Pokok bahasan III : MEDIUM KULTUR JARINGAN
Pendahuluan Salah satu faktor penentu keberhasilan pelaksanaan kerja kultur jaringan adalah pemberian nutrisi dalam jumlah dan perbandingan yang benar pada medium kultur. Medium yang dipergunakan pada kultur in vitro tumbuhan ada bermacam-macam. Pemilihan medium tergantung pada jenis tanaman yang digunakan, selera, tujuan serta perhitungan masing-masing peneliti. Isi dan komposisi dari medium kultur dirancang secara khusus untuk tujuan yang berbeda. Medium MS, singkatan dari nama penemunya, Murashige dan Skoog atau LS singkatan dari Linsmaier dan Skoog merupakan medium yang sangat banyak digunakan untuk kultur kalus dan regenerasi berbagai tanaman, medium ini mengandung garam-garam mineral dengan konsentrasi tinggi dan senyawa N dalam bentuk ammonium dan nitrat ; medium B5 (Gamborg) banyak digunakan untuk kultur suspensi sel tanaman leguminosae; Nitsch & Nitsch, N6 (Chu) banyak digunakan untuk serealia dan tanaman lain; medium WPM (Lloyd dan McCown) untuk kultur jaringan tanaman berkayu; Vacin dan Went (VW) dan Knudson C banyak digunakan untuk anggrek; medium Kao dan Michayluk digunakan untuk kultur protoplas Cruciferae, Gramineae dan Leguminosae. Pada dasarnya tidak ada satu macam medium kultur yang dapat memberikan pertumbuhan optimal untuk semua sel, penggantian medium atau salah satu komponen
medium
seringkali
diperlukan
untuk
merespon
setiap
type
pertumbuhan dari satu macam eksplan. Studi literature sangat diperlukan untuk mengembangkan atau memodifikasi medium kultur, modifikasi dari medium kultur yang telah ada umumnya didasarkan pada trial and error.
Tujuan Instruksional Khusus Setelah mengikuti kuliah ini diharapkan mahasiswa dapat menjelaskan komponen dasar medium kultur jaringan, kebutuhan zat-zat anorganik dan organik, substansi organik lamplek, bahan tambahan lain pada medium kultur dan proses pembuatan medium .
Subpokok Bahasan : KOMPONEN DASAR MEDIUM KULTUR JARINGAN
Pendahuluan Pada prinsipnya medium diberikan kepada sel-sel tanaman in vitro dengan maksud memberikan nutrisi sesuai dengan kebutuhan sel-sel tanaman tersebut secara alami sebagai tanaman utuh yang tumbuh dialam. Tumbuhan dialam bebas bersifat autotrof, memerlukan nutrient sederhana yang terdapat didalam tanah berupa garam-garam mineral dan air untuk meneruskan siklus hidupnya. Hal ini dapat dipahami karena sebagian terbesar tubuh tumbuhan tersusun atas unsur-unsur penyusun zat anorganik tersebut. Pada kultur in vitro tumbuhan, untuk keperluan hidupnya, sel-sel pada eksplan juga memerlukan nutrient yang komposisinya jauh lebih komplek karena eksplan sedikit banyak telah kehilangan sifat autotrofnya.
Materi subpokok bahasan 1 Komponen dasar dari medium kultur dapat bermacam-macam, secara umum medium kultur jaringan harus mengandung unsur-unsur sebagai berikut: 1. Garam-garam anorganik: a. Unsur makro : C, H, O, N, S, P, K, Ca dan Mg b. Unsur Mikro : Cl, B, Mo, Zn, Cu, Fe dan Co 2. Zat-zat organic a. Gula b. Myo-Inositol c. Vitamin d. Asam-asam amino e. Zat pengatur tumbuh 3. Substansi organik komplek: a. Air kelapa b. Ekstrak buah-buahan c. Ekstrak yeast d. Pepton e. Tripton f.
Hydrolisat kasein, dll
4. Bahan pemadat a. Agar-agar b. Gelrite c. Phytagel d. Sea Plaque Agarose, dll. 5. pH 6. Bahan tambahan lain misalnya arang aktip.
Kebutuhan zat-zat anorganik Unsur makro. Air merupakan zat terbanyak pada tubuh tumbuhan, oleh karena itu air juga merupakan bagian terbesar didalam medium kultur. Air selain sebagai bahan untuk membentuk material tubuh, juga sebagai medium untuk reaksireaksi kimia dan fisika. Air juga berguna untuk transport dan distribusi zat-zat yang terlarut didalamnya. Pada medium kultur jaringan digunakan air murni yang sudah mengalami demineralisasi, deionisasi dan didestilasi dengan gelas dua kali. Kebutuhan garam-garam mineral didalam jaringan kurang lebih sama dengan tanaman utuh. Garam-garam mineral merupakan gabungan unsur-unsur esensial makro dan mikro. Konsentrasi optimum dari tiap-tiap komponen untuk mencapai kecepatan pertumbuhan yang maksimal sangat bervariasi. Menurut Gamborg dan Shylluk (1981) biasanya berkisar antara 25-60mM. Unsur makro dibutuhkan dalam jumlah cukup besar, pada umumnya diberikan dalam bentuk persenyawaan. George dan sherrington (1984) menyebutkan beberapa persenyawaan makronutrien yang umum digunakan pada medium kultur jaringan, antara lain: KNO3; NH4NO3; Ca(NO3).4H2O; NaNO3; CaCl2. 2H2O; MgSO2. 7H2O; KCl; KH2PO4; NH4H2PO4; NaH2PO4. 2H2O; Na2SO4; (NH4)2SO4; NH4Cl; K2SO4. Nitrogen (N) Nitrogen diberikan dalam bentuk persenyawaan yang bermacam-macam, antara lain: KNO3; NH4NO3; Ca(NO3).4H2O; NaNO3; NH4H2PO4; (NH4)2SO4; NH4Cl. Kebutuhan N terbesar adalah untuk menyusun asam-asam nukleat, protein, sebagai koenzym atau persenyawaan lain yang mengandung N seperti
klorofil, alkaloid, derivat purin dan pirimidin dan beberapa hormon endogen. Sumber nitrogen pada medium kultur adalah ion ammonium (NH4)+ dan nitrat (NO3)-. Jumlah ion ammonium yang digunakan berkisar antara 2-8 mM, sedangkan nitrat berkisar antara 25-40 mM. Pengambilan unsur nitrat memerlukan pH rendah, sebaliknya pengambilan ammonium menyebabkan pembebasan H+ sehingga medium menjadi asam. Medium Murashige dan Skoog (MS) menyediakan nitrogen dalam bentuk garam NH4NO3, ini merupakan strategi yang baik dan mempunyai keuntungan ganda, karena selain sumber N nya lengkap juga dalam bentuk garam effeknya terhadap penurunan pH medium berkurang (George dan Sherrington, 1984).
