Pokok Bahasan II : PERLENGKAPAN DAN PERALATAN TEKNIS KULTUR JARINGAN
Pendahuluan Teknik kultur jaringan (kultur in vitro) mensyaratkan kondisi steril baik ruang, peralatan, bahan maupun seluruh rangkaian kerjanya. Hal ini disebabkan karena pertumbuhan eksplan didalam kultur harus selalu dalam kondisi aseptis. Untuk itu semua tahapan pelaksanaan teknik kultur in vitro harus dilaksanakan didalam laboratorium dan harus ditunjang oleh organisasi serta perlengkapan laboratorium yang memadai serta tata cara kerja yang teliti dari si peneliti. Laboratorium tidak harus dibangun baru, ruang-ruang didalam laboratorium yang sudah ada dapat direnovasi untuk keperluan kultur jaringan, namun demikian pendirian laboratorium baru merupakan langkah yang terbaik. Laboratorium sebaiknya mempunyai pembagian ruangan yang diatur sedemikian rupa sehingga tiap kegiatan terpisah satu dengan yang lainnya, tetapi masih dapat saling berhubungan dan mudah dicapai. Dalam bab ini akan diuraikan skema umum laboratorium kultur jaringan, prinsip dan fungsi ruang serta peralatan yang ada didalamnya.
Tujuan Instruksional Khusus: Setelah mengikuti kuliah ini diharapkan mahasiswa akan dapat menjelaskan dan menggambarkan skema umum laboratorium kultur jaringan, prinsip, fungsi ruang serta peralatan yang ada didalamnya.
Subpokok bahasan : Laboratorium Kultur Jaringan
Pendahuluan Laboratorium yang baik untuk pekerjaan teknik kultur jaringan harus memenuhi kriteria aman, bersih, memiliki organisasi dan penataan ruang yang sesuai. Lokasi dari laboratorium itu sendiri sebaiknya jauh dari lingkungan pabrik atau bengkel yang sering menimbulkan polusi. Kondisi bagian dalam laboratorium mutlak harus bersih, mulai dari lantai, dinding, meja, alat-alat yang digunakan, maupun udara diruangan laboratorium tersebut. Harus diusahakan semaksimal mungkin bebas dari debu, karena debu adalah sumber kontaminan yang paling potensial. Yang tidak menguntungkan adalah bahwa negara kita terletak didaerah beriklim tropis, debu-debu begitu banyak mendominasi ruangan udara disekitar kita sehingga sulit untuk dihindari. Oleh karena itu sebagai upaya pembuatan laboratorium bebas debu, kita harus merancang laboratorium yang tertutup rapat tanpa ada ventilasi. Jendela-jendela dibuat permanen dari kaca (tidak bisa dibuka). Didalam ruangan diberi pengatur udara (AC) untuk mempertahankan suhunya konstan (25-28)°C, dan dipasang exhauster untuk menyedot debu yang ada didalam ruangan. Lantai laboratorium juga harus dibersihkan secara rutin dengan antiseptik, meja dan dinding juga harus dibersihkan dengan larutan antiseptik umumnya permukaan meja dan dinding dilapisi dengan porselin supaya kedap air dan mudah dibersihkan. Ruangan didalam laboratorium harus dijaga tetap bersih dan bebas dari debu, hewan kecil dan insek. Setiap orang yang akan masuk laboratorium harus melepas sepatunya dan menggantinya dengan alas kaki yang ada didalam laboratorium dan harus mengenakan jas praktikum. Kebersihan laboratorium secara umum sangat menentukan keberhasilan kerja kultur jaringan. Sarana dasar seperti aliran listrik, air yang cukup dan gas harus dipunyai.
Materi subpokok bahasan Pelaksanaan kerja kultur jaringan tumbuhan memiliki tahapan-tahapan dan urutan kerja yang khusus. Oleh karena itu laboratorium harus diatur sedemikian rupa sehingga ada tingkatan sterilitas ruangan sesuai dengan tahapan kerja tadi, termasuk alur keluar-masuknya pekerja didalam laboratorium tersebut. Tahapan-tahapan kerja didalam laboratorium kultur jaringan dibagi
dalam 4 kelompok yaitu: 1. Persiapan. Merupakan tahap awal kerja kultur jaringan, dimulai dari penyiapan tanaman sebagai sumber eksplan yang ditanam di green house, kemudian menyiapkan alat-alat, botol-botol kultur dan pembuatan medium (meracik, merebus dan membaginya kedalam botol-botol sampai pada sterilisasi).
