POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE II.
Ing. Lenka GRIMOVÁ, Ph.D. DIAGNOSTICKÉ METODY V OCHRANĚ ROSTLIN 2013
VARIACE NA TÉMA PCR PCR –RFLP
= stanovení polymorfismu délky restrikčních fragmentů u produktů PCR o kombinace standardní PCR s následným štěpením restrikčními enzymy o používá se pro typizaci cílové sekvence (obvykle genu), obsahující sekvenční polymorfizmus o PCR produkt se amplifikuje pomocí „univerzálních“ primerů připojujících se ke konzervovaným oblastem genu. Výsledkem je PCR produkt o stejné délce . Amplikony jsou následně štěpeny restrikčními endonukleázymi a analyzovány na elektroforézou
Např. analýza RFLP u prokaryotických genů pro 16S rRNA. Celý gen o velikosti asi 1 600 bp je amplifikován pomocí univerzálních primerů komplementárních k sekvencím na koncích genů pro 16S rRNA. S použitím restrikční endonukleázy získáme spektrum několika (až 8) fragmentů, které se liší počtem a velikostí podle bakteriálního druhu nebo kmene.
VARIACE NA TÉMA PCR PCR –RFLP
VARIACE NA TÉMA PCR NÁHODNÁ PCR (AP-PCR, RAPD) =NÁHODNÁ AMPLIFIKACE POLYMORFNÍ DNA o
rychlá a jednoduchá technika fingerprinting DNA
o
vhodná pro rychlou srovnávací typizaci genomové DNA
o
není třeba znát sekvence studovaného organismu
o
využívá jeden či více krátkých primerů (o délce 8-12 nt) libovolné sekvence s neznámou homologií k cílové sekvenci DNA a málo přísné podmínky pro připojení primeru
o
výsledkem je amplifikace mnoha fragmentů s různou délkou a rozdílným molárním množstvím
o
problém s reprodukovatelností
o
metoda se v praxi využívá pro identifikační postupy a taxonomické studie
Např.
VARIACE NA TÉMA PCR RAPD – PCR (AP-PCR)
VARIACE NA TÉMA PCR AFLP = amplified fragment length polymorphism o kombinace RFLP a PCR
o vysoce spolehlivá metoda schopná odhalit variabil
o technická náročnost je vysoká vyžadující primery, sekvenačn radioakt elektroforézusekvenátor či automatický
DNA štěpena vybraným restrikčním enzymem. K oběma koncům restrikčních fragmentům je poté enzymem ligázou připojen tzv. adaptor (krátký úsek DNA). Následuje PCR se specifickými primery. Jejich 5' konec je homologní k adaptorové sekvenci. Na 3'-konci je přesah několika nukleotidů, které již s adaptorem homologní nejsou. Aby tento primer posloužil jako očko Taq polymeráze, je nutná homologie 3' konce primeru a několika krajních nukleotidů restrikčního fragmentu. Proto se amplifikuje jen určitá podmnožina všech restrikčních fragmentů. Čím delší je přesah primeru, tím menší je podmnožina amplifikovaných fragmentů. Podmínky PCR jsou stejné jako u specifické PCR, při teplotě annealingu vyšší než 50°C, tím je omezena pravděpodobnost
přisednutí ne úplně homologních primerů a výsledky jsou dobře reprodukovatelné. Produkty amplifikace je nutno analyzovat na denaturačním polyakrylamidovém sekvenačním gelu či pomocí kapilární elektroforézy.
