PhD. értekezés A Na+/K+ ATPáz szerepe a diabetes mellitus patomechanizmusában Dr. Rosta Klára Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola Patobiokémia program
Programvezető: Témavezető:
Dr. Mandl József, az MTA levelező tagja Dr. Vér Ágota PhD.
Szigorlati Bizottság Elnöke: Szigorlati Bizottság tagjai: Hivatalos bírálók:
Dr. Falus András, az MTA tagja Dr. Kökény Gábor PhD. Dr. Gallyas Ferenc PhD. Dr. Tretter László, az MTA doktora Dr. Farkas Klára PhD.
Budapest 2009
Tartalomjegyzék
2
1. ÖSSZEFOGLALÁS
5
2. SUMMARY
6
3. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
7
4. BEVEZETÉS
9
5. ELMÉLETI ÁTTEKINTÉS
10
5.1. A diabétesz kardiovaszkuláris szövődményei
11
5.2. A dabéteszes nefropátia
13
5.3. A Na+/K+-ATPáz (NKA)
16
5.3.1. A NKA biokémiai jellemzői, működése élettani körülmények között 17 5.3.2. A NKA szerkezete
20
5.3.3. A NKA lokalizációja szoros kapcsolatban áll funkciójával
22
5.3.4. A NKA aktivitását befolyásoló tényezők
24
5.3.4.1. Az alfa alegység foszforilációs mintázata
24
5.3.4.2. Az α alegységhez extracellulárisan kötődő ouabain szerepe 26 5.3.4.3. Hormonális szabályozás 5.3.5. A NKA működésének változása diabetes mellitusban 5.4. A cukorbetegségben használt kezelési módok támadáspontjai
28 30 32
6. CÉLKITŰZÉSEK
35
7. MÓDSZEREK
36
7.1. Kísérleti állatok
36
7.2. Kísérleti körülmények beállítása; az állatok kezelése
37
7.2.1. STZ- diabétesz indukálása
37
7.2.2. Akut és krónikus inzulin kezelés módja a szívizom vizsgálata során 37 7.2.3. Angiotenzin kezelés szívizom és vesekéreg vizsgálatok során
33
7.2.4. Losartan és metformin kezelés vesekéreg vizsgálatai során
38
7.3. Általános és laboratóriumi paraméterek vizsgálata (metabolikus és renális)
38
7.4. Az artériás középnyomás mérése
38
7.5. Teljes szabadgyökfogó kapacitás mérése (total scavenger capacity, TSC)
39
7.6. RT-PCR
40
7.7. Vese homogenizálás és szubcelluláris fehérjék szétválasztása
41
7.8. Western blot analízis
42
7.9 Sejtfelszín biotiniláció
42
2
7.10. NKA enzim aktivitás mérése
43
7.11. Fluoreszcens immunohisztokémia
44
7.12. Statisztikai analízis
44
8. EREDMÉNYEK 8.1. A bal kamra szívizomzatának morfológiai és biokémiai jellemzői STZ diabéteszben
45
8.1.1. A STZ diabétesz, a krónikus inzulin kezelés, valamint az ANGII adagolás hatása a metabolikus paraméterekre
45
8.1.2 Az akut inzulin kezelés hatása a vércukor szintre
47
8.1.3. A kontroll és a diabéteszes állatok bal kamrájának enzimatikus jellemzése
48
8.1.4. A NKA katalitikus alegységeinek megoszlása kontroll és diabéteszes szívizomban; inzulin kezelés hatása a NKA aktivitás sejten belüli eloszlására.
49
8.1.5. Az inzulin kezelés akut hatása a NKA alegységeinek sejten belüli elhelyezkedésére szubcelluláris frakcionálás módszerét használva
51
8.1.6. Sejtfelszíni biotinilációs technikával kimutatott PM-hoz kötött fehérjék változása inzulin hatására
54
8.2. A vesekéreg morfológiai és biokémiai jellemzői STZ diabéteszben
56
8.2.1 A STZ diabétesz és az angiotenzin adagolás hatása a metabolikus paraméterekre és a vesefunkcióra
56
8.2.2. A STZ diabétesz és az angiotenzin adagolás hatása a NKA alfa-1 alegységének mRNS és fehérje kifejeződésére, valamint az enzim aktivitására vesekéreg homogenizátumban vizsgálva
58
8.2.3. A STZ diabétesz és az angiotenzin adagolás hatása a NKA alfa-1 alegységének sejten belüli megoszlására
60
8.2.4. A STZ diabétesz és az angiotenzin adagolás hatása a NKA alfa-1 alegységének szerin foszforilációjára
62
8.2.5. Fluoreszcens immunhisztokémia
63
8.2.6. Az AT1R blokkoló losartan kezelés hatása a NAK α1 alegységére STZ diabéteszes patkányok vesekérgében
3
65
8.2.7. A metformin kezelés hatása a NAK α1 alegységére STZ diabéteszes patkányok vesekérgében
69
9. MEGBESZÉLÉS
72
9.1. A diabéteszes kardiopátia biokémiai háttere és a NKA lehetséges szerepe kialakulásában
72
9.2. A NKA szerepe a diabéteszes nefropátiában
78
9.3. A NKA patológiás változásainak szerepe a szövet átépülésében, a szövődmények progressziójában
84
10. EREDMÉNYEK RÖVID ÖSSZEFOGLALÁSA
90
11. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
92
12. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE
93
13. IRODALOMJEGYZÉK
96
4
1. ÖSSZEFOGLALÁS A Na +/K + ATPáz szerepe a diabetes mellitus pathomechanizmusában Dr. Rosta Klára Témavezető: Dr. Vér Ágota Ph.D. Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola, Semmelweis Egyetem, 2009 A diabetes mellitus (DM) hosszútávú szövődményei a szívizom és a vese strukturális és funkcionális károsodásához vezetnek. Mindkét szövet működéséhez elengedhetetlen a Na+/K+ATPáz (NKA) enzim, amely a sejtekben a másodlagos aktív transzportot lehetővé teszi és számos meghatározó jelpálya kiindulópontja. Vizsgálataink célja az volt, hogy a NKA működésének változásait kimutassuk DM-ban, emellett vizsgáltuk az enzim működésében bekövetkező változásokat a klinikai gyakorlatban használt kezelési módok hatására. 1-es típusú diabétesz állatmodelljében a NKA expressziója a szívizomban izoforma specifikusan 30-55%kal csökken, amit a tartós inzulin kezelés helyreállít, miközben csökken az antioxidáns rendszer aktivitása (TSC), és a szívizom hipertrófia progressziója figyelhető meg. Inzulin kezelés akut hatására a NKA az intracelluláris membránokból a sejthártyára helyeződik át. A kihelyeződés foszfatidilinozitol (PI) 3-kináz inhibitorral gátolható. Kezeletlen DM-ban csökken a NKA inzulinfüggő kihelyeződése feltehetően a szöveti expresszió nagymértékű csökkenése miatt. DMban a vese proximális tubulus sejtjeiben a NKA expressziója 50%-kal fokozódik. Ennek ellenére a sejthártyában nem nő a NKA-ok sűrűsége. Vizsgálataink igazolják, hogy a NKA α1 alegysége a sejtfelszín alatti vezikulákban dúsul fel, ahol a hatékony iontranszportban nem játszik szerepet. Az intracellulárisan elhelyezkedő pumpák Ser23 helyzetben foszforiláltak. Hosszantartó angiotenzin (ANGII) adagolás hatására tovább nő az intracelluláris NKA mennyisége és Ser23 foszforilációja is. A DM-ban megfigyelt patológiás pumpalokalizáció az antihipertenzív AT1R blokkoló losartan kezelés és a vércukorcsökkentő metformin hatására a fiziológiásnak megfelelően rendeződik. Vizsgálataink alapján a diabéteszes szív- és veseszövődményekben megfigyelhető funkcióromlásban szerepe lehet a NKA membránfrakciók közötti megváltozott megoszlásának, ami nemcsak az iontranszportot, de a szöveti struktúra kóros átépülését is befolyásolhatja. 1. Fekete A*, Rosta K*, Wagner L, Prokai A, Degrell P, Ruzicska E, Toth M, Vegh E, Ronai K, Rusai K, Somogyi A, Tulassay T, Szabo AJ, Ver A. Na+/K+ ATPase is modulated by angiotensin II in diabetic rat kidney– another reason for diabetic nephropathy? (2008) J Physiol, 586:5337-48. (IF:4.605) 2. Somogyi A, Rosta K, Pusztai P, Tulassay Z, Nagy G. Antioxidant measurements. (2007) Physiol Meas, 28: R41-55. (IF: 1,412) 3. Somogyi A, Ruzicska E, Blazovics A, Ver A, Rosta K, Toth M. Insulin treatment decreases the antioxidant defense mechanism in experimental diabetes. (2005) Med Sci Monit, 11: BR206-11.