2. Inokulasi. Inokulasi meliputi sterilisasi, pengambilan/pengirisan bagian tanaman yang akan dijadikan sebagai eksplan, kemudian menanamnya didalam atau diatas medium buatan yang telah disediakan. Untuk inokulasi eksplan ini diperlukan kondisi yang absolut steril.
3. Pemeliharaan. Setelah diinokulasi, botol kultur diletakkan di rak-rak pemeliharaan di ruang inkubator untuk diikuti pertumbuhan dan perkembangannya sampai menjadi plantlet. Untuk pemeliharaan tersebut dibutuhkan ruang yang tidak perlu steril tetapi harus bersih, dengan pengatur suhu (25-28)°C, dan pencahayaan dengan lampu TL (1000-3000) lux.
4. Aklimatisasi. Aklimatisasi merupakan proses penyesuaian/adaptasi plantlet dari kondisi heterotrof didalam botol kultur menjadi autotrof yang dapat ditanam pada kondisi alamiahnya ditanah. Proses aklimatisasi dilaksanakan didalam green house dengan memberikan perlakuan kelembaban, intensitas cahaya dan temperatur. Setelah melampauai masa aklimatisasi, tanaman dapat dibawa keluar dari green house untuk ditanam dilapangan.
Masing-masing tahapan pekerjaan tersebut harus terpisah satu dengan lainnya dan dengan menggunakan peralatan tersendiri. Berdasarkan adanya urutan tahapan kerja seperti tersebut diatas, maka dasar penataan ruang laboratorium adalah urutan kegiatan dan sterilitas ruangan. Oleh karena itu pembagian ruangan laboratorium yang baik meliputi
1. Ruang persiapan. 2. Ruang transfer (inokulasi) atau ruang steril. 3. Ruang kultur (inkubator dan ruang plantlet) 4. Ruang aklimatisasi
Ruang persiapan Ruangan ini dipergunakan sebagai tempat untuk mempersiapkan eksplan, medium dan alat-alat. Ruang persiapan biasanya dibagi menjadi berberapa ruangan kecil yang dipergunakan untuk menyimpan medium dan alatalat yang sudali steril, untuk menyimpan alat-alat gelas, bahan-bahan kimia dan pembuatan medium (ruang timbang), dan ruangan untuk mencuci. Persiapan eksplan yang dilakukan meliputi pencucian, pemotongan/pembuangan bagianbagian tanaman yang tidak dipergunakan serta perlakuan awal untuk mengurangi kontaminan yang ada dipermukaan tanaman. Persiapan medium meliputi penimbangan bahan kimia medium, pengenceran medium, penuangan kedalam wadah kultur dan sterilisasi. Sesuai dengan fungsinya, fasilitas yang dibutuhkan didalam ruangan ini adalah meja tempat meletakkan alat-alat pemanas, meja untuk alat-alat timbang, meja untuk bekerja dan tempat mencuci, semua meja adalah kongkrit (statis dari beton) dan beralas porselin. Peralatan yang diletakkan didalam ruangan ini terdiri dari: 1. Oven 2. Magnetic stirrer dengan atau tanpa pemanas 3. Alat-alat gelas standard: labu takar berbagai ukuran pipet pasteur erlenmeyer berbagai ukuran gelas piala pengaduk gelas wadali kultur : botol, tabung reaksi, cawan petri 4. Lemari alat-alat gelas 5. Alat-alat untuk mencuci 6. Rak-rak pengering 7. Alat-alat diseksi: spatula, pisau, scalpel, pinset, glinting, cutter 8. Borrer berbagai ukuran
9. Blender 10. Bidistilling water 11. Agar dispenser 12. Kompor gas 13. Autoclave 14. Lampu bunsen dengan kaki tiga 15. Kereta (cart) untuk memindahkan alat-alat dan media keruang lain 16. Growth chamber, untuk praperlakuan dingin pada tanaman berbunga, khususnya yang akan dipergunakan untuk kultur mikrospora.