VARIACE NA TÉMA PCR AFLP
restriční štěpení genomické DNA a ligace adapterů
pre-selektivní a selektivní amplifikace
VARIACE NA TÉMA PCR
VARIACE NA TÉMA PCR
VARIACE NA TÉMA PCR MULTIPLEX (MNOHONÁSOBNÁ) PCR varianta PCR, kdy je do reakční směsi přidáno několik párů primerů rozpoznávající několik rozdílných cílových sekvencí detekce několika genů současně v jedné reakční směsi ⊕ nižší cenové náklady
⊝ nutná optimalizace reakčních podmínek Např. A multiplex reverse transcription PCR assay for simultaneous detection of five tobacco viruses in tobacco plants (Dai et al., 2012)
VARIACE NA TÉMA PCR NESTED PCR (ODSTUPŇOVANÁ PCR) o velice citlivá metoda využívající vnějších a vnitřních specifických primerů o amplifikace ve dvou krocích, v prvním kroku využívaní vnějších primerů, ve druhém kroku využití vnitřních primerů, které jsou specifické pro vnitřní část sekvence amplifikované s párem vnějších primerů o různé modifikace o
dvoufázové PCR, dvě mikrozkumavky
o
jedna mikrozkumavka; fáze odděleny minerálním olejem, po proběhnutí první fáze centrifugace
o
jedna mikrozkumavka; různé Ta použitých primerů
Např. Ultrasensitive detection of phytoplasmas by nested-PCR assays using two universal primer pairs (Gundersen and Lee, 1996)
VARIACE NA TÉMA PCR REVERZNÍ TRANSKRIPCE – PCR (RT-PCR)
o metoda určená k amplifikaci molekul RNA o molekula RNA NEMŮŽE sloužit jako templát pro PCR ⊳ nejprve se musí převést na cDNA retrovirovou zpětnou transkriptázou o reverzní transkriptázy jsou izolovány z RETROVIRŮ (obalené ss RNA viry) o o
AMV reverzní transkriptáza (Avian myeloblastosisvirus) M-MuLV reverzní transkriptáza (Moloneymurine leukemiavirus)
o jedno (one step)/dvoufázové (two step) RT-PCR Např. Detection of Strawberry latent ring spot virus in Leaves of Olive Trees in Italy using a One-Step RT–PCR (Faggioili et al., 2002)
VARIACE NA TÉMA PCR REVERZNÍ TRANSKRIPCE – PCR (RT-PCR) o
JAK NA TO: 1.
izolace RNA
2.
návrh a syntéza primeru
3.
příprava RT reakční směsi:
o RNA dependentní DNA polymeráza o templátová RNA o zpětný (reverse) primer (očko) o dNTP (dATP, dGTP, dCTP a dTTP) o pufr o vhodném pH a složení s aktivátorem (optimální iontová síla roztoku a aditiv, které zlepšují průběh a výtěžek PCR) o Rnase inhibitor 4. denaturace 5 min 100 °C ⊳reverzní transkripce 1 h při 37-42 °C, deaktivace RT při 70 °C 10 min ⊳PCR
VARIACE NA TÉMA PCR PCR in situ o
metoda pro lokalizaci určité sekvence NK uvnitř jednotlivých buněk
o
ve srovnání s hybridizaci in situ je tato technika daleko citlivější (umožňuje amplifikaci řídce se vyskytujících nebo jediněčných kopií genů)
o
JAK NA TO: o před PCR je vzorek tkáně fixován a permeabilizován (tak aby jeho morfologie byla zachována a při tom byl umožněn přístup PCR komponentů) o PCR pak probíhá na podložním skle, na které se po přelití reakční směsi přiloží krycí sklo, jehož okraje se přilepí k podložnímu, aby nemohlo dojít k odpařování. Změny teploty nastávají např. na povrchu vyhřívacího bloku/ NEBO v mikrozkumavce jako obvykle a nakonec je vzorek přenesen na povrch skla o amplifikovaný produkt je pak detekován pomocí in situ hybridizace se sondou (nepřímá in situ PCR), anebo přímo, na základě detekce značených nukleotidů, které byly do produktu PCR zabudovány
o
velmi náročná technika!!! (výsledky mohou být zatíženy řadou artefaktů, jejichž odhalení do značné míry závisí na zkušenostech experimentátora a vhodné volbě kontrol).