Fosfor (P) Fosfor
diberikan
pada
medium
kultur
jaringan
dalam
bentuk
-
persenyawaan KH2PO4 atau K2HPO4; NH4H2PO4; NaH2 PO4. Ion PO total yang diberikan pada medium bervariasi antara 0,5 - 20 mM/1. Unsur P didalam sel diubah menjadi persenyawaan RNA dan DNA, zat-zat yang sangat penting yang bertanggung jawab atas sifat-sifat keturunan. Unsur P diperlukan sebagai aktifator ensim untuk memacu pertumbuhan pada jaringan meristematik. Kelebihan unsur P dapat menghambat pertumbuhan eksplan, karena akan terjadi persaingan penyerapan dengan unsur lain seperti seng (Zn), besi (Fe) dan tembaga (Cu).
Kalium (K) Kalium diberikan pada medium dalam bentuk KNO3; KH2PO4 atau K2HPO4, KCl; dan K2SO4. Ion K+ total yang diberikan pada medium bervariasi antara 1,837-25.18 mM/1. Unsur K sangat diperlukan untuk memacu pembelahan sel, sintesa karbohidrat dan protein, pembuatan klorofil serta untuk mereduksi nitrat (Kyte, 1983). Kalium berpengaruh pada hidratasi, menambah atau mengurangi hidratasi pada misel seiiingga mempengaruhi keluar masuknya nutrien ke dalam sel.
Sulfur (S) Sulfur atau belerang diberikan pada medium dalam bentuk MgSO4. 7H2O; (NH4)2SO4; K2SO4; FeSO4.7H2O; MnSO4.4H2O; ZnSO4. 7H2O; CuSO4. 5H2O.
Pemberian belerang berkisar antara 0,75 - 3 mM/1. Sulfur ada didalam beberapa molekul protein dan koenzym. Memacu perkembangan akar, juga berguna untuk ketahanan atau proteksi tubuh tumbuhan. Belerang diserap dalam bentuk SO4=, antara lain dijadikan aneurin, biotin, persenyawaan asam amino yang ada belerangnya misalnya, cystein, methionin.
Calcium (Ca) Calcium atau kapur diberikan pada medium dalam bentuk Ca(NO3). 4H2O; CaCl2.2H2O; Ca3 (PO4)2. Pemberian ion Ca berkisar antara 1-3 mM/l. Pemakaian Ca-nitrat ada kelemahannya karena sangat higroskopis, sehingga didalam wadahnya seringkali (dijumpai kristalnya berair. Sebaiknya Ca-nitrat dibuat larutan stok dan disimpan didalam kulkas. Ca-fosfat juga ada kelemahannya yaitu tidak mudah larut. Untuk melarutkannya, sejumlah tertentu Ca-fosfat dimasukan kedalam Erlenmeyer 50 ml, kemudian diberi beberapa tetes HCl 0,1 N campuran ini digojok sambil dipanasi sampai larut (tampak jemih). Calcium diperlukan untuk pembentukan dinding primitive, sebagai Capectat yaitu bagian integral dari dinding sel, penting sebagai kation selular dan kofaktor enzym. Calcium mempengaruhi hidratasi, permeabilitas dan penyerapan nutrient. Calcium juga mempengaruhi tingginya pH, menetralisir racun, misalnya pada asam oksalat. Asam oksalat dengan Ca akan menjadi Ca-oksalat berbentuk kristal dan diisolasi atau dimumifikasikan ikklam sel tertentu menjadi sel-sel kristal.