5
2. SUMMARY The role of Na+/K+-ATPase in the pathomechanism of diabetes mellitus Dr. Klara Rosta Supervisor: Dr. Agota Ver Basic Medical Sciences Doctoral School, Semmelweis University, 2009 Long-term complications of diabetes mellitus (DM) lead to structural and functional damage in the heart and kidney. Both tissues require the presence of Na+/K+-ATPase (NKA) which facilitates secondary active transport mechanisms and serves as the initiator of a number of signaling pathways. The aim of our studies was to examine the changes in the function of NKA in DM and the effect of therapeutic agents used in everyday clinical practice. NKA expression decreases by 30-55% in diabetic (D) heart muscle. Upon chronic insulin administration, this effect is abolished while the activity of the antioxidant system (TSC%) decreases and cardiac muscle hypertrophy is observable. Acute insulin administration recruits NKA and Glut4 from the intracellular membranes to the plasma membrane. This translocation can be inhibited by p hosphoinositide (PI) 3-kinase inhibitor. The insulin dependent translocation of NKA and Glut4 is decreased in DM, probably due to the large decrease in protein expression. NKA expression
increases by 50% in D kidney proximal tubular cells. In contrast, the density of NKA molecules remains constant in the plasma membrane. According to our study the α1 subunit of NKA accumulates under the plasma membrane in intracellular vesicles; these pumps are Ser23 phosphorylated and due to their localization fail to exhibit effective ion transport. Long-term angiotensin (ANGII) administration increases the amount of NKA localized in intracellular vesicles, along with Ser23 phosphorylation. The antihypertensive AT1R blocker, losartan, and the antihyperglycaemic metformin normalized the pathologic localization of NKA. According to our studies, changes in the subcellular distribution of NKA may contribute to tissue-specific malfunctions in the heart- and kidney-related complications of DM. The pathological subcellular distribution not only alters ion transport, but may also influence tissue-specific abnormal remodeling in DM. 1. Fekete A*, Rosta K*, Wagner L, Prokai A, Degrell P, Ruzicska E, Toth M, Vegh E, Ronai K, Rusai K, Somogyi A, Tulassay T, Szabo AJ, Ver A. Na +/K+ ATPase is modulated by angiotensin II in diabetic rat kidney– another reason for diabetic nephropathy? (2008) J Physiol, 586:5337-48. (IF:4,605) 2. Somogyi A, Rosta K, Pusztai P, Tulassay Z, Nagy G. Antioxidant measurements. (2007) Physiol Meas, 28: R41-55. (IF: 1,412 3. Somogyi A, Ruzicska E, Blazovics A, Ver A, Rosta K, Toth M. Insulin treatment decreases the antioxidant defense mechanism in experimental diabetes. (2005) Med Sci Monit, 11: BR206-11.
6
Dmet: diabéteszes metforminnal kezelt
3. Rövidítések jegyzéke
DNP: diabéteszes nefropátia ACE: angiotenzin-konvertáló enzim
eNOS: konstitutív nitrogén oxid szintáz
ACE2: angiotenzin-konvertáló enzim 2
ED: endogén digitálisz
ADP: adenozin-difoszfát
EDTA: etilén-diamin-tetraecetsav
AGE: késői glikációs végtermék
ELISA: enzyme-linked immunoassay
AMI: akut miokardiális infarktus
ER: endoplazmatikus retikulum
AMPK: AMP-aktivált protein kináz
EGF: epidermális növekedési faktor
ANGI: angiotenzin I
EGFR: epidermális
ANGII: angiotenzin II
receptor
ANOVA: varianciaanalízis
GFR: glomeruláris filtrációs ráta
ANP: kamrai nátriuretikus peptid
GBM glomeruláris bazálmembrán
AP1: aktivátor protein 1
GLUT: glukóz transzporter
AP2: aktivátor protein 2
IC: intracelluláris
ARB: angiotenzin-receptor gátlók
IDF: nemzetközi diabétesz szövetség
AT1R: az angiotenzin II 1-es típusú
IM: intracelluláris membrán
receptora
JGA: juxtaglomeruláris apparátus
AT2R: az angiotenzin II 2-es típusú
IGFI: Inzulin-szerű növekedési faktor 1
receptora
IP3: inozitol-trifoszfát
ATP: adenozin-trifoszfát
IP3R: inozitol-trifoszfát receptor
AVP: arginin-vazopresszin
IRS: inzulin receptor szubsztrát
BNP:B típusú nátriuretikus peptid
JAK: Janus-arcú kináz
2+
növekedési faktor
CaMKKII: Ca /calmodulin kináz kináz II
K: kontroll
cGMP: ciklikus guanozin monofoszfát
KA: kontroll angiotenzin II kezelt
cDNS: komplementer egyszálú DNS
KAT: kataláz
CNP: C-típusú nátriuretikus peptid
Kav1: kaveolin 1
D1R: dopamin 1-es receptor
LKB1: szerin-threonin kináz 11
DM: diabetes mellitus
MAP: artériás középnyomás
D: diabéteszes
MAPK: mitogén-asszociált protein kináz
DA: diabéteszes angiotenzin II kezelt
MnSOD mangán szuperoxid dizmutáz
DCCT: Diabetes Control and
mRNA: messenger ribonukleinsav
Complications Trial
n: szám
DI: diabéteszes inzulinnal kezelt
NCX: Na+/Ca2+ antiporter
DL: diabéteszes Losartan kezelt
NKA: Na+/K+ ATPáz 7
NO: nitrogén-monoxid
SREBP: sterol responsive element binding
nt: nem történt
protein
OCT: szerves kation transzporter
SR-OMFF: strofantidin-rezisztens 3-O-
OK: opposum kidney
metilfluorescein-foszfatáz
P: szignifikancia
STZ: streptozotocin
PT: proximális tubulus
Tg: triglicerid
PARP1: Poly (ADP-ribose) polymerase
TGF: transzformáló növekedési factor
family member 1
TORC2: target of rapamycin complex 2
PAS: Periodic acid-Schiff festék
TSC: teljes gyökfogó kapacitás
PBS: foszfát pufferokt sóoldat
UKPDS: United Kingdom Prospective
PCR: polimeráz láncreakció
Diabetes Study
PGC-1: peroxisome proliferator activated receptor coactivator 1 PI3K: foszfatidil-inozitol-3-kináz PKA: protein kináz A PKC: protein kináz C PKG: protein kináz G PLC: foszfolipáz C PM: plazma membrán RAGE: AGE receptor RAS: renin-angiotenzin rendszer RyR: ryanodin receptor SEM: az átlag standard hibája SERCA: Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPáz, SOCs: store operated channels SR: szarkoplazmás reticulum Src: tirozin kináz SREBP: Sterol Regulatory Element Binding Protein STAT: signal transducer and activator of transcription SÉ-OMFF: strofantidin-érzékeny 3-Ometilfluorescein-foszfatáz 8
4. BEVEZETÉS Munkacsoportunk már több évtizede foglalkozik a Na +/K+-ATPáz (NKA) szerepével cukorbetegségben. Amikor először csatlakoztam témavezetőm kutatómunkájához, akkor a harántcsíkolt izom vörös és fehér izomrostjaiban kifejeződő NKA működését vizsgáltuk diabéteszes állatokban. E minden sejtben megtalálható enzim számos általános feladata (pl. memebránpotenciál fenntartás, másodlagos aktív transzportfolyamatok facilitálása) mellett egyedülállóan
sokoldalú
alkalmazkodó
képességgel rendelkezik,
amely különböző
szövetekben és különféle fiziológiás vagy patológiás folyamatokban egyaránt tetten érhető. A NKA az evolúció folyamán évmilliók alatt konzervált, egyben mégis különböző feltételekhez alkalmazkodó enzim iskolapéldája, amely a bonyolultabb organizmusokban ugyanúgy megtalálható, mint a legegyszerűbb élőlényekben. Doktori munkám során 1-es típusú cukorbetegségben szenvedő patkányokon vizsgáltuk a NKA működését. Kimutattuk, hogy a NKA a szívizomban és a veseszövetben szövetspecifikusan alkalmazkodik a diabéteszben létrejövő kóros folyamatokhoz. Eredményeink alátámasztják, hogy diabéteszben felborul a pro- és antioxidáns rendszer egyensúlya, amely részben megmagyarázhatja a szívizom kóros hipertrófiáját. Vizsgálataink alapján feltehető, hogy a NKA működésében kimutatott változások pro- és antiapoptotikus jelpályákat indukálva, további patológiás folyamatokat indítanak el, amelyek tovább fokozzák a vese és a szívizom szövetének károsodását. Kísérleteinkkel igazoljuk, hogy a jelenlegi klinikai gyakorlatban is használt kezelési módok (pl. losartan, metformin, inzulin) nemcsak a magas vérnyomás és a kóros cukorháztartás tüneti kezelésére alkalmasak, de visszafordítják a NKA diabéteszben általunk megfigyelt változásait. Vizsgálataink jól mutatják, hogy egy olyan komplex betegség, mint a cukorbetegség szövődményeinek hátterében érdemes a különböző kompartmentek alapfolyamatait tanulmányozni és keresni a speciális, kompartmentre jellemző patológiás működés hátterét.
