladem jejich vzniku je alespoň jeden zlom. Mezi chromozomové aberace patří: delece, duplikace, inzerce, inverze, „ring“ chromozom (kruhový chromozom), translokace. Zkratky používané pro zápis strukturních aberací: Typ

Zkratka podle ISCN

delece

del

duplikace

dup

inzerce

ins

inverze

inv

„ring“ (kruhový chromozom)

r

translokace

t

Chromozomové aberace u nádorů Diagnostika nádorů, především leukémií, je z velké části založena na analýze karyotypu. Pro jednotlivé typy hematologických malignit je totiž charakteristická přítomnost specifických chromozomových odchylek, především translokací. Prokázání přítomnosti specifické translokace v leukemických buňkách je důležité pro správné určení diagnózy a prognózy onemocnění a mnohdy i pro adekvátní volbu terapie. Kromě translokací se u hematologických malignit často vyskytují i výrazné hyperdiploidie (někdy i >70 chromozomů).

20

v20150212

2.3

Patologické karyotypy u vrozených vývojových vad

U následujících 4 příkladů patologických karyotypů, které byly připraveny konvenční cytogenetickou metodou, proveďte jejich zápis. Uveďte, o jaký typ odchylky se jedná, postihuje-li autozomy nebo gonozomy a jaký syndrom způsobuje. Důležité je, abyste si uvědomili, že se tyto chromozomové odchylky nachází ve všech buňkách organizmu. I. Probandkou je 18ti letá dívka malého vzrůstu, infantilního vzhledu.

21

v20150212

II. Probandem je malý chlapec s mentálním postižením a typickou fyziognomií, nejmladší ze šesti sourozenců. Jeho matka měla v době porodu 41 let.

III. Probandkou je žena bez klinických příznaků, jejíž dcera je postižena Downovým syndromem. Předchozí těhotenství ženy skončilo spontánním potratem.

22

v20150212

IV. Probandem je tříletý chlapec s opožděným duševním a motorickým vývojem, se svalovou hypotonií a řadou výrazných vrozených odchylek.

23

v20150212

2.4

Patologický karyotyp u nádorových onemocnění

Na obrázku je znázorněn karyotyp krevních buněk pacienta s nádorovým onemocněním krve – chronickou myeloidní leukémií. Šipky označují chromozomy 9 a 22, mezi kterými došlo k reciproké translokaci. Důležité je, abyste si uvědomili, že tato chromozomová odchylka se nachází pouze v postižených buňkách krve. Tuto chromozomovou abnormalitu nenajdeme v žádné jiné buňce organizmu. Na přípravu tohoto karyotypu byla použita jiná cytogenetická technika (tzv. proužkování) než u předchozích případů. zápis: 46,XX,t(9;22)

2.5

Lidské metafázní chromozomy: trvalé preparáty

Materiál: Trvalé preparáty lidských buněk. Lidské buňky byly vystaveny působení kolchicinu, který zastavil buněčné dělení v metafázi. Vaším úkolem bude najít buňky zastavené v metafázi a určit počet chromozomů.

2.6

Příprava cytogenetického preparátu pro zjištění ploidie buněk

Princip metody Dělící se buňky se po dobu tří hodin vystaví působení kolchicinu, který zastaví buněčné dělení v metafázi. Posléze se buňky zpracují, nakápnou na podložní sklíčko a obarví. V metafázních buňkách se mikroskopicky zjišťuje počet chromozomů. K dispozici budete mít buněčnou suspenzi (buňky zastavené v metafázi) ve fixačním roztoku Carnoy (1 díl ledové kyseliny octové a 3 díly metanolu). Postup přípravy preparátu: Buněčnou suspenzi promícháme. Podložní sklo (umyté v 96% alkoholu) navlhčíme namražením na ledě. Navlhčení skla umožní pomalejší zaschnutí chromozomů na sklíčku, které je nutné pro oddálení jednotlivých chromozomů v metafázi od sebe (tj. chromozomy nejsou nahloučeny do jednoho místa). Na takto navlhčené podložní sklo kápneme suspenzi z výšky asi 50 cm a zafixujeme ji na plotýnce vyhřáté na 80°C (méně než minutu, do odpaření fixačního roztoku). 24

v20150212

Suché sklo barvíme roztokem Giemsa ve fosfátovém pufru (1 díl barvy a 9 dílů pufru). Barvíme 5 minut a poté sklo opláchneme v destilované vodě a necháme okapat a uschnout. Prohlížíme v mikroskopu (zvětšení 200× až 400×, zájemci si příp. mohou prohlédnout metafázní chromozomy imerzním objektivem). Nejsou-li chromozomy dostatečně nabarveny, můžeme je zpětně dobarvit v roztoku Giemsa opakováním barvícího postupu. Vaším úkolem bude určit počet chromozomů (ploidii) a rozhodnout, zda buněčná suspenze obsahuje buňky normální nebo buňky nádorové tkáně.

Kontrolní otázky: 1. Jaké techniky barvení chromozomů znáte? 2. Vysvětlete rozdíl mezi mutací v zárodečné a somatické buňce. 3. Vysvětlete pojem reciproká translokace. 4. Co je to tzv. Filadelfský chromozom? 5. Co je hlavním důsledkem hyperdiploidního počtu chromozomů? 6. Jak vzniká hyperdiploidie? 7. Proč nakapáváme buněčnou suspenzi z výšky 50 cm? 8. Jak působí kolchicin?

25

v20150212

3. Mendelovská dědičnost Studijní příprava Mendelovy zákony, základní genetická terminologie, interakce alelních genů, typy dědičnosti.

Teoretický úvod Mendelovská dědičnost popisuje pravidla, která se uplatňují při přenosu dědičných znaků/nemocí z rodičů na potomky. Tato pravidla – nazývaná jako Mendelovy zákony – se uplatňují při dědičnosti znaků, které jsou podmíněné pouze jedním genem, čili monogenně.

Základní terminologie Alela je alternativní forma genu lišící se od jiných variant téhož genu v nukleotidové sekvenci DNA. U diploidních organizmů 2 alely vytváří genotyp znaku a jsou lokalizované na homologních chromozomech. Lokus je specifické místo genu (alely) na chromozomu. Homozygot – na lokusu obou homologních chromozomů obsahuje stejnou alelu. Heterozygot – na lokusu homologních chromozomů obsahuje 2 různé alely. Polymorfismus/Mnohotná alelie je stav, kdy se v populaci vyskytuje více než 2 varianty/alely genu. Soubor těchto alel vytváří alelickou sérii (např. alely pro krevní skupinu AB0, alely pro HLA). Každý jedinec však může mít z této série pouze 2 alely pro určitý gen! Důvodem je diploidie. Vztah mezi alelami téhož genu se nazývá interakce alelních genů. Typ interakce mezi alelami určitého genu určíme podle fenotypu heterozygota. Rozlišujeme 3 typy interakcí mezi alelami určitého genu:  úplná dominance (A>a) Fenotyp heterozygota Aa je stejný jako fenotyp homozygota AA. Alelu dominantní zapisujeme velkým písmenem – A. Alelu recesivní zapisujeme zpravidla tímtéž, ale malým písmenem – a. U heterozygota alela A potlačí fenotypový projev alely a. Výsledný fenotypový projev heterozygota bude pouze projevem alely A.  neúplná dominance (semidominance) (A≥a) Fenotyp heterozygota (Aa) je mezi fenotypem obou homozygotů (AA a aa). U heterozygota Aa je vyjádření dominantní alely mírnější než u homozygota AA. U heterozygota Aa dominantní alela nepotlačuje recesivní alelu úplně. Recesivní alela se také částečně projeví ve fenotypu.  kodominance (A = B) Vyjádření obou alel (A i B) ve fenotypu heterozygota je rovnocenné, obě alely jsou plně exprimované. U heterozygota AB se vyskytují fenotypy přítomné u homozygotů, tj. jak u AA, tak u BB. Kodominance je charakteristická např. pro geny kódující lidské antigeny nebo AB0 krevní systém. Monogenní znaky/onemocnění mohou vykazovat 4 základní typy dědičnosti: dominantní

recesivní

autozomální

autozom. dominantní (AD)

autozom. recesivní (AR)

vázanou na X chromozom

X-vázaná dominantní (XD)

X-vázaná recesivní (XR)

26

v20150212

U monogenních onemocnění se můžeme setkat s variabilní expresivitou, resp. penetrancí genu. Variabilní expresivita genu říká, že tentýž genotyp se u různých jedinců může do fenotypu promítnout různě silně (různý stupeň závažnosti klinických projevů). Neúplná penetrance poukazuje na to, že jen určitý podíl jedinců daného genotypu vykazuje příslušný fenotyp (někteří nositelé mutantního genu jsou nemocní, jiní jsou bez klinických projevů). Příklady, které budeme řešit, jsou vesměs monogenně podmíněné znaky a platí pro ně Mendelovy zákony dědičnosti. Pro řešení příkladů je důležité vědět: 1. Do každé gamety vstupuje při meioze z každého páru alel jen jedna alela. 2. Homozygot tvoří všechny gamety stejného genotypu. Heterozygot (Aa) tvoří dva druhy gamet (polovinu gamet s alelou A, polovinu s alelou a). Dvojitý heterozygot (AaBb) tvoří čtyři druhy gamet rozdílného genotypu (AB, Ab, aB, ab), jestliže jsou oba alelové páry (A/a, B/b) umístěny na různých chromozomech. 3. Zygota, resp. potomek, dostává pro daný znak vždy jednu alelu od matky (z vajíčka) a druhou alelu téhož genu od otce (ze spermie). Symboly čteme takto: A .................. dominantní alela a ................... recesivní alela AA ............... dominantní homozygot v genu A Aa ................ heterozygot v genu A aa .................. recesivní homozygot v genu A

Postup při řešení úkolů Jsou dvě základní situace: 1. Známe fenotypy rodičů a chceme určit fenotypy jejich potomků: a) Určíme genotypy rodičů podle typu interakce alel. b) Určíme genotypy jejich gamet pomocí úvahy o segregaci alel. c) Určíme genotypy zygot spojením (kombinací) jednotlivých genotypů spermií a vajíček. d) Zygotickým genotypům přiřadíme fenotypy odpovídající danému typu interakce alel. Dostaneme fenotypy potomků. 2. Známe fenotypy potomků a chceme určit genotypy nebo fenotypy jejich rodičů. a) Určíme genotypy potomků, odpovídající danému typu interakce alel. b) Pro každý alelový pár v genotypu potomka platí, že jednu alelu dostal od matky, druhou od otce. Symboly těchto alel zapíšeme jako složku genotypu matky a genotypu otce. Získáme genotypy obou rodičů. c) Rodičovským genotypům přiřadíme fenotypy odpovídající typu interakce alel v daném případě. Výsledek řešení nemusí být vždy jednoznačný, protože často je teoreticky možných genotypů více.

27

v20150212

Při řešení příkladů nám pomůže nákres rodokmenu. Symboly používané v rodokmenech:

3.1

Dědičnost barvy očí

Barva očí je výsledkem interakce několika párů alel různých genů, které dědičně určují tvorbu a ukládání pigmentu v duhovce. Pro jednoduchost se omezíme na jediný alelový pár, ve kterém alela pro hnědou barvu očí B je dominantní nad alelou pro modrou barvu očí b. a) Hnědooký muž se ožení s modrookou ženou a mají 8 hnědookých dětí. Jaké jsou genotypy všech členů rodiny? b) Hnědooký muž, jehož oba rodiče byli hnědoocí, se ožení s hnědookou ženou, jejíž otec byl hnědooký a matka modrooká. Mají jedno modrooké dítě. Jaký je genotyp všech členů rodiny?

3.2

Dědičnost monogenně založeného onemocnění

Byl sledován výskyt jistého onemocnění v souboru 100 rodin. Na základě výsledků vyšetření určete, zda se jedná o dominantní nebo recesivní chorobu a napište genotypy rodičů. Fenotyp rodičů

Počet rodin

Fenotyp dětí zdravé

nemocné

zdravý × nemocný

51

80

37

zdravý × zdravý

40

90

16

9

0

17

nemocný × nemocný

28

v20150212

3.3

Cherubinismus

Tumorózní zbujení fibrózní tkáně vede k deformaci obličejových kostí, poruchám okluze, ztrátě zubů, u dětí k bilaterálnímu zduření úhlu mandibuly, příp. i maxily. Dědí se autozomálně dominantně se 100% penetrancí u mužů a asi 50% penetrancí u žen. Zdravým rodičům se narodil postižený syn. Určete pravděpodobné genotypy členů rodiny a vysvětlete.

3.4

Anodoncie (chybění zubů)

Defectus praemolaris et incisivi se dědí autozomálně recesivně. Jaké děti lze očekávat ze sňatku dvou postižených rodičů; jednoho postiženého a jednoho zdravého rodiče?

3.5

Torus palatinus

Patří mezi anomálie tvaru patra. Je to benigní zbytnění orální strany tvrdého patra, vedoucí až k poruše řeči. Dědí se autozomálně dominantně. Sňatek uzavřeli dva jedinci s popsaným defektem. Narodilo se jim jedno dítě s normálním tvarem patra. Jaké jsou genotypy rodičů?

3.6

Fenylketonurie

Fenylketonurie (PKU) je autozomálně recesivní onemocnění. Patří mezi enzymopatie neboli metabolické poruchy. Pro PKU je charakteristické chybění enzymu, který metabolizuje fenylalanin na tyrosin. Pokud recesivní homozygoti nedodržují speciální dietu založenou na eliminaci fenylalaninu ze stravy, jsou silně postiženi. Heterozygoti jsou bez zdravotních potíží a mají jen slabé, laboratorně zjistitelné projevy. O PKU budeme podrobněji mluvit v praktiku věnovaném genové kontrole metabolismu. a) Jaké děti se mohou narodit z manželství, když u obou zdravých rodičů byly tyto projevy laboratorně zjištěné? b) S jakou pravděpodobností se jim může narodit dítě postižené a dítě zdravé?

3.7

Dědičnost srpkovité anémie

Srpkovitá anémie/chudokrevnost je autozomálně recesivní onemocnění vyznačující se přítomností abnormálního hemoglobinu (HbS) a srpkovitostí červených krvinek. Příčinou je bodová mutace v ß-globinovém genu. Heterozygoti jsou bez klinických příznaků nemoci, v krvi mají však přítomný kromě standardního typu hemoglobinu (HbA) i Hb mutantní (HbS). Zdravý muž, u něhož byl v krvi prokázán i HbS, uzavře sňatek se zdravou ženou, která má v krvi pouze HbA. Jaké děti se mohou narodit v tomto manželství? Jak by tomu bylo v případě, kdyby i u jeho ženy byl prokázán HbS?

3.8

Beta talasemie

Beta talasemie je AR dědičným onemocněním. Příčinou je nejčastěji bodová mutace v ß-globinovém genu, která vede ke kvantitativní redukci ß-globinového řetězce. Heterozygoti jsou většinou asymptomatičtí a/nebo mají jen mírné klinické projevy. Naproti tomu homozygoti mají těžkou anémii vyžadující transfuze. Napište možné genotypy dětí dvou heterozygotních rodičů. Ke genotypům přiřaďte odpovídající fenotypy.

3.9

Dědičnost barvy očí a levorukosti u člověka

Hnědá barva očí je u člověka dominatním znakem (alela B), modrá barva očí znakem recesivním (alela b), pravorukost (alela R) dominuje nad levorukostí (alela r).

29

v20150212

Pravoruký modrooký muž si vezme pravorukou hnědookou ženu. Mají dvě děti, jedno levoruké a hnědooké, jedno pravoruké a modrooké. Tento muž se ožení podruhé s jinou ženou, která je také pravoruká a hnědooká. Mají 6 pravorukých a hnědookých dětí. Jaký je genotyp tohoto muže a jeho dvou žen?

3.10 Dědičnost krevně skupinového systému AB0 AB0 krevní systém je kontrolován mnohotnou sérií alel A, B a 0. Mezi alelami A a B je vztah kodominance. Mezi alelami A a 0 a mezi B a 0 je vztah dominance a recesivity; alela 0 je recesivní. Krevní skupina 0 je tedy založena recesivně homozygotně (00). 1. Napište všechny možné genotypy krevních skupin A, B, AB, 0. 2. Doplňte následující tabulky: Tab. 1 Krevní skupiny rodičů 0

×

0

0

×

A

A

×

A

A

×

B

0

×

AB

B

×

AB

AB ×

AB

Krevní skupiny, které lze očekávat u jejich dětí

Krevní skupiny, které nelze očekávat u dětí

Krevní skupina matky

Krevní skupina muže, který je z otcovství vyloučen

Tab. 2 Krevní skupina dítěte 0

0

0

A

A

B

B

0

AB

A

AB

AB

3.11 Dědičnost Rh faktoru

U tohoto krevního znaku rozlišujeme dvě fenotypové třídy: Rh pozitivní a Rh negativní. Znak je dědičně řízen třemi geny, které jsou ve velmi silné vazbě (geny C, D a E). Je-li v genotypu přítomna alespoň jedna alela D, je fenotyp jednoznačně určen jako Rh pozitivní, a to bez ohledu na zbývající dva geny. Rh+ (-D-) je dominantní nad Rh- (d,C,c,E,e). Doplňte následující tabulky:

30

v20150212

Tab. 3 Genotypy rodičů Ccddee

Genotypy dětí

× CcDDEe

CCDdEe × CCddee CCDdEE × ccDdEe Tab. 4 Fenotypy rodičů

Fenotypy dětí

A Rh+ × AB Rh0 Rh+ × AB RhA Rh+ ×

0 Rh-

3.12 Příklady snadno zjistitelných znaků u člověka s jednoduchou mendelovskou dědičností Zjistěte své vlastní fenotypy a genotypy:

a) Ohnutý malíček (B,b) Dominantní alela způsobuje trvalé ohnutí posledního článku pátého prstu směrem dovnitř (k čtvrtému prstu – prsteníčku). Recesivní homozygoti mají malíčky rovné. b) Chloupky na článcích prstů (M,m) Jen recesivní homozygoti nemají žádné chloupky na středních článcích prstů. Pokud je přítomna v genotypu alespoň jedna dominantní alela, chloupky se vyvíjejí. Je možné, že se jedná o alelickou sérii se sestupnou dominancí, kde vždy předešlá alela je dominantní vůči následující (M1 > M2 > M3...). c) Stáčení jazyka do ruličky (R,r) Osoby s alespoň jednou dominantní alelou dovedou stočit vyplazený jazyk do ruličky, homozygoti recesivní se to nemohou naučit. d) Typy vlasové hranice (W,w) Recesivní homozygoti mají rovnou hranici vlasů nad čelem, v přítomnosti dominantní alely (alel) se vytváří uprostřed špička směřující dolů. e) Přeložení palců (C,c) Dominantní homozygoti a heterozygoti při uvolněném složení rukou s překříženými prsty mají nahoře palec levé ruky, recesivní homozygoti dávají mimoděk pravý palec přes levý. f) Tvar ušního lalůčku (A,a) Recesivní homozygoti mají přirostlý ušní lalůček, dominantní homozygoti a heterozygoti lalůček volný – oddělený od kůže hlavy. g) Schopnost ohnutí palce vzad (H,h) Recesivní homozygoti mohou ohnout (vyvrátit) poslední článek palce vzad až o 90 stupňů, v přítomnosti dominantní alely (alel) je maximální ohnutí v průměru jen 30 stupňů.

31

v20150212

32

v20150212

4. Gonozomální dědičnost a rodokmeny Studijní příprava Gonozomy. Dědičnost vázaná na chromozom X. Dědičnost pohlavím ovládaná a ovlivněná. Rodokmeny, symbolika.