Ruang timbang Ruangan ini dipergunakan untuk tempat menyimpan bahan-bahan kimia medium dan mempersiapkan medium kultur. Persiapan medium kultur meliputi penimbangan bahan kimia medium, pengenceran larutan stok, membagi-bagi dalam botol kultur dan sterilisasi. Ruang timbang berhubungan langsung dengan ruang persiapan. Fasilitas yang diperlukan dalam ruangan ini adalah meja kerja dan meja untuk alat-alat timbang beralas porselin. Peralatan yang diletakkan diruangan ini terdiri dari : 1. Timbangan analitik 2. Lemari es dan freezer untuk menyimpan larutan stok 3. Hot plate dengan magnetik stirrer 4. Bunsen dengan kaki tiga 5. pH meter 6. Lemari bahan kimia dana alat-alat (aluminum foil, kertas timbang, kertas saring dsb) 7. Hood tempat penimbangan bahan-bahan kimia yang karsinogenik 8. Blender / homogenizer
Ruang stok Ruang stok dipergunakan untuk menyimpan alat-alat steril dan medium yang sudah jadi (steril). Didalam pelaksanaan teknik kultur jaringan, sebelum penanaman eksplan maupun subkultur dilakukan, medium kultur harus sudah disiapkan minimum tiga hari sebelum diperlukan. Medium yang sudah jadi harus disimpan didalam ruangan yang dingin dan gelap. Fasilitas yang diperlukan
diruangan ini berupa meja kerja beralas porselin. Ruang stok harus berhubungan langsung 2 arah, satu arah dengan ruang persiapan (setelah media disterilisasi diruang persiapan, dapat langsung dibawa keruangan ini) dan arah yang lain dengan ruang transfer atau ruang steril, ruangan ini meskipun tidak harus steril tetapi kebersihannya harus tetap terjaga. Alat-alat yang terdapat diruangan ini meliputi: 1. Kereta dorong 2. Rak-rak untuk meletakkan medium steril 3. Oven untuk menyimpan alat-alat steril.
Ruang steril / transfer Ruang transfer merupakan ruangan dimana semua kegiatan aseptis dimulai. Kegiatan yang dilakukan meliputi : sterilisasi, isolasi bagian-bagian tanaman dan penanaman eksplan dalam medium. Kegiatan subkultur, sterilisasi medium dengan ultrafiltrasi juga dilakukan diruangan ini. Ruangan ini mutlak harus steril, sehingga sedapat mungkin bebas dari debu dan hewan kecil, dinding ruangan dilapis porselin atau bahan lain yang kedap air dan mudah dibersihkan. Ruangan ini juga dilengkapi dengan tempat cuci tangan sehingga memudahkan petugas yang akan memulai dengan pekerjaan aseptis, pengatur suhu (AC), lampu Ultra Violet dan lampu TL biasa. Ruang transfer harus terisolir sedemikian rupa tetapi masih dapat berhubungan dengan ruang stok, ruang inkubasi dan ruang mikroskop. Pintu penghubung harus selalu dalam keadaan tertutup. Ruang transfer dilengkapi dengan alat-alat sebagai berikut: 1. Laminar air flow cabinet, peralatan utama untuk melakukan pekerjaan aseptis 2. Dissecting microscope 3. Cart yang selalu disemprot dengan alkohol 70% 4. Alat-alat diseksi: scalpel, pinset, spatula, gunting, jarum 5. Millipore filter 6. Syrink 7. Hand sprayer untuk alcohol 8. Tempat alcohol 9. Bunsen burner/lampu alkohol/bacticinerator 10. Meja beralas kaca/formica dengan laci untuk menyimpan alat-alat steril,
kapas dan alcohol 11. Entkas 12. Timbangan kecil 13. Electrofusion chamber 14. Vacumpump 15. Centrifuge, untuk proses isolasi protoplas
Ruang inkubasi/kultur Ruang kultur merupakan ruang besar dengar kemungkinan perluasan bila diperlukan. Kebersihannya harus diperhatikan dan sedapat mungkn dihindari terlalu banyak keluar masuknya orang-orang yang tidak berkepentingan. Ruangan ini dipergunakan untuk memelihara eksplan yang telah ditanam pada medium secara aseptis. Kultur yang telah lumbuh dan memperbanyak diri, secara teratur harus disubkultur. Tergantung dari jenis eksplan dan tipe kultur, subkultur dilakukan setiap 3-6 minggu sekali, hal ini berarti tiap bulan ada pelipatan jumlah kultur. Botol-botol kultur diatur dengan menempatkannya pada rak-rak terbuka yang bertingkat (3-4 tingkat) dengan lampu fluorescent, jarak tiap tingkat 40-50 cm. Jarak antara rak harus diatur sedemikian rupa sehingga memudahkan lalulintas pemeriksa kultur. Didalam ruang kultur, lingkungan fisik diatur sedemikian rupa sehingga mendukung pertumbuhan yang optimal, untuk itu perlu ada pengaturan terhadap suhu dan cahaya. Unsur-unsur dan cahaya yang perlu diperhatikan adalah kualitas, lama penyinaran dan intensitas cahaya.