9
5. ELMÉLETI ÁTTEKINTÉS
A cukorbetegek száma a megváltozott környezeti tényezők miatt halmozottan nő. Földünk több mint 240 millió lakosát sújtja, szövődményein keresztül a szervezet valamennyi szervrendszerét érinti. A DM anyagcsere-betegség, amely szinte az összes anyagcsere út zavarát okozza. A betegség vezető tünete az inzulin relatív vagy abszolút hiánya miatt kialakuló magas vércukorszint, amely közvetve vagy közvetlenül felelős a szövődmények kialakulásáért. A nem- vagy rosszul kezelt cukorbetegség fogyáshoz, az ozmotikus diurézis miatt
gyakori és
nagy mennyiségű
vizeletürítéshez,
viszketéshez,
szomjúsághoz,
kiszáradáshoz, kómához vezethet. Cukorbetegekben a sérülések gyógyulási hajlama rosszabb, gyakoribbak a fertőzések. Hosszútávú következményei közül legfontosabbak a makro- és mikrovaszkuláris szövődmények, amelyek a betegek várható élettartamát 5-7 évvel megrövidítik, életminőségét rontják. A cukorbetegségben kialakuló- alapvetően az érelmeszesedés szövődményeként létrejövőszöveti struktúra- és funkciókárosodás hátterében számos etiológiai tényező állhat. Az Anyicskov által leírt lipid teória [1] mellett tudjuk, hogy a gyulladásos faktorok [2, 3], az alvadási faktorok működésének károsodása és a hiperglikémia által okozott oxidatív stressz [4-7] együttesen hozzájárulnak a hosszútávú szövődmények kialakulásához. A krónikus, de az átmeneti hiperglikémia is megteremti a feltételeit annak, hogy a glukóz nem enzimatikus úton kapcsolódjon az aminosavak, fehérjék, és nukleinsavak aminocsoportjához. A glikált termékek szerkezeti és funkcionális károsodást okoznek a szövetekben [3, 7, 8]. Nem enzimatikus reakcióban korai glikációs termékek Schiff-bázisok és Amadori-termékek keletkeznek, majd irreverzibilis reakciók során késői glikációs termékek (advanced glycation end product: AGE) jönnek létre. Ezek receptorukhoz (RAGE) kötődve gyulladást és oxidatív stresszt okoznak. A RAGE aktiváció a kardiovaszkuláris betegség és a nefropátia felgyorsulásához vezet. Diabéteszben a RAGE-ok száma nő [9, 10]. A krónikus hiperglikémia, a késői glikációs végtermékek keletkezésén, illetve ezen keresztül a protein-kináz C aktiválásán, a polyol út stimulációján és az oxigénalapú szabadgyökök nagyfokú képződésén át vezet a gyulladásos mediátorok, növekedési faktorok, citokinek, és extracelluláris mátrix gének megváltozott génexpressziójához, a vérlemezkék és a macrophagok aktivációjához [11]. A kialakuló mikro- és makroangiopátia áll a kardiopátia, a nefropátia, a retinopátia és a neuropátia hátterében.[7] 10
Doktori munkám során 1-es típusú DM állatmodelljét, streptozotocin (STZ) indukált diabéteszben szenvedő patkányokat vizsgáltam. A STZ az inzulint elválasztó sejtekre szelektíven toxikus, azokat elpusztítja. Az STZ egy nitrózurea származék, amit a Streptomyces achromogenesből izolálnak. Erős alkilálószer, amely hatással van a glukóz transzportra, a glukokináz funkciójára, valamint többszörös DNS-szál törést indukál. Egyszeri nagy dózisú STZ, feltehetőleg a direkt toxikus hatásai miatt 1-es típusú diabéteszt okoz patkányokban. Az STZ-re fogékony rágcsálókban az inzulinhiányos diabétesz kialakulásában – csakúgy, mint a humán 1-es típusú diabéteszben – szerepet játszik az immunrendszer kóros aktivációja.
5.1. A diabétesz kardiovaszkuláris szövődményei A makrovaszkuláris szövődmények közül a kardiovaszkuláris betegség felelős a cukorbetegséggel kapcsolatba hozható halálozás több, mint 50%-áért [12]. A diabéteszhez társuló kardiovaszkuláris betegségek közé tartoznak az angina pectoris, a szívizom infarktusa és a kongesztív szívelégtelenség. A cukorbetegek azon csoportja, akiknek korábban nem volt vaszkuláris történése ugyanolyan incidenciával esik át első szívinfarktusán, mint a diabéteszben nem szenvedő, de már élete első infarktusán átesett és bizonyítottan koszorúér betegségben szenvedő populáció tagjai (Diabetes Atlas 2008-IDF, [12]) (1. ábra). 1. ábra A diabetes mellitus kardiovaszkuláris rizikófaktor Incidencia (%)
Nem diabéteszes
Diabéteszes
1. ábra. Egy diabéteszben szenvedő egyénnél ugyanolyan incidenciával fordulhat elő miokardiális infarktus, mint aki nem szenved cukorbetegségben, de igazoltan koronária beteg és már átesett élete első infarktusán [12]. 11
Rubler és mtsai. 1972-ben vetették fel, hogy létezik egy diabéteszre jellemző kardiomiopátia, mivel azt észlelték, hogy cukorbetegekben gyakran koszorúérbetegség vagy egyéb rizikófaktor nélkül alakul ki szívelégtelenség [13]. A Framingham-vizsgálat szerint a diabéteszben kialakult szívelégtelenség nem hozható direkt összefüggésbe az elhízással, a magasvérnyomással, az emelkedett koleszterin értékekkel illetve a koszorúérbetegséggel [14]. Mindezek alátámasztják, hogy a cukorbetegségben észlelt kardiomiopátia cukorbetegekben,
oka
a
mind
diabétesz pedig
speciális
diabéteszes
hatása
a
szívizom
állatmodellen
működésére.
kimutathatóak
a
Mind
szívizom
működésének rendellenességei, beleértve a diasztolés funkciózavart is, amit a szívizom csökkent teljesítőképessége, elhúzódó szívizom relaxáció és károsodott balkamrai telődés jellemez. A folyamat előrehaladása során szisztolés funkciózavar is kialakul, amely végül szívelégtelenséghez vezet [6, 15]. A cukorbetegek szívbetegségére jellemző megnövekedett bal kamra hipertrófia a diffúz miokardiális fibrózis eredménye, amely mind az interstíciumban, mind pedig perivaszkulárisan megfigyelhető és már a cukorbetegség korai stádiumában [16-18]. A szívizom összehúzódó képességének romlásáért a szívizomsejtek nekrózisa felelős, előrehaladott diabéteszes kardiomiopatiában a kontraktilis rostok helyét Periodic acid-Schiff (PAS) pozitív festődésű kötőszövet foglalja el. Cukorbeteg patkányok szívizmában a különböző típusú kollagénrostok arányának eltolódása, a III. típusú kollagén felszaporodása mutatható ki [19]. Az elváltozások hátterében a hiperglikémián és a megváltozott hemodinamikai hatásokon kívül az oxidatív stressz és az antioxidáns védekező rendszer csökkent működése, valamint a lokális és szisztémás renin-angiotenzin rendszer (RAS) fokozott működése is áll [20, 21]. Cukorbetegségben csökken az endothelialis nitrogén monoxid (NO) termelés, és megnő a vazokonstriktor prosztaglandinok, glikált proteinek, adhéziós molekulák és növekedési faktorok mennyisége is [22]. A szívizomelégtelenség okaként diabéteszben felmerül a NKA és egyéb transzporterek fiziológiástól eltérő működése. Ismert, hogy STZ diabéteszben a NKA szívizomban kisebb mértékben fejeződik ki. Ez rontja a szívizom kapacitását a Na+, K+ és Ca2+ koncentrációk változásainak kompenzálására. A cukorbetegségben megfigyelt változások magyarázhatják a cukorbetegek fokozott rizikóját a szívritmuszavarokra és a szívelégtelenségre diabéteszes kardiomiopátiában [23]. Mindezidáig nem vizsgálták, hogy a diabétesz és az inzulin akut 12
hatása szívizomban milyen módon befolyásolja a NKA alegységeinek szubcelluláris elhelyezkedését.
5.2. A diabéteszes nefropátia
A mikrovaszkuláris komplikációk közé tartozik a diabéteszes nefropátia (DNP), ami a betegek 20-40%-át érinti és a vesetranszplantációk többségéért felelős (American Diabetes Association, 2005, http://www.diabetes.org). A DNP a krónikus vesebetegségek egyik leggyakoribb formája, egyben a cukorbetegek 30-40%-ában fellépő szövődmény [24, 25]. A DNP-ben szenvedő betegek többsége 2-es típusú cukorbeteg [26]. Az 1-es típusú, vagy inzulin dependens diabetes mellitusban a betegség kezdetétől számított 20-30 év múlva jelenik meg a DNP, amire a mikroalbuminuria megjelenése utalhat. (IDFDiabetes Atlas 2008, http://www.eatlas.idf.org). A 2-es típusú, vagy nem-inzulin dependens diabetes mellitusban azonban a DNP már a diabétesz felfedezésének pillanatában jelen lehet. A mikroalbuminuria megjelenésekor a betegek kardiovaszkuláris kockázata 2-3-szorosa az albumint nem ürítő cukorbeteg populáció kockázatának. A DNP a vizelettel történő albuminürítés fokozódásával, a vérnyomás emelkedésével és a glomeruláris filtrációs ráta (GFR) fokozatos csökkenésével járó, végstádiumú vesebetegséghez, veseelégtelenséghez vezető állapot. A folyamat mind a glomerulusokat, mind a tubulusokat érintheti. A glomerulusok bazális membránja megvastagodik, a mezangiális matrix felszaporodik, így a glomerulusok megnagyobbodnak (2. ábra). A folyamat a kapillárislumen beszűkülését eredményezi és ez a filtrációs felület csökkenéséhez vezet [27]. Az irodalomban szerzői névvel illetett Kimmelstiel-Wilson glomeruloszklerózisra a gócos megjelenés jellemző, de gyakoribb a diffúz, szinte valamennyi glomerulust érintő forma.