VARIACE NA TÉMA PCR PCR in situ
Fig. 6. Singly AbMV (A) and AbMV/CMV doubly infected (B) tomato plants: symptoms and tissue tropism of AbMV. Synergism of a DNA and an RNA virus: Enhanced tissue infiltration of the begomovirus Abutilon mosaic virus (AbMV) mediated by Cucumber mosaic virus (CMV) (Wege and Siegmund, 2006)
VARIACE NA TÉMA PCR KVANTITATIVNÍ PCR V REÁLNÉM ČASE (qPCR) o
technika umožňující přímou kvantifikaci PCR produktu v průběhu reakce
o
detekce a kvantifikace fluorescenčního signálu ve speciálním zařízení, které kromě cyklického střídání teplot umožňuje detekci fluorescence a monitorování postupu PCR v reálném čase bez nutnosti detekovat produkty PCR elektroforeticky
o
intenzita fluorescence = úměrná množství PCR produktu
o
spektrum aplikací kvantitativní PCR v reálném čase je podobné jako pro nekvantitativní techniky
o
kvantifikace množství molekul NK je důležitá při detailním studiu genové exprese nebo
diagnostice některých patogenů
⊕ obrovská výhoda je informace o kvantitě detekovaného produktu ⊕ poměrné nenáročná metoda na provedení ⊕ vysoce reprodukovatelná ⊕ možnost analyzovat velké množství vzorků najednou ⊕ vysoká pořizovací cena potřebných zařízení
VARIACE NA TÉMA PCR qPCR Např. Boyle et al. (2005) za použití kvantitivní PCR v reálném čase studovali dynamiku růstu fytopatogenních hub rodu
Melampsora. Na základě kvantifikace DNA těchto fytopatogenů v jednotlivých stádií růstu, od inokulace až po tvoru urédií, se jim podařilo sestrojit růstové křivky pro jednotlivé druhy rodu Melapsora. Stejně tak byli úspěšní při monitorování výskytu těchto hub před objevením prvních pozorovatelných příznaků choroby, čímž byly potvrzeny i prakticky možnosti této techniky. Jelikož citlivost této techniky mnohonásobně převyšuje klasické imunochemické metody detekce rostlinných virů, jako je např. ELISA, má i zde PCR v reálném čase své uplatnění.
Schneider et al. (2004) vyvinuli a optimalizovali metodu kvantitativní PCR detekce fytopatologicky významného viru šárky švestky (Plum pox virus) v souvislosti s jeho prvním výskytem v Kanadě.
VARIACE NA TÉMA PCR qPCR o
o
pro kvantitativní detekci produktu v průběhu PCR existují tři obecné metody založené na použití: o
interkalačního barviva vázajícího se na DNA
o
flourescenčně značených sond vázajících se na střední část amplifikovaného produktu
o
fluorescenčně značených primerů
pro značení primerů a hybridizačních sond se používají FLUOROFORY (emitují světlo určité vlnové délky po předchozí absorpci světla odlišné vlnové délky; emitovaná vlnová délka světla je vždy vyšší než absorbovaná)
o
dvojitě fluorescenčně značené sondy obsahují kromě fluoroforu také zhášeč, což je molekula, která přijímá energii z fluoroforu ve formě světla a způsobuje její rozptýlení buď ve formě světla s vyšší vlnovou délkou nebo tepla
o
detekce produktů qPCR se může provádět celou řadou technologií: ⊳ ⊳ ⊳ ⊳ ⊳ ⊳ ⊳
SYBR GREEN TAQMAN SONDY PŘENOS ENERGIE FLUORESCENČNÍ REZONANCÍ MOLEKULÁRNÍ MAJÁKY SCORPIONS AMPLIFLUOR LUX
VARIACE NA TÉMA PCR qPCR
SYBER GREEN. Pro kvantifikaci amplikonů se běžně používají fluorescenční kyaninová barviva SYBER Green, která floreskují po vazbě na menší žlábek dsDNA. Fluorescence SYBR green I je po vazbě na DNA až 1000 x vyšší a fluorescenční signál se zvyšuje se vzrůstajícím množstvím PCR produktů. Signál se měří na konci elongace nebo kontinuálně. Nevýhodou techniky je nemožnost využití u multiplex PCR reakcí a nemožnost rozlišení nespecifických produktů.
VARIACE NA TÉMA PCR qPCR HYDROLYTICKÉ SONDY (TAQ MAN): oligonukleotidová sonda označená dvěma fluorochromy nasedá na cílovou sekvenci uvnitř
amplifikovaného PCR produktu. Fluorochrom na 5´konci je označován jako reportér a fluorochrom na 3´konci jako zhášeč. Jestliže jsou oba fluochromy přítomny na jedné DNA molekule, nedochází k žádnému vyzařování fluorescence. V okamžiku, kdy Taq polymerasa zahají další kolo syntézy, dochází díky její exonukleasové aktivitě k degradaci sondy a reportérový fluorochrom je uvolněn ze zhasnutého stavu. Intenzita fluorescence je monitorována kontiuálně během amplifikačního procesu, vždy na konci jednotlivých cyklů. Intenzita fluorecence tedy přímo odpovídá množství PCR produktu v reakci.
