Pokok Bahasan III PERTUMBUHAN MIKROBIA DALAM BIOREAKTOR Deskripsi Singkat Pertumbuhan mikrobia adalah peningkatan semua komponen sel sehingga menghasilkan peningkatan ukuran sel dan jumlah sel (kecuali mikrobia yang berbentuk filamen) akan menyebabkan peningkatan jumlah individu didalam populasi. Pertumbuhan mikrobia dalam bioreaktor terjadi secara pertumbuhan individu sel dan pertumbuhan populasi, pertumbuhan individu sel meliputi peningkatan substansi dan komponen sel, peningkatan ukuran sel serta pembelahan sel. Sedang pertumbuhan populasi meliputi peningkatan jumlah akibat pembelahan sel dan peningkatan aktivitas sel yang melibatkan sintesa ensim. Dalam pertumbuhan mikrobia juga terlibat proses metabolik yaitu mulai dari transpot nutrien dari medium kedalam sel, konversi bahan nutrien menjadi energi dan konstituen sel, replikasi kromosorn, peningkatan ukuran dan masa sel serta pembelahan sel secara biner yang terjadi pula pewarisan genetik (genom turunan) ke sel anakan. Dalam bab ini akan dibahas tentang kinetik pertumbuhan mikrobia dalam sistem sekali unduh, kontinyu dan kultur terputus, studi kinetika pertumbuhan dan fermentasi diperlukan sebagai dasar untuk memahami setiap proses fermentasi. Kinetika pertumbuhan mikrobia terutama menguraikan tentang kecepatan produksi sel (biomasa)
dan
pengaruh
lingkungan
terhadap
kecepatannya.
Pengamatan
pertumbuhan mikrobia tidak cukup untuk rnengetahui apakah biakan tumbuh atau tidak (pengamatan kuantitatif) tetapi juga diperlukan pengamatan yang bersifat kualitatif dan studi kinetika pertumbuhan. Pengukuran pertumbuhan secara kuantitatif disajikan dalam bentuk kurva yang menunjukkan hubungan antara waktu dan jumlah biomasa. Data pengamatan pertumbuhan mikrobia perlu diamati parameter-parameter seperti : 1.
Kecepatan pertumbuhan (specific growth rate)
2.
Waktu rnengganda (doubling time)
3.
Hasil pertumbuhan (growth yield)
4.
Kemampuan metabolisme (metabolic quosient)
5.
Affinitas substrat
6.
Jumlah maksimum biomasa
Kinetika untuk pertumbuhan mikrobia pembentuk koloni, filamen maupun mobilisasi sel memiliki kinetika pertumbuhan yang lebih kompleks. Tujuan Instruksional khusus Setelah mahasiswa mempelajari pokok bahasan tentang pertumbuhan mikroba dalam
bioreaktor,
maka
mahasiswa
mampu
mengetahui
pertumbuhan
dan
menerapkan sistem pertumbuhan serta kinetikanya pada sistim sekali unduh. continue dan fedbatch culture. Apakah yang dimaksud pertumbuhan untuk mikrobia ? Definisi umum : peningkatan semua komponen di dalarn sel sehingga menghasilkan suatu peningkatan ukuran sel dan pembelahan sel (kecuali rnikrobia yang membentuk filamen) sehingga terjadi peningkatan jumlah individu di dalam populasi. Pertumbuhan mikrobia di dalam bioreaktor : 1. Pertumbuhan individu sel a. Peningkatan substansi dan komponen sel b. Peningkatan ukuran sel c. Pembelahan sel 2. Pertumbuhan populasi a. Peningkatan jumlah akibat pembelahan sel b. Peningkatan aktivitas sel yang melibatkan sintesis ensim Bagaimana mekanisme terjadinya pertumbuhan mikrobia ? Reproduksi sel bakteri: 1.
Pembelahan biner : proses pembelahan sel menjadi dua sel anakan yang mempunyai ukuran hampir sama.
2.