Teoretický úvod Fenotyp některých znaků je závislý na pohlaví jedince. Jednou z příčin je umístění genů, které kódují tyto znaky, na pohlavních chromozomech (gonozomech) X a Y: hovoříme o znacích vázaných na pohlaví. Přítomnost gonozomu v zygotě je rozhodující nejen pro určení pohlaví, ale také pro vytvoření těch znaků, jejichž genetická informace je v daném gonozomu zakódována. Znaky vázané neúplně na pohlaví mají geny umístěné v homologických částech gonozomů X a Y. V tomto úseku dochází ke crossing-overu, takže u obou pohlaví se znak vyskytuje se stejnou četností a vykazuje znaky autozomální dědičnosti. Znaky na pohlaví vázané úplně jsou kontrolovány geny v heterologických částech gonozomů a vykazují různou distribuci mezi pohlavími. Prakticky je významný pouze gonozom X, v dalším výkladu se proto omezíme na geny v heterologické části gonozomu X a budeme hovořit o znacích/nemocích vázaných na chromozom X. Pro dědičnost vázanou na X chromozom platí některá specifická pravidla, lišící se od autozomální dědičnosti: Recesivní dědičnost vázaná na chromozom X 1. Postižený muž má všechny syny zdravé. 2. Všechny dcery postiženého muže jsou přenašečky. 3. Žena přenašečka má v průměru polovinu synů postižených, polovina jejích dcer jsou opět přenašečky. Dominantní dědičnost vázaná na chromozom X 1. Postižený muž má všechny syny zdravé. 2. Všechny dcery postiženého muže jsou postiženy. 3. Postižená žena má v průměru polovinu synů a polovinu dcer postižených. Znaky s X dominantní dědičností jsou poměrně vzácné. Znaky pohlavím ovládané Tyto znaky jsou kódovány geny lokalizovanými v autozomech. Manifestují se však pouze u jednoho pohlaví. Obecné schéma dědičnosti znaku pohlavím ovládaného (+ znamená „znak přítomen“): Genotyp AA

Aa

aa

muž

+

+

-

žena

-

-

-

Pohlaví

Příklad: Hypospádie, rozštěp močové trubice, se vyskytuje pouze u mužů. U žen žádný z genotypů nemá klinický efekt. Jedna z forem hypospádie se dědí takto: muži s genotypem HH, Hh jsou postižení, muži s genotypem hh jsou zdraví. 33

v20150212

Znaky pohlavím ovlivněné Tyto znaky jsou také kódovány geny lokalizovanými v autozomech. Manifestují se u obou pohlaví, avšak v různé míře. Výskyt znaku závisí na: 1. přítomnosti jedné či dvou dominantních alel A 2. pohlaví jedince Obecné schéma dědičnosti znaku pohlavím ovlivněného (+ znamená „znak přítomen“): Genotyp AA

Aa

aa

muž

+

+

-

žena

+

-

-

Pohlaví

Příklad: U muže je předčasná lysivost dědičně založena dominantní alelou alelního páru Bb. K tomu, aby se vyskytla lysivost u ženy, musí být gen B v homozygotní konstituci (BB). U muže se tento gen projevuje i v heterozygotní konstituci Bb, pravděpodobně proto, že je přítomen mužský pohlavní hormon. Rovněž autozomálně recesivní onemocnění může být ovlivněno pohlavím. Příkladem je hemochromatóza – porucha metabolizmu železa, která vede k přetížení organizmu železem. Ženy trpí tímto onemocněním méně častěji. Důvodem je snížená absorpce železa ve střevu a zvýšené ztráty železa menstruační krví u žen.

Dědičnost znaku vázaného na pohlaví 4.1

Dědičnost hemofilie

Hereditární hemofilie (krvácivost) je dědičně založena recesivní alelou genu, který je lokalizován v heterologickém segmentu X chromozomu. Jedná se o poruchu srážlivosti krve v důsledku deficitu některého z koagulačních faktorů: deficit faktoru VIII – hemofilie A, deficit faktoru IX – hemofilie B. a) Zdravý muž se ožení se zdravou ženou, jejíž otec měl hemofilii. Jaké děti se mohou narodit v tomto manželství? b) Zdravým manželům se narodily tři děti: dvě dcery a jeden syn, který měl hemofilii. Obě dcery se provdaly za zdravé muže. V jednom z těchto dvou manželství se narodil nemocný chlapec a zdravá dcera, ve druhém jedna dcera a čtyři synové, z nichž pouze jeden byl nemocný. Jaké byly genotypy rodičů těchto dětí, jejich babičky a dědečka?

4.2

Dědičnost daltonismu

Daltonismus (barvoslepost) je dědičně založen recesivní alelou genu, který je lokalizován v heterologickém segmentu X chromozomu. a) Zdravý otec měl barvoslepého syna. Jaké jsou genotypy obou rodičů? b) Zdravým manželům se narodil jeden barvoslepý syn a zdravá dcera. Tato dcera se provdala za zdravého muže. Narodilo se jim 7 synů, z nichž 4 byli barvoslepí a tři měli normální zrak. Jaké byly genotypy jejich rodičů, babičky a dědečka?

4.3

Dědičnost deficitu G6PD

Deficit glukózo-6-fosfát-dehydrogenázy (G6PD) je nejběžnější enzymový defekt, způsobující onemocnění u člověka – odhaduje se, že postihuje 400 milionů lidí po celém světě. Tento deficit je dědičný XR. Je to velmi heterogenní porucha s mnoha variantami bodových mutací a delecí. 34

v20150212

Favismus – těžká hemolytická anémie, která vznikne u jedinců trpících tímto deficitem po požití bobu Vicia faba, byla odedávna známa v oblastech kolem Středozemního moře. Deficit G6PD poskytuje, podobně jako srpkovitá anémie a talasémie, určitou ochranu vůči malárii. (Tato enzymopatie upoutala pozornost když se zjistilo, že muži s tímto deficitem jsou postihovaní hemolytickou anémií po požití antimalarického léku primaquinu – proto byla choroba nazývána citlivost na primaquin. U deficitu G6PD snižují léky s oxidačním účinkem hladinu redukovaného glutationu v buňce a následné oxidativní poškození vede k hemolýze. Další nebezpečí přinášejí jedincům s deficitem G6PD sulfonamidová antibiotika). Ve čtyřčlenné rodině – otec, matka, dcera a syn – byl pouze syn postižen hemolytickou anémií po požití bobu. Jaké jsou genotypy všech členů rodiny?

4.4

Fosfátový diabetes

Fosfátový diabetes (hypophosphataemia renalis) je dědičně založen dominantní alelou alelního páru, který je lokalizován v heterologickém segmentu X chromozomu. a) Sňatek uzavřou nemocná žena a zdravý muž. Může se jim narodit zdravý syn? b) Sňatek uzavřou zdravá žena a nemocný muž. Jakého pohlaví budou zdravé děti? c) Když později zdravý potomek z uvedeného sňatku vstoupí do manželství se zdravým partnerem, může se jim narodit nemocné dítě?

35

v20150212

Rozbor rodokmenů – genealogická metoda

Monogenní choroby mají charakteristický způsob přenosu v rodinách. Pro stanovení typu dědičnosti je obvykle prvním krokem získání informace o rodinné anamnéze pacienta a shrnutí skutečností ve formě rodokmenu, jeho grafické podoby s použitím standardních symbolů.

Symboly používané v rodokmenech:

Zjednodušení, která přijímáme pro účely praktického cvičení: 1. Sledovaný znak (nemoc) je podmíněn vždy jen jedním genem se dvěma známými alelami, mezi těmito alelami je vztah úplné dominance. 2. Předpokládáme úplnou penetranci genu. 3. V rodokmenu sledujeme pouze jeden znak. 4. Znak je podmíněn genem buď na autozomu (A) nebo na gonozomu X (X), výskyt znaku je určen alelou dominantní (D) nebo recesívní (R). Autozomálně dominantní typ dědičnosti (AD) Jedinci genotypu AA, Aa jsou nemocní, jedinci genotypu aa jsou zdraví. a) Jestliže se nemoc vyskytuje u některého jedince v kterékoli generaci, zpravidla se objeví i v generaci následující (rozdíl od AR dědičnosti). Jestliže je určitý jedinec nemocný, pak má genotyp (1) AA nebo (2) Aa. V případě (1) předá „alelu pro nemoc“ A všem potomkům (všichni budou nemocní), v případě (2) polovině všech potomků. b) Počet postižených mužů a žen je přibližně stejný (rozdíl od XR dědičnosti). c) Jestliže sňatek uzavřeli zdraví jedinci (aa × aa), všechny jejich děti budou zdravé. (Důsledek: Jestliže se dvěma zdravým jedincům narodí nemocné dítě, pak se nejedná o AD dědičnost). d) Jestliže se dvěma nemocným jedincům narodí zdravé dítě, pak oba rodiče jsou heterozygoti (Aa × Aa). 36 v20150212

Příklady onemocnění: Huntingtonova chorea, achondroplazie, polydaktylie, familiární hypercholesterolemie, Marfanův syndrom Autozomálně recesivní typ dědičnosti (AR) Jedinci genotypů AA, Aa jsou zdraví, jedinci aa jsou nemocní. Aa jsou přenašeči onemocnění. a) Znak někdy „přeskakuje“ generace, tj. nevyskytuje se ve všech generacích za sebou. Nemocný zpravidla uzavře sňatek se zdravým partnerem, tj. buď (1) aa × AA, nebo (2) aa × Aa. V případě (1) budou všechny děti zdravé, v případě (2) bude 50 % dětí zdravých. b) Počet postižených mužů a žen je přibližně stejný (rozdíl od XR dědičnosti). c) Jestliže sňatek uzavřeli nemocní jedinci (aa × aa), pak všechny jejich děti jsou nemocné (tj. aa). Důsledek: Jestliže se dvěma nemocným jedincům narodí zdravé dítě, nejedná se o AR typ dědičnosti. d) Dvěma zdravým jedincům se může narodit nemocné dítě (pokud jsou rodiče heterozygoti: Aa × Aa). Příklady onemocnění: fenylketonurie, cystická fibróza, talasemie, srpkovitá anémie, galaktosemie, albinismus Na X chromozom vázaný dominantní typ dědičnosti (XD) Zdravé ženy mají genotyp XaXa, zdraví muži XaY. Jedinci XAXa, XAXA, a XAY jsou nemocní. a) Je-li partnerem zdravé ženy nemocný muž (XaXa × XAY), pak všichni synové jsou zdraví (XaY), všechny dcery jsou postižené (XAXa). b) Je-li partnerem zdravého muže nemocná žena, pak v případě, že: tato žena je homozygot (XAXA × XaY), jsou všechny děti nemocné tato žena je heterozygot (XAXa × XaY), pak je v průměru polovina synů a polovina dcer postižených Příklady onemocnění: vitamin D rezistentní rachitis, incontinentia pigmenti  

Na X chromozom vázaný recesivní typ dědičnosti (XR) Zdravé ženy mají genotyp XAXA, XAXa, zdraví muži XAY. Jedinci XaXa, XaY jsou nemocní. Ženy XAXa jsou přenašečky onemocnění. a) Postižení jsou většinou pouze muži: XaY. b) Jestliže sňatek uzavřel nemocný muž se ženou, jejíž genotyp je XAXA (XaY × XAXA), pak všechny děti budou zdravé, avšak všechny dcery budou přenašečky (XAXa). c) Jestliže žena přenašečka uzavře sňatek se zdravým mužem (XAXa × XAY), potom bude v průměru polovina synů postižených; přibližně polovina dcer budou přenašečky. Příklady onemocnění: deficit G6PD, daltonizmus, Duchennova svalová dystrofie

37

v20150212

4.5

Rozbor rodokmenů

Proveďte analýzu níže uvedených rodokmenů a uveďte, který typ dědičnosti je u každého z nich nejpravděpodobnější: AD, AR, XD, nebo XR. K jednotlivým rodokmenům pak zkuste přiřadit některé z následujících onemocnění: talasemie, cukrovka, daltonizmus, polydaktylie, Huntingtonova chorea, fenylketonurie, leukémie. Nejprve si povšimněme, zda jsou v rodokmenu přibližně stejně postiženi muži i ženy a zda se onemocnění vyskytuje ve všech generacích. Dále se zaměříme na část rodokmenu, která umožňuje (ve většině případů) jednoznačně určit typ dědičnosti.

Rodokmen 1 I.

II.

III.

IV.

Rodokmen 2 I. 1

2

3

4

5

II. 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

6

7

III. 1

2

3

4

5

IV. 1

2

38

3

4

v20150212

Rodokmen 3 I. 1

2

II. 1

2

3

III. 1

2

3

4

1

2

3

5

6

7

8

IV. 4

5

6

Rodokmen 4 I. 1

2

3

4

II. 1

2

3

4

5

6

7

8

7

8

9

III. 1

2

3

4

5

6

Rodokmen 5 Žena IV. 2 je postižena achondroplázií (AD). Vysvětlete rodokmen. I. 1

2

3

4

5

6

7

8

II. 1

2

3

4

5

6

7

8

9

III. 1

2

3

4

IV. 1

2

39

3

4

v20150212

4.6

Sestavte rodokmen podle rodinné anamnézy

Z příbuzenského sňatku bratrance a sestřenice (oba jsou zdraví) se narodila jedna zdravá dcera a jedna dcera postižená závažným typem anémie, která vyžaduje opakované transfuze. Již předtím se manželům narodilo jedno mrtvé dítě mužského pohlaví, navíc matka prodělala 2 spontánní potraty. Teď je opět těhotná a ptá se: 1. Bude dítě, které se má narodit, zdravé nebo postižené? 2. Bude to záviset na jeho pohlaví? Nakreslete rodokmen, určete pravděpodobný typ dědičnosti a pokuste se zodpovědět otázku tazatelky.

40

v20150212

5. Vazba genů a mapování chromozomů Studijní příprava Lokalizace strukturních genů v chromozomech. Genová vazba. Projevy genové vazby. Genová vazba a mapování. Nepřímá DNA diagnostika. Mapování chromozomů pomocí somatických buněčných hybridů.

Teoretický úvod Umístění genů Dva geny mohou být umístěny buď na dvou různých chromozomech (asynténně) anebo na společném vláknu jednoho chromozomu (synténně). Asynténní geny vstupují při meioze do gamet na sobě nezávisle, takže se nezávisle kombinují: gametogonium

A

a

B

b

S-fáze

primární gametocytS-

A

Aa

a B

Bb

b

meiotická segregace

gamety: B

A

genotypy gamet: četnost (frekvence): poměr: umístění genů: genotypy:

b

A

AB

Ab

1

1

/4

1

:

b

a

aB

ab

1

/4 1

B

a

1

/4

:

1

/4

:

1

asynténní AaBb

41

v20150212

Synténní geny jsou předávány do gamet společně. Proto se nemohou nezávisle kombinovat. Tyto geny označujeme jako vázané. Soubor genů v určitém chromozomu představuje vazbovou skupinu. Počet vazbových skupin organismu tedy odpovídá počtu rozdílných chromozomů v jeho buňkách; u diploidních organismů tedy odpovídá haploidnímu chromozomovému počtu (u člověka je to 23 chromozomů). Schéma znázorňující úplnou vazbu: I.

II.

gametogonia A B

a b

A b

a B

S-fáze

A B

A a B b

S-fáze

primární gametocyty

a b

A b

A a b B

a B

meiotická segregace

gamety: A B

genotypy gamet: četnost (frekvence): poměr: umístění genů: genotypy: vazbová fáze:

A B

a b

AB

ab

1

1

/2

1

a b

/2

:

1

A b

A b

a B

Ab

aB

1

1

/2 1

/2

:

synténní

synténní

AB/ab

Ab/aB

cis

trans

42

a B

1

v20150212

U diploidních organismů jsou alely vázaných genů umístěny na mateřském a otcovském homologním chromozomu určitého chromozomového páru. Jsou-li geny A a B lokalizovány na jednom chromozomu, potom u dvojitého heterozygota (AaBb) mohou být uloženy ve dvou polohách (fázích) podle toho, které dvojice alel jsou synténní. Vazbová fáze cis Na jednom homologním chromozomu jsou obě dominantní, na druhém obě recesivní alely. Synténní dvojice alel tedy jsou AB, ab. Zápis vázaných genů: AB/ab A

B

a

b

cis

Vazbová fáze trans Na jednom homologním chromozomu je dominantní alela jednoho genu s recesivní alelou druhého genu, na druhém obráceně. Synténní dvojice alel tedy jsou Ab, aB. Zápis vázaných genů: Ab/aB. A

b

a

B

trans

Při zápisu vázaných genů (AB/ab, Ab/aB) si můžeme představit, že zlomek představuje pár homologních chromozomů, takže v čitateli a jmenovateli jsou vždy dvojice alel, které vstupují do gamet společně. Dvojitý heterozygot cis proto tvoří za nepřítomnosti crossing-overu dva druhy gamet AB, ab se stejnou pravděpodobností (0,5), dvojitý heterozygot trans tvoří gamety Ab, aB se stejnou pravděpodobností (0,5).

43

v20150212

Změna vazbové fáze Mezi vázanými alelními páry může nastat během meiozy crossing-over (rekombinace nesesterských chromatid homologních chromozomů), který změní fázi trans na cis nebo obráceně. Potomek, nesoucí vázané geny v rekombinované fázi, se nazývá rekombinant. crossing-over (v 1. meiotické profázi)

vazbová fáze cis

A

A

B

B

a

a

b

b

A

A

B

b

a

a

B

b

po 1. meiotickém dělení

vazbová fáze trans

A

A

B

b

a

a

B

b


A

A

a

a

B

b

B

b

rekombinantní gamety

Pravděpodobnost, že rekombinace nastane, je vyjádřena četností (%) tohoto děje. Pravděpodobnost rekombinace je tím větší, čím je větší vzdálenost mezi alelními páry na chromozomech. Jestliže jsou alely obou genů navzájem velmi vzdálené (jejich vzájemná vzdálenost je větší než 50 cM), tyto geny mohou projevovat nezávislou kombinovatelnost, neboť četnost jejich rekombinace se může přiblížit 50 %.

44

v20150212

Síla vazby Úplná vazba dvou genů znamená, že mezi nimi nedochází ke crossing-overu (oba geny jsou na chromozomu těsně vedle sebe). Dvojitý heterozygot v těchto genech pak netvoří rekombinované gamety. Úplná vazba je vzácným jevem. Při neúplné vazbě vznikají rekombinované gamety. Geny neúplně vázané jsou tedy rekombinovatelné. Čím častěji se crossing-over mezi nimi uskuteční, tím více vznikne rekombinantů a síla jejich vazby je tím menší. Vzdálenější alelové páry budou rekombinovat častěji, než alelové páry blízké. Frekvence rekombinace (udávaná procentem rekombinací) tedy závisí na vzdálenosti mezi geny a vyjadřuje sílu jejich vazby: 1 % rekombinací ⇒ 1 % rekombinovaných gamet ⇒ 1 % rekombinantů mezi potomky z křížení dvojitého heterozygota (cis nebo trans) s dvojitým recesivním homozygotem ⇒ 1 cM (centimorgan, mapová jednotka). V tomto případě dochází k rekombinaci v 1 % buněk při meiotickém dělení a zároveň můžeme říct, že takovéto 2 geny jsou od sebe vzdáleny 1 cM. Maximální podíl gamet s rekombinantním genotypem je 50 % (tyto geny se již chovají jako volně kombinovatelné). Pokud je vzdálenost mezi 2 geny větší než 50 cM (týká se vzdálených genů na dlouhých chromozomech), podíl rekombinantních gamet se již dále nezvyšuje. U různých genů se může síla jejich vazby pohybovat od 0 do 50 %. Vztah četnosti rekombinací (v %) a síly vazby: 0 % ………….......... 1-5 % ………......... 30-40 % ……....……........ 50 % vazba úplná

silná vazba

slabá vazba

nezávislá kombinovatelnost

Princip testování genové vazby křížením Tabulka uvádí, jak se mění četnost (%) jednotlivých gametických genotypů u heterozygota cis a trans při různém % rekombinací. Nerekombinované (parentální) genotypy gamet a jejich četnosti jsou podtrženy: Genotyp (fáze) Četnost rekombinací (%)

AB/ab (cis)

Ab/aB (trans)

četnost gamet (%) četnost gamet (%) AB Ab aB ab AB Ab aB ab

0

50

0

0

50

0

50

50

0

10

45

5

5

45

5

45

45

5

50

25

25

25

25

25

25

25

25

...