Magnesium (Mg) Magnesium terutama diberikan pada medium dalam bentuk MgSO4. 7H2O. Magnesium diperlukan sebagai elemen utama dalam pembentukan klorofil, berperan penting sebagai aktivator ensim terutama dalam proses fosforilasi dan sintesis protein dengan cara membentuk komplek ensim-substrat. Unsur mikro Unsur hara mikro adalah unsur yang diperlukan dalam jumlah sedikit. Fungsinya belum diketahui secara pasti, tetapi tidak adanya zat-zat ini dapat menyebabkan kelainan pertumbuhan. Air dan bahan kimia yang tingkat kemurniannya rendah seringkali terkontaminasi oleh unsur hara mikro. Bentuk
persenyawaan hara mikro yang umum digunakan pada beberapa medium kultur menurut George dan Sherrington (1984) adalah: MnSO4.4H2O; ZnSO4. 7H2O; H3BO3; KI; CuSO4. 5H2O; NaMoO4. 2H2O; CoCl2. 6H2O; FeCl3. 6H2O; Fe III citrate; FeSO4.7H2O; NaFeEDTA; Na2EDTA. 2H2O; Fe(SO4)3; Fe III tartrate. Besi (Fe) Besi diperlukan dalam jumlah sedikit lebih banyak daripada unsur mikro yang lain, diberikan dalam bentuk chelat. Pemberian Fe bersama-sama dengan NaEDTA dimaksudkan agar besi tetap pada jangkauan pH yang luas dalam jangka waktu yang lama sehingga dapat diserap oleh jaringan tanaman. Fe berperan penting dalam sintesis klorofll, konfersi energi pada fotosintesis dan respirasi dengan melakukan reduksi oksidasi, bagian dari sitokrom. Besi diberikan pada medium kultur jaringan berupa FeCl3. 6H2O; Fe III citrate; FeSO4.7H2O; NaFeEDTA 2H2O; Fe(SO4)3; Fe III tartrate. Boron (B) Boron diberikan pada medium kultur sebagai asam borak (boric acid, H3BO3). Berperan dalam translokasi karbohidrat, juga terlibat dalam difsrensiasi seluler dan perkembangan. Ikatan boron organis memungkinkan adanya diferensiasi dan penyusunan
struktur
halus dari dinding
sel sehingga
memudahkan transport karbohidrat dan penyerapan ion kedalam sel; sebagai aktifator dan inaktifator bagi zat pengatur tumbuh. Kalau boron kurang zat pengatur tumbuh menjadi terlalu banyak sehingga menghambat pertumbuhan.
Molybdenum (Mo) Molybdenum
diberikan
pada
medium
sebagai
sodium
molybdat
(Na2MoO4. 2H2O) berpartisipasi pada konfersi nitrogen ke ammonia dan fiksasi nitrogen, ikut dalam metabolisme protein, sintesis asam askorbat, kofaktor enzim.
Manganese (Mn) Manganese merupakan elemen esensial yang terdapat pada membran kloroplas, berperan sebagai aktifator ensim dengan bertindak sebagai perantara pada proses fosforilasi atau sebagai gugus redok Mn++. Bahan pembentuk klorofil dan aktip dalam fotosintesa, metabolisme protein dan pembentukan vitamin C.
Pada medium kultur diberikan dalam bentuk MnSO4. Cobalt (Co) Cobalt merupakan elemen dari molekul vitamin B komplek, esensial untuk fiksasi nitrogen. Pada medium kultur jaringan diberikan dalam bentuk persenyawaan Cobalt Oiloride (CoCl2). Zincum (Zn) Zincum berperan sebagai aktifator ensim, penyusun khlorofil, pemacu pembentukan zat pengatur tumbuh terutama IAA. Pada medium kultur jaringan diberikan dalam bentuk one sulfate (ZnSO4). Cuprum (Cu) Cuprum merupakan bagian dari ensim, Cu bereaksi menjadi komponen phenolase, lactase dan askorbat oksidase. Ikut ambil bagian dalam proses fotosintesis dan reduksi nitrit. Cuprum diberikan pada medium kultur jaringan dalam bentuk Cupric sulfate (CuSO4 5H20). Chlorine (Cl) Chlorine sebagai ion berpengaruh terhadap aktifitas ensim, memacu proses fotosintesis. Chlorine diberikan pada medium kultur jaringan berupa calcium chloride (CaCl2) Kebutuhan zat-zat organik Zat-zat organik adalah persenyawaan yang mengandung karbon, ditambahkan pada medium kultur jaringan berupa gula, myo-Inositol, vitamin, asam-asam amino dan zat pengatur tumbuh. Zat-zat organik tersebut biasanya tidak diberikan pada tanaman karena tanaman dapat mensintesis sendiri, tetapi pada kultur in vitro, karena eksplan yang digunakan umumnya berukuran sangat kecil dan tidak marnpu mensintesis sendiri semua zat-zat organik tersebut, maka zat-zat organik harus ditambahkan pada medium.
Gula Tumbuhan dialam bebas mencukupi kebutuhan gula dengan mengasimilasi CO2
pada proses fotosintesa, dengan pertolongan klorofil dan sinar matahari, dijadikan glucose kemudian dijadikan pati, selulose dan persenyawaanpersenyawaan lain. Pada kultur in vitro, sel dan jaringan tumbuhan belum sempurna dalam melakukan asimilasi fotoautotrof, sehingga diperlukan gula sebagai sumber karbon dan enersi. Selain sebagai sumber enersi bagi sel dan jaringan, gula juga berfungsi sebagai penjaga keseimbangan tekanan osmotik potensial didalam medium. Gula pada umumnya diberikan pada medium kultur berupa sukrosa atau komponen-komponennya seperti monosakarida glukosa atau fruktosa. Sukrosa pada medium kultur ditambahkan sebanyak 30 gr/l. Glukosa atau D-glukosa biasanya ditambahkan dengan konsentrasi 20 - 30 gr/l, tergantung dari jenis eksplan. Sukrosa ternyata lebih berpengaruh dalam perkembangan kalus, sedangkan pengaruhnya terhadap organogenesis belum dapat dipastikan (George dan Sherrington, 1984). Pada kultur mikrospora beberapa spesies tanaman digunakan maltosa, maltosa dihidrolisis lebih lambat dibandingkan dengan sukrosa, ini memberi pengaruh yang lebih baik pada mikrospora yaitu dapat memacu embryogenesis (Indrianto et al. 1999).