Melibatkan 3 proses: a. Peningkatan ukuran sel (pemanjangan sel): memerlukan pertumbuhan dinding sel, yaitu untuk menutup permukaan pada sisi tertentu.
b. Replika DNA : indikasi pertumbuhan pertu awal pada sel bakteri. c. Pembelahan sel:: diawaIi dia aIi dengan invaginasi lapisan di bagian tengah sel Hampir semua bakteri menerima men DNA. Proses metabolik apa yang terlibat dalam dala pertumbuhan? 1. Transportasi nutrien dari medium ke dalam sel s 2. Konversi bahan ahan nutrien sehingga menjadi tenaga dan konstituen sel 3. Replikasi kromosom 4. Peningkatan ukuran dan masa sel s 5. Pembelahan sel secara biner yang dibarengi dengan pewarisan genetik (genom turunan) ke sel anakan.
KINETIKA PERTUMBUHAN MIKROBIA Pertumbuhan uhan mikrobia (Prokariota) 1. Sel prokariotik membelah secara biner: 1 → 2 → 4 → 8 → 16 → 32 → 64 → n 2. Pembelahan sel dinyatakan sebagai fungsi 2 : 21 22 23 24 25 26 2n 3. Apabila jumlah sel setelah waktu tertentu = Nt maka
Nt = 1 x 2n
Jumlah lah total sel tergantung pada jumlah generasi (pembelahan) yang terjadi didatam waktu tertentu. 4. Apabila jumlah sel awal = N0, jumlah sel dalam populasi dapat dinyatakan se sebagai Nt = N0 x 2n
berikut:
5. Jumlah total sel dalam populasi = Nt yang merupakan fungsi dari 2, dapat lebih mudah diplot dengan nilai logaritmiknya, sehingga diperoleh diperoleh garis eksponensial. Didalam praktek digunakan angka dasar 10 log Nt = log N0 + n Iog2 Kecepatan pembelahan sel : k n/t
→
→
Kecepatan tumbuh suatu bakteri biasanya dinyatakan sebagai jumlah generasi per satuan waktu atau generasi per jam. 6. Waktu generasi (g) adalah waktu yang diperlukan sel didalam suatu populasi untuk membelah diri. Pada umumnya berlangsung konstan dan relative singkat (menit). g = t/n = 1/k
Cara-cara penentuan Pertumbuhan : 1. Menentukan jumlah dalam suatu populasi a. Dengan plating menggunakan medium yang sesuai, diperoleh : jumlah x ml-1 b. Menghitung secara langsung dengan pengecatan sederhana : jumlah x ml-1 2. Mengukur kerapatan/densitas a. Kerapatan optik dengan spektrofotometer (Absorbansi 450-660 nm) b. Berat kering melalui flitrasi kultur dengan filter (0.20 µm) : mg berat kering x ml-1 Beberapa parameter yang harus ditentukan didalam penentuan pertumbuhan kultur : 1. Jumlah generasi (n) 2. Kecepatan membelah sel (jumlah jam-1) 3. Waktu generasi rata-rata (jam) Pengukuran pertumbuhan berdasarkan masa bakteri 1. Secara langsung: a. Biomasa berdasarkan berat kering (gl-1) dengan melalui sentrifugasi b. Aktivitas metabolik atau ensim, melalui analisis :
•
Kandungan N total di dalam kultur dengan teknik mikro Kjeldhal (gl-1)
•
Kandungan C di dalam kultur dengan menggunakan fenol-suifat (gl-1)
•
Kandungan protein dengan metoda Lowry
•
Kandungan asam nukleat
2. Pengukuran pertumbuhan secara tidak langsung berdasarkan aktivitas metabolic : a. Keperluan oksigen untuk pertumbuhan b. CO2 yang dilepaskan dan asam organik yang terbentuk c. Kekeruhan kultur bakteri