Z tabulky vidíme, že se zvyšujícím se procentem rekombinací dvou alelních párů A/a, B/b vzrůstá relativní četnost (%) gamet s rekombinovaným genotypem a snižuje se četnost gamet s nerekombinovaným genotypem. Tato skutečnost se uplatňuje v testovacím křížení dvojitého heterozygota cis nebo trans s dvojitým recesivním homozygotem v těchže genech. Toto křížení umožňuje určit vazbovou fázi a sílu genové vazby podle štěpných poměrů u potomků. Vysvětlení Je-li četnost rekombinace nižší než 50 %, tvoří dvojitý heterozygot více nerekombinovaných, než rekombinovaných gamet. Mezi potomky budou častěji zastoupeni jedinci nesoucí alely ve stejné fázi jako u heterozygotního rodiče. Četnost rekombinantů naproti tomu bude mezi potomky menší. Genotyp potomků zastoupený se statisticky významně vyšší četností informuje tedy o tom, v jaké vazbové fázi jsou alely u testovaného heterozygotního rodiče. Četnost (%) rekombinantů 45

v20150212

z uvedeného typu křížení udává sílu vazby mezi těmito geny, vyjádřená v cM udává zároveň vzdálenost mezi nimi na chromozomu (ve vazbové skupině). V našich příkladech předpokládáme stejnou pravděpodobnost rekombinace v průběhu oogeneze i spermatogeneze (ve skutečnosti bývá větší u oogeneze).

I. Genová vazba při zpětném křížení 5.1

Testovací křížení

Proveďte křížení typu AaBb × aabb za předpokladu, že oba alelní páry jsou úplně vázané a) ve fázi cis, b) ve fázi trans.

5.2

Testovací křížení

Proveďte křížení typu AaBb × aabb za předpokladu, že oba alelní páry jsou a) ve fázi cis neúplně vázané, p = 5 cM, b) ve fázi trans neúplně vázané, p = 5 cM. Určete četnosti genotypů potomků z obou křížení, srovnejte je a odůvodněte rozdíly.

5.3

Vazba genů u drozofily

Alela B pro hnědou barvu těla je úplně dominantní nad alelou b pro černou barvu těla. Alela Vg pro normální vývin křídla je úplně dominantní nad vg alelou pro zakrnělá křídla. Z křížení dvojitého heterozygota v genu B a genu Vg a dvojitého recesívního homozygota bylo hybridizačním pokusem získáno: 91 drozofil hnědé barvy s normálními křídly, 411 drozofil černé barvy s normálními křídly, 413 drozofil hnědé barvy se zakrnělými křídly, 84 drozofil černé barvy se zakrnělými křídly. Určete jejich genotypy. Rozhodněte a odůvodněte, zda alelní páry B/b a Vg/vg jsou složkami dvou nebo jedné vazbové skupiny. Pokud jsou umístěny na jednom chromozomu, potom napište fázi vázaných genů a odůvodněte. Jak se změnila fáze alel v důsledku crossing-overu? Vypočítejte sílu vazby obou genů.

46

v20150212

II. Genová vazba u člověka 5.4

Zjišťování genové vazby v rodině

Vazba se nejlépe studuje v rodinách, kde: 1. jeden z rodičů je dvojitý heterozygot a 2. z rodokmenu lze poznat fázi vázaných genů 3. máme informace o minimálně třech generacích. Uvedený rodokmen ukazuje příklad nemoci podmíněné vzácnou dominantní alelou A s úplnou penetrancí, jejíž lokus je vázaný s lokusem pro krevní skupinu MN. Vztah alel M a N je kodominantní. Odhadněte výpočtem sílu vazby obou genů zastoupených alelními páry Aa, MN. MN

I.

M

MN

M

II.

MN

M

M

MN

MN

III.

Postup: 1. Postižený muž II,1 dostal od své matky I,2 alely aM (matka je homozygotem v obou genech). Od otce I,1 dostal alely AN. Má tedy genotyp AN/aM. 2. Žena II,2 mohla všem svým dětem předat pouze alely aM (je homozygotem v obou genech). 3. Postižený muž II,1 předal svým synům III,1 a III,5 kombinaci alel AN. Alely aM předal dcerám III,2 a III,3. 4. Zajímavý je syn III,4. Ten mohl dostat od své matky II,2 jedině aM. Protože není postižen (nemůže tedy mít alelu A) a má skupinu MN, musel od svého otce II,1 dostat aN (nikoli očekávané AN). 5. Otec II,1 však neměl geny ve fázi aN. Usoudíme, že tato sestava aN vznikla rekombinací. Její nositel III,4 je tedy rekombinant. 6. Ostatní členové rodiny jsou nerekombinanti, protože ve svých genotypech mají alelní páry ve stejné fázi jako rodiče. Zapište genotypy všech členů rodiny. Jaký je podíl rekombinantů v potomstvu III. generace? (1 rekombinant z 5 potomků). Uveďte sílu vazby obou lokusů procentem rekombinancí. (20 %) Údaje tohoto typu jsou spolehlivé jen tehdy, byly-li získány z většího počtu rodokmenů.

47

v20150212

5.5

Rh faktor a eliptocytóza

Eliptocytóza je dědičná porucha červených krvinek, kdy v důsledku mutace jednoho proteinu cytoskeletu ztrácí červené krvinky svůj bikonkávní tvar a stávají se eliptoidními. a) Předpokládejme, že geny pro Rh faktor a eliptocytózu (E) jsou úplně vázané. Eliptocytóza i Rh pozitivita se dědí AD. Muž II,1 Rh negativní je zdravý. Rh pozitivní žena II,2 zdědila eliptocytózu od svého nemocného Rh pozitivního otce I,1. Její zdravá matka I,2 byla Rh negativní. Jaká je pravděpodobnost, že dítě z tohoto manželství bude postiženo eliptocytózou? Jaká je pravděpodobnost, že dítě postižené eliptocytózou bude zároveň Rh pozitivní? I. II. III. b) Řešte příklad znovu s tím, že geny pro Rh a eliptocytózu vykazují sílu vazby 3 %.

5.6

Daltonismus a hemofilie A

V rodině se společně vyskytl daltonismus a hemofilie. Matka je heterozygotní přenašečkou obou chorob, alely jsou na jejích chromozomech uloženy ve fázi cis. Její partner má na X chromozomu recesivní alelu d a dominantní alelu H a je tedy barvoslepý. Mají barvoslepého syna, syna postiženého barvoslepostí i hemofilií a barvoslepou dceru. Vysvětlete. I. Daltonismus Hemofilie

5.7

II.

Asociace znaků

Pacienti s perniciózní anémií mají často krevní skupinu A. Stačí nález asociace (sdružení) dvou znaků (nemoci a určité krevní skupiny) pro tvrzení, že jejich genové lokusy jsou vázané? Jak by se vazba dala dokázat? Využití genové vazby Genová vazba se využívá pro nepřímou DNA diagnostiku, kdy nemůžeme příčinnou mutaci onemocnění vyšetřit přímo (pomocí přímé DNA diagnostiky) nebo tato mutace ještě není známá. Tato diagnostika je založená na analýze tzv. markerů, které jsou v těsné vazbě s alelou mutantní nebo s alelou podmiňující onemocnění. Pro využití nepřímé DNA diagnostiky musí platit: 1. silná vazba mezi mutací a markerem, takže rekombinace je nepravděpodobná 2. rodina je informativní, to znamená, že důležití členové rodiny jsou k dosažení a pro markery heterozygotní 3. je známá fáze vazby nebo může být snadno určena 4. mezi sledovaným markerem a genem pro chorobu nedošlo k rekombinaci. 48

v20150212

III. Lokalizace lidských genů pomocí somatické hybridizace

Somatická hybridizace je metoda, při které dochází k fúzi buněk a po fúzi jader vznikají buňky, které v jádře obsahují chromozomy 2 odlišných druhů – např. chromozomy lidské a myší. Během následné kultivace se vyselektují různé buněčné klony. Tyto buněčné klony obsahují myší chromozomy, ale většina lidských chromozomů je v průběhu buněčných dělení spontánně eliminována. Přesto si tyto klony uchovají kromě myších chromozomů i některé lidské chromozomy ⇒ tyto buněčné klony produkují některé lidské proteiny.

5.8

Lokalizace genů kódujících enzymy

Po somatické hybridizaci byly izolovány následující buněčné klony. Určete a odůvodněte lokalizaci genu pro enzym A (izocitrátdehydrogenáza 1) a genu pro enzym B (peptidáza B) v lidském chromozomu, když klony buněčných hybridů mají tyto znaky: Klon 1 obsahuje lidské chromozomy 1, 2, 14 a má aktivitu enzymu A. Klon 2 obsahuje lidské chromozomy 3, 12, 18 a má aktivitu enzymu B. Klon 3 obsahuje lidské chromozomy 2, 16, 18 a má aktivitu enzymu A i B.

5.9

Lokalizace HLA a P lokusů

Určete a odůvodněte, ve kterém lidském chromozomu jsou umístěny geny pro histokompatibilitu (HLA) a pro krevní skupinu P, když klony buněčných hybridů mají tyto znaky: Klon 1 obsahuje lidské chromozomy 5, 12 a 20 a nemá znak HLA ani P. Klon 2 obsahuje lidské chromozomy 5, 6 a 17 a má znak HLA a znak P. Klon 3 obsahuje lidské chromozomy 9 a 17 a nemá znak HLA, má znak P. Klon 4 obsahuje lidské chromozomy 6, 12 a 20 a má znak HLA a nemá znak P.

5.10 Vybrané lokusy lidského genomu Ve webové databázi Online Mendelian Inheritance in Man (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/getmap.cgi) je možné najít cytogenetickou lokalizaci lokusů genů, které se nějakým způsobem podílejí na lidských chorobách. V databázi lze vyhledávat podle nemocí nebo názvů genů. Příklad: Search for: galactosemia Location Symbol

9p13

GALT

Title Galactose-1phosphate uridyltransferase

MIM #

606999

Disorder

Comments Method Mouse

Galactosemia, 230400 (3)

(jeden z výsledků)

49

v20150212

Search for: thalassemia Location Symbol

11p15.5

HBB

Title

Hemoglobin beta

MIM #

Disorder

Sickle cell anemia (3); Thalassemias, beta- (3); Erythremias, beta-(3); Methemoglobinemias, 141900 beta- (3); Heinz body anemias, beta- (3); HPFH, deletion type (3); Thalassemia-beta, dominant inclusionbody, 603902 (3)

Comments Method Mouse

pseudogene HBBP1 between HBG and HBD loci

(jeden z výsledků)

50

v20150212

6. Nemendelovská dědičnost Studijní příprava Interakce nealelních genů, multifaktoriální dědičnost, heritabilita, studium dvojčat, mitochondriální dědičnost. V předchozích prakticích jsme se věnovali dědičnosti znaků a nemocí podmíněných monogenně, pro dědičnost kterých se uplatňují zákony Mendelovské genetiky. Na dnešním praktiku si uvedeme příklady dědičnosti znaků/nemocí, u kterých se Mendelovy zákony neuplatňují (multifaktoriální a mitochondriální dědičnost) nebo se uplatňují v modifikované formě (interakce nealelních genů).

I. Interakce nealelních genů

Některé kvalitativní znaky mohou být dědičně podmíněny dvěma nebo více geny. Proto se dědičnost těchto znaků někdy nazývá „multigenní“. Tak jako u monogenní dědičnosti se na vytvoření znaku podílí pouze genotyp jedince bez přispění environmentálních faktorů. Vztah mezi alelami různých lokusů označujeme jako interakce nealelních genů neboli intergenová interakce. I v tomto případě platí pro dědičnost Mendelovy genotypové zákony beze změny, ale Mendelova pravidla o fenotypovém vyštěpování mohou být modifikována různým způsobem, a to podle typu interakce. Existuje několik typů interakcí nealelních genů, které jsou známé především v živočišné a rostlinné genetice. Je pravděpodobné, že některé znaky člověka, až dosud považované za monogenní, mají multigenní základ. Důkaz však vyžaduje studium segregace ve velkých souborech rodin.

I. A) Epistáze Pro epistázi platí, že geny jednoho alelního páru (epistatické geny) potlačují projev genů jiného alelního páru (geny hypostatické). V případě recesivní epistáze dvě recesivní alely jednoho genu potlačují fenotypový projev dominantních alel jiného genu.

6.1

Recesivní epistáze u člověka: Bombay fenotyp u krevních skupin

Krevní skupina systému AB0 je podmíněna třemi základními alelami: A, B, 0. Aby se mohly alely A a B projevit ve fenotypu (aby mohly vzniknout krevní skupiny A, B, AB), musí být v genotypu přítomna také alespoň jedna dominantní alela genu H (tzv. Bombay gen). Alela H kóduje tvorbu tzv. antigenu H, který je prekurzorem pro tvorbu antigenů A a B. V případě homozygotní konstituce (hh) tento prekurzor chybí a tudíž se antigeny A a B nemohou vytvořit, krevní skupina jedince se jeví jako 0. Relativní četnost alely h v populaci je velmi malá, takže uvedená recesivní epistáze se vyskytuje velmi zřídka. a) Sňatek uzavřeli: žena s krevní skupinou 0 a muž s krevní skupinou A. Narodilo se jim dítě s krevní skupinou AB. Rodiče ženy (příbuzenský sňatek): otec měl krevní skupinu 0, matka krevní skupinu B. Nakreslete rodokmen, napište genotypy všech členů rodiny a vysvětlete. b) Sňatek uzavřeli: muž s krevní skupinou 0 (genotyp 00) a žena s krevní skupinou B (genotyp BB). Dvojčata, která se jim narodila, měla krevní skupinu 0. Napište genotypy všech členů rodiny a vysvětlete.

51

v20150212

I. B) Geny duplicitní O duplicitních genech hovoříme tehdy, jestliže nějaký znak je dědičně založen dvěma i více páry alel. K tomu, aby daný znak vznikl, postačí jediný pár alel. Interakce se projevuje v ovlivnění intenzity projevu znaku.

6.2

Duplicitní geny: dědičnost barvy pokožky u člověka

Barva pokožky u člověka je podmíněna několika páry alel. Pro názornost však použijeme Davenportovu hypotézu a omezíme se jen na dva geny. Podle Davenportovy domněnky je zbarvení pokožky dědičně založeno dvěma alelními páry S/s, T/t, jejichž účinek se sčítá. Intenzita zbarvení pokožky závisí od počtu dominantních alel přítomných na lokusech: SSTT – černá barva, SSTt, SsTT – tmavě hnědá barva, SsTt, SStt, ssTT – středně hnědá barva, Sstt, ssTt – světle hnědá barva, sstt – bílá barva. Jaké můžeme očekávat zbarvení kůže u dětí, jejichž rodiče měli následující genotypovou konstituci: SSTT × sstt, SsTt × Sstt, ssTT × Sstt?

52

v20150212

II. Multifaktoriální dědičnost

Nemoci nebo znaky podmíněné genotypově i faktory environmentálními vykazují komplexní neboli multifaktoriální dědičnost. Nemoc/znak vzniká jen za určitých zevních podmínek u osob s určitým genotypem (na jednom nebo více lokusech). Na jejím vzniku se podílí vrozená dispozice (genetický základ) a vlivy vnějšího prostředí různou měrou (např. diabetes mellitus). Přenos těchto onemocnění neodpovídá Mendelovým zákonům. Sem patří i nemoci vyvolané vnějšími vlivy, které se však projevují jen u osob s dědičnou dispozicí (hypertenzní nemoc, ulcus duodeni, astma). Tento typ dědičnosti vykazují jak znaky kvantitativní, tak i některé znaky kvalitativní – především nemoci.

II. A) Kvantitativní znaky    

jsou měřitelné charakteristiky např. výška postavy, krevní tlak jejich proměnlivost je spojitá frekvence v populaci vykazuje Gaussovo rozdělení

II. B) Diskrétní neboli kvalitativní znaky / nemoci     

jsou neměřitelné charakteristiky např. diabetes, rozštěp rtu jejich proměnlivost je nespojitá – jen 2 možnosti: nemocný, zdravý Gaussovo rozdělení platí s ohledem na náchylnost k nemoci platí tzv. prahový model: znak/nemoc se projeví pouze v případě, že náchylnost překročí určitý práh

53

v20150212

Nemoci s multifaktoriálním typem dědičnosti jsou velmi časté a mají největší podíl na morbiditě a mortalitě lidí. Tyto nemoci vykazují familiární výskyt, dědí se však pouze predispozice k nemoci (míra náchylnosti). S ohledem na podíl vnějších faktorů se nemoci i v rámci jedné rodiny vyznačují různou závažností klinických projevů. Velmi časté jsou i rozdíly ve frekvenci postižení mužů a žen. V následujícím textu se seznámíme s možností určení podílu genetických a environmentálních faktorů na rozvoj multifaktoriální nemoci.

Heritabilita a genetické studium dvojčat

Velmi vhodnou metodou pro odlišení genetických a environmentálních vlivů je genetický rozbor dvojčat (gemelilogická metoda). Tato metoda umožňuje odhadnout podíl genetických a negenetických faktorů na variabilitě znaků. Monozygotní (MZ) dvojčata mají stejný genotyp, protože vznikají rozdělením jedné rýhující se zygoty. Dizygotní (DZ) dvojčata mají různý genotyp, protože vznikají oplozením dvou vajíček dvěmi různými spermiemi a jsou tedy stejně příbuzní jako kteříkoli jiní sourozenci. Gemelilogickou metodou porovnáváme shodu v určitém znaku (nemoci) u MZ a u DZ dvojčat. Principem metody je skutečnost, že rozdíly ve fenotypu dvou geneticky identických MZ dvojčat musí být vyvolány vnějšími vlivy. Naproti tomu fenotypové rozdíly DZ dvojčat jsou vyvolány jak vlivy vnějšími tak i rozdílnou genetickou výbavou. Hodnotíme konkordanci (shodu) nebo diskordanci (neshodu). Konkordance: oba jedinci mají sledovaný znak; diskordance: jedno z dvojčat daný znak má, druhé dvojče tento znak nemá. Konkordance vyjadřuje četnost fenotypově shodných párů dvojčat ve vyšetřovaném souboru v procentech. Porovnáváním těchto konkordancí či diskordancí můžeme zjistit, jaká je heritabilita sledovaného znaku. Heritabilita neboli dědivost je hodnota udávající, do jaké míry je vytvoření znaku závislé na genotypu jedince a nakolik je konečná hodnota znaku výsledkem působení vnějších faktorů. Označení heritability je h2. Hodnota h2 se pohybuje od 0 (jestliže geny vůbec nepřispívají ke vzniku určitého fenotypu) k 1 (jestliže jsou geny za vznik určitého znaku plně zodpovědné). Pro zjednodušení těchto odhadů zavádíme hodnotu H, která se přímo heritabilitě nerovná, ale je s ní vysoce pozitivně korelována. Odhad podílu dědičnosti a prostředí na vzniku znaku pomocí hodnoty H:

H=

K MZ − K DZ 100 − K DZ

KMZ ... počet konkordantních párů MZ dvojčat v % KDZ ... počet konkordantních párů DZ dvojčat v % Hodnota H se u různých znaků pohybuje v rozmezí od 0 do 1. Blíží-li se k nule, uplatňuje se na variabilitě znaku převážně vnější prostředí. Blíží-li se hodnota H k jedné (počet shodných MZ dvojčat se tedy blíží 100 %), uplatňuje se převážně dědičnost a prostředí jen málo. H = 0 ...........………………………......1 vliv prostředí

vliv dědičné složky

54

v20150212

Upozornění: Ačkoli jsou studie dvojčat velmi užitečným nástrojem pro analýzu vlivu genetických a environmentálních faktorů, je zapotřebí opatrnosti při jejich interpretaci, a to z několika důvodů: 1. MZ dvojčata ženského pohlaví nemají vzhledem k náhodné inaktivaci chromozomu X v různých tkáních stejnou expresi X-vázaných genů a to i při zcela totožném genotypu. Heterozygotní ženy se dokonce mohou fenotypově i lišit. 2. Nejnovější studie ukázaly, že genetická informace MZ dvojčat se liší epigeneticky: tj. ne v sekvenci DNA, ale v úpravách DNA (např. metylace bazí), které sice nemění její primární strukturu, ale ovlivňují expresi genů. 3. Krajnějším případem je, že nemoc nemusí mít vždy genetický podklad, tedy že mohou existovat i negenetické fenokopie. Tabulka konkordance některých onemocnění Onemocnění Netraumatická epilepsie Roztroušená skleróza Diabetes mellitus typ I Schizofrenie Osteoartróza Revmatoidní artritida Psoriáza Rozštěp rtu (nikoli patra) Systémový lupus erythematodes

Konkordance (%) MZ DZ 70 6 17,8 2 40 4,8 53 15 32 16 12,3 3,5 72 15 30 5 22 0

Převzato z Thompson & Thompson Nussbaum, McInnes, Willard: Thompson & Thompson – Klinická genetika. Triton 2004

6.3

Vrozená luxace kyčelního kloubu

Byl sledován výskyt vrozeného vykloubení kyčle u novorozenců. V souboru 290 párů MZ dvojčat byla zjištěna konkordance u 120 párů. V souboru 327 párů DZ dvojčat byla konkordance u 9 párů. Zhodnoťte vliv genetických a negenetických faktorů u tohoto onemocnění.