Kualitas cahaya Cahaya putih merupakan cahaya yang baik untuk pertumbuhan kultur. Lampu fluorescent (neon/TL) biasa digunakan sebagai sumber cahaya dalam ruang kultur. Keseimbangan spektrum lampu fluorescent sangat baik dan efisien dalam penggunaan energi bila dibandingkan dengan lampu pijar. Bentuk lampu memungkinkan penyebaran cahaya yang baik, dengan panas yang dikeluarkan relatip rendah, bila transformer dapat diletakkan diluar ruang kultur. Pada lampu pijar hampir 90% merupakan energi panas sehingga mempengaruhi temperatur temperatur ruangan. Pada ruang kultur juga dapat diberikan campuran lampu pijar dan fluorescent secara bersamaan.
Intensitas cahaya Intensitas cahaya yang baik dari lampu fluorescent adalah antara 100-400 foot candel (1000-4000 lux). Intensitas cahaya diatur dengan menempatkan sejumlah lampu dengan kekuatan tertentu pada jarak antara 40-50 cm dari tabung kultur pada luas area tertentu.
Lama penyinaran Seberapa lama cahaya harus diberikan pada eksplan sehingga berpengaruh positip terhadap pertumbuhannya, sangat tergantung dari jenis tanaman dan respon yang diinginkan. Untuk proses morfogenesis, umumya diperlukan pencahayaan terus menerus, sebaliknya untuk induksi kalus umumnya tidak memerlukan pencahayaan. Sedangkan untuk pertumbuhan plantlet, yang segera akan dilakukan aklimatisasi, umumnya memerlukan periode penyinaran selama 14-16 jam. Panjang penyinaran diatur dengan alat automatic timer switch atau timer.
Temperatur Temperatur didalam ruang kultur yang baik adalah pada suhu normal yaitu antara 25-28° C. Pengaturan suhu dilakukan dengan menggunakan AC, karena ruang kultur merupakan ruang tertutup yang sedikit sekali mempunyai aliran udara bebas. Beberapa perlakuan khusus kadang-kadang memerlukan suhu rendah (18-20°C), sehingga diperlukan adanya growth chamber yang dapat diatur suhu dan pencahayaannya. Alat-alat yang diperlukan didalam ruang kultur adalah: 1. Rak-rak kultur 3-4 tingkat dengan lampu fluorescent, jarak tiap tingkat 4050 cm. 2. Timer untuk mengatur lama penyinaran 3. AC untuk mengontrol suhu ruangan 4. Binocular microscope dan loupe/kaca pembesar 5. Tangga aluminium untuk melihat kultur di rak yang tinggi 6. Shaker, untuk inkubasi kultur dengan medium cair
Ruang mikroskop Ruangan ini dipergunakan untuk pengamatan dan analisa selama kultur berjalan, reaksi suatu kultur dalam media perlakuan sering diikuti sejak awal inisiasi. Untuk membedakan morfologi eksplan atau struktur internal pada kultur mikrospora, sel dan protoplas yang terjadi pada awal perkembangannya, diperlukan bantuan mikroskop. Untuk keperluan tersebut dipergunakan binocular mikroskop (stereoscope), inverted microscope, fluorescent microscope, yang dilengkapi dengan peralatan untuk fotografi. Penelitian-penelitian yang lebih canggih seperti fusi protoplas, micro-injection DNA atau organel kedalam sel atau protoplas, memerlukan mikroskop dengan mikro-manipulator. Ruangan ini harus senantiasa kering/tidak lembab dan bersih, untuk pengoperasian fluorescent microscope, diperlukan ruangan yang gelap total. Meja kongkrit (dari beton) untuk tempat meletakkan mikroskop diperlukan didalam ruangan ini. Alat-alat yang terdapat didalam ruangan ini adalah: 1. Inverted microscope 2. Stereoscope 3. Student microscope 4. Fluorescent microscope 5. Micro-manipulator 6. Alat-alat fotografi 7. Alat-alat untuk pengamatan sitologis, misalnya gelas preparat dan penutup, jarum, microtome dsb.