Pengukuran parameter pertumbuhan dikerjakan dengan interval waktu sesingkat mungkin sehingga dapat dideteksi pertumbuhan eksponensial. Pengaruh kecepatan pertumbuhan pada fisiologi sel 1. Semakin tinggi kecepatan pertumbuhan semakin tinggi biomasa 2. Semakin tinggi kecepatan pertumbuhan sel-sel menjadi Iebih besar dan mengandung komponen lebih banyak, antara lain: DNA, RNA dan protein 3. Konsentrasi makromolekul meningkat 4. RNA relatif lebih banyak dibanding dengan makromolekul lain, karena ribosom meningkat jumlahnya. 5. Semakin tinggi kecepatan pertumbuhan sel semakin tinggi jumlah DNA Fase-fase pertumbuhan mikrobia 1. Penentuan fase-fase pertumbuhan dapat dikerjakan dengan menumbuhkan kultur bakteri dengan jumlah tertentu ke medium baru. Pertumbuhan dipantau dengan pengukuran konsentrasi sel pada interval waktu tertentu (jam). Perubahan konsentrasi sel pada waktu tertentu dapat diplot menjadi kurva pertumbuhan. 2. Pengukuran pertumbuhan dilakukan dengan menggunakan sistem tertentu, antara lain kultur sekali unduh (batch culture), kultur berkesinambungan (contuous
culture), dan kultur terputus (fed-batch culture). PERTUMBUHAN KULTUR BAKTERI 1. Dengan menggunakan sistem pemeliharaan khusus: a. Kultur sekali unduh (batch culture) b. Kultur berkesinambungan (contuous culture) c. Kultur terputus (fed-batch culture). 2. Memerlukan kultur murni 3. Medium yang tepat 4. Bejana untuk berlangsungnya pertumbuhan yang disebut bioreaktor. Kultur sekali unduh (batch culture) 1. Merupakan sistem tertutup 2. Medium segar yang berupa nutrien dengan jumlah tertentu diinokulasi dengan bakteri yang telah diketahui jumlahnya.
3. Nutrien akan habis dan terjadi akumulasi hasil akhir 4. Untuk mempelajari beberapa parameter pertumbuhan, dan faktor lingkungan yang mempengaruhi pertumbuhan 5. Untuk produksi biomasa, metabolit primer dan metabolit sekunder 6. Kultur akan tumbuh melalui beberapa fase a. Setelah inokulasi terdapat suatu waktu dimana tidak tampak adanya pertumbuhan. Fase tersebut adalah fase lag yang merupakan waktu beradaptasi. b. Di dalam proses komersial lama fase lag diusahakan sependek mungkin, yaitu dengan menyiapkan inokulum yang sesuai dan sehat c. Fase berikutnya terjadi peningkatan kecepatan pertumbuhan, sel tumbuh konstan dan mencapai kecepatan rnaksimurn. Fase ini adalah fase eksponensial. dx/dt = µ x
d. Persamaan untuk fase eksponensial adalah Dimana
x : konsentrasi biomasa mikrobia t : waktu (jam)
µ : kecepatan pertumbuhan spesifik (per jam = jam-1) xt = x0 eµ t
e. Dalam integrasi maka : f.
ln xt = ln x0 + µt
Bila digunakan log normal :
7. Selama fase eksponensial akan dicapai kecepatan pertumbuhan maksimum (µmax). Kecepatan pertumbuhan maksimum sangat spesifik untuk masing-masing jenis mikrobia. Misal aspergillus nidulans mempunyal µmax = 0,36; Methylomonas methyanolytica µmax = 0,53. 8. Mikrobia tumbuh mengkonsumsi makanan dan mengekskresikan hasil akhir. Hasil akhir yang terbentuk dapat mempengaruhi pertumbuhan mikrobia. 9. Suatu
saat
pertumbuhan
akan
berhenti
dan
bahkan
mati.