6.4

Hypertenzní nemoc

V souboru 340 párů MZ dvojčat byla zjištěna konkordance v hypertenzní nemoci u 120 párů. V souboru 436 párů DZ dvojčat byla konkordance u 12 párů. Zjistěte podíl dědičnosti a vnějšího prostředí na vzniku této nemoci.

6.5

Schizofrenie

V souboru 378 párů MZ dvojčat byla nalezena konkordance ve schizofrenii u 283 párů. V souboru 985 párů DZ dvojčat byla konkordance v této nemoci u 147 párů. Co lze říci o vlivu prostředí a dědičnosti na vznik této nemoci?

6.6

Prořezávání zubů

Pořadí, v jakém se dítěti prořezávají zuby, je u monozygotních dvojčat shodné ve 47 %, u dizygotních v 16 %. Určete hodnotu H a vyslovte závěr o úloze genetických a negenetických faktorů při prořezávání zubů.

55

v20150212

6.7

Osm nemocí

V tabulce je uvedena konkordance u MZ a DZ dvojčat, zjištěná pro několik nemocí. Uspořádejte nemoci podle stoupajícího vlivu genetických faktorů na jejich vzniku. Zhodnoťte praktický dopad tohoto zjištění pro prevenci vzniku onemocnění. Odůvodněte. Onemocnění Vrozené vykloubení kyčle Hypertenzní nemoc Schizofrenie Basedowova nemoc Diabetes mellitus typ I Revmatická horečka Tuberkulóza Asthma bronchiale

Konkordance (%) MZ DZ 41 3 53 23 53 15 47 3 40 4,8 33 10 54 27 63 38

56

v20150212

III. Mitochondriální dědičnost

Dědičnost znaků kódovaných geny v mitochondriálním genomu se nazývá mitochondriální dědičnost. Mitochondriální geny jsou přenášeny matroklinním způsobem (to znamená od matky na potomky), protože všechny mitochondrie v oplozeném vajíčku jsou mateřského původu. Jedinci, postižení mitochondriální nemocí, mohou být muži i ženy, ale tyto nemoci se mohou v rodinách přenášet jen po mateřské linii. Dítě zdědí veškerou mitochondriální DNA od matky a žádnou od otce. Dcery přenášejí mitochondriální DNA na své potomky, synové nikoliv. Děti žen s mutací v mitochondriální DNA tuto mutaci dědí, zatímco žádný z potomků muže nesoucího tutéž mutaci defektní DNA nezdědí. Příklad rodokmenu s chorobou, způsobenou defektem v mitochondriální DNA: I.

II.

III.

IV. Mitochondriální genom kóduje některé enzymy nezbytné pro buněčné dýchání. Mitochondriální mutace proto nejvíce postihují tkáně, které potřebují intaktní oxidativní fosforylaci pro pokrytí vysokých požadavků na metabolickou energii. Mitochondriální choroby proto postihují neuromuskulární systém a způsobují encefalopatii, myopatii, ataxii, retinální degeneraci a ztrátu funkce zevních okohybných svalů. Příklady mitochondriálních poruch:  Leberova hereditární optická neuropatie (rychlá nekróza optického nervu, vedoucí ke slepotě na počátku dospělosti)  Myoklonická epilepsie, choroba s potrhanými červenými fibrilami ve svalech (abnormality CNS a poruchy ve funkci kosterních a srdečních svalů)  Kearns-Sayrův syndrom (nervosvalové symptomy, zahrnující paralýzu očních svalů, demenci a epizody podobné mrtvici)

6.8

Nakreslete rodokmen

Žena trpící mitochondriální chorobou se vdala za zdravého muže. Jejich jediný syn se oženil se zdravou manželkou a měli dva syny a dvě dcery. Nakreslete rodokmen této rodiny a vyznačte na něm jedince postižené zmíněnou chorobou.

57

v20150212

7. Genová kontrola metabolismu Studijní příprava Genová kontrola metabolismu, enzymopatie, hemoglobinopatie.

Teoretický úvod Průběh metabolických drah umožňují enzymy. Bílkovinná složka každého enzymu je kódována nejméně jedním strukturním genem. Genová kontrola metabolismu je uskutečňována tím, že se podle genetické informace syntetizují enzymy, strukturní a regulační bílkoviny, které zasahují do procesů syntézy a rozkladu chemických komponent buňky či organismu. Geny a metabolické dráhy Jednotlivé strukturní geny (např. G1 až G4) kódují specifické enzymy (E1 až E4), potřebné k uskutečnění jednotlivých stupňů chemických přeměn v určité metabolické dráze: geny:

G1

G2

G3

G4

enzymy:

E1

E2

E3

E4

metabolické dráhy:

substrát

M1

M2

M3

konečný produkt

Výsledkem působení enzymů jsou metabolické produkty – metabolity (M1-4) v posloupnosti, která je pro jednotlivé dráhy charakteristická. V organismu je mnoho metabolických drah. Jsou navzájem propojeny v harmonicky a účelně fungující síť, která představuje biochemickou osnovu organismu. Metabolické poruchy 1. Enzymopatie. Vznikají v důsledku mutací strukturních genů kódujících specifický enzym. Projevují se snížením aktivity, nedostatkem či chyběním určitého enzymu v těle. Nedostatek určitého enzymu má potom za následek zablokování metabolické dráhy – v těle je nedostatek produktu této metabolické dráhy. Navíc může docházet k hromadění nespotřebovaného substrátu nebo tento substrát může být přeměňován na toxický metabolit, který je produkován alternativní metabolickou drahou (Obr.1). Obr. 1:

A přebytek substrátu

B

×

C

nedostatek produktu

D

toxický metabolit

Enzymopatie vykazují recesivní dědičnost, to znamená, že projevy nemoci mají pouze recesivní homozygoti. U enzymopatií však lze rozpoznat heterozygota na biochemické úrovni. Heterozygot má ve srovnání se zdravým dominantním homozygotem asi o polovinu sníženou aktivitu enzymu 58

v20150212

zodpovědného za chorobný stav recesivního homozygota. Příčinou je, že heterozygot má jen jednu funkční alelu kódující tento enzym, dominantní homozygot dvě alely. Určení heterozygota (zdravého přenašeče, Aa) přímým vyšetřením (např. zátěžovým testem) může mít rozhodující význam pro genetickou předpověď postižení dítěte enzymopatií. Nejznámější enzymopatie jsou:  fenylketonurie (PKU) – porucha metabolizmu aminokyseliny fenylalaninu  galaktosémie – porucha metabolizmu cukru galaktózy  deficit glukóza-6-fosfátdehydrogenázy (deficit G6PD) – porucha tvorby NADPH v pentozovém cyklu. 2. Metabolické poruchy mohou vznikat i v důsledku mutací, které neovlivňují přímo tvorbu enzymu. Příkladem je porucha metabolizmu lipoproteinů – familiární hypercholesterolémie (FH). Genetickým podkladem tohoto onemocnění jsou mutace v genu pro receptor plazmatického LDL (LDL-R, zkratka LDL je odvozena z angl. „Low Density Lipoprotein“ – lipoprotein s nízkou hustotou). Tento receptor hraje klíčovou roli v udržování homeostázy cholesterolu v těle. Dědičnost FH je autozomálně semidominantní. 3. Diabetes mellitus (DM) je asi nejznámějším metabolickým syndromem. Z etiologického hlediska se jedná o heterogenní skupinu chorob, jejichž společným znakem je hyperglykémie (zvýšená koncentrace cukru v krvi). Hladina glukózy v krvi je kontrolována hormonem inzulínem, který je produkován beta-buňkami pankreatu. Dvě nejčastější formy diabetu, diabetes mellitus typ 1 (DM typ 1, inzulíndependentní) a diabetes mellitus typ 2 (DM typ 2, noninzulíndependentní) vykazují multifaktoriální dědičnost.

7.1

Metabolizmus fenylalaninu

Přeměna fenylalaninu na tmavý pigment melanin probíhá v jedné části metabolické dráhy takto: gen P

enzym PAH

tyrosin

melanin

fenylalanin enzym A

kys. fenylpyrohroznová

gen A

1. Gen P je mutací vyřazen z funkce. a) Které metabolity se budou v těle hromadit a které budou chybět? b) Proč jsou postižené děti světlejší než děti zdravé? c) Proč mohou být postiženy slabomyslností? d) Na čem je založena léčba této enzymopatie a jak se nemoc nazývá?

59

v20150212

2. Zátěžový test Dvěma zdravým vyšetřovaným byla orálně podána určitá dávka fenylalaninu. Po jisté době byla u osoby A naměřena dvakrát vyšší hladina fenylalaninu v krvi než u osoby B. a) Která osoba je heterozygotem? b) O kterou chorobu se asi jedná? c) Uveďte název zodpovědného enzymu.

7.2

Trávení laktózy

Laktóza (mléčný cukr) je v tenkém střevě rozkládaná pomocí enzymu laktázy na glukózu a galaktózu; oba monosacharidy jsou následně metabolizovány za účasti dalších enzymů. Aktivita laktázy je nejdůležitější v kojeneckém období (pro vysoký obsah laktózy v mateřském mléku) a postupně s věkem klesá. Deficit enzymu galaktózo-1-fosfát-uridyl-trasferázy (GALT), který metabolizuje galaktózu, je příčinou vzniku galaktosémie. V důsledku poruchy funkce enzymu vznikají metabolity (galaktitol, galaktózo-1-fosfát), které se hromadí v krvi a ve tkáních a vedou k poškození různých orgánů: zákal oční čočky, poškození jater a ledvin i dalších. Zastavením příjmu laktózy (jako hlavního zdroje galaktózy) v potravě je omezen vznik velkého množství škodlivých metabolitů a těžkého poškození orgánů. Protože je galaktóza tak jako ostatní uhlohydráty životně důležitá pro funkci každé buňky i celého organismu, je každá buňka v těle schopna galaktózu tvořit (tzv. endogenní produkce galaktózy). Obr.2: Trávení laktózy laktóza laktáza

laktózová intolerance

glukóza + galaktóza GALT

galaktosémie

uridin difosfogalaktóza (UDPG)

Galaktosémie může být někdy nesprávně zaměňována s laktózovou intolerancí (Obr.2). To je stav, při kterém v důsledku chybění nebo omezené produkce laktázy nedochází k rozkladu laktózy na monosacharidy. Konzumace mléka a mléčných výrobků se projeví nadýmáním a plynatostí. Tyto příznaky vymizí po vyloučení mléka a mléčných výrobků ze stravy. 1. Proč se ani přísnou speciální dietou u galaktosémie nedá zcela zabránit trvalému poškození orgánů? Porovnejte to s PKU. 2. Proč jsou někteří lidé postižení laktózovou intolerancí schopni dobře strávit některé druhy jogurtů a zakysaných mléčných produktů?

7.3

Deficit glukóza-6-fosfátdehydrogenázy

Glukóza-6-fosfát dehydrogenáza (G6PD) je enzym katalyzující iniciální krok pentosofosfátové cesty, tj. procesu, který slouží k tvorbě NADPH. Vznikající NADPH je nutný pro udržení glutathionu v redukované formě, který chrání buňku před oxidačním stresem (odstraňováním H2O2). Tento proces je důležitý zejména pro erytrocyty, protože je to pro ně jediný mechanizmus 60 v20150212

ochrany před oxidačním stresem. Infekce a podávaní některých léčiv způsobuje nadměrnou tvorbu H2O2. Za těchto podmínek u osob s deficitem enzymu nedostatečná kapacita G6PD nestačí na ochranu erytrocytů před oxidačním stresem, což vede k poruše integrity erytrocytů a k jejich hemolýze. Mezi tato léčiva patří: antimalarika, sulfonamidová antibiotika, nitrofurantoin, chloramfenikol, vitamin K, chinidin a jiné. 1. Proč je výskyt tohoto onemocnění zvýšený v malarických oblastech? 2. Jaký typ dědičnosti vykazuje toto onemocnění? Může se postiženému otci narodit zdravé dítě?

7.4

Familiární hypercholesterolemie (FH)

Cholesterol je v krvi transportován pomocí lipoproteinů. Jedním typem je i lipoprotein nízké denzity (Low Density Lipoprotein) – LDL. Do buněk se komplex LDL-cholesterol dostává po vazbě na specifický LDL receptor (LDL-R). Mutace LDL-R znemožňují příjem LDL-cholesterolu z krevní plazmy do buněk a způsobují zvýšení jeho koncentrace v krevní plazmě, což je jedním z faktorů přispívajících ke vzniku aterosklerózy. 1. Jaké jsou důsledky zvýšené hladiny LDL cholesterolu v krvi? 2. Lze pouze na základě zvýšené hladiny cholesterolu v krvi stanovit diagnózu FH? 3. Co to je semidominantní dědičnost?

7.5

Diabetes mellitus

Dva nejčastější typy diabetu (DM typ 1, DM typ 2) jsou alespoň částečně vrozené, přesněji řečeno, dědí se genetická predispozice k rozvoji tohoto onemocnění.

DM typ 1 (inzulíndependentní) Tento typ diabetu vzniká v důsledku snížené produkce inzulínu. Příčinou je zničení beta buněk Langerhansových ostrůvků slinivky břišní autoimunitním zánětem. Zásadní vliv mají environmentální faktory, především virové infekce, stres, působení některých látek a chemikálií (nitrozaminy z uzených potravin), předčasné zahájení konzumace kravského mléka a celkový stav výživy. V současné době je identifikováno asi 20 kandidátních lokusů, které jsou asociované se zvýšeným rizikem vzniku tohoto onemocnění. Nejznámější je asociace s některými HLA antigeny (HLA DR3, HLA DR4). Mezi další patří polymorfismus v genu pro inzulín, mutace genů TAP1 a TAP2 (kódující buněčné transportéry) a jiné.

DM typ 2 (noninzulíndependentní) Vzniká v důsledku snížené odpovědi těla na inzulín (tzv. inzulínová rezistence). Tento typ zahrnuje asi 90 % všech případů s DM. Podíl genetických faktorů na jeho rozvoji je vyšší než u DM typu 1. Kandidátní geny lze rozdělit do 2 skupin: a) geny ovlivňující funkci beta buněk pankreatu: geny ABCC8 a KCNJ11 kódující proteiny důležité pro fungování draslíkového kanálu, gen SLC2A2 kódující glukózový transportér, gen pro inzulín b) geny ovlivňující působení inzulínu: gen pro inzulínový receptor (INSR), geny kódující proteiny důležité v signální dráze inzulínu (PIK3R1 a SOS1) Mezi rizikové environmentální faktory patří obezita, nesprávná výživa, nedostatek pohybové aktivity. Tyto faktory mohou uspíšit propuknutí choroby a zhoršit její klinický průběh.

61

v20150212

Diabetes s monogenní dědičností Asi 1-5 % případů s DM vykazuje monogenní dědičnost a můžeme tedy jednoznačně prokázat souvislost mezi mutací konkrétního genu a vznikem diabetu bez podílu vnějších faktorů. Tyto mutace postihují proteiny, které ovlivňují produkci inzulínu nebo schopnost inzulínu snižovat hladinu glukózy v krvi. 1. MODY („Maturity Onset Diabetes of the Young“) vykazuje autozomálně dominantní dědičnost. Nemocní nejsou závislí na inzulínu. Podle příčinné mutace rozeznáváme 6 typů MODY. Pět jich je způsobeno mutacemi v transkripčních faktorech: MODY 1 (HNF-4 alfa), MODY 3 (HNF-1 alfa), MODY 4 (IPF-1), MODY 5 (HNF-1 beta) a MODY 6 (NEUROD1). Jeden typ, MODY 2, vzniká v důsledku mutace enzymu glukokinázy. 2. NDM (Neonatal Diabetes Mellitus) je velice vzácná forma diabetu s nástupem onemocnění v průběhu prvních 6 měsíců života. Buňky slinivky netvoří dostatek inzulínu a NDM může být zaměněn s DM typ1. Podle příčinných mutací rozeznáváme opět několik typů NDM, které mohou vykazovat autozomálně dominantní, autozomálně recesivní nebo na X-chromozom vázaný typy dědičnosti

Zodpovězte otázky: 1. Můžeme obecně říci, že cukrovka se v rodinách dědí? Upřesněte toto tvrzení. 2. Lze rozvoj diabetu ovlivnit? 3. Genetické studie dvojčat ukázaly, že konkordance DM typ 2 se u monozygotních dvojčat blíží k 90 % (u DM typu 1 je < 50 %). Jedno z monozygotních dvojčat trpí DM typ1. Jaká je pravděpodobnost, že se tato nemoc rozvine i u druhého dvojčete? Jak by tomu bylo v případě DM typu 2? Přehled nejčastějších forem DM DM typ 1 DM typ 2 nástup genetika autoimunitní proces inzulínová rezistence spojení s obezitou

MODY

mládí

dospělost

mládí

multifakt. (predispozice)

multifakt. (predispozice)

AD

ano

ne

ne

ne

ano

ne

ne

ano

ne

62

v20150212

8. Genetika populací Studijní příprava Genetická struktura populace. Hardy-Weinbergův (HW) zákon genetické rovnováhy. Uplatnění HW zákona ve skutečných populacích. Přímé stanovení četnosti alel. Evoluční činitelé. Inbríding.