VARIACE NA TÉMA PCR qPCR HYBRIDIZAČNÍ SONDY (FRET). Dvojice fluorescenčně značených sond využívají přenos energie fluorescenční rezonancí (FRET), což je excitovaný stav interakce dvou
fluoroforů závislý na vzdálenosti, ve kterém je emise energie z donorového fluoroforu na 3´-konci první sondy spojená s excitací akceptorového fluoroforu na 5´konci druhé sondy vázající se na sousedící sekvenci. Přenos energie mezi ligandy se může uskutečnit na vzdálenost 10100 Å (5-10 nt), přičemž citlivost FRET může detekovat změny vzdálenosti 1-2 Å na základě změny intenzity
fluorescence.
VARIACE NA TÉMA PCR qPCR
VARIACE NA TÉMA PCR qPCR o
typická amplifikační křivka má esovitě zakřivený tvar a lze ji rozdělit na 3 části: 1)
„background" fáze kdy je amplifikátu tak málo, že jeho fluorescence ještě nedosahuje měřitelných hodnot
2)
exponenciální fázi, kdy množství produktu exponenciálně roste (trvá asi 4-8 cyklů)
3)
fáze plató, kdy dochází k saturaci systému, množství amplifikovaného produktu se dále nemění a fluorescenční signál zůstává konstantní.
o
o
čím dříve amplifikační křivka dosáhne exponenciální fáze, popř. překročí určitý fluorescenční práh umístěný do této fáze, tím více startovních templátových molekul bylo přítomno ve vzorku na počátku reakce. používané matematické modely pracují s hodnotou zvanou CT („threshold cycle"), která se rovná cyklu, kdy amplifikační křivka překročí zmíněný fluorescenční práh umístěný do exponenciální fáze reakce.
VARIACE NA TÉMA PCR qPCR - KVANTIFIKACE o
Absolutní kvantifikace, která se používá např. při detekci specifických mikroorganismů, přímo determinuje výchozí počet kopií cílových molekul. Je založena na zjištění, že existuje lineární vztah mezi logaritmem startovního počtu templátových kopií a CT příslušné amplifikační křivky. Pokud tedy amplifikujeme vzorek o neznámé koncentraci společně s diluční sérií standardů o známé koncentraci, získáme kalibrační přímku („standard curve"), ze které lze odečíst výchozí koncentraci neznámého vzorku.
o
Relativní kvantifikace, která se používá ke stanovení míry genové exprese, zpravidla nevyžaduje sestrojení kalibrační přímky. Porovnává se relativní změna genové exprese (relativní expresní poměr) v testovaném vzorku oproti kontrolnímu vzorku, kterým může být např. mRNA neovlivněných buněk a pod. CT amplifikační křivky daného genu se vždy normalizuje oproti CT housekeeping genu.
VARIACE NA TÉMA PCR qPCR - analýza křivky tání o
metoda, která se používá po ukončení qPCR reakce ke zjištění povahy produktů PCR ve spojení s oligonukleotidovými sondami - detekci SNP polymorfismů a mutační analýzu při použití interkalačních barviv - k odlišení specifických a nespecifických produktů PCR reakce
o
tání DNA = proces separace komplementárních řetězců dsDNA indukovaný zvyšováním teploty
o
tání DNA můžeme po skončení qPCR reakce sledovat tak, že roztok dsDNA ochladíme na teplotu nižší než je očekávaná Tm produktů, postupně ohříváme na teplotu vyšší než je očekávaná Tm a měříme přitom fluorescenci
ZDROJE OBRÁZKŮ POUŽITÝCH V PREZENTACI - VLASTNÍ FOTOGRAFIE, FOTOGRAFIE A OBRÁZKY STAŽENÉ Z VEŘEJNĚ PŘÍSTUPNÝCH INTERNETOVÝCH ZDROJŮ (www.google.cz atd.)