Myo-Inositol Myo-Inositol ditambahkan pada medium untuk membantu diferensiasi dan pertumbuhan jaringan. Myo-Inositol ikut serta dalam beberapa reaksi metabolik penting yang berhubungan dengan pembelahan sel. Myo-Inositol merupakan perantara pada perubahan glukosa menjadi asam galakturonat juga sebagai prazat untuk pektin dan penyusun dinding sel.
Vitamin Vitamin ditambahkan pada medium untuk mempercepat pertumbuhan, diferensiasi kalus. Vitamin berfungsi sebagai kofaktor atau bagian dari molekul kofaktor dari reaksi-reaksi ensimatis penting, vitamin juga berfungsi protektif. Seperti halnya zat pengatur tumbuh, vitamin juga mempengaruhi (menstimulasi) inisiasi, pertumbuhan dan perkembangan akar. George dan Sherrington (1984) memasukan beberapa macam vitamin yang umum digunakan pada berbagai medium dasar, antara lain: Thiamin-HCl, Nicotinic acid, Pyridoxin-HCl, Ca Dpanthothenate, Folic acid, Choline chloride, Riboflavin, yang kesemuanya merupakan anggota dari vitamin B kompleks. Ascorbic acid dan adenin juga
sering ditambahkan pada medium. Vitamin labil terhadap pemanasan, dianjurkan untuk selalu menggunakan filter steril jika akan ditambahkan pada medium. Thiamin merupakan vitamin yang esensial terdapat pada hampir semua medium kultur jaringan tumbuhan, cenderung mempercepat pembelahan sel pada meristem akar tetapi tidak berpengaruh terhadap pemanjangan sel. Thiamin merupakan bagian prostetik yang terdapat didalam sel, berperan sebagai koensim dalam reaksi yang menghasilkan enersi dari karbohidrat dan memindahkan enersi. Thiamin diberikan dalam jumlah yang bervariasi dari kirakira 0,1 sampai 30 mg/l (Doods dan Roberts, 1983). Nicotinic acid (niacin) penting dalam reaksi-reaksi ensimatis disamping peranannya sebagai prekursor dari beberapa alkaloid. Ascorbic acid sering ditambahkan pada medium, terutama untuk mencegah terjadinya pencoklatan pada permukaan irisan jaringan yang disebabkan karena terjadinya reaksi oksidasi senyawa polyphenol menjadi quinon yang berwarna coklat, vitamin disini berfungsi sebagai antioksidan.
Asam-asam amino Asam amino merupakan sumber N organik , penyusun protein dan asam nukleat, lebih cepat diambil oleh sel dan jaringan tanaman dari pada N anorganik didalam medium kultur jaringan. Adapun asam amino yang umum ditambahkan pada medium adalah: Glutamine, Glycine, L-Cyteine, L-Arginine, L-Aspartic acid, L-Methionine.
Zat pengatur tumbuh Selain nutrisi, zat pengatur tumbuh sangat diperlukan sebagai komponen medium bagi pertumbuhan, perkembangan dan diferensiasi. Zat pengatur tumbuh aktif pada konsentrasi rendah dan diproduksi didalam tubuh tanaman itu sendiri (endogen). Untuk keperluan kultur jaringan telah dibuat zat pengatur tumbuh sintetik, tanpa zat pengatur tumbuh pertumbuhan eksplan akan terhambat bahkan mungkin tidak tumbuh sama sekali. Zat pengatur tumbuh dikelompokan dalam beberapa grup: Auksin, Sitokinin, Gibberellin, Abscisic acid, dan Ethylene.
Auksin Indole-3-acetic acid (IAA) merupakan auksin alamiah yang terdapat pada sebagian besar tumbuhan. Disintesis dari tryptophane terutama di primordia daun, daun muda dan pada kecambah. IAA ditransport dari sel ke sel dengan arah basipetal (dari pucuk ke akar). IAA berperan dalam mempengaruhi pemanjangan sel; pembelahan sel; diferensiasi jaringan faskuler; inisiasi pembentukan akar; mempengaruhi dominasi apikal; zona absisi pada daun dan buah; pembungaan; pemasakan buah, dll. IAA mudah larut dalam alkohol. Penggunaan IAA pada medium kultur kerap kali kurang menguntungkan karena mudah rusak oleh cahaya, oksidasi ensimatik dan pemanasan pada saat proses sterilisasi dengan autoclave. Penggunaan auksin sintetik lebih menguntungkan karena lebih stabil. Auksin sintetik yang umum digunakan pada medium adalah: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D); 1-naphthaleneacetic acid (NAA) dan indole-3-butyric acid (IBA). Beberapa persenyawaan seperti dicamba (3,6-dichloro-O-anisic acid) dan picloram (4-amino-3,5,6-trichloro-2-pyridinecarboxilic acid) pada konsentrasi tinggi merupakan herbisida, digunakan sebagai auksin substitusi. Kultur in vitro tumbuhan yang pada mulanya memerlukan auksin eksogen untuk pertumbuhannya, secara gradual atau bahkan secara tiba-tiba dapat hilang dan tidak memerlukan auksin lagi, hal yang demikian disebut sebagai habituasi terhadap auksin. Penggunaan auksin secara tunggal pada umumnya sudah cukup mampu untuk menginduksi pembentukan dan pertumbuhan kalus, tetapi untuk
beberapa
tanaman
yang
rekalsitran
akan
lebih
membantu
jika
menggunakan lebih dari satu jenis auksin secara simultan. Pada kultur jaringan tanaman monokotil, terutama rumput-rumputan dan palem, juga pada kultur in vitro umbi akar wortel, memerlukan auksin sintetik seperti 2,4-D dengan dosis yang cukup tinggi. Penghilangan atau pengurangan kadar auksin pada sub kultur berikutnya dapat memacu produksi embrio somatik atau organ adventiv. Pertumbuhan kultur juga dapat dipacu dengan penambahan substansi yang dapat mengatur tingkatan IAA endogen misalnya, dopamine dapat menghambat aktifitas IAA oksidase sehingga tidak terjadi oksidasi terhadap IAA, akibatnya pertumbuhan jaringan dan organ pada kultur in vitro menjadi lebih baik. Penghambat sintesis auksin seperti 5-hydroxy-nitrobenzyl bromide (HNB) dan 7azaindole memacu embryogenesis somatik pada kultur kalus citrus yang telah
mengalami habituasi.