Teoretický úvod Populační genetika studuje distribuci alelových frekvencí a jejich změny v důsledku působení evolučních faktorů: selekce, mutace, migrace a genetického driftu. Populace v Hardy-Weinbergově rovnováze U ideální populace, která splňuje následující kritéria: 1. panmixie 2. dostatečná velikost populace 3. nepůsobí na ni žádný z evolučních činitelů nastává rozdělení alelových frekvencí do genotypů podle Hardy-Weinbergova zákona. Jestliže je populace v HW rovnováze, potom existuje jednoduchý vztah mezi četností alel a četností genotypů (p + q)2 = p2 + 2pq + q2 současně platí: p+q = 1 Symboly, vyskytující se v uvedeném vztahu, znamenají toto: p: četnost dominantní alely A, resp. XA q: četnost recesivní alely a, resp. Xa p2: četnost dominantních homozygotů (AA, resp. XAXA) 2pq: četnost heterozygotů (Aa, resp. XAXa) q2: četnost recesivních homozygotů (aa, resp. XaXa) Toto panmiktické kombinování alel stabilizuje populaci do neměnného stavu HW rovnováhy a neumožňuje tedy evoluci. Populace s vývojem genového fondu. Evoluční faktory působí proti HW rovnováze. V důsledku toho může v populaci docházet k rozšíření nových alel, ztrátě některých stávajících alel a formování nových genotypů. Mění se tak genetická struktura populace.

Postup při řešení Pro všechny řešené příklady budeme předpokládat, že se populace nacházejí v HW rovnováze a pro genotypové frekvence platí binomické rozdělení. A) Autozomální dědičnost V populaci se vyskytují dvě alely určitého genu A/a mezi kterými je vztah úplné dominance a recesivity. Předpokládejme, že jedinci s dominantním fenotypem (tj. genotyp AA nebo Aa) se vyskytují v populaci s četností 84 %, jedinci s recesivním fenotypem (genotyp aa) s četností 16 %. Určete četnosti jednotlivých alel a dále četnosti dominantních homozygotů a heterozygotů. Řešení: 1. četnost recesivních homozygotů je uvedena již v zadání: 16 % ⇒ q2 = 0,16 63

v20150212

2. V uvedené situaci je nejlepším statistickým odhadem četnosti recesivní alely a hodnota q, kterou vypočítáme jako druhou odmocninu z četnosti recesivních homozygotů (q2): q = √0,16 = 0,4 3. Protože platí vztah p + q = 1, pak četnost druhé alely A je doplňkem do jedné: p = 1 – 0,4 = 0,6 4. Četnost dominantních homozygotů a četnost heterozygotů určíme ze základního vztahu: Genotyp: Četnost: Výpočet:

AA p2 (0,6)2 = 0,36 = 36 %

Aa 2pq 2 × 0,6 × 0,4 = 0,48 = 48 %

B) Dědičnost vázaná na X chromozom Alely určitého genu, který je lokalizován v heterologické části chromozomu X a jejichž vztah odpovídá úplné dominanci a recesivitě označujeme: XA a Xa Četnost genotypů v populaci je vyjádřena takto: XAXA XAXa XaXa XAY XaY Genotyp 2 2 p 2pq q p q Četnost Pro recesivní znaky vázané na X chromozom lze určit četnost žen přenašeček (XAXa), které mohou být fenotypově neodlišitelné od žen konstituce XAXA. Vycházíme ze skutečnosti, že nejlepším odhadem četnosti alely Xa je přímo četnost mužů s genotypem XaY, které lze jednoznačně fenotypově odlišit. Muži XaY jsou hemizygoti (mají pouze jedinou alelu pro daný gen) a tudíž i přítomnost jediné recesivní alely v genotypu má za následek recesivní fenotyp. To znamená, že frekvence mužů s recesivním fenotypem (XaY) se rovná frekvenci recesivní alely (Xa) = q. Limitní forma HW zákona Usnadňuje výpočet četností heterozygotů. Užívá se jen pro vzácné alely s četností nižší nebo nejvýše rovnou 0,01. Odůvodnění: je-li q = 0,01, pak p = 0,99, takže p může být zaokrouhleno na jednu. Z toho vyplývají pro limitní formu tři pravidla. Uvedeme je v modifikaci pro vzácné alely podmiňující AR choroby: 1. Většina vzácných recesivních alel se v populaci nachází v heterozygotech, kde tyto alely nejsou fenotypově vyjádřeny. 2. Když hodnotíme náhodně vybraný vzorek populace (zahrnuje zpravidla stovky jedinců), zachytíme v něm většinou pouze jedince zdravé (AA, Aa). Důvod je ten, že četnost nemocných recesivních homozygotů (aa) je nižší nebo nejvýš rovna 0,012 (t.j. 1 : 10 000), takže pravděpodobnost jejich zachycení v populaci je velmi nízká. 3. Četnost heterozygotů (Aa) se rovná dvojnásobku četnosti řídké recesivní alely, zjednodušeně tedy 2q. Četnost dominantních homozygotů (AA) je pak doplňkem do jedné, tedy 1-2q. Příklad: Četnost jedinců postižených fenylketonurií (q2) = 3×10-5, q = 0,007, četnost heterozygotů je 2q = 0,014 (= 2pq).

64

v20150212

I. Běžné sňatky I. A) Autozomální geny v populaci 8.1

Dědičnost barvy očí

Pro zjednodušení předpokládejme, že barva očí je determinována jedním alelním párem. Alela pro hnědou barvu očí (B) je dominantní nad alelou pro modrou barvu očí (b). V jisté populaci je asi 36 % modrookých lidí, ostatní jsou hnědoocí. a) Jaká je frekvence alely pro hnědou barvu očí? b) Kolik procent hnědookých lidí je homozygotů a kolik heterozygotů?

8.2

Dědičnost Rh-faktoru

Asi 15 % bělochů je Rh negativních (dd). a) Vypočítejte četnost Rh pozitivních jedinců dominantně homozygotního (DD) a heterozygotního (Dd) genotypu. b) Vypočítejte, jaká je v populaci četnost sňatků Rh negativní ženy (dd) s Rh pozitivním mužem genotypu DD, při kterých je každé dítě ohroženo fetální erytroblastózou.

8.3

Cystická fibróza (CF) – mukoviscidóza

Ve Finsku se rodí průměrně jedno postižené dítě na 25 000 zdravých; u nás jedno postižené dítě na 3 250 zdravých. a) Vypočítejte četnost defektní alely v obou populacích. b) Vypočítejte, jaká je v obou populacích četnost (%) přenašečů (Aa) defektní alely. c) Zhodnoťte zdravotní význam tohoto zjištění.

8.4

Fenylketonurie (PKU)

PKU je choroba podmíněná autozomálně recesivně. V naší populaci se vyskytuje přibližně jeden postižený jedinec na deset tisíc zdravých jedinců. a) Zjistěte četnost alely způsobující tuto chorobu v této populaci. b) Kolik procent obyvatel má defektní alelu v heterozygotní konstituci? c) Jaký zdravotní význam má tento poznatek?

8.5

Další autozomálně recesivní choroby

V populaci je četnost recesivní alely pro: a) glaukom.............................0,014 b) galaktosemii ......................0,004 c) retinitis pigmentosa ...........0,005

Vypočítejte četnost příslušných dominantních alel, heterozygotů a nemocných v této populaci.

65

v20150212

8.6

Srpkovitá anemie

Alela A kóduje syntézu normálního globinového řetězce, alela S kóduje syntézu pozměněného globinového řetězce. Srpkovitá anémie se dědí takto: SS ... nemocný (abnormální Hb, anémie) AS ... bez zdravotních potíží (normální i abnormální Hb) AA ... genotyp zdravého jedince (normální Hb). V různých regionech Afriky byly studovány dvě populace. V populaci I je četnost alely S = 0,10. V populaci II je četnost alely S = 0,41. a) Kolik procent obyvatel je srpkovitou anémií postiženo v populaci I a II? b) Kolik procent obyvatel je bez projevů chudokrevnosti, ale tvoří normální i abnormální Hb v populaci I a II? c) Jaký je praktický význam informace z otázky b)? Jak vysvětlíte vysokou četnost nevýhodné alely v populaci II?

8.7

Dens caninus

Velký dens caninus (špičák) se vyskytuje u 2 % obyvatel (Němci). Dědí se autozomálně dominantně. Určete četnost alely podmiňující tento znak v populaci. Vypočítejte četnost (%) heterozygotů a homozygotů v tomto genu pro tuto populaci.

8.8

Izolovaný rozštěp patra – palatoschisis

V populaci připadá na 1 pacienta s touto vadou 2 500 zdravých lidí. Vyznačuje se autozomálně dominantní dědičností. Vypočítejte četnost příslušné alely v této populaci a četnost (%) heterozygotů a homozygotů v tomto genu.

8.9

Trema

Trema (mezera mezi špičákem a řezákem) se dědí autozomálně dominantně. V populaci má tento znak 10 % jedinců. Vypočítejte četnost příslušné alely a četnost (%) heterozygotů a homozygotů v tomto genu pro tuto populaci.

I. B) X-vázané geny v populaci 8.10 Daltonismus Tato choroba je podmíněná XR. Vyskytuje se průměrně u 8 % mužů kavkazské (bíle) rasy. a) Vypočítejte četnost žen přenašeček. b) Jakou můžeme očekávat četnost daltonismem postižených žen v této populaci?

8.11 Hemofilie V populaci jsou průměrně 2 muži postiženi hemofilií A na deset tisíc zdravých mužů. Vypočítejte četnost žen přenašeček hemofilie A. Jakou můžeme očekávat v této populaci četnost postižených žen?

8.12 Deficit glukóza-6-fosfát-dehydrogenázy (G6PD) V určité populaci v Africe bylo zjištěno 7 % mužů postižených enzymopatií (deficitem G6PD). V evropské populaci bylo takových mužů zjištěno 1,5 %. Defekt je podmíněn XR. Vypočítejte četnost žen přenašeček v obou populacích. Jakou můžeme očekávat v obou populacích četnost žen postižených tímto defektem? 66

v20150212

II. Inbríding, příbuzenské sňatky, koeficient inbrídingu

Inbríding (z anglického inbreeding, vnitřní křížení, příbuzenské křížení) je křížení blízce příbuzných jedinců. Tento termín se používá hlavně u šlechtění a znamená příbuzenskou plemenitbu, např. u hospodářských zvířat. U lidských populací jsou jeho analogií příbuzenské sňatky. Křížení blízkých příbuzných vede k redukci genetické diverzity a ke zvýšení homozygozity (stejná alela ve stejném lokusu na obou homologních chromozomech). U inbredních jedinců se zvyšuje pravděpodobnost fyzických a zdravotních problémů zahrnujících:      

sníženou plodnost zvýšený počet genetických onemocnění zvýšenou mortalitu novorozenců sníženou rychlost růstu menší velikost dospělých jedinců ztrátu funkcí imunitního systému

Inbríding se využívá při šlechtění nových plemen zvířat a odrůd rostlin k upevnění požadovaných znaků v populaci, ale vždy se musí počítat s vyřazováním méně životaschopného potomstva.

Inbríding u člověka O příbuzenském sňatku hovoříme tehdy, jestliže oba partneři vstupující do sňatku mají společného předka. V těchto situacích se totiž nejvýrazněji projeví rozdíl mezi dvěma typy sňatků: (1) mezi nepříbuznými jedinci, (2) mezi příbuznými jedinci. Tento rozdíl spočívá ve větší četnosti dětí homozygotní konstituce v případě sňatků mezi příbuznými jedinci. Riziko příbuzenských sňatků tkví v tom, že je zde větší pravděpodobnost vzniku recesivně dědičných chorob, neboť je zde riziko, že oba příbuzní jedinci nesou mutovanou alelu, kterou zdědili od společného předka. K inbrídingu u lidí dochází ve zvýšené míře díky existenci tzv. genetických izolátů: geografických, náboženských nebo lingvistických. Incest je sexuální aktivita mezi blízkými příbuznými. Ve většině národů je poměr mezi blízkými pokrevními příbuznými zločinem, i když se definice blízkosti mění. V některých zemích, jako například v ČR, jde o závažný žalovatelný trestný čin, v jiných zemích je klasifikován jako přečin s mnohem méně vážnými právními důsledky. Příbuzenské sňatky u aristokracie Aristokratické vládnoucí rodiny v Evropě využívaly sňatků k politickému upevnění moci a tím docházelo k častému příbuzenskému propojení a k fenotypovému vyjádření vzácných recesivních znaků. Například u rodu Habsburků docházelo velmi často k příbuzenským sňatkům. Vedlo to k rozvoji slavného Habsburského rtu, typického pro všechny rodinné příbuzné Habsburků během šesti století. Postupně se tento znak vyvíjel a zhoršoval až to vedlo u Karla II Španělského k tak výrazné změně horní čelisti, že nedokázal žvýkat (recesivní znak, ovládaný více geny).

67

v20150212

II. A) Koeficient inbrídingu (F) Koeficient inbrídingu F vyjadřuje pravděpodobnost, že se u jedince narozeného z příbuzenského svazku vyskytnou na určitém lokusu dvě identické alely (homozygotní konstituce), pocházející od společného předka (viz alela A1m na obrázku 1). Obr. 1 A1mA2m

A1pA2p

I.

A1mA2p

A2A2

A1mA1p

A1A2

II. A1mA2

A1mA1

III.

A1mA1m

IV.

Předpokládejme, že společný předek (např. prababička I.1) má genotyp A1mA2m (m jako maternální). U potomka (pravnučky IV.1) příbuzenského svazku (III.1 × III.2), který má homozygotní genotyp A1mA1m pochází obě alely A1m od prababičky I.1. Přenos alely A1m je vyznačen tučným písmem. Dvěma společným předkům (prababičce a pradědečkovi) odpovídají nanejvýš čtyři různé homozygotní genotypy jejich potomka (pravnučky): A1mA1m, A2mA2m, A1pA1p nebo A2pA2p (p jako paternální). Výpočet koeficientu inbrídingu jedince: F = S×(1/2)P+M S vyjadřuje nejvyšší možný počet různých homozygotních konstitucí, které se u potomka mohou vyskytnout. V případě jednoho společného předka S=2, v případě dvou společných předků S=4, atd. Formálně lze tedy hodnotu S určit jako dvojnásobek počtu společných předků. P je počet generačních intervalů od jedince ke společnému předkovi přes otcovskou linii M je počet generačních intervalů od jedince ke společnému předkovi přes mateřskou linii 1

/2 – pravděpodobnost, že od rodiče získáme konkrétní alelu (např. A1m)

68

v20150212

II. B) Koeficient příbuznosti (Rxy)

Z koeficientu inbrídingu pak můžeme vypočítat koeficient příbuznosti Rxy, který hovoří o míře genetické příbuznosti dvou jedinců (X a Y). Rxy = 2 × F Rxy vyjadřuje pravděpodobnost, s jakou nastane situace, že náhodně vybraná alela A z lokusu L jedince X (Obr.1 III.1) a alela ze stejného lokusu jedince Y (Obr.1 III.2) pocházejí od společného předka (I.1). Rxy se využívá při výpočtu specifického rizika postižení dítěte dědičným genetickým onemocněním (viz přiklad 2).

8.13 Vypočítejte koeficient inbrídingu

Tabulka koeficientů inbrídingu a příbuznosti u nejčastějších typů příbuzenských svazků Koeficient Koeficient Typ příbuznosti inbrídingu příbuznosti rodič – dítě 1/4 1/2 bratr – sestra strýc – neteř 1/8 1/4 teta – synovec bratranec – sestřenice 1/16 1/8 bratranec – dítě 1/32 1/16 sestřenice (i opačně) bratranec – sestřenice 1/64 1/32 druhého stupně

8.14 Inbríding a autozomálně recesivně dědičné onemocnění

Fenylketonurie (PKU). V populaci se vyskytuje přibližně jeden postižený jedinec na deset tisíc zdravých jedinců. To vyjadřuje pravděpodobnost, s jakou se nepříbuzným zdravým manželům může narodit dítě s PKU. Zjistěte, jak se změní pravděpodobnost postižení dítěte, jestliže se jedná o potomka z manželství bratrance a sestřenice. Oba jsou zdraví. Výpočet rizika: Riziko postižení = populační riziko (PR) + specifické riziko (SR) PR = q2  populační riziko je frekvence nemoci v populaci  vyjadřuje pravděpodobnost, že se 2 zdravým manželům narodí postižené dítě, protože oba jsou nositeli mutantní alely; tato alela však nepochází od společného předka  toto riziko se rovná riziku postižení dítěte v jakémkoli svazku v populaci

69

v20150212

SR = Rxy × 2pq × 1/4  specifické riziko vyjadřuje pravděpodobnost, s jakou se zdravým manželům může narodit postižené dítě v důsledku příbuzenského sňatku (homozygotizace)  mutantní alela v tomto případě pochází od společného předka manželů  Rxy ... koeficient příbuznosti manželů  2pq ... frekvence heterozygotů v populaci (přenašečů mutantní alely) ... pravděpodobnost, že zdraví manželé jsou heterozygoti 1  /4 ... pravděpodobnost, že se heterozygotním manželům narodí postižené dítě ... Aa × Aa → AA, Aa, Aa, aa Řešení příkladu: q2 = 10-4 q = 10-2 p=1 2pq = 2q = 2×10-2 Rxy = 1/8

Riziko postižení

= PR + SR = q2 + Rxy × 2pq × 1/4 = 0,0001 + 1/8 × 0,02 × 0,25 = 0,000725 = 7×10-4

Z výpočtu vyplývá, že riziko postižení dítěte PKU je v příbuzenském manželství bratrance a sestřenice více než 7× větší než v ostatní populaci.

70

v20150212

9. Genetická prognostika Studijní příprava Monogenně dědičná onemocnění a Mendelovy zákony, pravidla jednotlivých typů dědičnosti. Penetrance a expresivita genů. Koeficient inbrídingu, koeficient příbuznosti. Populační genetika. Genetická prognóza a prevence. Genetické poradenství.