Berhentinya
pertumbuhan disebabkan karena : a. Kekurangan makanan yang tersedia di dalam medium. b. Terjadi akumulasi produk yang bersifat ototoksik terhadap jasadnya. c. Kombinasi keadaan tersebut diatas. 10. Untuk mengetahui berapa banyak substrat pertumbuhan diperlukan, dapat dilakukan percobaan pertumbuhan mikrobia dengan menggunakan konsentrasi
substrat yang berbeda, hasilnya dapat dinyatakan dalam persamaan sebagai berikut:
x = Y (S0 – St) x : konsentrasi biomasa yang dihasilkan, Y : faktor hasil S0 : konsentrasi substrat awal St : substrat tersisa
11. Penurunan
kecepatan
pertumbuhan
dan
berhentinya
pertumbuhan
yang
disebabkan karena kekurangan substrat, maka dapat diamati hubungan antara µ dan substrat yang tersisa di dalam medium yaitu melalui persamaan Monod (1942) sebagai berikut :
!" #
12. S : konsentrasi substrat tersisa. Ks : konsentrasi substrat ketika µ = ½ µmax K. biasanya digunakan untuk mengukur afinitas atau spesifikasi substrat a. Kalau nilai K rendah artinya bahwa mikrobia tersebut mempunyai afinitas tinggi untuk
substrat
pertumbuhannya
maka
kecepatan
pertumbuhan
tidak
terpengaruh oleh kurangnya substrat b. Kalau nilai K tinggi maka mikrobia tersebut rnempunvai afinitas rendah untuk substratnya,
artinya
kecepatan
pertumbuhan
sangat
dipengaruhi
oleh
konsentrasi substrat yang relatif tinggi. Kecepatan pertumbuhannya rendah. 13. Fase stasioner pada kultur sekali unduh merupakan titik dimana kecepatan pertumbuhan turun menjadi nol. 14. Menurut Bull (1974): fase stasioner merupakan istilah yang salah karena pada fase ini populasi mikrobia tetap aktif melakukan metabolisme dan aktif menghasilkan metabolit sekunder. Maka fase ini dapat dikatakan sebagai fase populasi maksimum. 15. Beberapa contoh metabolit sekunder: Asam giberelat. 16. Berdasarkan tipe produk metabolisme yang dihasilkan selama pertumbuhan, dikenal dua tipe metabolit: a. Metabolit primer (ensim, asam organik dan alkohol) dihasilkan pada fase eksponensial (trofofase). b. Metabolit sekunder yang dihasilkan selama fase stasioner atau fase idiofase. 17. Kinetika pembentukan hasil akhir (produk) oleh kultur mikrobia yang dihubungkan dengan pertumbuhan:
dp/dt = qpx ……..(1)
p : konsentrasi produk qp : kecepatan spesifik pembentukan produk
18. Hubungan antara pembentukan produk dan produksi biomasa, dapat dinyatakan persamaan : dp/dx = Yp/x Yp/x : produk yang dihasilkan setelah mengkonsumsi substrat 19. KaIau dp/dx = Yp/x dikalikan dx/dt = µx → dp/dt = Yp/x . µx ……..(2) 20. Gabungan antara (1) dan (2) : qp = Yp/x . µ 21. Persamaan di atas dapat dilihat bahwa kecepatan pertumbuhan erat hubungannya dengan kecepatan spesifik pembentukan produk. Persyaratan yang harus diperhatikan di dalam kultur sekali unduh : a. Kondisi kultur harus steril sehingga tercapai produksi biomasa yang maksimum b. Memperpendek
fase
lag
dan
memperpanjang
waktu
eksponensial
:
diaplikasikan untuk produksi metabolit primer. c. Memperpendek fase eksponensial : digunakan untuk produksi metabolit sekunder. d. Fermentasi sekali unduh telah digunakan untuk :
•
Produksi biomasa : kondisi kultur yang mendukung populasi sel maksimum
•
Produksi metabolit sekunder : memerlukan kondisi untuk mempercepat tercapainva fase stasioner.