Sitokinin Sitokinin adalah derivat dari adenin, kinetin (6-furfurylaminopurin) dan zeatin adalah sitokinin alami yang umum digunakan secara meluas pada medium kultur. Sitokinin disintesis melalui modifikasi biokimia dari adenin, terjadi pada ujung akar dan biji yang tumbuh. Kebalikan dari auksin, sitokinin ditransport melalui xylem dari akar ke pucuk. Sitokinin hanya aktip jika ada auksin, pemberian sitokinin bersama auksin pada medium kultur dapat memacu pembelahan sel dan morfogenesis. Sitokinin mempengaruhi transport auksin, pertumbuhan kuncup lateral (mematahkan dominasi apikal), perkembangan daun, menghambat proses penuaan daun dan mempengaruhi perkembangan kloroplas. Sitokinin sintetik seperti N6-benzylaminopurine (BAP) lebih sering digunakan pada medium kultur jaringan. Phenylurea, substansi aktip yang terdapat pada air kelapa mempunyai efek yang sama dengan zeatin, penggunaannya memerlukan konsentrasi yang lebih
tinggi.
komersial
Thidiazuron
digunakan
(N-phenyl-N-l,2,3-thiazol-5-ylurea),
sebagai
defoliant,
karena
yang
kemampuannya
secara untuk
menstimulasi produksi ethylene, dapat digunakan untuk memacu pembentukan dan proliferasi tunas in vitro. Substansi lain yang mempunyai aktifitas seperti sitokinin adalah endosperm cair pada kecambah jagung. Diferensiasi selular dan morfogenesis in vitro terutama dikendalikan oleh interaksi antara konsentrasi auksin dan sitokinin yang diberikan pada medium kultur. Manipulasi rasio auksin: sitokinin dapat mempengaruhi organogenesis, pada
perbandingan
auksin/sitokinin
tinggi
memacu
pembentukan
akar,
perbandingan yang sebaliknya akan memacu pembentukan tunas. Jika perbandingan auksin sitokinin seimbang hanya terbentuk kalus.
Gambar 3.1. Efek auksin + sitokinin (George dan Sherrington, 1984) Ada beberapa perkecualian: 1. Proliferasi tunas aksiler pada beberapa spesies tanaman dapat dipacu dengan auksin bersama sitokinin. 2. Induksi kalus pada beberapa monokotil dapat dipacu pada medium yang ditambahkan auksin dengan konsentrasi tinggi tanpa sitokinin. 3. Morfogenesis in vitro pada monokotil dipacu pada medium dengan auksin konsentrasi rendah atau tanpa auksin.
Gibberellin (GA) Pada 1926 Kurasawa mendapatkan kecambah padi yang tumbuh abnormal karena terinfeksi oleh sejenis jamur Gibberella fujikuroy. Substansi yang menyebabkan pertumbuhan seddling padi menjadi sangat cepat (abnormal) tadi diketahui sebagai gibberelic acid (GA3). Gibberellin merupakan zat pengatur tumbuh yang dalam bentuk larutan pada temperatur tinggi mudah kehilangan sifatnya sebagai zat pengatur tumbuh. Gibberellin merupakan keluarga persenyawaan yang didasarkan pada struktur entgibberellane. Ada 34 gibberellin
yang telah diidentifikasi secara kimia, beberapa diantaranya ditemukan pada embryo dimana dapat memicu produksi alfa amilase yang dapat mengubah cadangan makanan pada biji menjadi gula sehingga dapat digunakan oleh embryo untuk pertumbuhannya. Gibberellin disintesis dari asam mevalonat pada jaringan muda dari tunas dan biji yang sedang berkecambah, ditransport di dalam xylem dan phloem. Gibberellin berpengaruh pada pertumbuhan batang, pembesaran dan pembelahan sel, induksi perkecambahan biji, produksi ensim selama perkecambahan, pembentukan bunga. Seperti halnya auksin, gibberellin juga dapat memacu pembentukan akar, George dan Sherrington (1984) mengatakan bahwa pacuan pembentukan akar dapat terjadi karena gibberellin dapat menyebabkan peningkatan jumlah auksin endogen. Pada medium kultur yang biasa digunakan adalah GA3. Abscisic acid (ABA) Abscisic acid (ABA) adalah persenyawaan tunggal dengan berat molekul 264,31, larut dalam NaHCO3 cair, kloroform, aceton dan ether. ABA disintesis dari asam mevalonat pada daun-daun tua terutama sebagai respon terhadap stres air (kekeringan). ABA ditransport dari daun melalui phloem, ABA dapat bergerak ke akar didalam phloem dan kemudian kembali ke pucuk melalui xylem. ABA berperan pada penutupan stomata, transport fotosintat kearah biji-biji yang sedang tumbuh. Pada kultur in vitro tumbuhan, ABA digunakan untuk menginduksi embryogenesis mikrospora, ABA juga dapat menghambat proses perkecambahan yang terlalu dini pada embryo somatik.