Teoretický úvod Genetické poradenství Genetickou prognózu (předpověď) výskytu dědičné choroby zjišťuje genetické poradenství. Nejčastější otázky tazatelů: Jsem ohrožen nemocí, kterou měl některý z mých prarodičů, rodičů nebo kterou má můj sourozenec? Jaké je nebezpečí, že moje dítě bude postiženo chorobou, kterou mám já sám nebo kterou má některý z mých rodičů či sourozenců? Jaké je riziko, že naše další dítě bude postiženo chorobou, kterou má první dítě? Jaké nebezpečí je při sňatku bratrance se sestřenicí, že se u jejich dětí vyskytne choroba, kterou měl někdo z příbuzných? U 10 % rodin naší populace je nutné genetické poradenství. Účel poradenské služby Zbavit tazatele pocitu viny a uklidnit jej, rozptýlit jejich obavy při malém riziku genetického postižení, určit pravděpodobnost postižení, riziko rekurence (viz níže), informovat o pravděpodobnosti výskytu genetického postižení u dalšího dítěte a u příbuzných, poradit, jak genetickému riziku čelit (např. prenatální diagnostika, umělé oplodnění s využitím dárcovských spermií nebo vajíček, nedoporučení těhotenství, adopce dítěte, ochranný léčebný režim u ohrožených osob). Hodnocení rizika genetického postižení Při každém těhotenství je riziko 3-5 % postižení dítěte vrozenou odchylkou či vývojovou vadou pokládáno za normální (populační průměr), riziko kolem 5 % je považováno za nízké, 5-10 % za střední a nad 10 % za vysoké. Je-li pravděpodobnost postižení nižší než 10 %, považuje se genetická prognóza za příznivou, je-li vyšší než 10 %, za nepříznivou. Je důležité, že určení předpovědi na základě pravděpodobnosti neznamená většinou jistotu, ale jen pravděpodobnost s jakou postižení může nastat. Obecné riziko: že gravidita skončí spontánním potratem (1/8), že se dítě narodí s nějakou vrozenou vadou (1/30), že manželství bude neplodné (1/10), že bude dítě postiženo dědičnou chorobou (5/100) a další. Velikost obecného rizika je dána četností těchto případů v populaci. Riziko rekurence: pravděpodobnost, s jakou se choroba projeví u jiných členů rodiny. Riziko mendelovské (teoretické): určuje se u monogenně podmíněných chorob s využitím Mendelových zákonů s poměrně přesnými výsledky. Je předmětem našeho cvičení. Riziko empirické: u multigenně a polygenně podmíněných chorob a u většiny chromozomálně podmíněných patologických stavů známe jen empirické riziko. Rovněž v situacích, kdy je nejistota o manželském původu dítěte, možné zkreslení údajů anamnézy, neúplný rodokmen nebo choroba vznikla spolupůsobením vnějších faktorů. V takových případech se odhaduje riziko postižení empiricky – to znamená podle zkušeností u případů, které se již dříve vyskytly v mnoha rodinách určité populace. Několik příkladů empirického rizika uvádí tabulka:

71

v20150212

Empirické riziko narození postiženého dítěte (v %) Nemoc Rozštěp rtu / patra Rozštěp patra izolovaný Epilepsie Schizofrenie Mentální retardace Luxace kyčelního kloubu Diabetes mellitus Pes equinovarus

Oba rodiče zdraví, žena poprvé těhotná 0,1 0,04 0,5 1,0 1,0 0,07

Oba rodiče zdraví, již mají jedno postižené dítě 4 2 10 14 15 5 25-35 5

0,1

Jeden z rodičů postižen, žena poprvé těhotná 4 7 5 16 35 5 20 7

Údaje potřebné pro předpověď Správné řešení a spolehlivost prognózy jsou podmíněny objektivními informacemi: 1. přesná diagnóza choroby 2. typ její dědičnosti ve vyšetřované rodině 3. hodnota penetrance „chorobné“ alely 4. často též četnost přenašečů (heterozygotů, 2pq) „chorobné“ alely v populaci

Postup při stanovení prognózy Nejčastěji se setkáváme s následujícími třemi situacemi: Situace I: Zdravým rodičům se narodilo postižené dítě Jaké je riziko postižení dalšího dítěte? Je třeba rozhodnout, o který z následujících šesti případů se v dané rodině jedná: 1. Choroba vznikla na základě čerstvé dominantní mutace nebo chromozomové aberace u dítěte. Prognóza pro další dítě v rodině je příznivá, protože přenos choroby do další generace začíná až u postiženého jedince. 2. Choroba má multigenní podklad. Prognóza je většinou příznivá, nejsou-li manželé příbuzní (a zvláště nemají-li už jedno postižené dítě). Pro předpověď se užívají empirické údaje zjištěné z velkých populačních vzorků. 3. Jde o fenokopii. Choroba byla vyvolána negenetickým faktorem (vnější noxou). Prognóza pro sourozence i děti postiženého je příznivá, pokud noxa nepůsobí trvale. 4. Choroba má AR podklad. Pro každé další dítě těchto rodičů je riziko 25 %, že bude mít tuto chorobu. Prognóza nepříznivá. 5. Choroba je podmíněna AD genem s neúplnou penetrancí či expresivitou. Riziko výskytu choroby pro další děti je až 50 %. Prognóza je nepříznivá. 6. Choroba má XR podklad. Riziko postižení dalšího syna je 50 %. Prognóza pro syny nepříznivá. Pro dcery příznivá (přenašečky nejsou fenotypově postižené). Situace II: Jeden z rodičů je postižen chorobou, jaké je riziko postižení dítěte v této rodině? I zde nutno rozhodnout, o který ze sedmi případů v rodině se jedná: 1. Choroba je dědičná AD nebo jde o čerstvou dominantní mutaci u postiženého rodiče. Riziko postižení dětí nejméně 50 %. Prognóza nepříznivá. 2. Choroba má AR podklad. Viz situace I, 4). 72

v20150212

3. Choroba je dědičná XR. a) Děti postiženého muže jsou fenotypově zdravé,všechny dcery přenášejí chorobu na své syny. b) Postižená žena bude mít všechny syny postižené a všechny dcery přenašečky. V tomto případě je prognóza nepříznivá – riziko 50 %. 4. Choroba je dědičná XD. Je riziko postižení poloviny dětí. Je-li postižen otec, jsou postiženy jen dcery, nikoli synové. Je-li postižena matka, je polovina dětí postižena bez ohledu na pohlaví. Prognóza je nepříznivá. 5. Choroba má multigenní podklad. Není-li stejnou chorobou postižen další příbuzný, je prognóza příznivá. Pravděpodobnost opakování choroby u dětí udávají empirická data. 6. Choroba má povahu fenokopie. Genom postiženého je tedy normální, genetická prognóza je pro jeho potomky příznivá. 7. Podkladem choroby je chromozomové aberace. Záleží na typu aberace (vyšetření karyotypu). Prognóza bývá většinou nepříznivá. Situace III: Choroba vykazuje autozomálně recesivní dědičnost Při odhadu pravděpodobnosti postižení dítěte předpokládáme, že se nejedná o příbuzenský sňatek. Relativní četnost heterozygotů v populaci vypočítáme pomocí Hardy-Weinbergova zákona z četnosti nemocných (q2). Pokud není v zadání příkladů uvedeno jinak, jsou rodiče manželů i ostatní členové rodiny zdraví. Charakteristika 1. Oba manželé jsou zdraví. Jaká je pravděpodobnost, že se jim narodí nemocné dítě? Pravděpodobnost P = (P1, že 1. partner je heterozygot) × (P2, že 2. partner je heterozygot) × (P3, že se dvěma heterozygotům narodí nemocné dítě) P = 2pq × 2pq × 1/4 2. Oba manželé jsou zdraví. Jeden z manželů má nemocného sourozence. Jaká je pravděpodobnost, že se jim narodí nemocné dítě? Rodiče manžela, který má nemocného sourozence, musí být oba heterozygoti. Pravděpodobnost, že se dvěma heterozygotům narodí zdravé dítě, které je také heterozygot, je rovna 2/3. P = (P1, že 1. partner je heterozygot) × (P2, že 2. partner je heterozygot) × (P3, že se dvěma heterozygotům narodí nemocné dítě) P = 2/3 × 2pq × 1/4 3. Oba manželé jsou zdraví. Oba manželé mají nemocného sourozence. Jaká je pravděpodobnost, že se jim narodí nemocné dítě? P = (P1, že 1. partner je heterozygot) × (P2, že 2. partner je heterozygot) × (P3, že dvěma heterozygotům se narodí nemocné dítě) P = 2/3 × 2/3 × 1/4 = 11,1 % 4. Jeden z manželů je zdravý, druhý nemocný. Jaká je pravděpodobnost, že se jim narodí nemocné dítě? P = (P1, že nemocný je recesivní homozygot) × (P2, že zdravý manžel je heterozygot) × (P3, že ze sňatku recesivního homozygota a heterozygota se narodí nemocné dítě) P = 1 × 2pq × 1/2

73

v20150212

Přístup k řešení úkolů Shora popsané situace se vyskytují v různých obměnách v úkolech, které budeme řešit. Jejich řešení si usnadníme, posoudíme-li napřed charakter údajů v jednotlivých úkolech: 1. Údaje uvedené o rodinné situaci stačí k vyřešení prognózy: můžeme určit s jistotou nebo jednoduchou pravděpodobností genotypy osob s chorobným genem. Je to obvyklé u AD, XD, XR a řídké u AR typu dědičnosti. 2. Údaje o rodinné situaci nedostačují k vyřešení prognózy: musíme použít poznatků z genetiky populací a počtu pravděpodobnosti. Sem patří mnoho případů s AR typem dědičnosti. 3. Pro nedostatek údajů nemůžeme postupovat podle bodu 1) ani 2): neznáme typ dědičnosti choroby v rodině, choroba má multigenní podklad, uplatňuje se snížená penetrance, nejsou vyloučeny fenokopie, atd. Pro řešení je nutno použít údajů empirického rizika. Zkratky použité v dalším textu čteme takto: AD ... autozomálně dominantní

AR ... autozomálně recesivní

XD ... vázaná na X chromozom dominantní

XR ... vázaná na X chromozom recesivní

AA ... dominantní homozygot Aa ... heterozygot aa ... recesivní homozygot P ... pravděpodobnost

9.1

Albinismus

Albinismus se dědí AR, četnost heterozygotů v populaci (2pq) je 1/50. a) Tazatelka je zdravá, ale její otec měl albinismus. Ptá se, jaké je riziko postižení jejich dětí albinismem. Tazatelčin manžel je zdravý a v jeho rodině se albinismus nevyskytuje. b) Je možné, aby se dvěma zdravým manželům narodilo albinotické dítě, když se v jejich rodinách albinismus nikdy nevyskytl? Nebo je to vyloučeno? Odůvodněte.

9.2

Cystická fibróza (CF, mukoviscidóza)

Tato choroba se dědí AR a četnost heterozygotů v populaci (2pq) je 1/25. Žena hodlá uzavřít sňatek. Její bratr zemřel na CF, její rodiče byli zdraví. Má obavu, že až se provdá, bude mít stejně postižené dítě. (více informací k CF: http://www.genomac.cz/cz/view.php?cisloclanku=2006050021)

9.3

Myopatie

Tazatel se ptá, zda může onemocnět nervovou chorobou (myopathia myotonica), když tuto chorobu měl jeho dědeček. Dědečkova dcera (tazatelova matka) je zdravá. Choroba začala u dědečka ve 40 letech a dědí se AD s úplnou penetrancí. Nakreslete rodokmen a odůvodněte svou odpověď. Předpokládejme, že chorobou byl postižen nejen dědeček, ale i tazatelova matka. Jakou má tazatel pravděpodobnost, že zdědil „chorobnou“ alelu a že onemocní jako jeho dědeček a matka?

9.4

Fenylketonurie

Zdravým manželům se narodil syn postižený fenylketonurií (dědičnost AR). Matka je podruhé těhotná a ptá se, zda její další dítě bude také postiženo. Znázorněte rodokmen, odpovězte a odůvodněte. 74

v20150212

9.5

Choroba podmíněná XD

Zdravá žena má za manžela muže postiženého svalovou slabostí (progresivní svalová dystrofie). Tito manželé mají dceru postiženou svalovou dystrofií. Žena je znovu těhotná. Mají obavu, že se jim opět narodí postižené dítě. Znázorněte rodokmenem a odůvodněte svou odpověď. Vysvětlete princip volby pohlaví dítěte a jeho význam pro prevenci postižení.

9.6

Hemofilie

Zdravá žena má bratra s hemofilií. Ptá se, jaké je riziko, že její syn bude mít hemofilii. Sestavte rodokmen a odpovězte jí.

9.7

Hluchota

Jeden typ hluchoty je podmíněn AR a četnost heterozygotů v populaci (2pq) je 0,04. a) Hluší manželé chtějí vědět, zda jejich děti budou stejně postiženy, či zda je naděje, že by mohli mít slyšící dítě. b) Podrobným vyšetřením se prokázal nehereditární původ hluchoty u muže a hereditární původ u ženy. Určete pravděpodobnost postižení dítěte z tohoto manželství pro obě situace. (Muž s nedědičnou hluchotou může mít genotyp buď AA, nebo Aa.) Vyvoďte genetické důsledky a určete pravděpodobnost narození hluchého dítěte pro obě situace. Výsledky srovnejte. Zhodnoťte význam přesné diagnózy choroby a genealogického vyšetření pro genetickou předpověď. Zobecněte.

9.8

Marfanův syndrom (arachnodaktylie)

Marfanův syndrom je podmíněn AD genem s 80% penetrancí. Postižená žena a zdravý muž uzavřeli manželství. Rodiče ženy: matka zdravá bez pozitivní rodinné anamnézy, otec postižený; jediný bratr ženy je postižený. V rodině muže se toto onemocnění nevyskytlo. Znázorněte rodokmenovým schématem. Jaká je pravděpodobnost, že se těmto manželům narodí postižené dítě?

9.9

Hemolytická sférocytární anémie

Tato porucha krvetvorby se vyznačuje AD dědičností. Postižený tazatel má zdravé rodiče a 6 zdravých sourozenců. Jeho jediná dcera je postižená. Určete riziko postižení jeho dalších dětí. Tazatel je nositelem čerstvé genové mutace – odůvodněte.

9.10 Hemofilie Dva zdraví jedinci uzavřeli sňatek. Otec ženy měl XR dědičnou hemofilii. Rodiče muže byli zdraví, ale u mužova dědečka z matčiny strany se tato choroba vyskytovala. Znázorněte rodokmenem. Jaká je pravděpodobnost, že se těmto manželům narodí postižený syn? Jestliže se jim už postižený syn narodil, jaká je pravděpodobnost, že i další dítě, které se má narodit, bude postiženo?

9.11 Barvoslepost (daltonismus) Zdravá žena uzavřela sňatek se zdravým mužem. Rodiče ženy jsou zdraví, ale její dědeček z matčiny strany měl daltonismus. a) Jaká je pravděpodobnost, že se těmto manželům narodí postižený syn? Daltonismus je podmíněn XR. b) Jestliže se jim narodil postižený syn, jaká je pravděpodobnost, že další dítě bude postiženo?

75

v20150212

9.12 Katarakta Katarakta (šedý zákal oční čočky) je AD podmíněná choroba. a) Sňatek uzavřeli dva zdraví jedinci. Matka ženy je postižena, otec je zdravý. Oba bratři ženy jsou postiženi, otec muže má šedý zákal, matka je zdravá, sestra muže je chorobou postižená. Znázorněte celou situaci rodokmenem. Jaká je pravděpodobnost postižení dítěte touto chorobou u těchto manželů? b) Jestliže postižená sestra uvedeného muže uzavře sňatek se zdravým mužem, jaká je pravděpodobnost, že se jim narodí postižené dítě?

9.13 Porucha zubní skloviny Primární porucha matrice zubní skloviny se dědí XD. Zuby jsou žluté až hnědé, někdy až poloprůsvitné. a) Sňatek uzavřeli: žena se zdravým chrupem a muž trpící uvedeným defektem. Jaká je pravděpodobnost: (1) že se jim narodí dcera se zdravým chrupem, (2) že se jim narodí syn postižený tímto defektem? b) Sňatek uzavřeli: zdravý muž a žena trpící primární poruchou matrice zubní skloviny. Chtějí mít 4 syny a jednu dceru. Jaká je pravděpodobnost, že u žádného z těchto dětí se nevyskytne defekt zubů, jaký má matka?

9.14 Inbríding a autozomálně recesivně dědičné onemocnění

Fenylketonurie (PKU): v populaci se vyskytuje přibližně jeden postižený jedinec na deset tisíc zdravých jedinců. Zdraví manželé (bratrance a sestřenice) se ptají, jestli je riziko postižení jejich dítěte stejné nebo jiné. Odůvodněte a vypočítejte. Rxy pro bratrance a sestřenici je 1/8.

9.15 Downův syndrom

Downův syndrom je nejčastější vrozená vývojová vada s incidencí 1/830. Manželé se ptají, jaké je riziko postižení jejich dítěte Downovým syndromem, když se mužově sestře narodilo dítě postižené tímto syndromem. Navrhněte postup genetické konzultace, případná vyšetření a diskutujte možné alternativy.

76

v20150212

10. Genová kontrola imunity Cíl cvičení V této kapitole se omezíme na studium genetické kontroly antigenů, které u člověka ovlivňují slučitelnost (kompatibilitu) tkání při transplantacích. Nazýváme je proto histokompatibilní (nebo také transplantační) antigeny: zkráceně HLA antigeny.

Teoretický úvod HLA systém (Human Leukocyte Antigen) je název pro lidský hlavní histokompatibilní komplex (z anglického „Major Histocompatibility Complex“, MHC). Tento systém je zodpovědný za produkci membránových glykoproteinů (antigen-prezentujících proteinů), které se označují jako HLA antigeny. Hlavní funkcí HLA antigenů je prezentace imunogenních peptidů T lymfocytům. HLA antigeny se tak uplatňují v následujících situacích: 1. při obraně proti infekčním nemocem 2. podílí se na rozpoznání vlastních a cizích buněk 3. jsou zodpovědné za odvržení nekompatibilního transplantátu 4. chybná funkce je asociována s některými autoimunitními nemocemi Geny kódující HLA antigeny jsou umístěny na chromozomu 6 v tzv. HLA oblasti. HLA lokusy se označují písmeny A, B, C, E, F, G; DR, DQ, DP. Obr. 1 HLA oblast na chromozomu 6

HLA lokusy, kódující HLA antigeny, lze rozdělit do dvou tříd: 1. MHC třída I zahrnuje „klasické“ geny HLA-A, HLA-B, HLA-C a „neklasické“ geny HLAE, HLA-F, HLA-G a další. „Klasické“ geny HLA-A a HLA-B jsou exprimovány ve všech jaderných buňkách lidského těla s výjimkou neuronů, zárodečných buněk a trofoblastu. V lidské populaci se vyskytuje mnoho různých alel těchto genů. „Neklasické“ geny třídy I (HLA-E, HLA-F, HLA-G) jsou exprimovány buňkami embrya a trofoblastu; HLA-G je znám i v solubilní formě (je uvolňován buňkami embrya). Mají klíčový význam pro toleranci embrya a plodu matčiným tělem (aby embryo a následně plod nebyly matčiným imunitním systémem rozpoznány jako cizorodá tkáň). Je třeba si uvědomit, že embryo (plod) má polovinu HLA antigenů odlišných od matčiných HLA antigenů. Genetický polymorfismus „neklasických“ HLA genů je mnohem nižší než polymorfismus „klasických“ HLA genů. 2. MHC třída II zahrnuje geny HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP. HLA antigeny této třídy se nacházejí především na buňkách, které se zúčastňují imunitní odpovědi. 77

v20150212

(více informací lze nalézt v databázi Evropského ústavu bioinformatiky: http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.html)

Obr. 2 Schematický náčrt struktury molekul HLA antigenů třídy I a II

V populaci se nachází mnoho různých alel jednotlivých HLA lokusů. HLA alely jsou označeny písmenem lokusu, na kterém jsou definovány, a pořadovým číslem; např. HLA-A1. Mezi různými alelami téhož lokusu je vztah kodominance. Například fenotyp A2A11 je podmíněn alelami A2 a A11. Jedinec, u kterého byl zjištěn jen jeden antigen kontrolovaný daným lokusem (např. antigen A2), může být genotypově buď homozygot (A2A2) nebo heterozygot (A2AX). Nomenklatura alel vychází ze staršího sérologického označení jednotlivých alel (původně byly HLA antigeny definovány podle jejich reakce s antisérem). S rozvojem molekulární genetiky byla nomenklatura rozšířena. V současnosti se používá k označení alel písmeno příslušného lokusu spolu se čtyřciferným kódem: první 2 číslice kódu označují sérologickou skupinu; třetí a čtvrtá číslice označují specifickou DNA-sekvenci alely. Jednotlivé alely v sérologické skupině se mohou mezi sebou lišit jedním nebo více nukleotidy. Např. alely HLA-A*0205 a A*0210 kódují různé polypeptidy, ale oba polypeptidy patří k sérotypu A2 – tzn. obě alely kódují epitopy rozeznávané anti-A2 antisérem; tyto polypeptidy se však liší několika aminokyselinami na jiných místech než na epitopu. Epitop je část molekuly, která je rozpoznávána imunitním systémem. Pozn.: Pro určení sérotypu pro určitý lokus se používá reakce buněk s antisérem. Vzhledem k velkému množství sérotypů však v laboratoři jednoho pracoviště nebývají k dispozici všechny protilátky umožňující určit přítomnost všech známých sérotypů. Pokud je v praxi určena přítomnost pouze jednoho antigenu (např. A2), tak se předpokládá, že vyšetřený člověk je heterozygot – tedy že druhá alela nebyla určena (tato se označí AX).