13
2. ábra Diabéteszes nefropátia (DNP) jellegzetes szövettani képe
2. ábra. A DNP mikrovaszkuláris szövődmény, mely glomeruláris és tubuláris károsodással jár. A képen látható diffúz glomeruloszklerózisra a glomerulusok bazális membránjának megvastagodása, a Periodic acid-Schiff (PAS) pozitív festődésű mezangiális mátrix felszaporodása, a glomerulusok hipertrofiája jellemző. (hematoxilin eozin-PAS festés) A DNP lefolyása során korai stádiumban hipertrófia és hiperfiltráció figyelhető meg a GFR növekedésével [28]. A kompenzációban a vese transzporterei és a vesére ható hormonrendszerek kapnak központi szerepet. A hosszan fennálló cukorbetegség során azonban számos olyan anyagcsereút aktiválódik vagy gyorsul fel, amelyek termékei a sejteket, traszportereket, lipideket, fehérjéket és a DNS-t közvetlenül vagy közvetetten károsítják, így a kompenzációs mechanizmusok sérülnek. Ilyen folyamat a magas vércukorszint miatt létrejövő fokozott glikáció vagy a felszaporodott szabadgyökök okozta fokozott lipidperoxidáció [7, 8]. A diabétesz anyagcsere-változásai és a következményes funkciófokozódás miatt a vese károsodik; kialakul a diabéteszes nefropátia második stádiuma, amelyben a GFR már emelkedett lehet és átmeneti mikroalbuminuria (30-300 mg/nap) is előfordul. Tartós mikroalbuminuria a betegség harmadik stádiumára jellemző, ilyenkor a vérnyomás már határérték hipertóniát jelezhet. A negyedik stádiumra proteinuria jellemző, megnövekedett vérnyomás értékekkel. Az ötödik stádiumban a működő nefronok száma nagymértékben lecsökken, ami végül urémiához, veseelégtelenséghez vezet, ilyen esetekben a proteinuria megszűnik [29].
14
A DNP kialakulásában szerepe van a diabéteszben megjelenő hemodinamikai változásoknak is. A diabéteszes mikroangiopátia során a kapillárisok progresszív károsodása következik be azáltal, hogy a bazális membrán megvastagszik, s ez a vese vérellátásának romlásához vezet [27, 30]. A nem, vagy rosszul kezelt 1-es és 2-es típusú DM-ban egyaránt kialakuló hiperglikémia a DNP önálló etiológiai tényezője. A hiperglikémia hatására a glomeruláris bazalmembrán, a podociták és a tubulus epithelsejtek fehérjéinek glikációja következik be, amely károsítja a veseműködést [7]. A glikáció miatt megváltozik az albumin töltése, így könnyebben átjut a glomerulus bazális membránján. Számos transzporter esetében kimutatták, hogy a diabéteszre jellemző hiperglikémia önmagában is károsítja a működést [31]. A cukorbetegségben kimutatták, hogy a RAS, az inzulin, a dopamin és a C-típusú nátriuretikus peptid (CNP) jelpályájának működése is megváltozik diabéteszes vesében [30, 32-37]. Különböző citokinek, például a transzformáló növekedési faktor β1 (TGFβ1) szintje is emelkedik [38, 39]. Epidemiológiai adatok szerint a DNP-ben szenvedők vérrokonai körében gyakoribb a DNP megjelenése. A DNP kialakulásában a RAS aktiválódása kulcsfontosságú [34, 40]; irodalmi adatok szerint az angiotenzin-konvertáló enzim (ACE) egyik inzerciós-deléciós génpolimorfizmusa kapcsolatba hozható a DNP kialakulásával [41, 42]. A vese kérgi részében, a szervezet só- és vízháztartásának szabályozásában az ANGII központi jelentőségű. Cukorbetegségben a RAS aktivitása fokozódik, ezért a diabétesz gyakran társul szisztémás hipertóniával [43]. A magas vérnyomás tartós fennállása esetén az afferens arteriola autoregulációja romlik, a magas nyomás áttevődik a glomerulusra. Nem minden esetben alakul ki a szisztémiás hipertónia, de a RAS lokálisan, intrarenálisan is aktiválódhat [44]. A szisztémás és a renális nyomásnövekedés következtében a nyomás a glomerulusban is megnövekszik, ez pedig hiperfiltrációhoz, és az endothelsejtek, a bazális membrán és a podociták károsodásához vezet. A diabéteszben megfigyelhető fokozott só- és vízvisszaszívás összefügg a transzporterek megváltozott működésével, amelyekre számos hormon mellett a diabéteszben megnövekedett koncentrációjú ANGII és endogén digitáliszok is hatással bírnak [44-46]. Ellentmondásos eredmények állnak rendelkezésre a diabétesz, illetve az ANGII és a NKA kapcsolatát illetően. Egyesek szerint emelkedett vércukorszint hatására az enzim kifejeződése és aktivitása nő, míg mások ellenkező eredményről számoltak be [47, 48]. Az 15
ANGII NKA aktivitásra gyakorolt hatásának vizsgálata vesében sem hozott egybehangzó eredményt [49-52]. Rövidtávú ANGII emelkedés és cukorbetegség együttes hatását eddig még nem vizsgálták, pedig a mindennapi orvosi gyakorlatban rendszeresen előforduló problémáról van szó. A cukorbetegség számos állapotában (pl. diabéteszes ketoacidózis, hiperozmoláris nemketoacidotikus kóma, akut szívelégtelenség, krónikus szívelégtelenség akut exacerbációja során) figyelhető meg, hogy a hirtelen ANGII emelkedés a veseműködést és a diabéteszes vesekárosodást tovább rontja. 5.3 A Na +/K +-ATPáz 3. ábra Jens Christian Skou
1957-ben Skou (3. ábra) elsőként vetette fel,
hogy
a
Na
és
a
K
ionok
plazmamembránon keresztüli transzportja és a Na és K ionok által aktivált ATPáz között kapcsolat állhat fenn. 1997-ben ezért a felfedezéséért Nobel díjat kapott. A Na+/K+-ATPáz egy membránhoz kötött enzim, amely a Na+ és a K+ koncentráció
Jens Christian Skou, dán kémikus, aki a NKA felfedezéséért 1997-ben Nobel díjat kapott
grádienst szabályozza a plazmamembrán két oldalán. Az elmúlt évek kutatásainak eredménye, hogy a vese transzportfolyamatait és a szívizomsejtek összehúzódási képességét elsődlegesen befolyásoló pumpát, a Na+/K+-ATPázt ma már egy folyamatos adaptációra képes, gyorsan és finoman szabályozható enzimnek tartjuk. A NKA-nak központi szerepe van az élettani változásokhoz való alkalmazkodásban és nem elhanyagolható a szerepe a patológiás folyamatok (pl. diabetes mellitus) során beindult káros változásokban sem. Mindezek miatt kutatásaink középpontjául a NKA-t választottuk 1-es típusú diabéteszes patkánymodellen, feltételezve, hogy a diabéteszes nefropátia és a diabéteszes kardiomiopátia kialakulásában a NKA működésének megváltozása is szerepet játszhat.
16
5.3.1. A NKA biokémia jellemzői, működése élettani körülmények között
A NKA működése során egy molekula ATP hidrolízisével két K iont transzportál az extracelluláris térből az intracelluláris térbe, miközben három Na iont juttat ki a sejtből. A sejtmembrán két oldala között így kialakult elektrokémiai potenciál biztosítja a sejtmembránon keresztül zajló, másodlagosan aktív transzportfolyamatok (pl. Na+/Ca2
+
csere, Na+/glükóz
kotranszport stb.). számára az energiát. Az így vándorló ionok transzmembrán feszültséget és koncentrációkülönbséget hoznak létre, amely az ioncsatornákon keresztül végbemenő passzív elektrolit áramlást hajtja. Az enzim alapvetően befolyásolja a szervezet folyadéktereinek összetételét és a sejtek térfogatát, egyben az összehúzódásra képes sejtek működésének alapja.
