Ph.D. tézisek
A lizil oxidáz (LOX) és a lizil oxidáz-szerő fehérje 2 (LOXL2) enzimek szerepe epiteliális és neuroepiteliális eredető daganatok progressziójában
Hollósi Péter
Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Doktori Iskola I.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet Budapest 2009 Témavezetık: Kovalszky Ilona, D.Sc., M.D., Ph.D. Csiszár Katalin, Ph.D. Sheri Fumiko Tsuda Fong, M.D., Ph.D. Bíráló bizottság: Sasvári Mária, D.Sc. M.D. Ph.D., elnök Deák Ferenc, D.Sc. Ph.D., hivatalos bíráló Lotz Gábor, M.D. Ph.D., hivatalos bíráló Döme Balázs, M.D. Ph.D., bizottsági tag Firneisz Gábor, M.D. Ph.D., bizottsági tag
1. Bevezetı A
sejtközötti
állomány
daganatos
megbetegedések
kialakulásában és progressziójában játszott szerepét számtalan tanulmány vizsgálja, melyek az egyes sztrómális komponensek összetételét modulálva annak mind tumornövekedést elısegítı mind tumornövekedést gátló szerepét azonosították. Egyéb faktorokkal egyetemben, a lizil oxidáz enzimcsalád tagjaira egyre nagyobb figyelem irányul ebben a tekintetben is. A szekretált és aktív lizil oxidázok katalitikus tevékenységük révén az extracelluláris mátrix bizonyos strukturális fehérjéinek lizin oldalláncait oxidatívan deaminálják, majd az így képzıdı reaktívabb aldehid oldalláncok egymással spontán reakcióba lépve a molekulán belül illetve molekulák közt kovalens keresztkötéseket alakítanak ki, mely folyamat révén a mátrix egy keményebb, kevésbé rugalmas közeggé válik. A rugalmatlan mátrix több kutatócsoport eredményei szerint is feltétlenül befolyásolja a daganat progresszióját. A reakció melléktermékeként felszabaduló hidrogén-peroxid potenciálisan szintén befolyásolhatja a daganat viselkedését. A lizil oxidázok funkciója normál, egészséges szövetekben jól ismert, ezzel szemben újabban számos közlemény számol be – gyakran egymásnak látszólag ellentmondó eredményekkel – a lizil oxidáz enzimcsalád egyes tagjainak különbözı daganattípusokban betöltött fontos szerepérıl.
2
2. Célkitőzések
Kísérleteinkben a LOX és LOXL2 enzimek szerepét vizsgáltuk különbözı egészséges és malignus transzformáción átesett szöveteken és sejteken. A vizsgált mintákban észlelt különbözı fokú LOX
és
LOXL2
termelıdés
okát
keresve
epigenetikus
géncsendesítési folyamatokat azonosítottunk. Ezen túlmenıen, az enzimek jelenlétének és aktivitásának funkcionális következményeit vizsgáltuk, különösen a LOXL2 túltermelés hatására bekövetkezett sejtmorfológiai változások okaira összpontosítva. Általánosságban elmondhatjuk,
hogy a
daganat-prevenció
potenciális
molekuláris
és
célpontokat
terápia
céljára
azonosítottunk,
tanulmányainkkal tovább vizsgáltuk ezt a már bizonyos részleteiben tisztázott, más részleteiben hiányos problémakört.
Célkitőzéseink a következık voltak: -
A LOX termelıdés jellemzése a központi idegrendszerben és neuroepiteliális tumorokban.
-
A
LOX
asztrocitóma
tumorprogresszióban
betöltött
szerepének vizsgálata. -
A LOXL2 termelıdés vizsgálata egészséges és tumoros vastagbél és nyelıcsı szövetekben.
-
A
LOXL2
génexpressziót
szabályzó
azonosítása vastagbél és nyelıcsı daganatokban.
3
folyamatok
-
A LOXL2 termelıdés jellemzése egészséges és tumoros emlı epitéliumban.
-
A LOXL2 túltermelés hatásainak vizsgálata egészséges és tumoros emlı epiteliális sejtekben.
-
A
LOXL2
génexpressziót
szabályzó
folyamatok
azonosítása emlı epiteliális sejtekben.
3.
Anyagok és módszerek
Kísérleteinkhez NHA, U87 MG, U251 MG, U343 MG-A, HCT-116, DLD-1, HCT-15, WHCO1, WHCO3, WHCO5, WHCO6, HMEC, MCF-10A, MCF-7, T-47D, MDA-MB-231 in vitro sejttenyészeteket használtunk. Az immunhisztokémiai analízisekhez formalinnal fixált, parafinba ágyazott normál agy, nyelıcsı, vastagbél, emlı, illetve asztrocitóma, vastagbél adenokarcinóma, nyelıcsı laphámrák és infiltráló lobuláris emlı adenokarcinóma szöveti
metszeteket
használtunk.