Gambar 2.1. Skema umum laboratorium Kultur Jaringan
R1. Ruang Persiapan
R4. Ruang Steril/transfer
R7. Ruang Administrasi
R2. Ruang Timbang
R5. Ruang Mikroskop
R8. Ruang cuci
R3. Ruang Stok
R6. Ruang Inkubator
Latihan soal-soal. 1. Jelaskan persyaratan umum laboratorium yang dapat dipergunakan untuk melaksanakan pekerjaan kultur jaringan! 2. Apa yang menjadi dasar pembagian ruang-ruang didalam laboratorium? 3. Jika kita ingin merenovasi laboratorium yang sudah ada, bagaimana saudara merancang ruang-ruang didalam laboratorium agar dapat mengurangi masalah kontaminasi! 4. Jelaskan mengapa ruang transfer harus terisolir dari ruang-ruang yang lain!, sebutkan peralatan apa saja yang harus ada didalam ruangan ini!. 5. Gambarkan skema umum laboratorium kultur jaringan!
Perunjuk jawaban latihan soal-soal 1. Ingat tahapan pekerjaan didalam kultur jaringan! 2. Ingat alur pekerjaan kultur jaringan! 3. Ingat fungsi setiap ruang! 4. Ingat prinsip pekerjaan aseptis dan peralatan yang digunakan! 5. Ingat alur kerja dan tahapan pekerjaan didalam kultur jaringan!
Ringkasan Didalam kultur jaringan, pertumbuhan eksplan harus dalam lingkungan aseptik dan terkendali. Implikasi dari keadaan ini adalah bahwa setiap tahapan dalam pelaksanaannya harus dilakukan didalam laboratorium. Laboratorium kultur jaringan dirancang sedemikian rupa mengikuti alur pekerjaan aseptis, sehingga setiap kegiatan dilakukan didalam ruangan secara terpisah, namun masih dapat saling berhubungan satu sama lain. Setiap ruangan dirancang sesuai dengan kebutuhan dan peralatan yang ada disetiap ruangan juga disesuaikan dengan kegiatan yang dilakukan.
Tes Formatif 2 1. Laboratorium Kultur jaringan dirancang sesuai dengan alur kegiatan aseptis, lokasi Laboratorium sebaiknya ditempat yang: a. Aman b. Sejuk c. Dekat pabrik
d. Pinggir jalan raya 2. Alur pekerjaaan didalam kultur jaringan meliputi persiapan eksplan, inokulasi, pemeliharaan dan aklimatisasi, pekerjaan utama yang absolut steril dilaksanakan di ruang: a. Persiapan b. Inkubator c. Transfer d. stok 3. Peralatan utama yang terdapat didalam ruang steril adalah: a. Laminar air Flow cabinet b. Bidistiling water c. Oven d. Autoclave 4. Ruang transfer harus mutlak steril, untuk itu sterilisasi ruangan tersebut dilakukan dengan menggunakan: a. Laminar Air Flow cabinet b. Lampu Ultra violet c. Autoclave d. AC 5. Medium kultur jaringan dibuat dengan meracik setiap komponen yang tertera didalam resep, preparasi media dapat dilakukan di ruang yang tersebut dibawah ini, kecuali: a. Ruang timbang b. Ruang persiapan c. Ruang stok d. Ruang steril
Kunci jawaban Tes Formatif 2 1. a dan b, 2. c, 3. a, 4. b, 5. c