A NKA aktív transzportja a vesében a sejtek energiafelhasználásának 50-70%-át teszi ki [53]. Az emberi vese napi több, mint 600 gramm Na iont pumpál, mintegy 2 kg ATP hidrolízise során. A vesében figyelemre méltóan sok NKA helyezkedik el, több mint 50 millió sejtenként. Ez sokszorosa a nem polarizált sejtekben levőknek [54]. A Na ion visszaszívás mértéke az egyes nefron szegmentumokban szoros kapcsolatban van a NKA mennyiségével. A legnagyobb mennyiségben a vastag felszálló szegmentumban és a disztális kanyarulatos csatornában mutatható ki az enzim mRNS-e. Kisebb mennyiségben expresszálódik a NKA a proximális kanyarulatos csatornában és a kérgi gyűjtőcsatornákban, és alig kimutatható a glomerulusban, a fel- és leszálló vékony Henle kacsban és a külső- és belső velő gyűjtőcsatornáiban. A különböző szegmentumokban az enzimmennyiség és -aktivitás értékek összefüggést mutatnak a mRNS expresszió változásaival [55]. A NKA a vese tubulussejtjein a bazolaterális membrán betüremkedésein helyezkedik el, amelyek szorosan körbe vannak véve mitokondriumokkal. A Na+ vándorlása a savós hártya és a nyálkahártya kompartmentjei között csak akkor jöhet létre, ha a NKA traszporterek térbeli elhelyezkedése szigorúan meghatározott, illetve lap szerinti vándorlásuk a membránban nem lehetséges az apikális és bazolaterális membránok határán lévő szoros kapcsolatok miatt [56]. Ez a polaritás szükséges a tubuláris transzport megfelelő működéséhez (4.ábra).
17
4.ábra A proximális kanyarulatos csatornában végbemenő transzportfolyamatok lumen
interstícium
Na+/H+ cserélő
Na+
Na+
H+
HCO3-+H+ H2CO3-
K+
OH-+CO2HCO32-es típusú szénsavanhidráz H20+CO2 4-es típusú szénsavanhidráz
Na+/K+ -ATPáz
Na+ CO2 HCO3-
ClH20
K+ csatorna
Na+/3HCO3kotranszporter
Na+ glükóz, foszfát, aminosav, peptid 4. ábra. A NKA működése a vese proximális tubulussejtjében elengedhetetlen feltétele a Na+, víz, glukóz, aminosavak, peptidek, foszfát visszaszívásának, a H ionok kiválasztásának és a sav-bázis rendszer szabályozásának. A NKA szívizomban is központi szerepű, hiszen ez az enzim tartja fenn az elektrokémiai iongrádienst, amely lehetővé teszi a Ca ion koncentráció változását és a szívizom összehúzódó képességét. Működése direkt befolyásolja a Na+/Ca2+ antiportert, és ezen keresztül a pumpafunkciót [46]. Az irodalmi adatokból ismert, hogy a NKA aktiválása és gátlása is vezethet a szívizom összehúzódási képességének javulásához. A két mechanizmus nagyban különbözik
egymástól.
A
gátlás
megvalósulhat
gyógyszerként
használt
digitálisz
készítményekkel és endogén digitáliszokkal (5. ábra). A szívizom összehúzódó képességének javítása, a pozitív inotróp hatás a frekvencia fokozása nélkül számos klinikai helyzetben kívánatos. A digitáliszok, a NKA endogén és exogén gátlószereinek hatását régóta imserjük illetve alkalmazzuk klinikai gyakorlatban szívelégtelenségben, de csak az utóbbi tíz évben merült fel, hogy a NKA aktiválása is lehet pozitív inotróp hatású izolált patkány szívizomsejtekben in vitro, és in vivo egér szívben; a klinikai felhasználás azonban még várat magára. A NKA specifikus, mesterséges aktivátora a SSA412 nem befolyásolja a Na+/Ca2+
18
antiporter működését, nem okoz intracelluláris (ic) Na+ koncentráció emelkedést, hanem a NKA-on keresztül fokozza az L típusú Ca2+ csatorna aktivitását. Szívizomban az L típusú, plazmamembránhoz asszociált, feszültségfüggő Ca2+ csatornák serkentik a szarkoplazmás retikulum (SR) Ca2+ csatornáját, ami a citoplazma Ca2+ jelét erősíti. Ez a pozitív inotrop mechanizmus nagyban különbözik az ouabain által indukált pumpa gátlás és következményes ic Na
+
koncentráció valamint Ca2+ beáramlás növekedést indukáló hatásától (5. ábra). Az
aktivátor hatására létrejött ic Ca ion koncentráció emelkedés nem jár Na+ áram változással, nem ritmuszavarkeltő, ellentétben a digitáliszok hatásával [57].
Ca2+
5. ábra Digitálisz hatása a szívizom kontraktilitására
Ca2+ ATPase PM SOCs
Ca2+ Na+
ANGII ED
Na+ AT1R
NCX
NKA
Na+ Ca2+ Ca2+ plasmERoszóma
+
Na+ K+
IP3R
SERCA
+ Ry R
ER/SR
Ca2+ Ca2+ Ca2+ 2+ 2+ Ca2+ Ca 2+ Ca 2+ 2+ Ca Ca Ca2+ Ca2+ Ca
Ca2+ Ca2+ Ca2+ Schoner W,2007 alapján Ca2+ 5. ábra. A plazmamembrán alatt feltehetően létezik egy speciális kompartment, a plazmERoszóma. A NKA gátlás vagy a SOCs aktiválódás hatására ebben a kompartmentben a Na+ koncentráció átmenetileg megemelkedik, mely az icCa2+ koncentráció növekedéséhez vezet. Ezt a jelet tovább erősíti az SR/ER Ca2+ koncentrációjának növekedése és az IP3R-RyR útvonalon ható egyéb szignálok (pl. ANGII). Ha a NKA nem gátolt, akkor a plazmERoszómából a PM Ca2+-ATPáz és a NCX távolítja el a Ca2+ ionokat. Rövidítések: ANGII: angiotenzin II, AT1R: az angiotenzin II 1-es típusú receptora, ED: endogén digitáliszok, IP3R: IP3R: inozitol-trifoszfát receptor, NCX: Na+/Ca2+ antiporter, NKA: Na+/K+-ATPáz, SOCs: store operated channel, SERCA: Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPáz, RyR:ryanodin receptor
19
5.3.2. A NKA szerkezete
A NKA egy transzmembrán, heterotetramer felépítésű enzim, amelynek három alegysége ismert (α, β, γ). Az α alegység egy körülbelül ezer aminosavból álló, tíz transzmembrán régióval rendelkező fehérje, amely a katalitikus aktivitásért felelős [58-60]. Extracelluláris oldalán találhatóak a kálium és oubain kötőhelyek, míg a nátrium és az ATP kötőhelyek a citoplazma felőli oldalon helyezkednek el (6. ábra). 6. ábra A NKA szerkezete Ouabain kötőhelyek Kálium kötőhelyek K+ EC β
α
α
γ
β
IC Na+
ATP kötőhelyek Nátrium kötőhelyek
6. ábra. A NKA egy heterotetramer felépítésű fehérje, mely két α és két β alegységből, illetve vesében egy kiegészítő γ alegységből áll. Az alegységeknek számos izoformája ismert, amelyek expressziója szövetspecifikus. Az α alegységek extracellulárisan kötik a K ionokat és receptorként szolgálnak az ED-ok számára. A Na ionokat és az ATP molekulákat intracelluláris oldalon kötik az alegységek. Rövidítések: NKA: Na+/K+ -ATPáz, EC: extracelluláris, ED: endogén digitáliszok, IC: intracelluláris Az enzim β alegysége 370 aminosavból áll, egyszeresen transzmembrán, N-glikált molekula [59]. A β alegységen az extracelluláris oldalon N-glikációs láncok találhatóak [45]. Feladata a pumpa
érésének,
a
fehérje
foldingjának
és
stabilitásának
regulációja
[60].
Immunprecipitációval kimutatták, hogy a NKA mindig a sejt-sejt kapcsolódási pontok helyén található a sejtmembránban [61]. A β alegység révén az enzim direkt interakcióba lép a kadherinnel [58, 62], így felelős azért, hogy az α alegység a megfelelő helyen épüljön be a sejtmembránba. Az α-β kapcsolat szükséges az enzim aktivitásának megtartásához. A 20
vesetubulus és a hasnyálmirigy sejtjeiben [63-65], a NKA α és β alegységeihez kapcsolódik egy harmadik γ alegység is [58, 66]. A γ alegység az FXYD proteincsalád tagja, egyszeresen transzmembrán fehérje [63, 65]. A hasnyálmirigyben detektálható γ alegység mennyisége rendkívül alacsony, míg a vesetubulus sejtjeiben nagy mennyiségben szintetizálódik. A γ alegység vesetubulus-specifikus elhelyezkedése összefüggésben van a NKA aktivitásának szabályozásával [64]. Az α alegységnek négy izoformája ismert (α1, α2, α3, α4), amelyek közül a vesére, idegekre, tüdőre legnagyobb mennyiségben az α1-es izoforma jellemző [55, 67]. Vesében az α1 alegység mellett kis mennyiségben az α3-as izoforma [67, 68] is megtalálható. Az izoformák előfordulása magzati szövetekben (így magzati vesében is) eltérő [69]. A kifejlett szervezetben az α1-es izoforma mellett a vázizomban és a szívizomban az α2-es izoforma is kifejeződik. Az α3-as izoforma az idegszövetben, a petefészkekben és néhány fajban (pl. az emberben) a vörösvértestekben és a szívizomsejtekben mutatható ki. Az α4-es izoforma a herékben dominál [67, 70]. Az izoformák Kd értékei Na+, K+ és ATP kötés tekintetében eltérőek. Az α3 izoforma egészen alacsony ATP koncentráció mellett is aktív, így ischemiás körülmények között is működik. Az α1, α2 α3, α4 izoformák különböző mértékben ouabain érzékenyek [70]. A β alegységnek három izoformája ismert, melyek közül a β1-es izoforma fordul elő az epithelsejtekben, tehát a vesében is. A β alegység 1-es, 2-es és 3-as izoformái N-glikációs mintázatukban
különböznek,
a
különböző
izoformák
sejt-sejt
közötti
kapcsolatok
regulációjában betöltött szerepe is eltérő. Vesére az α1β1-es izoforma kombináció a jellemző, míg szívizomban az α1, α2, β1, β2 izoformák kifejeződése jelentős [55, 61, 67].