Exprese HLA genů je tkáňově specifická: jejich kvantitativné zastoupení je v membránách buněk různých tkání odlišné. Jednotlivé HLA lokusy jsou na chromozomu umístěny velmi blízko sebe a vykazují tak velmi silnou vazbu. Celá skupina alel všech lokusů HLA komplexu vyskytujících se na jednom chromozomu (viz obr. 1) se tak přenáší z rodičů na potomky jako jeden celek; tato skupina alel jednoho chromozomu se nazývá haplotyp (odvozeno ze slov haploidní genotyp).

I. Charakteristika polymorfismu HLA systému U člověka se žádný z dosud studovaných systémů nevyznačuje tak vysokou úrovní polymorfismu jako HLA systém. Genetický polymorfismus lze přibližně charakterizovat jako situaci, kdy se v populaci vyskytuje současně (tj. v jedné generaci) 3 nebo více alel daného genu (lokusu); každý jedinec však má právě 2 alely daného genu (2 různé nebo 2 stejné alely daného genu). Pomocí elementárních početních operací lze zjistit teoretický počet všech možných HLA haplotypů, genotypů a fenotypů v populaci. V důsledku velmi silné vazby a vazebné nerovnováhy (častější výskyt určitých kombinací alel) se však nemusejí všechny varianty vyskytnout a také nelze vypočítat četnosti jednotlivých haplotypů. Stanovují se proto empiricky.

78

v20150212

Počty identifikovaných alel pro vybrané lokusy (říjen 2012): HLA lokus HLA-A HLA-B HLA-C HLA-E HLA-F HLA-G DRB1 DQB1 DPB1

Počet různých sérotypů 1 527 2 110 1 200 3 4 16 887 128 136

Počet známých alel 2 132 2 798 1 672 11 22 50 1 196 179 158

10.1 Stanovení teoretického počtu haplotypů

Představme si, že určitá alela na jednom lokusu (např. na lokusu HLA-A) se v haplotypu může teoreticky vyskytnout s kteroukoliv alelou na jiném lokusu (např. na lokusu HLA-B). Počet všech teoreticky možných haplotypů (n) lze proto stanovit jako součin počtu alel na těch lokusech, které bereme v úvahu. Doplňte následující tabulku: HLA lokusy A-B

Teoretický počet všech možných haplotypů 2 132 × 2 798 = 5 965 336

A-B-DRB1 A-B-DRB1-DQB1

10.2 Stanovení teoretického počtu genotypů

Genotyp každého jedince je určen dvěma haplotypy. Celkový teoretický počet všech možných genotypů tedy vypočítáme tak, že zjistíme, kolik všech možných dvojic haplotypů (bez ohledu na pořadí) je možné z celého souboru haplotypů (n) vytvořit. Vytváříme tedy kombinace druhé třídy z n prvků (s opakováním):

 (n + 1) n × (n + 1)   = 2  2  Doplňte následující tabulku: HLA lokusy A-B

Počet všech možných genotypů (5 965 336 × 5 965 337)/2 = 35 585 239 558 232

A-B-DRB1 A-B-DRB1-DQB1 Oba tyto příklady slouží jen k demonstraci rozsáhlosti HLA systému. Ve skutečnosti jsou počty haplotypů a genotypů nižší v důsledku velmi silné vazby a vazebné nerovnováhy. Stanovují se proto empiricky.

79

v20150212

II. Rozbor segregace HLA alel v rodinách V této a v následující části se omezíme na dva lokusy: HLA-A a HLA-B. Pro řešení příkladů si situaci můžeme dále zjednodušit a budeme se zabývat HLA antigeny jen na úrovni sérotypů (např. A1, B8, atd.). Nejprve si uvedeme obecné charakteristiky dědičnosti HLA antigenů. 1. Každý jedinec má právě dvě alely každého HLA lokusu a tedy nanejvýš dva různé antigeny kódované tímto lokusem – např. A1 a A2 (důsledek diploidního stavu). 2. Jestliže jeden z rodičů má například antigeny A1 a A2, pak jeho dítě po něm zdědí buď alelu kódující antigen A1 (s pravděpodobností 50 %) nebo alelu kódující antigen A2 (rovněž s pravděpodobností 50 %). 3. U dítěte se nevyskytne žádný antigen, který není zastoupen u jeho rodičů. Návod k řešení příkladů a) U jedince byl zjištěn HLA fenotyp A11 A24, B39 B56. Určete možné genotypy. V jednom haplotypu je vždy jedna alela na lokusu HLA-A a jedna alela na lokusu HLA-B. Určit možné genotypy znamená určit všechny možné dvojice haplotypů. Uvedený HLA fenotyp proto může být podložen jedním z těchto dvou genotypů:  A11, B39/A24, B56  A11, B56/A24, B39 b) Je znám HLA fenotyp členů rodiny. Uveďte genotypy, které přicházejí v úvahu. HLA fenotypy členů rodiny: Matka: A23 A31, B13 B39 Dítě: A31 A36, B7 B13 Otec: A11 A36, B7 B4 Při řešení úkolu vycházíme ze skutečnosti, že dítě obdrželo jeden haplotyp od matky a druhý od otce. V našem příkladě obdrželo dítě od matky haplotyp A31, B13, od otce A36, B7. Tím jsou jednoznačně určeny genotypy všech členů rodiny: genotyp matky: A31, B13/A23, B39 genotyp dítěte: A31, B13/A36, B7 genotyp otce: A36, B7/A11, B45 V minulosti se obrovské variability HLA antigenů využívalo při řešení paternitních sporů. V současné době se v paternitních sporech využívají jiné metody; pro pochopení problematiky HLA antigenů si tyto příklady vysvětlíme. Příklady sporů o otcovství řešíme pomocí postupů popsaných v a) a b). Jsou známy tyto fenotypy účastníků sporu: Matka: A23 A31, B13 B45 Dítě: A31 A24, B8 B45 Nařčený muž: A3 A29, B7 B51 Rozhodněte, zda nařčeného muže lze vyloučit. Dítě zdědilo od matky haplotyp (A31, B45). Haplotyp (A24, B8) muselo zdědit po svém biologickém otci. Protože nařčený muž antigeny A24, B8 ve svém fenotypu nemá, nemůže mít ani haplotyp (A24, B8). Je proto vyloučen z paternitního sporu, neboť nemohl být biologickým otcem tohoto dítěte.

80

v20150212

10.3 Určení genotypu

U jedinců byl zjištěn HLA fenotyp. Určete, které genotypy přicházejí v úvahu: a) A1, A23, B7, B18 b) A2, B8, B39

10.4 Genotypy v rodinách V následujících příkladech jsou uvedeny fenotypy členů rodiny. Uveďte, které genotypy přicházejí v úvahu: a) matka: A11, A30, B7, B35 otec: A2, A23, B18, B37 b) matka: A2, A26, B7, B41 dítě: A1, A2, B27, B41 c) matka: A2, A24, B41, B51 dítě: A24, A26, B41, B51 d) matka: A1, A2, B18, B35 otec: A1, A2, B8, B27 dítě: A1, A2, B8, B18

10.5 Paternitní spor Při sporech o otcovství byly zjištěny HLA fenotypy všech zúčastěných. Napište genotypy všech účastníků sporu a rozhodněte, zda může být nařčený muž biologickým otcem dítěte nebo zda je to vyloučeno: a) matka: A1, A24, B27, B35 dítě: A3, A24, B7, B27 nařčený muž: A3, A23, B7, B49 b) matka: A2, A26, B7, B41 dítě: A2, A26, B27, B41 nařčený muž: A25, A26, B18, B27 c) matka: A1, A11, B35 dítě: A2, A11, B35, B44 nařčený muž: A1, A2, B8, B18

81

v20150212

III. Výběr dárce pro transplantace

Stupeň shody mezi dárcem a příjemcem transplantovaného orgánu je důležitý pro výsledek transplantace. Dárce a příjemce jsou zcela histokompatibilitní, jestliže dárce má pouze ty HLA antigeny, které jsou zastoupeny u příjemce, a žádné navíc. Shoda v HLA antigenech se hledá na různých úrovních podle transplantovaného orgánu. Např. při transplantaci ledvin se posuzuje shoda na úrovni sérotypů pro lokusy HLA-A, HLA-B, HLA-DR, při transplantacích kostní dřeně je třeba hledat shodu až na úrovni genetické pro lokusy HLA-A, HLA-B, HLA-DR, HLA-DQ; u transplantací srdce a plic je HLA kompatibilita méně významná vzhledem k minimální expresi HLA antigenů v buňkách těchto tkání. Obdobně se k HLA fenotypu výrazně nepřihlíží ani u transplantace jater. Důsledek uvedené definice si ukážeme na příkladě. Předpokládejme, že čekatel na transplantaci ledviny (příjemce) má tyto HLA antigeny: A1, A2, B7, B12, DR3. Dárci, kteří jsou kompatibilitní s tímto příjemcem, mohou mít jeden (kterýkoliv) z těchto devíti HLA sérotypů: 1. A1, B7, DR3 2. A1, B12, DR3 3. A1, B7, B12, DR3 4. A2, B7, DR3 5. A2, B12, DR3 6. A2, B7, B12, DR3 7. A1, A2, B7, DR3 8. A1, A2, B12, DR3 9. A1, A2, B7, B12, DR3 Pro výpočet pravděpodobnosti výskytu kompatibilitního dárce bychom museli vypočítat četnosti výskytu všech uvedených sérotypů v populaci (viz níže) a tyto četnosti sečíst.

10.6 Fenotypy kompatibilních dárců

V následujících příkladech jsou uvedeny fenotypy čekatelů na transplantaci ledviny. Napište všechny možné fenotypy kompatibilitních dárců: a) A2, B8, DR7 b) A11, A33, B18, B53, DR1, DR9

10.7 Vhodnost dárcovství Sestavte následující příbuzné příjemce transplantátu do pořadí podle vhodnosti dárcovství (začnete nejvhodnějším): sourozenec, monozygotní dvojče, nepříbuzná osoba, matka, dizygotní dvojče.

82

v20150212

IV. HLA asociace Příklady prokázaných pozitivních asociací mezi HLA antigeny a nemocí: Nemoc Ankylozující spondylitida (B27) Diabetes mellitus (DR3, B8) Reiterova choroba (B27) Psoriasis vulgaris (Cw6) Sclerosis multiplex (DR2) Celiakie (DQ2, DQ8)

Frekvence antigenu v % u pacientů u kontrolních osob 90 50 80 50 55 90

8 21 9 23 23 22

Relativní riziko (RR) udává, kolikrát je častější výskyt nemoci u jedinců nesoucích daný antigen, ve srovnání s jedinci, kteří tento antigen nemají. RR < 1 znamená asociaci negativní, RR = 1 v případě, kdy asociace není prokázána, RR > 1 v případě pozitivní asociace. Relativní riziko vzniku choroby u osob s daným antigenem lze vypočítat pomocí vztahu: RR = ad/bc a ... počet pacientů s daným antigenem, b ... počet pacientů bez antigenu, c ... počet kontrolních osob s daným antigenem, d ... počet kontrolních osob bez antigenu.

10.8 Relativní riziko vzniku choroby Vypočítejte relativní riziko vzniku choroby u osob s antigenem v těchto situacích: a) diabetes mellitus a B8, když a = 48 b = 590, c = 59 d = 1900 b) ankylozující spondylitida a B27, když a = 57 b = 160 c = 6 d = 183 c) celiakie a DQ2, DQ8, když a = 30 b = 275 c = 4 d = 750

83

v20150212

V. Studium HLA genetické struktury populace Až dosud jsme se zabývali praktickými důsledky Hardy-Weinbergova zákona v nejjednodušší situaci: na jednom autozomálním lokusu se v populaci vyskytují dvě alely A, a, mezi kterými je vztah úplné dominance a recesivity. V této části přistoupíme ke zobecnění Hardy-Weinbergova zákona pro libovolný počet alel (tedy pro mnohotnou alelii). Označení alel: Ai, Aj, atd. Četnosti alel: pi, pj, atd. Četnost homozygotů AiAi je pi2, AjAj je pj2, četnost heterozygota AiAj je 2pipj. Návod k řešení příkladů a) Zjistěte, jaká je v naší populaci četnost jedinců s HLA fenotypem A3A29. Tito jedinci mají na HLA-A lokusu dvě různé alely (A3 a A29) a jsou tedy heterozygoti. V tab. č. 1 zjistíme, že četnost alely A3 v naší populaci je 11,6 %, četnost alely A29 je 3,8 %. Četnost jedinců genotypu A3A29 je tedy: 2×0,116×0,038 = 0,009 (tj. 0,9 %) b) Vypočtěte, s jakou četností se u nás vyskytují jedinci s HLA fenotypem A2. Tito jedinci mohou být buď homozygoti A2A2 nebo heterozygoti A2AX. V tab. č. 1 zjistíme, že četnost alely A2 v naší populaci je 26,0 %, četnost alely AX je 4,3 %. Jedinci fenotypu A2 mohou tedy být: buď homozygoti A2A2 s četností (0,26)2 = 0,0676 nebo heterozygoti A2AX s četností 2×0,26×0,043 = 0,0224 Součet četností obou těchto možností je 0,0900 (tj. 9 %). Jedinec nesoucí ve svém fenotypu pouze antigen A2 se tedy v naší populaci vyskytuje s četností 9 %. c) Vypočítejte, s jakou četností se v naší populaci vyskytují jedinci s genotypem A1 B8/A3 B7. V tab. č. 2 zjistíme, že četnost haplotypu A1B8 je v naší populaci 0,0591, četnost haplotypu A3B7 je 0,0315. Četnost jedinců s uvedeným genotypem: 2×0,059l×0,0315 = 0,0037, tj. 0,37 % (v průměru téměř 4 jedinci z tisíce).

10.9 Určení četnosti genotypu z haplotypových četností

Vypočítejte, s jakou četností se v populaci vyskytují jedinci s uvedeným genotypem. K výpočtu použijte haplotypových frekvencí. a) A1 B8/A1 B8 b) A23 B42/A28 B48

10.10 Určení četnosti fenotypu z haplotypových četností

Vypočítejte, s jakou četností se v populaci vyskytují jedinci s uvedeným fenotypem. K výpočtu použijte haplotypových frekvencí: a) A2, B13, B27 b) A3, A29, B37

84

v20150212

Tab. 1. Relativní četnosti HLA alel a HLA antigenů

A1 A2 A3 A11 A23 A24 A25 A26 A28 A29 A30 A31 A32 A33 A34 A36

četnost alel 14,9 26,0 11,6 5,9 2,3 9,6 1,9 3,7 4,0 3,8 2,4 2,7 4,5 1,7 0,6 0,3

Relativní četnosti (%) četnost antigenů četnost alel 27,5 B7 8,8 45,3 B8 8,2 21,9 B13 2,8 11,5 B14 3,0 4,5 B18 5,8 18,2 B27 3,9 3,7 B35 9,5 7,2 B37 1,5 7,7 B38 2,5 7,4 B39 2,1 4,7 B41 1,0 5,4 B42 0,3 8,8 B44 11,0 3,3 B45 1,1 1,2 B47 0,4 0,7 B48 0,5 B49 2,3 B50 1,2 B51 7,2 B52 1,5 B53 0,9 B55 2,2 B56 0,6 B57 3,1 B58 1,1 B59 0,5 B60 3,4 B61 1,7 B62 5,3 B63 0,5

85

četnost antigenů 16,8 15,7 5,6 5,8 11,2 7,7 18,2 3,0 5,0 4,1 2,0 0,6 20,7 2,2 0,9 1,0 4,5 2,5 13,9 2,9 1,7 4,4 1,1 6,2 2,2 0,9 6,7 3,3 10,4 1,0

v20150212

Tab. 2. Četnosti haplotypů (×10-4) pro lokusy A a B A1

A2

A3

A111 A23

A24

A25

A26

A28

A29

A30

A31

A32

A333

A343

A433

Ax

B7 B8 B13 B18 B27 B35 B37 B38 B39 B41 B42 B44 B45 B46 B47 B48 B49 B50 B51 B52

56 591 21 30 10 75 83 36 24 4 1 61 8 1 2 1 13 7 22 29

213 99 60 153 121 125 33 44 67 65 3 416 21 1 8 14 69 60 220 61

315 39 20 36 56 188 13 17 15 10 10 62 4 1 20 10 12 5 84 5

61 4 9 18 39 131 2 14 6 4 8 40 3 1 4 1 9 3 43 52

19 8 4 4 8 11 1 6 2 21 1 81 14 1 1 1 39 9 3 8

94 6 18 78 43 160 18 23 25 5 1 48 10 1 2 5 22 10 66 4

5 16 1 80 1 4 1 3 10 1 2 33 2 1 1 2 2 2 6 2

18 6 12 13 21 39 2 132 6 29 2 13 3 1 1 2 28 1 16 1

19 112 13 11 29 45 7 2 11 1 1 62 5 1 1 1 2 4 43 3

16 24 2 18 12 17 7 8 1 1 1 196 18 1 3 1 4 1 16 2

4 10 94 49 14 24 2 7 4 7 1 17 1 1 1 2 6 3 7 1

15 4 14 16 23 33 2 1 16 3 1 11 1 1 3 2 7 4 58 4

13 13 13 11 35 56 2 14 4 1 1 70 1 1 2 1 15 7 43 8

1 4 3 2 6 10 3 2 3 1 1 16 2 1 1 1 4 1 8 1

3 1 1 1 1 5 1 8 1 5 1 10 3 1 1 6 1 1 2 1

7 6 1 2 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

20 5 3 1 1 50 1 1 3 2 1 7 3 1 2 5 1 7 1 1

B53 B54 B55 B56 B57 B58 B59 B60 B61 B62 B63 B64 B65 B66 B67 B68 B69 Bx

6 1 19 3 1 1 8 17 31 6 5 61 12 7 176 22 1 28

1 1 30 22 1 1 24 187 41 21 4 228 29 2 64 30 7 27

4 1 19 6 1 1 7 37 19 56 6 76 7 1 22 10 4 4

5 1 86 6 1 1 1 31 6 11 2 14 5 3 17 7 1 1

6 1 1 2 1 1 7 1 2 5 2 11 1 1 1 3 1 1

3 1 34 1 1 1 10 34 17 12 11 49 13 3 22 8 3 18

5 1 6 1 1 1 1 8 2 6 1 11 1 1 10 1 1 1

7 1 18 1 1 1 1 8 5 19 6 21 1 1 2 1 1 1

26 1 14 7 1 1 10 54 6 32 7 18 8 1 12 4 1 1

6 1 17 5 1 1 9 4 4 10 4 11 1 1 12 6 1 1

15 1 3 1 1 1 2 6 1 8 1 6 2 1 1 4 1 1

1 1 8 1 1 1 4 29 4 3 5 8 3 1 7 1 1 1

5 1 6 5 1 1 1 21 27 17 5 18 1 1 21 2 1 1

1 1 1 2 1 1 1 6 2 67 26 4 1 2 6 17 1 1

1 1 4 1 1 1 1 1 2 1 3 1 1 1 1 1 1 1

4 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 1

1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1

2 1 7 7 1 1 1 2 123 8 1 7 1 1 1 2 15 1

86

A36A

v20150212

11. Molekulární genetika I Aplikace metod molekulární genetiky v medicíně Základem pro stanovení správné diagnózy a adekvátní volby terapie geneticky podmíněného onemocnění je znalost molekulární podstaty patogeneze. Molekulární genetika je relativně mladá vědní disciplína, která se mimo jiné snaží odhalovat příčiny onemocnění na molekulární úrovni a hledá příčinné vztahy mezi poškozením DNA (mutací) a pozorovaným fenotypem (onemocněním). Molekulární genetika používá řadu specializovaných metod, které umožňují studovat molekulární podstatu fungování genů, jejich strukturu na úrovni DNA, RNA a proteinů, expresi na úrovni RNA a proteinů, a také jejich biologickou funkci. Metody molekulární genetiky se využívají pro: 1. detekci vrozených mutací a) při diagnostice dědičných geneticky podmíněných onemocnění b) v předklinickém stadiu při identifikaci nosičů mutantních alel (přenašečů AR onemocnění) nebo při odhalování genetické predispozice ke geneticky podmíněnému onemocnění c) v prenatální diagnostice – analýza postižení plodu dědičným onemocněním, určení pohlaví 2. Pro detekci získaných mutací a) v onkogenetice – analýza somatických mutací asociovaných s nádorovými onemocněními 3. detekci patogenů způsobujících infekční onemocnění – virů, bakterií či kvasinek

Přehled základních metod molekulární genetiky pro analýzu DNA a RNA 1. Izolace DNA/RNA Předpokladem úspěšné analýzy nukleových kyselin je jejich získání v dostatečném množství, kvalitě a čistotě. Výchozím materiálem pro získání vzorků DNA/RNA je nejčastěji krev (lymfocyty z periferní krve), ale také různé tkáně (kůže, játra, slezina, nádory), popř. vlasy, chlupy či sperma. Prvním krokem izolace nukleových kyselin je rozrušení všech buněčných struktur pomocí detergentů, čímž se do roztoku uvolní DNA, RNA, bílkoviny, polysacharidy a lipidy. Další kroky jsou pak zaměřené na purifikaci (čištění) DNA nebo RNA. Gelová elektroforéza Je separační metoda, která se využívá k dělení molekul DNA/RNA na gelu umístěném v stejnosměrném elektrickém poli. Nukleové kyseliny jsou negativně nabité, putují k anodě. Molekuly se rozdělují na základě jejich pohyblivosti v gelu, přičemž menší molekuly putují rychleji (jsou dále od startu) než molekuly větší (obr.1). Vizualizace se provádí většinou pomocí ethidium bromidu (EtBr), který se interkaluje mezi báze dvoušroubovice DNA a při ozáření UV světlem fluoreskuje. Velikost molekul nukleových kyselin se vyjadřuje v počtu nukleotidů či párů bazí; zkratka bp z anglického „base pair“.