Ethylene Ethylene adalah zat pengatur tumbuh yang berbentuk gas, disintesis dari methionine didalam berbagai jaringan tumbuhan sebagai respon terhadap stres. Pada umumnya gas ethylene disintesis pada jaringan-jaringan yang mengalami senescence atau yang mengalami penuaan. Ethylene bergerak secara berdifusi dari tempat sintesisnya. Perananya adalah dalam membebaskan dormansi, diferensiasi dan pertumbuhan tunas, pembentukan akar adventiv, pemasakan buah, induksi pembungaan dll. Ethylene jarang dipergunakan pada kultur in vitro. Penggunaan ethylen inhibitor seperti silver nitrate atau sulfat (ZnSO4), cobalt atau nickel chloride (CoCl2) dan asam salisilat pada medium kultur dapat
iraeningkatkan regenerasi pucuk dan produksi embryo somatik, tetapi hasilnya sering kali koetradiktif. Ethylen dapat mempercepat perusakan sitokinin dan menstimulasi perakaran pada kultur in vitro. Zat pengatur tumbuh yang umum digunakan pada kultur jaringan
Zat pengatur tumbuh
Singkatan
Berat Molekul
Abscisic acid
ABA
264,3
Indole-3-acetic acid
IAA
175,2
Naphthaleneacetic acid
NAA
186,2
2,4-Dicholorophenoxyacetic
2,4-D
221,04
IBA
203,2
6-Furfurylaminopurine
Kinetin
215,2
6-Benzyl-aminopurine
BA
225,2
2Ip
203,3
Zeatin
219,2
GA3
346,4
Indole-3-butyric acid
6
2
N (Δ -isopentenyl)-adenine Trans-6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl) amino purine Gibberelic acid
Sabstansi organik komplek Substansi
organik
komplek
biasanya
belum
dikenal
benar
isi
komposisinya, termasuk didalamnya pepton, tripton, hydrolisat casein, yeast ekstrak, malt ekstrak, dan bermacam-macam tanaman seperti, air kelapa, endosperm jagung, ekstrak pisang, tomat, kentang, jeruk, nanas dll. Substansisubstansi komplek ini jika digunakan terlalu tinggi dapat merugikan pertumbuhan sel, disarankan untuk melakukan pengujian dahulu dengan interval 1- 5 g/1, untuk menetapkan pengaruhnya terhadap pertumbuhan. Jumlah air kelapa yang biasanya ditambahkan pada medium adalah 2-15 % v/v. Substansi organik kompleks ini kelemahannya tidak konsisten kadarnya dan tidak diketahui dengan pasti komposisinya.
pH medium pH merupakan simbol dari derajat keasaman atau kebasaan dari larutan
yang ditunjukan dengan konsentrasi ion hidrogen. pH tertentu diperlukan untuk pertumbuhan jaringan tanaman agar tidak mengganggu fungsi membran sel dan sitoplasma. pH yang diperlukan pada medium kultur biasanya berkisar antara 4,6 -5,8. Pengaturan pH medium dilakukan dengan menggunakan sodium hydroxyde (1M NaOH), digunakan untuk menaikan pH medium (menjadi lebih alkalin, basa) dan hydrochloric acid (1M HC1), untuk menurunkan menjadi lebih asam. pH medium harus dipertahankan konstan selama kultur berlangsung karena akan mempengaruhi ketersediaan nutrien yang dapat diserap oleh sel dan jaringan tanaman untuk pertumbuhannya. Ada suatu persenyawaan komplek yang mampu membuat pH suatu medium tetap pada jangkauan tertentu, misalnya besi yang berikatan dengan chelat. KH2PO4 juga dapat berfungsi sebagai buffer. pH juga penting pada proses embryogenesis somatik pada kultur umbi akar wortel, stadium preglobular embryo dapat dipertahankan dan ditingkatkan jumlahnya pada medium dengan pH dibawah 4,5. Jika pH dinaikkan, embryo somatik melanjutkan pertumbuhannya melalui tahapan-tahapan yang normal seperti pada embryo zygotik, yaitu globular, jantung, torpedo dan cotyledonary (atau equivalen dengan system yang berlaku pada monokotil).
Bahan pemadat (Gelling agent) Gelling agent digunakan untuk memadatkan medium, bahan pemadat yang sering digunakan pada medium adalah agar-agar (7-10 g/l), bahan pemadat lain (Jarang digunakan) adalah gelrite, gelrite lebih bening dari agar-agar. Pemakaian gelrite juga lebih sedikit untuk mencapai kepadatan yang sama dengan agar, yaitu 2 g/l. Agarose juga sering digunakan untuk kultur protoplas dan
mikrospora.
Penggunaan
bahan
pemadat
ini
megandung
banyak
kelemahan: 1. Hanya sebagian eksplan yang kontak dengan medium 2. Terjadi gradient nutrisi yang tidak sama 3. Mobilitas hara menjadi kurang baik 4. Terjadi akumulasi zat-zat toksik yang dikeluarkan oleh eksplan.