21
5.3.3. A NKA lokalizációja szoros kapcsolatban áll funkciójával
Az epithelsejtek esetében már a sejt fejlődésének korai szakaszában megfigyelhető a NKA polarizált [71] elhelyezkedése. A pumpa mennyiségének kis hányada a perinukleáris régióban található, nagyobb hányada, pedig a bazális membránban helyezkedik el [61]. A NKA enzimatikus működése közben a sejtmembránban lokalizált, de a sejten belül megtalálható membránközeli vezikulákban is [72]. Ezekből különböző stimulusok hatására besorolódhat a sejtmembránba, s így ott rövid időn belül megnövekedhet az enzimaktivitás [72, 73]. Az intracelluláris vezikulákban elhelyezkedő enzimmolekulák sorsa nemcsak kihelyeződés, hanem lebomlás is lehet. Továbbá lehetséges, hogy az éppen újonnan szintetizálódó NKA közvetlenül kihelyeződik a plazmamembránba anélkül, hogy a membránközeli poolban (raktárban) várakoznia kellene (7.ábra). Az intracelluláris vezikulákban elhelyezkedő enzim, jelátviteli utak kiinduló pontjaként szolgál és így szabályozhatja a sejt működését. A NKA egy része a kaveolákban foglal helyet [74]. A kaveolák
olyan
membrán
betüremkedések,
amelyek
gazdagok
koleszterinben,
glikoszfingolipidekben és szfingomielinben [72, 75]. Ezekben a kaveolákban a NKA-hoz különböző proteinek kötődnek, és a létrejövő kapcsolat révén szignál transzdukciós folyamatok indulnak el.
22
7. ábra NKA elhelyezkedése és funkciója Na+ K+
β
α α
β Kav
PI3K
EGFR
ED
Kav
β α
α β
Src
ER KKV
jelátvitel
lebomlik
iontranszport
sejtmag
7. ábra. A NKA funkciója függ a szubcelluláris elhelyezkedésétől. A plazmamembránban klasszikus iontranszport funkciót tölt be az enzim. A plazmamembrán kaveolinban gazdag terültein elhelyezkedő NKA képes klatrinnal fedett vezikulumként endoszomákba kerülni, onnan ismét kijuthat a plazmamembránra vagy lizoszómákban lebomolhat. Az endoszomákban a NKAval együtt internalizálódik a PI3K, src, és az EGFR is. Ezekről jelpályák aktiválódhatnak, csakúgy mint a plazmamembránban elhelyezkedő NKA tartalmú kaveolákról, melyeket szignaloszomának neveznek [76]. Rövidítések: ED: endogén digitálisz, EGFR: epidermális növekedési faktor receptor, ER: endoplazmás retikulum, Kav: kaveolin, KKV:klatrinnal fedett vezikulum, NKA: Na+/K+ -ATPáz, PI3K: foszfatidil-inozitol-3-kináz, Src: tirozin kináz. A NKA proteinkötő helyei nem olyan konzervatívak, mint a katalitikus funkcióért felelős domén, tehát az evolúció során később jelentek meg. A kaveolákban a NKA-hoz kötődő fehérjék közt szerepel a kaveolin, a klatrin, az ankirin, az adducin és a γ alegység [75, 77]. A NKA tartalmú kaveolák az ún. szignaloszómák, amelyről egyebek között az Src Tyr kináz-PLC-IP3 útvonal, a MAPK útvonal, az Akt aktivációja indul ki. Az innen induló jelátviteli utak szabályozzák a sejt génexpresszióját, sejt-sejt közötti interakcióit, a sejtpolaritás kialakulását, a fehérje trafficking folyamatait, a sejten belüli ionmozgásokat és a proliferatív és apoptotikus
23
jeleket [77-79]. Ismert, hogy az oubain indukálta endocitózis sejttípustól függően apoptózist vagy hipertófiás/ proliferációs választ indukál [77].
5.3.4. A NKA aktivitását befolyásoló tényezők
Az enzimaktivitást mindazon tényezők befolyásolják, amelyek megváltoztatják a plazmamembránban
elhelyezkedő
NKA
aktivitását,
és
amelyek
megváltoztatják
a
plazmamembránban elhelyezkedő aktív pumpák számát. A sejtmembránban elhelyezkedő pumpák aktivitása főként az α alegységeken szabályozódik. A renális NKA jóval a maximális sebessége alatt működik, közel a MichelisMenten állandójához, így az enzim Na+ és a K+ iránti affinitásában bekövetkező kis változás is jelentősen megváltoztatja az iontranszportot [52]. A tubulussejt bármilyen transzporterének aktivitásváltozása, amely az intracelluláris (ic) Na + szint növekedéséhez vezet, megnyilvánul a NKA aktivitásának növekedésében is. Az enzimmennyiség a sejtmembránban megnövekedhet azáltal, hogy több molekula szintetizálódik, illetve, hogy a sejtben már jelenlevő intracelluláris, inaktív vezikula poolból az enzim kihelyeződik, továbbá, hogy csökken az enzim degradációja.
5.3.4.1. Az α alegység foszforilációs mintázata
Az α alegység több ismert intracelluláris foszforilációs hellyel rendelkezik. Az enzim foszforilációs mintázata befolyásolja az enzim lokalizációját és kationok iránti affinitását. [8085]. A foszforilációval kapcsolatban beszélhetünk az enzim bazális foszforiláltsági állapotáról (össz-foszforiláció)
és
egy-egy
foszforilációs
hely
konkrét
foszforilációjáról
vagy
defoszforilációjáról [54]. A foszforiláció mértékét kinázok és foszfatázok befolyásolják. Több jelpálya aktivációja együttesen befolyásolja az enzim foszforilációs állapotát és foszforilációs mitázatát. Bizonyos hatások közvetítésénél az is ismert, hogy az enzim össz-foszforilációjában nem áll be változás, de a helyek más kombinációban foszforiláltak/defoszforiláltak [81]. Az α alegység foszforilációs helyei az N-terminálistól kezdve a következőek (8.ábra): tirozin 10, amelyet az inzulin jelpálya foszforilál, szerin 11, 16, 18 és 23, amelyekre az
24
angiotenzin II és a dopamin jelpálya van hatással, és szerin 943, amit a PKA foszforilál az adrenerg jelpálya aktiválódása során.
8. ábra Az alfa 1 alegység szerkezete és szabályozása Extracelluláris tér
Kaveolin kötő domén
Citoplazma Aktivátor domén
PKC PKC
Ser 18, 23 Ser 11, 16
TK
Tyr 10 NH2
Asp
Ser 943 PKA
Katalitikus foszforiláció
Nukleotid kötő domén
COOH
8. ábra. A NKA α alegysége 10 transzmembrán doménnal rendelkezik. Mind az N-, mind pedig a C- terminális végek intracitoplazmatikusan helyezkednek el. Az eddig ismert aminosavak, melyeket a PKC és különböző tirozin kinázok foszforilálnak az NH2 vég közelében találhatóak. A tyr-10 és a Ser 16 aminosavak az eddig klónozott összes α1 alegységen azonosak, míg a Ser23-as foszforilációs hely patkányra specifikus. A PKA által foszforilált Ser-943 aminosav a C terminálishoz közel helyezkedik el. Rövidítések: Asp: aszparagin, COOH: C- terminális, NH2: N- terminális, PKA: protein kináz A, PKC: protein kináz C, Ser: szerin, TK: tirozin kináz, Tyr: tirozin A különböző jelpályákban végbemenő foszforilációs változások jelenleg is kutatás tárgyát képezik [81, 83, 84, 86, 87]. A katalítikus alegységet a különböző hormonhatások aktiválására a PKC az N terminális Ser11, Ser18 és Ser23 [88] helyzetben foszforilálhatja, míg a PKA a Cterminális Ser943 aminosavához kapcsol foszfát csoportot [89]. A reverzibilis kovalens módosításnak szerepe van a NKA celluláris kompartmentek közötti mozgásában, [86, 90] hozzájárul az enzim aktivitás szabályozásához [88].