87

v20150212

Obrázek 1: Gelová elektroforéza genomické DNA vizualizované EtBr a UV světlem. Dráhy 1-4: genomická DNA izolována z lymfocytů periferní krve 4 osob, dráha 5: DNA marker (viz níže).

start

2. PCR Polymerázová řetězová reakce (PCR) je metoda, která slouží k namnožení (amplifikaci) úseku DNA o délce max. 10 tis. nukleotidů. Daný úsek DNA musí být na začátku a na konci vymezen krátkou sekvencí, na kterou nasedá tzv. primer. Podle principu replikace DNA pak dochází k extenzi řetězců DNA od primerů dále ve směru syntézy (5´→3´). Postupně je amplifikován vybraný úsek DNA. Pro syntézu DNA se využívá termostabilní DNA polymeráza (např. Taq polymeráza). PCR zahrnuje 3 kroky, které se cyklicky opakují: 1. Denaturace DNA – reakční směs se zahřívá na teplotu ~95°C (30 s). Při této teplotě se ruší vodíkové můstky a rozvolňuje se dvoušroubovice DNA. Vzniká tak jednovláknová DNA. 2. Nasednutí primerů (annealing) – teplota se sníží na ~60°C, což umožní nasednutí primerů na cílová místa DNA a to na principu komplementarity bazí. Na primery se váže termostabilní polymeráza, která je přítomna v reakční směsi. 3. Prodlužovací fáze (elongace) – v tomto kroku dochází k samotné syntéze DNA. Taq polymeráza má optimum aktivity při 75-80°C. Ve směru 5'→3' je syntetizováno vlákno komplementární k původní molekule DNA. Výsledek PCR se pak kontroluje pomocí gelové elektroforézy (Obr. 2). Pro kontrolu délky fragmentů se používají tzv. DNA markery, které obsahují DNA fragmenty o definované délce (dráha 5). Obrázek 2. Výsledek PCR. Dráha 1: vzorek bez DNA – negativní kontrola; dráhy 2-4: PCR produkty vzniklé amplifikací tří různých vzorků; dráha 5: DNA marker.

88

v20150212

V dnešní době existuje několik variant PCR reakce. Uveďme alespoň PCR variantu, která slouží k namnožení specifického úseku mRNA a označuje se jako reverzně transkripční PCR neboli RTPCR. Využití PCR v diagnostice: 1. Detekce patogenů: virů: HIV; hepatitidy A, B, C bakterií a kvasinek: Mycobacterium tuberculosis (TBC), Candida sp. (kvasinková onemocnění)  amplifikace genu specifického pro daný patogen ve vzorku pacientovy krve, tkáně, sputa 2. Detekce delecí genu – získáme zkrácený PCR produkt.  

3. Detekce přítomnosti fúzních genů na úrovni mRNA pomocí RT-PCR 

jeden z primerů (P1) musí ležet v kódující sekvenci prvního genu zahrnutého ve fúzi, druhý (P2) musí ležet proti němu v kódující sekvenci druhého genu

4. Kvantifikace genové exprese (stanovení množství produkované mRNA). 5. Příprava materiálu pro další analýzy, např. pro: a) restrikční analýzu b) sekvenování 6. DNA fingerprinting 3. Restrikční analýza Restrikční endonukleázy (RE) jsou enzymy, které se specificky vážou na DNA a štěpí ji na specifických místech nacházejících se uvnitř, nebo blízko rozpoznávané sekvence. Název enzymu je odvozen od bakterie, která jej produkuje, římská číslice označuje pořadí enzymu izolovaného z daného kmene bakterie. Bakterie produkují RE jako obranu proti cizí DNA (z bakteriofágů). Např. EcoRI – RE izolována z E. coli. Na obr. 3 je znázorněna EcoRI rozpoznávací sekvence a místo štěpení. Obrázek 3. Rozpoznávací sekvence a místo štěpení EcoRI

RE se využívají pro restrikční analýzy, kdy jsou DNA nebo PCR produkty podrobené štěpení jednou nebo více RE. Fragmenty jsou pak rozdělené a vizualizované pomocí elektroforézy. Obrázek 4 znázorňuje restrikční analýzu PCR produktu o délce 499 bp, který obsahuje 1 štěpné místo pro RE. Po štěpení vznikají 2 fragmenty: 268 a 231 bp. Vpravo je znázorněn výsledek gelové elektroforézy: v první dráze neštěpený PCR produkt, v dráze druhé 2 fragmenty vzniklé štěpením PCR produktu. Všimněte si rozdělení a pohybu fragmentů na gelu podle jejich délky.

89

v20150212

Obrázek 4. Schéma a výsledek restrikční analýzy

restrikční endonukleáza

Restrikční analýza se využívá např. pro detekci známé bodové mutace v genu, která buď ruší nebo vytváří restrikční místo pro RE do standardní sekvence DNA. 4. Sekvenování Sekvenování je technologie, která umožňuje stanovit primární strukturu DNA(sekvenci bazí). V dnešní době se provádí automatické sekvenování. Výsledkem sekvenační analýzy je tzv. chromatogram (viz obr. 5), který udává sekvenci nukleotidů analyzovaného vzorku (nejčastěji PCR produktu). Píky odpovídají jednotlivým nukleotidům, přičemž každý typ báze je označen jiným fluorescenčním barvivem. Obrázek 5 znázorňuje výřezy ze dvou chromatogramů. Vlevo je část sekvence genu zdravého jedince, vpravo je část sekvence genu nemocného. Šipka ukazuje pozici bodové mutace T→C. Všimněte si přítomnost 2 píků v tomto místě, které znamenají, že jedna alela pacientova genu má normální sekvenci a druhá alela je postižena bodovou mutací; pacient je tedy heterozygot. Obrázek 5. Výsledek sekvenováním – chromatogramy

Sekvenování se využívá pro detekci mutací, které se nedají identifikovat restrikční analýzou a pro detekci nových, dosud neznámých mutací v genu: bodové mutace, substituce, krátké delece či inzerce.

90

v20150212

5. DNA fingerprinting „DNA fingerprinting“ či „DNA otisky“ je technika umožňující vytvoření jedinečného genetického profilu jedince. K tomuto účelu slouží analýza nekódujících oblastí genomu, které jsou vysoce polymorfní a jsou tvořené opakováním krátkého motivu, např. -CATG-CATG-CATG-, který nazýváme tandemová repetice. U různých jedinců mají tyto repetice různé počty opakování, což se projeví ve variabilitě délky daného úseku DNA – tento jev se nazývá VNTR (variable number of tandem repeats – variabilní počet tandemových opakování). Délka úseku se označuje jako alela příslušného polymorfismu a vyjadřuje se číslem. Při testování se využívá restrikční analýza a následně Southernova hybridizace nebo častěji PCR amplifikace několika VNTR mikrosatelitů (označovaných i jako STR – short tandem repeats), které určí jak jsou vybrané repetice u daného člověka dlouhé. Vzhledem k velké variabilitě mezi jedinci v populaci je velmi malá pravděpodobnost, že se dva jedinci shodují v alelách většího počtu polymorfizmů DNA. Obvykle se jich zkoumá kolem 13 až 15. DNA fingeprinting se využívá nejen v kriminalistice při identifikaci osob, ale také v paternitních sporech. Každý jedinec totiž zdědí jednu alelu daného polymorfismu od matky a druhou od otce. Vychází se z předpokladu, že matka je vždy jistá, takže alely polymorfismu, které dítě nezdědilo od matky, muselo zdědit od otce.

11.1 DNA diagnostika Ze kterých z následujících tkání můžeme získat DNA k diagnostickým účelům: tkáňové biopsie, krev, kultivované buňky z plodové vody, erytrocyty?

11.2 Sekvenování DNA V čem vidíte přínos sekvenování DNA?

11.3 PCR reakce Jaké složky musí obsahovat PCR reakce?

11.4 Restrikční analýza

V PCR produktu se nachází 2 štěpná místa pro RE. Kolik fragmentů dostaneme po restrikční analýze? Zakreslete!

11.5 Analýza přítomnosti mutace IVS-1-I (G→A) ß-globinového genu

Tato bodová mutace vytváří restrikční místo pro BsaBI restrikční endonukleázu. Příslušný úsek ß-globinového genu byl amplifikován pomocí PCR. Získaný PCR produkt byl následně podroben štěpení BsaBI. Obrázek znázorňuje výsledek vyšetření u 8 jedinců s podezřením na ß-talasemii. Vysvětlete výsledek vyšetření.

Jaký další postup (jaké metody) byste zvolili v případech, kdy je na základě laboratorních vyšetření vyslovené podezření na přítomnost mutace v ß-globinovém genu, ale provedená restrikční analýza je negativní? 91

v20150212

Mutace IVS-1-I (G→A) (mutace prvního nukleotidu v prvním intronu) je jednou ze dvou nejčastěji se vyskytujících mutací způsobujících ß-talasemii minor v české populaci.

11.6 Analýza přítomnosti mutace V617F genu JAK2

Mutace V617F genu JAK2 vede k záměně 617-té aminokyseliny (valin V za fenylalanin F) v kináze JAK2. Tato bodová mutace ruší restrikční místo pro BsaXI restrikční endonukleázu. Příslušný úsek genu JAK2 byl amplifikován pomocí PCR. Získaný PCR produkt byl následně podroben štěpení BsaXI. Vysvětlete následující výsledek vyšetření 3 jedinců.

Mutace V617F je získaná mutace v genu pro JAK2. Je přítomna v některých krvetvorných buňkách a je asociována s onemocněním označovaným jako Polycytemia vera (PV). PV je maligní onemocnění červené krevní řady charakterizované nadměrnou produkcí erytrocytů.

11.7 PCR detekce mutace u dědičného onemocnění

Zdravým manželům se narodila jedna zdravá a jedna postižená dcera. Pomocí PCR byla amplifikována část genu, která je postižena mutací. Uveďte o jaký typ mutace se jedná. K: kontrolní vzorek (zdravý jedinec), O a M: otec a matka, 1 a 2: dcery. Určete, který vzorek (1 nebo 2) patří postižené dceři. Jaký typ dědičnosti vykazuje dané onemocnění? K

1

2

O

M

11.8 Analýza přítomnosti fúzního genu

Na obrázku je schematicky znázorněn fúzní gen BCR-ABL:

a) Kterou tkáň/buňky budete na analýzu jeho přítomnosti potřebovat? b) Jakou metodu byste zvolili na jeho detekci a proč? c) Zakreslete pozici a orientaci primerů, které byste mohli použít na jeho detekci. d) Jaký výsledek budete očekávat u zdravého jedince a u pacienta s tímto fúzním genem?

92

v20150212

11.9 Paternitní spor Dva muži jsou ve sporu o otcovství. Podrobili se proto vyšetření DNA. Na obrázku máte znázorněn výsledek PCR analýzy několika STR. Který z mužů je biologickým otcem dítěte?

11.10 Doplňte tabulku Typ mutace

Metoda detekce

bodová mutace delece fúzní gen

93

v20150212

12. Molekulární genetika II: Proteiny, aplikace v medicíně Základní znalosti o struktuře, funkci a vlastnostech proteinů jsou v medicíně nezbytné pro pochopení patofyziologie nemocí. V dnešní době se tyto znalosti nejen rutinně využívají v diagnostice, ale i v rychle se rozvíjející terapii využívající uměle připravené rekombinantní proteiny.

I. Využití detekce proteinů v diagnostice 1. Nativní proteinová elektroforéza Základní metodou detekce proteinů je separační metoda – elektroforéza, která využívá rozdílné mobility proteinů v gelu v elektrickém poli na základě velikosti, náboje nebo konformace proteinu. V nativní elektroforéze se studují proteiny v nativním (přirozeném stavu). Vysvětli princip nativní elektroforézy proteinů a možnosti detekce proteinů v gelu. Kde se tato metoda používá? Lze každou mutaci v genu (substituci báze) vedoucí na úrovni proteinu k záměně aminokyseliny detekovat touto metodou? Proč? Této metody se využívá například v diferenciální diagnostice anémií k detekci jednotlivých hemoglobinových variant. Jaká onemocnění jsou charakterizována přítomností hemoglobinu F, nestabilních hemoglobinů, abnormálních hemoglobinů? 2. Imunohistochemie/imunocytochemie Imunohistochemické barvení se používá k detekci proteinů v jednotlivých buňkách (nátěry buněk) nebo v rámci celého tkáňového řezu. Využívá se specifických protilátek, konjugovaných s fluorescenčním barvivem nebo s enzymy – peroxidázou nebo alkalickou fosfatázou. Za přítomnosti substrátu tyto enzymy katalyzují reakce, kdy vzniká barevný produkt, který lze lehce detekovat pomocí světelné mikroskopie. Vysvětlete obecný princip detekce antigenu pomocí protilátky. Jaký je rozdíl mezi přímou a nepřímou detekcí? Vysvětli pojmy primární a sekundární protilátka. Touto metodou lze detekovat buněčnou nebo tkáňovou lokalizaci antigenu. V čem je to výhodné? Tato metodika se využívá například k diagnostice solidních tumorů nebo má velmi široké uplatnění v základním výzkumu, uveďte příklad. Jaký je rozdíl mezi imunohistochemickým a imunocytochemickým barvením? 3. Průtoková cytometrie Teorie k průtokové cytometrii byla již v rámci praktik představena. Jaký je princip této metody? V klinické praxi se tato metodika rutinně využívá například ke stanovení počtu a typů leukocytů (stanovení diferenciálu leukocytů). Jednotlivé leukocytární populace lze rozlišit na základě tzv. CD antigenů přítomných na povrchu buněk. Vysvětlete pojem CD („cluster of differentiation“). Dále se tato metoda používá například k imunofenotypizaci leukémii, např. u diagnózy chronické lymfatické leukémie. Uveďte příklad využití průtokové cytometrie v medicíně a vysvětlete. 4. ELISA (enzymová imunoanalýza, enzyme-linked immunosorbent assay) Tato metoda opět využívá reakce protilátky s antigenem. Antigen nebo protilátka je navázána na pevný povrch. Protilátka proti antigenu je konjugovaná s enzymem, který, pokud se protilátka naváže na antigen, po přidání substrátu katalyzuje reakci, kdy vzniká snadno detekovatelný barevný produkt. Touto metodou lze například kvantitativně stanovit koncentraci látky v séru nebo v moči (hormonů např. LH, HCG, TSH nebo léčiva či drog např. kokain, opiáty, marihuana tj. THC). Dále se tato metoda používá například k testování dárcovské krve na přítomnost virových infekcí (HIV, hepatitida B). Vysvětlete princip metody a na konkrétním příkladu ukažte aplikaci v medicíně.

94

v20150212

5. Western blot (imunoblot) Tato metoda detekuje protein v homogenním proteinovém lyzátu z buněk nebo z tkání. Proteinový lyzát se podrobí denaturační gelové elektroforéze (SDS-PAGE), kde se proteiny rozdělí podle velikosti. Poté se proteiny přenesou v elektrickém poli na membránu. Navázané proteiny lze detekovat pomocí specifických protilátek. Tato metoda se využívá například k potvrzení pozitivního výsledku ELISA metodiky pro detekci HIV viru v séru. Dále se používá pro definitivní potvrzení diagnózy BSE (nemoc šílených krav) nebo v některých testech na lymskou boreliózu. Samozřejmě tato metoda patří k základním technologiím v základním výzkumu. Vysvětli princip metody western blotu. Uveď příklad využití v medicíně.

II. Využití proteinů v terapii 6. Rekombinantní proteiny Rekombinantní protein je protein produkovaný geneticky modifikovaným organismem. DNA kódující tento protein je vnesena do genomu tohoto organismu. Prvním léčivem uvedeným do klinické praxe připraveným pomocí technologie genového inženýrství byl insulin. (Gen pro lidský insulin byl vnesen do bakterie Escherichia coli). Použití rekombinantního proteinu odstranilo alergické reakce na zvířecí insuliny. Jaký je princip přípravy rekombinantního proteinu? Proč nelze brát insulin per os? Jaké další rekombinantní proteiny se využívají v terapii lidských nemocí?

95

v20150212

Otázky Po skončení prezentací odpovězte na následující otázky: 1. Definujte termíny: primární protilátka, sekundární protilátka. 2. Vyjmenujte metodiky analýzy proteinů založené na imunobarvení. 3. Kterou metodou byste použili: a) k ověření správné lokalizace proteinu v buňce? b) k detekci abnormálního Hb? c) k detekci protilátek v séru? d) k rozdělení buněk na základě velikosti? 4. Vyjádřete se ke každému z následujících tvrzení a rozhodněte je-li správné nebo nesprávné. Svoji odpověď odůvodněte. a) Rekombinantní proteiny vznikají crossing-overem v meióze. b) Při SDS-PAGE se proteiny dělí na základě molekulové hmotnosti. c) Western blot se používá pro analýzu nukleových kyselin. d) Průtoková cytometrie umožňuje analýzu krevních diferenciálů. e) ELISA umožňuje detekci abnormálních hemoglobinů. f) Při imunohistochemické analýze zjišťujeme přítomnost proteinu v jeho přirozeném prostředí. 5. Pro které z následujících metod se používají intaktní buňky? a) imunohistochemie b) western blot c) průtoková cytometrie d) nativní elektroforéza e) SDS-PAGE f) imunocytochemie

96

v20150212

© kolektiv autorů, Ústav biologie LF UP Olomouc Praktická cvičení z biologie 2014 Skriptum pro letní semestr 1. ročníku Určeno pro studenty oborů Všeobecné lékařství, Zubní lékařství

97

v20150212

98

v20150212

Praktická cvičení z biologie Letní semestr

Recommend Documents