A
sejtek
morfológiájának
monitorozására fáziskontraszt mikroszkópot, míg a fehérjeexpresszió lokalizálására konfokális lézermikroszkópot használtunk. Emlı epiteliális sejtekben egy lentivíruson alapuló expressziós rendszer segítségével LOXL2-t stabilan túltermeltettünk. A termelıdı fehérjemennyiség kvantitálására Western blot és kvantitatív real time PCR technikákat alkalmaztunk. A sejtek in vitro migrációs képességét
egy
kollaborációban
kifejlesztett
MICS
sejtmigrációs/inváziós kamra segítségével mértük fel. A lizil oxidáz
4
reakció in vitro detektálására egy kadaverin subsztráttal mőködı módszert használtunk, melynek lényege a melléktermékként keletkezı hidrogén-peroxid detektálása. Online elérhetı adatbázisok és programok (NCBI Nucleotide Search, GrailEXP CpG Island Locator) segítségével a loxl2 gén promóter régióját vizsgáltuk. Promóter demetiláló (5-aza-dC) és hiszton deacetilázokat gátló (trichostatin
A)
kezelésekkel
epigenetikus
géncsendesítési
folyamatok aktivitási fokát mértük.
4. Eredmények
Kísérleteink megkezdésekor sem a LOX, sem a LOXL2 fehérjére specifikus ellenanyag nem volt kereskedelmi forgalomban, ezért magunk terveztünk antitesteket, gyártattuk le ıket és specificitásukat igazoltuk. A késıbbiekben ezeket a nyúlban termeltetett
poliklonális
immuncitokémiai,
ellenanyagokat
immunhisztokémiai
és
használtuk Western
blot
kísérletekben. Szöveti bebizonyítottuk,
mintákat hogy
és
normál
sejtvonalakat és
malignusan
használva transzformált
asztrociták LOX enzimet termelnek. A LOX termelés intenzitása pozitív összefüggést mutatott a malignus asztrocitóma tumor grádusával. Az asztrociták által termelt LOX-ról megmutattuk, hogy katalitikusan aktív. A magas grádusú asztrocitóma tumorokból származó sejtvonalakban a megemelkedett szinten termelıdı LOX fokozta a sejtek migrációs képességét, mely hatás ellensúlyozható
5
volt mind specifikus LOX gátlószer (béta-amino-propionitril) kezeléssel, mind a termelıdı hidrogén peroxid eliminálásával (kataláz kezelés). A termelıdı hidrogén-peroxid megemelkedett FAK(Tyr576) és paxillin(Tyr118) foszforilációt okozott, melyek szükséges feltételei a sejtmigrációban elengedhetetlen fokális adhéziók kialakulásának. Vastagbél és nyelıcsı szöveti minták immunhisztokémiai analízise révén beláttuk, hogy a malignus transzformáción átesett szövetekben több sejt termel LOXL2-t, mint a normál szövetekben. Ez
az
emelkedett
fokú
LOXL2
termelıdés
statisztikailag
szignifikáns mértékben pozitív összefüggésben állt a vastagbél adenokarcinóma tumorok grádusával. Mindkét szövettípus esetén bár több sejt, de némely esetben alacsonyabb szinten termelt LOXL2-t, melynek hátterében a heterozigótaság elvesztését feltételeztük. Valóban,
mindkét
tumortípus
esetén
körülbelül
a
minták
egyharmadában a loxl2 gént is érintı deléciót tapasztaltunk. Ezen felül alacsony grádusú vastagbél-tumorokból származó sejtekben aktív
promóter
hipermetilációt
és
hiszton
deacetilációt
azonosítottunk, melyek következményeként a kevésbé agresszív daganattípus kevesebb LOXL2-t termel. Egy következı kísérletsorozatban bemutattuk, hogy az emlı epiteliális sejtek által termelt LOXL2 katalitikusan aktív, és hogy a LOXL2 túltermelés csak a malignus transzformáción átesett emlı epiteliális sejtekben indukál sejtmigrációs képesség növekedést, míg normál emlı epiteliális sejtekben nem. A jelenség hátterében feltételezésünk szerint egy megváltozott extracelluláris fehérjeérési
6
folyamat rejlik, hiszen az eddig ismeretlen 50 kDa-os LOXL2 fragmentum csak a normál sejtekbıl volt detektálható. Tudható, hogy míg a normál emlı epitélium nagy mennyiségő LOXL2-t termel, a neminvazív emlı adenokarcinóma sejtek alig termelnek LOXL2-t. Ennek a jelenségnek a hátterében szintén epigenetikus géncsendesítési folyamatokat tártunk fel.