Beberapa macam medium dasar Ada beberapa macam medium dasar, pada umumnya diberi nama sesuai dengan nama penemunya. Beberapa diantaranya adalah:
1. Medium Murashige dan Skoog (MS) (1962), medium yang paling populer digunakan untuk hampir semua macam tanaman, terutama tanaman herbaceus. Medium ini paling banyak digunakan untuk kultur kalus dan tunas, mempunyai konsentrasi garam-garam mineral yang tinggi, dan senyawa N dalam bentuk ammonium dan nitrat. 2. Medium Gamborg (B5) (1968), digunakan untuk kultur suspensi sel kedele, alfalfa dan legume lain. 3. Medium White (W63) (1963), merupakan medium dasar dengan konsentrasi garam-garam mineral yang rendah, digunakan untuk kultur akar. 4. Medium Vacint dan Went (VW) (1949), digunakan untuk kultur embryo anggrek. 5. Medium Nitsch dan Nitsch, digunakan untuk kultur mikrospora dan kultur sel pada tembakau 6. Medium N6, Chu (1978), digunakan untuk kultur jaringan serealia terutama padi 7. Medium WPM (Lloyd dan McCown, 1980), untuk tanaman berkayu 8. Medium Kao dan Michayluk (1975) digunakan untuk kultur protoplas Cruciferae, Grarmneae dan Leguminosae. (George & Sherrington, 1984). PEMBUATAN MEDIUM MURASHIGE & SKOOG Untuk membuat medium kultur jaringan, kita harus menimbang setiap komponen bahan kimia yang tertera pada resep. Langkah ini menjadi kurang praktis, memakan banyak waktu dan mengurangi ketepatan. Selain itu timbangan yang digunakan untuk menimbang sejumlah kecil bahan kimia kadang-kadang tidak tersedia. Jalan keluar yang harus ditempuh adalah dengan membuat larutan stok, setiap larutan stok dapat dipergunakan untuk 40, 50 dan bahkan 100 liter medium. Larutan stok dibuat menjadi beberapa kelompok : stok besi (iron), stok mikronutrien, stok vitamin dan stok hormon. Untuk makronutrien tidak dibuat stok, jadi harus ditimbang satu persatu, tetapi jika diperlukan dapat dibuat larutan stok secara tunggal, tidak dikelompokkan menjadi satu.
Yang
perlu
diperhatikan
dalam
pembuatan
larutan
stok
adalah
kepekatannya. Larutan stok yang dibuat terlalu pekat akan mengalami pengendapan sejalan dengan lama waktu penyimpanan, jika hal ini terjadi stok harus dilarutkan dengan pemanasan terlebih dahulu sebelum digunakan. Larutan stok harus disimpan dalam lemari es (kulkas). Larutan stok kadang-kadang terkontaminasi, ditumbuhi mikroorganisme, stok yang terkontarninasi tidak dapat dipergunakan lagi. Jadi kebersihan harus dijaga dan jangan membuat larutan stok terlalu banyak. Bahan dan alat: 1. Tabel formula dan bahan-bahan kimia untuk medium MS 2. Akuades 3. Aluminum foil, kertas timbang, tissue, kertas label 4. Timbangan analitik 5. Gelas piala 600 ml, 50 ml 6. Labu takar 100 ml, gelas ukur 100 ml 7. Erlenmeyer 1000 ml, 100 ml, 50 ml, atau botol kultur 8. Pipet, pengaduk 9. Magnetic stirrer dengan hot plate 10. pH meter 11. Autoclave, millipore filter, pompa fakum
I. Pembuatan larutan stok untuk medium MS
A.
Stok besi (IRON): dalam 200 ml (40 kali konsentrasi) 1. Ditimbang 1.492 mg Na2EDTA dan 1.112 mg Fe2SO4.7H2O, kedua bahan tersebut dilarutkan dalam kira-kira 75 ml akuades secara terpisah. Larutan Fe2SO4.7H2O dipanaskan sampai hampir mendidih, kemudian masukan larutan Na2EDTA sedikit demi sedikit sambil diaduk (dengan magnetik stirrer). Kedua larutan akan tercampur, bening dan berwarna kuning emas, jika larutan keruh, tambahkan beberapa tetes HCl 1 N lalu dipanaskan. Biarkan mendingin pada suhu kamar, tambahkan akuades sampai volume menjadi 200 ml. Masukan dalam botol khusus berwarna gelap, beri label: IRON. MS 40X, 5 ml/I
2. Simpan dalam kulkas, untuk membuat 1 liter medium MS, diperlukan 5 ml larutan stok besi.
B.
Stok Mikronutrien : dalam 100 ml (100 kali konsentrasi) Mikronutrien diperlukan dalam jumlah sangat sedikit, oleh karena itu stok
mikronutrien dibuat dalam satu wadah sebagai stok campuran. 1. Ditimbang bahan-bahan kimia mikronutrien dengan timbangan analitik, masing-masing MnSO4. H2O
2.230 mg
ZnSO4.4 H2O
860 mg
H3BO3
620 mg
KI
83 mg
NaMoO4. 2H2O
25 mg
CuSO4. 5H2O
2,5 mg
CoCl2. 6H2O
2,5 mg
2. Masukan satu persatu dalam gelas piala 200 ml yang berisi akuades kurang lebih 80 ml. Setiap kali memasukan bahan kimia harus segera dilarutkan
(diaduk),
baru
kemudian
bahan
berikutnya.