25
5.3.4.2. Az α alegységhez extracellulárisan kötődő oubain szerepe
Már az 1950-es években igazolták, hogy a strofantin (szívglikozid) specifikusan gátolja a vörösvértestek aktív Na + pumpáját. Egy évtizeddel később Skou mondta ki azt, hogy a NKA a szívglikozidoknak specifikus receptoraként működik. Már az 1980-as évektől kezdve foglalkoznak az endogén digitálisz-szerű (ED) anyagok azonosításával, bioszintézisükkel, fiziológiai és patológiai jelentőségükkel. A strofantinon kívül a digoxint és további 4 endogén szívglikozidot izoláltak. Az ED-ok a mellékvese zona fasciculataban termelődnek, bizonyítottan hormonként viselkednek, a szteroid hormonok új csoportját képezik; szerepük van a szervezet vérnyomásának valamint só- és vízháztartásának szabályozásában [91]. A minden sejtben jelenlévő NKA működésének befolyásolásán túlmenően, fiziológiás körülmények között szabályozzák
a
sejtnövekedést,
a
fehérjeszintézist.
Patológiás
körülmények
között
koncentrációjuk emelkedhet, és kulcsszerepet játszanak különböző kórképekben, elsősorban az esszenciális hipertónia kialakulásában. A diabetes mellitus és a diabéteszhez társuló magasvérnyomás az adrenerg, valamint a reninangiotenzin rendszer működésének fokozódásához vezet. A katekolaminok és az angiotenzin II serkenti a mellékvesekéreg zona fasciculatajának endogén digitálisz (ouabain) elválasztását [92] (9. ábra). A mellékvese kéreg sejtjeiben az ouabain adrenalin és noradrenalin, valamint ANGII hatására szabadul fel. AT1R blokkolóval, ACE gátlóval és béta blokkolóval az ouabain termelés gátolható. Az ic Na+ koncentráció emelkedés növeli az ACE szintézisét, így az ouabain elválasztást is fokozza. Az emelkedett ouabain koncentráció (pl diabéteszben) a katekolaminok elválasztását fokozza, melyek a plazma renin koncentrációt emelik. Mindezen hatások pozitív visszacsatolás útján fokozzák az ouabain keletkezését és emelik a vérnyomást [91].
26
9. ábra Az endogén digitáliszok felszabadulásának szabályozása
Szérum Na+ Hipoxia, Izommunka Diabetes mellitus Nefropátia Szívelégtelenség
Vese juxtaglomeruláris sejtek
ANGIOTENZIN I
ADRENERG RENDSZER
renin
ANGIOTENZINOGÉN
ACE KATEKOLAMINOK
ANGIOTENZIN II
zona fasciculata OUABAIN
Somogyi, 2004 (átdolgozva)
9. ábra. Diabéteszben, diabéteszes nefropátiában és szívelégtelenségben a renin- angiotenzin és az adrenerg rendszer működése fokozódik. A katekolaminok és az angiotenzin II serkenti a mellékvesekéreg endogén digitálisz elválasztását. A ouabain a NKA-hoz kötődve az enzim internelizációját serkenti, plazmamembránhoz kötődő aktivitását csökkenti és számos jelátviteli utat indukál. Rövidítések: ACE: angiotenzin-konvertáló enzim, NKA: Na+/K+ -ATPáz A ouabain a NKA-hoz kötődve az enzim internalizációját idézi elő és többféle jelátviteli utat indukál. Az enzim aktivitását az α alegységhez extracellulárisan közvetlenül kötődő ED-ok is szabályozzák. Az oubain kötődésekor konformációváltozás jön létre, amelynek hatására az enzim affinitása a kationokhoz csökken, illetve az enzim endocitózisa következik be [45, 77]. Az α alegység különböző izoformái eltérő mértékben érzékenyek az oubainra; legkevésbé az α1 érzékeny, ezt az irodalomban oubain-inszenzitív izoformának is nevezik [93, 94]. Az ED-ok legismertebb fiziológiás szerepe a vérnyomás szabályozása. Érdekes, hogy magasvérnyomás betegségben, diabetes mellitusban, izommunka során, szív és veseelégtelenségben megnövekszik a keringő ED-ok koncentrációja. A magasvérnyomás ”circulus vitiosus”-át a megnövekedett ED szinttel is magyarázzák, amely hosszú távú digitálisz terápia iatrogén következményeként is kialakulhat. [91]. Az ED-ok hatására a Na és Ca ionok egyensúlya felbomlik a membrán két
27
oldalán és a Na+/Ca2+ antiporter működésének megfordulása révén Ca2+ koncentráció emelkedés alakul ki a citoplazmában. Már kismértékű Ca2+ koncentráció növekedés is Ca2+ beáramlást okoz a SR-ba, ami nagyobb mértékű és hosszabb idejű izom-összehúzódást idéz elő az ér endotheliumában és a szívizomsejtekben. Ez az alapja annak, hogy a szívglikozidok bár nátriuretikus hatással bírnak, emelik a vérnyomást és a szívelégtelenség tüneteit részben enyhítik.
5.3.4.3. Hormonális szabályozás
Számos hormonról tudjuk, hogy megváltoztatják a NKA rövid vagy hosszútávú aktivitását. A szteroidok hosszútávon növelik az enzim aktivitását az által, hogy megnövelik az α és β alegységek expresszióját. A nemi hormonok eltérően befolyásolják a NKA enzim expresszióját és aktivitását az egyes fajokban és szövetekben. Az in vivo modellekben nyert eredmények ellentmondásosak. In vitro körülmények között a 17-ß ösztradiol kezelés csökkenti a NKA enzim aktivitást. A folyamatban az ösztrogén receptor-2 közvetlen szerepét feltételezik, mivel a receptor blokkoló tamoxifen hatására az aktivitáscsökkenés elmarad. Ezzel ellentétben humán vörösvértesten és limfocita sejtkultúrákban több, független munkacsoport a 17-ß ösztradiol kezelés serkentő hatását írta le A tesztoszteron hatására a NKA aktivitásának növekedését észlelték patkány agy, illetve máj szövethomogenizátumok vizsgálata során, míg a szubmandibuláris nyálmirigy pumpafunkciójában nem volt változás. Fekete és mtsai. ischémiásreperfúziós vesekárosodásban figyelték meg, hogy az akut veseelégtelenség tolerálásában nemi különbségek figyelhetőek meg, amelyek az NKA működésének különbségeiből adódhatnak [95]. Az aldoszteronról ismert, hogy 1-es típusú receptorán keresztül hat az mRNS kifejeződésre. A katekolaminok közül a dopamin a vesében gátolja a NKA aktivitását, amely fontos fiziológiás szabályozó mechanizmus magas sótartalmú étrend mellett. Chibalin és munkatársai bizonyították, hogy a dopamin által aktivált PKC jelátviteli út a NKA pumpák endocitózisát eredményezi. A PKC a patkány vesében lévő NKA α alegységét Ser 23 helyzetben foszforilálja [86]. Az adrenalin és a noradrenalin növelik a NKA aktivitását. A dopaminhoz hasonlóan, hatásuk szövetspecifikus. Jó példa a szövetspecificitásra az adrenalin NKA aktiváló hatása izomterhelés után kialakult hiperkalémiában vagy a noradrenalin dopaminhatást antagonizáló funkciója a vesében. Vesetubulus sejtekben azt is megfigyelték, hogy kis intracelluláris (ic) nátrium
28
koncentráció emelkedés hatására a dopamin 1-es receptorok (D1R) membránba sorolása következik be, míg az angiotenzin 1-es receptorok (AT1R) mennyisége csökken. A folyamatban nátrium-szenzor fehérjének szerepét feltételezik, amely finoman szabályozná a tubulussejt Na+ reabszorbcióját. Az ic nátrium koncentráció változtatásával a NKA maga is befolyásolja az őt szabályozó hormonális rendszerek jelpályáit [90]. A peptid hormonok közül az inzulinnak fontos szerepe van a K+ homeosztázis kialakításában. Az inzulin hatásának mechanizmusa a NKA-ra egyike a legintenzívebben kutatott kérdéseknek, ám ennek ellenére még ma is sok részletében hiányos. Az akut inzulin hatásra a NKA intracelluláris poolokból mobilizálódik és a sejtmembránhoz transzlokálódik. Az akut inzulin hatás a pumpa gyors szabályozását teszi lehetővé, amelyet elsőként harántcsíkolt izomban írtak le [96]. Harántcsíkolt izomban az α2β1 izoformájú alegységek felelősek a pumpa gyors mobilizációjáért. A nyugalomban lévő harántcsíkolt izomban az 21 alegység izoformák túlnyomó többségükben intracelluláris membránokhoz kötötten helyezkednek el és inzulin-hatásra kihelyeződnek a plazmamembránra. Ezzel megnövelik a K+ beáramlását és a Na ionok kiáramlását a sejtekből [97, 98]. Ma már tudjuk, hogy az 21 alegység izoformák mellett az 11 alegység izoformák is reagálnak akut inzulin hatásra csak sokkal kisebb mértékben [99]. Szívizomban idáig az akut inzulin NKA-ra gyakorolt hatását nem vizsgálták. Más szövetekben például a vese kérgi tubulusaiban az inzulin hatására a NKA affinitása megnövekszik a Na+ iránt és az α1β1 izoforma plazmamembrán transzlokációja is növeli az aktivitását [96]. A különböző szöveti hatásokat az α alegység Tyr10 helyzetben lévő aminosavának foszforilációja indítja be [85, 100]. A krónikus hiperinzulinémia hatására az angiotenzin 1-es receptorának szintje is megnő. Sokáig úgy gondolták, hogy a proximális kanyarulatos csatornában az ANGII közvetlenül csupán a Na+/H + antiportert stimulálja, s az intracelluláris Na+ koncentráció növekedése másodlagosan növeli a NKA aktivitást. Azóta azonban kimutatták, hogy az ANGII az 1-es receptorán keresztüli jelátvitel útján közvetlenül is serkenti a NKA működését [52, 101, 102]. Az AT1R és a dopamin jelpályák során a szerin foszforilációs helyeken figyelhetünk meg változásokat [84, 103]. Az AT1R-on induló jelátvitel Gq útvonalon, PKC β és különböző foszfatázok (kalcineurin) aktiválódása révén növeli a NKA aktivitását [81, 85, 103, 104]. Ezzel szemben a D1R-on keresztüli jelátvitel a PKC ζ izoformájának aktiválódása következtében csökkenti a NKA enzimaktivitását [85-87]. További kutatások tárgyát képezi az angiotenzin 2-es receptorának (AT2R) jelátviteli útja is, amelynek hatása az AT1R-al éppen ellentétes, máig sem teljesen ismert
29
mechanizmus. Feltehetően a NO-cGMP-PKG útvonalon vezet a NKA aktivitásának csökkenéséhez [105-107]. Más peptid hormonok is szabályozzák a NKA működését, így az IGFI, EGF, vazopresszin, ANP, BNP, endothelin is. Az enzimműködésben beálló változások a foszforiláció hatására szövetspecifikusak. Ugyanaz a foszforilációs szignál eltérő hatást vált ki veseszövetben, mint pajzsmirigysejtekben, zona glomerulosában vagy a harántcsíkolt izomban [104, 108]. Így például pajzsmirigysejtekben AT1R aktiválódása révén, PKC ζ mediálta Ser16 és 23 foszforiláció következik be, majd a NKA aktivitás és transzlokáció nő [108]. A vese tubulussejtjeiben az AT1R hatására a PKC β izoformája aktiválódik, a ζ izoformát a dopamin jelpálya befolyásolja. Mindkét PKC izoforma foszforilálja a Ser23-at, ám az enzim aktivitásában mégis ellentétes változások következnek be, feltehetően a többi foszforilációs helyen bekövetkező eltérő változások miatt [109].