5. Következtetések
A
LOX
és
adenokarcinóma, szövetekben
LOXL2 nyelıcsı
betöltött
enzimek
asztrocitóma,
laphámrák
szerepének
és
vastagbél
emlı
karcinóma
megismerésére
vonatkozó
kísérleteink eredményeit a következı pontokban foglaljuk össze: -
A LOX termelés mértéke pozitív összefüggésben áll az asztrocitómák tumor grádusával.
-
Enzimatikusan aktív LOX sejtmigrációt indukál, melynek hátterében a fokális adhézió egyes komponenseinek a katalizált reakció melléktermékeként termelıdı hidrogénperoxid általi aktiválódása lehet a felelıs.
-
Vastagbél adenokarcinómákban és nyelıcsı laphámrákban megemelkedett LOXL2 termelıdés detektálható, mely a vastagbéldaganatok esetében statisztikailag szignifikáns mértékben pozitívan korrelál a tumorgrádussal.
-
A loxl2 lókuszát érintı heterozigótaság elvesztése mind vastagbél adenokarcinóma, mind nyelıcsı laphámrák szövetminták egyharmadában detektálható.
7
-
A nem-invazív emlıkarcinóma sejtekben tapasztalható alacsony szintő LOXL2 expresszió – legalább is részben – epigenetikus géncsendesítés eredménye.
-
Magas szintő LOXL2 termelés a normál emlı epiteliális sejtekben nem, de transzformált emlı epiteliális sejtekben fokozza a sejtmigrációs képességet, melynek hátterében feltételezhetıen eltérı extracelluláris fehérjeérési folyamatok állhatnak.
6. Publikációs lista
Közlemények az értekezés témájában: Hollosi P, Yakushiji J, Fong KS, Csiszar K, Fong SFT Lysyl oxidase-like 2 promotes migration in non-invasive breast cancer cells but not in normal breast epithelial cells International Journal of Cancer 2009; elfogadva Laczko R, Szauter KM, Jansen MK, Hollosi P, Molnar J, Muranyi M, Fong KS, Hinek A, Csiszar K Lysyl oxidase (LOX) promotes FAK/paxillin activation and migration in invasive astrocytes Neuropathol Appl Neurobiol. 2007 Dec;33(6):631-43. Fong SF, Dietzsch E, Fong KS, Hollosi P, Asuncion L, He Q, Parker MI, Csiszar K Lysyl oxidase-like 2 expression is increased in colon and esophageal tumors and associated with less differentiated colon tumors Genes Chromosomes Cancer 2007 Jul;46(7):644-55
8
Az értekezés témájától független közlemények: Peterfia B, Hollosi P, Szilak L, Timar F, Paku S, Jeney A, Kovalszky I. Role of syndecan-1 proteoglycan in the invasiveness of HT-1080 fibrosarcoma Magy Onkol. 2006;50(2):115-20. Hungarian. Kovalszky I, Dudas J, Gallai M, Hollosi P, Tatrai P, Tatrai E, Schaff Z Proteoglycans in the liver Magy Onkol. 2004; 48(3):207-13. Hungarian. Kiss AL, Botos E, Turi A, Mullner N, Hollosi P, Kovalszky I Ocadaic acid treatment alters the intracellular localization of caveolin-1 and caveolin-2 in HepG2 cells human isolated coronary arteries Acta Biol Szeged 2003; 47:11-17
Poszter-elıadások az értekezés témájában: Fong SFT, Fogelgren B, Szauter-Molnarne K, Moon C, Hollosi P, Weaver V, Kirschmann DA, Csiszar K Lysyl oxidase (LOX) is expressed in the microenvironment of breast tumor cells and promotes epithelial plasticity, invasive properties and metastasis. American Association for Cancer Research, 2005, Anaheim, CA, USA Fong SFT, Fogelgren B, Szauter-Molnarne K, Moon C, Hollosi P, Weaver V, Kirschmann DA, Csiszar K Lysyl oxidase (LOX) is re-expressed in the microenvironment of breast tumor cells and promotes epithelial plasicity, invasive properties and metastasis Second National Meeting of the American Society for Matrix Biology, 2004, San Diego, CA, USA
9
Fong SFT, Moon C, Fogelgren B, Szauter K, Hollosi P, Kirschmann DA, Chun M, Csiszar K Lysyl oxidase induces epithelial-mesenchymal transition and invasive phenotype in breast cancer cells. XIXth meeting of the Federation of the European Connective Tissue Societies, 2004, Taormina-Giardini Naxos, Italy Fong SFT, He QP, Fong KSK, Dietzsch E, Asuncion L, Hollosi P, Parker MI, Csiszar K Increased Lysyl Oxidase-Like Expression in Colon and Esophageal Tumors are Assiociated with Markers of Poor Prognosis Biomedical Sciences Symposium, 2004, Honolulu, HI, USA
10