Kultur berkesinambungan (cotinuous culture) 1. Penambahan media baru untuk memperpanjang fase eksponensial 2. Penambahan substrat yang terus menerus dengan kecepatan alir tertentu sehingga mencapai keadaan tunak steady state yang artinya pembentukan sel seimbang dengan terlepasnya sel keluar fermentor. 3. Alat turhidostat : sistem yang dilengkapi dengan pengukur turbiditas, signal listrik yang digunakan untuk mengatur aliran media segar kedalam bejana fermentasi. 4. Aliran medium masuk ke dalam fermentor secara berkesinambungan dengan kecepatan tertentu, maka segera tercapai keadaan tunak (steady state), yaitu keadaan dimana pembentukan biomasa baru seimbang dengan hilangnya sel-sel yang keluar fermentor. Aliran medium tersebut erat hubungannya dengan volume fermentor, sehingga menimbulkan kecepatan pengenceran (D) :
D=F/V
F : kecepatan alir V : isi fermentor D : kecepatan alir medium 5. Alat kemostat: alat yang digunakan untuk mengukur pertumbuhan yang dilengkapi dengan bejana penyimpan media, dialirkan dengan kecepatan tertentu, sehingga
tidak terjadi akumulasi hasil akhir. Bahkan kemungkinan terjadi pengenceran dan menyebabkan sel terbuang keluar (washed out). Kecepatan pertumbuhan populasi bakteri di dalam kemostat dapat diformulasikan sebagai berikut : $% = $&
pertumbuhan – yang keluar
dx/dt = µX - DX
dx/dt = X (µ- D) ……….(3)
D : kecepatan pengenceran Pada kondisi tunak (steady state): dx/dt = 0
µX = DX atau µ = D
Kecepatan terlepasnya sel (washed out) sama dengan kecepatan pertumbuhan, maka kecepatan pengenceran sama dengan kecepatan tumbuh sel yang ada di dalam kemostat. Hubungan antara waktu generasi dan konsentrasi substrat pembatas pertumbuhan :
µ = µmax.s/Ks + s digabungkan dengan persamaan (3)
%$$&
= X'
() *+ , -. #,
/ 01………………..(4)
µ
: waktu generasi kultur
µmax
: kecepatan pertumbuhan maksimal
s
: konsentrasi substrat
Ks
: konstanta konsentrasi substrat pada µ = 3 µmax
2
Apabila dihubungkan dengan sisa konsentrasi substrat yang dikonsumsi, maka : dS/dt = substrat yang masuk - substrat yang keluar - substrat yang dikonsumsi sel dS/dt = Dsa - DS - µmax. x/Y (S/Ks + s) ……………….(5) Pada keadaan tunak ; ds/dt atau dx/dt = 0. maka persamaan (4) dan (5) menjadi: S' = Ks D / (µmax – D) S' = konsentrasi sisa substrat X = konsentrasi sel pada kondisi tunak X = Y(S0 - S') Kelebihan kultur berkesinambungan: a. Keseragaman didalam operasionalnya yang berkaitan dengan produktivitas b. mudah dikerjakan dengan otomatik c. mudah terkontaminasi Kultur terputus (Fed-batch culture) 1. Kultur berkesinambungan terputus adalah sekali unduh yang diberi tambahan makanan secara terus menerus tetapi pengurangan cairan kultur
2. Terjadi peningkatan volume :
Xt = X0 + Y(S0 – St)
3. Konsentrasi biomasa akhir yang diproduksi dimana St = 0 maka X0 adalah lebih kecil dari Xmax :
Xmax = Y S0
Pada keadaan X = Xmax maka segera medium segar ditambahkan sehingga: D < Xmax
D = F/(V + Ft)
4. Aplikasi kultur berkesinambungan terputus : a. untuk memelihara kultur aerobic b. untuk menghindarkan kultur dari pengaruh substansi yang toksik di dalam medium Latihan soal untuk pertumbuhan 1. Selama pertumbuhan bakteri dalam kultur sekali unduh, biomasa meningkat dari 2,1 mg berat kering sel per ml dalam waktu 15 menit. Hitung kecepatan tumbuh spesifik bakteri tersebut dan waktu bergandanya! Asumsi apa saja yang harus anda kerjakan untuk menghitung parameter pertumbuhan? 2. Pertumbuhan eksponensial menyebabkan populasi bakteri meningkat dari 4 x 108 sel per ml menjadi 6,25 x 108 sel per ml dalam waktu 30 menit. 1012 sel ekivalen dengan 2,5 x berat kering sel. Berapa kecepatan tumbuh dan waktu berganda kultur tersebut ? 3. Medium segar dialirkan secara kontinyu ke dalam kemostat (V = 3,250 L) dengan kecepatan 15 ml per menit. Berapa kecepatan pengenceran yang terjadi di dalam kemostat tersebut dan berapa waktu tinggal dan waktu berganda kultur pada kondisi tersebut ? 4. Pseudomonas sp ditumbuhkan di dalam kemostat dengan glukosa sebagai substrat pembatas pertumbuhannya (So = 10 gl-1). Buatlah plot secara teori bakteri tersebut dalam keadaan tunak (steady state). Hitung berapa kecepatan pengencerannya ! Berapa nilai produktivitasnya apabila µmax = 1 per jam; Ks = 0,1 gl-1; Y = 0,5 g berat kering per g substrat !