Jangan
memasukan semua bahan kimia kemudian dilarutkan, akan terjadi presipitat (endapan). Untuk melarutkan bisa dibantu dengan magnetik stirrer. 3. Larutan yang sudah jadi ditambahkan akuades sampai volume menjadi 100 ml. 4. Masukan dalam botol khusus, tutup yang rapat, beri label: MIKRO MS 100X, 1 ml/I. 5. Simpan dalam kulkas, untuk membuat medium MS 1 liter, diperlukan 1 ml stok mikro C. Stok Vitamin, dalam 200 ml (50 kali konsentrasi) Vitamin dapat dibuat dalam satu wadah sebagai stok campuran 1. Ditimbang bahan-bahan dibawah ini: Glycine Nicotinic acid
100 mg 25 mg
Pyridoxine-HCl
25 mg
Thiamine-HCl
5 mg
2. Larutkan satu persatu dalam gelas piala 600 ml yang berisi akuades (steril) kira-kira sebanyak 150ml. 3. Tambahkan akuades steril sampai volume mencapai 200 ml 4. Masukan dalam botol khusus, tutup yang rapat, beri label: VITAMIN MS. 5OX, 4 ml/I 5. Simpan dalam kulkas, untuk membuat 1 liter medium MS, diperlukan 4 ml stok vitamin.
D. Stok zat pengatur tumbuh Zat pengatur tumbuh diperlukan dalam jumlah yang sangat terbatas. Kelarutan dari masing-masing zat juga berbeda-beda. Biasanya stok zat pengatur tumbuh dibuat dengan kepekatan 100-500 mg/l. Siok Kinetin : 500 mg/l (500 ppm) 1. Timbang kinetin 50 mg, masukan dalam gelas piala 100 ml 2. Teteskan sedikit larutan HCl 1 N dan dipanaskan sebentar sampai larut, sambil diaduk tambahkan 20 ml akuades panaskan sebentar sampai larutan menjadi jernih. 3. Setelah dingin, masukan dalam labu takar 100 ml, tambahkan akuades sampai volume menjadi 100 ml. 4. Pindahkan dalam erlenmeyer 100 ml atau wadah lain yang bersih, tutup rapat, beri label: KINETIN 500 ppm 5. Simpan dalam kulkas. Stok IAA; NAA; 2,4-D; IBA : 500 mg/l (500 ppm) 1. Timbang IAA; NAA; 2,4-D dan IBA secara terpisah masing-masing sebanyak 50 mg, masukan masing-masing bahan dalam gelas piala 100 ml. 2. Teteskan beberapa tetes larutan KOH 1 N dengan hati-hati panaskan sampai larut benar (jernih), sambil diaduk tambahkan 20 ml akuades, untuk
mempercepat
proses
pelarutannya
dapat
dibantu
dengan
pemanasan 3. Pindahkan dalam labu takar 100 ml, tambahkan akuades sampai volume menjadi 100 ml. 4. Pindahkan dalam wadah stok, tutup yang rapat, beri label pada masingmasing wadah : IAA 500 ppm
2,4-D 500 ppm
NAA 500 ppm
IBA500 ppm.
5. Simpan dalam lemari es. E. Myo-Inositol dan Sukrose: karena jumlahnya cukup banyak,tidak dibuat stok, ditimbang setiap kali membuat media.
II. Pembuatan medium MS padat sebanyak 1 liter 1. Siapkan erlenmeyer 1000 ml yang berisi 500 ml akuades 2. Timbang setiap komponen bahan kimia makronutrien (sesuai dengan label), larutkan satu persatu, untuk mempercepat pelarutan dapat dibantu dengan magnetic stirrer. 3. Masukan 5 ml larutan stok IRON 4. Masukan 1 ml larutan stok MIKRONUTRIEN 5. Masukan 4 ml larutan stok VITAMIN 6. Masukan zat pengatur tumbuh (sesuai kebutuhan) 7. Timbang 100 mg Myo-Inositol, masukan dalam erlenmeyer dan larutkan 8. Timbang 30 g sukrose, masukan dalam erlenmeyer dan larutkan. 9. Tambahkan akuades sampai volume mencapai 1000 ml 10. Ukur pH menjadi 5,6 - 5,8 dengan penambahan HCl atau KOH. 11. Timbang 8 g agar-agar, masukan dalam erlenmeyer, panaskan (sambil diaduk) sampai agar-agar larut. 12. Dalam keadaan masih cair, bagilah media kedalam botol kira-kira 40 ml/botol. 13. Tutup rapat dengan aluminum foil dan beri label sesuai dengan perlakuan. 14. Masukan kedalam autoclave dan sterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit dengan tekanan 15 psi. 15. Setelah tekanan turun sampai 0, medium yang sudah steril segera
dikeluarkan dari autoclave, jangan menunggu sampai dingin didalam autoclave. 16. Medium yang sudah steril disimpan dalam ruang penyimpanan.
Latihan soal-soal 1. Sebutkan dan jelaskan dengan singkat 5 komponen dasar dari medium kultur! 2. Apa keunggulan medium Murashige dan Skoog ! 3. Jelaskan apa kelemahan digunakannya medium agar! 4. Jelaskan peranan auksin dan sitokinin pada proses diferensiasi in vitro! 5. Jelas mengapa micronutrient harus dibuat larutan stok!
Petunjuk jawaban latihan soal-soal 1. Ingat komponen dasar medium kultur j aringan! 2. Ingat keunggulan medium MS 3. Ingat kelemahan medium agar! 4. Ingat peran auksin dan sitokinin! 5. Ingat pembuatan medium!