5.3.5. A NKA működésének változása diabetes mellitusban
Az inzulinhiányos állapotok (diabetes mellitus) hosszútávú hatása a pumpa aktivitására ellentmondásos; a pumpaaktivitás fokozódására és csökkenésére is találunk példát az irodalomban (1. táblázat). 1976-ban Das és kollégái az NKA aktivitásának csökkenését mutatták ki diabéteszes patkányok
nervus
ischiadicusában
[110],
míg
egy
másik
munkacsoport
1978-ban
aktivitásnövekedést észlelt diabéteszes állatok vékonybél nyálkahártya sejtjeiben [111]. A két kísérlet jól mutatja, hogy a diabétesz hatása a NKA-ra szövetspecifikus. A szemlencsében, szívizomban, nervus ischiadicusban, vörösvértestekben a cukorbetegség csökkenti a NKA aktivitását, míg vékonybél nyálkahártyában, májsejtekben illetve a vese egyes területein növeli az aktivitást. A vese és az agy két olyan terület, ahol a jelenlegi kutatások ellentmondásos eredményekre vezettek (1. táblázat). Munkacsoportunk 1995-ben kimutatta, hogy diabéteszben a vese medulláris állományában jelentősen megnövekszik az alegységek mRNS expressziója, míg a kérgi állományban ugyanezt nem tapasztaltuk. 2002-ben Scherzer and Popovtzer vizsgálatai szerint a nefronok teljes hosszában ki lehet mutatni az mRNS expresszió növekedést [112]. A diabéteszben megfigyelt NKA expresszió különbségeit magyarázhatja, hogy míg korai diabéteszben az enzimaktivitás átmenetileg kompenzatorikusan növekedhet, a későbbiek során a kompenzáló képesség kimerülhet és az enzim aktivitásának csökkenése következik be. A
30
különböző eredmények hátterében méréstechnikai okok is állhatnak. A NKA összaktivitás mérésére több különböző módszer alkalmas, amelyek egy része intercelluláris kapcsolataiktól megfosztott sejteken méri a plazmamembránhoz (PM) kötődő aktivitást, míg egy másik része a sejteken belüli intracelluláris poolokban (IM) lévő NKA aktivitást is méri. Feltehető, hogy funkcionálisan különbséget lehet tenni a NKA plazmamembránban mért aktivitása és az intracelluláris poolban jelen levő NKA aktivitása között. Az intakt sejtek iontranszportjának szabályozásában, az elektrokémiai grádiens fenntartásában elsődlegesen a PM-ban elhelyezkedő NKA frakció a felelős. A NKA jelátvitelt befolyásoló funkcióját feltehetően inkább az intracelluláris poolban észlelt változások befolyásolják. A NKA megváltozott működésének hátterében diabéteszben több eltérő hatás szerepe, így a megváltozott hormonális környezet, az alacsony inzulin [113] és C-peptid szintek, az intracelluláris myo-inozitol mennyiségének csökkenése a PKC aktivitás változása is felmerült. Ezek valamennyien közvetlen hatást gyakorolnak a NKA hosszútávú szabályozására [114]. A cukorbetegségben kifejezett hiperglikémia, oxidatív stressz, a felhalmozódó glikációs termékek, a megváltozott szabad zsírsav koncentráció és a fiziológiástól eltérő zsírsav arány is hozzájárulhat a NKA aktivitásának változásához [115]. Harántcsíkolt izomban több munkacsoport, köztük a mi munkacsoportunk is arra az eredményre jutott, hogy a cukorbetegség izoforma-specifikus változásokat okoz az α alegység expressziójában, ami befolyásolhatja az enzim aktivitását. Nishida és munkatársai 14 nappal a diabétesz indukciója után az α2 alegység expressziójának növekedését észlelték, míg a β1 alegység kifejeződése szignifikánsan csökkent [116]. Az enzimaktivitás a β1 alegységnek megfelelően csökkent. Látszik, hogy az egyes izoformák koncentrációjának változása nem feltétlenül korrelál az enzimaktivitással, hiszen a pumpa csak megfelelő sztöchiometriai arányban összekapcsolódott alegységek esetén funkcióképes.
31
1. táblázat A NKA aktivitásának változása a különböző szövetekben 1-es típusú diabéteszes patkányokban. Szövettípus Szívizom Teljes vese Glomerulusok Medulláris vastag felszálló szár Proximális tubulus Harántcsíkolt izom
NKA aktivitás ↓ ↑ ↓ ↓
Irodalmi hivatkozások
↑ ↓
Ziegelhoffer és mts. 2003[23] Ianello és mts., 2006[114] Cohen és mts., 1985[117] Tsimaratos és mts., 2001 [118], Vér és mts., 1995 [47] Körner és mts., 1994 [48] Chibalin és mts., 2007 [119]
Máj
↑
Sennoune és mts., 2000 [120]
Aorta
↓
Vörösvérsejt
↓
Ohara és mts.,1991 [121], Aydemir-Koksoy és mts., 2008 [122] Temel és mts., 2007 [123]
Hepatocita
↓
Carnovale és mts., 1991 [124]
Agy homogenizátum Nervus vagus
↔,↓ ↓
Vér és mts., 1995 [125], Zarros és mts., 2009 [126] Nowak és mts., 1995[127]
Vékonybél mucosa
↑
Gnanaprakasam és Srivastava, 1978 [111], Wild és mts.,1999 [128] N ischiadicus ↓ Coste és mts.,1999 [129] + + Diabétesz hatására a Na /K -ATPáz aktivitása () nő, () csökken, () nem változik.
5.4. A cukorbetegségben használt kezelési módok támadáspontjai
A nagyszámú betegen, randomizált kontrollált körülmények között végzett vizsgálatok alapján (UKPDS: United Kingdom Prospective Diabetes Study, DCCT: Diabetes Control and Complications Trial ) tudjuk, hogy az egészségesekét megközelítő anyagcsere fenntartásával lehet a leghatékonyabb módon késleltetni a diabétesz hosszútávú szövődményeinek kialakulását. Az életmódváltás, a hatékony inzulin terápia, az inzulin rezisztens szövetek érzékenyítése (pl. metforminnal), a megfelelő vérnyomás kontroll (ACE gátlók, AT1R gátlók), a diszlipidémia és a trombózisgátlás kombinálásával érhetjük 32
le, hogy a betegség progressziója lassuljon. Gyógyítani azonban a cukorbetegséget ma még nem tudjuk, mivel feltehetően nem ismerjük az összes támadáspontot, amely az eredményes terápia kialakításához szükséges. A RAS részt vesz a vérnyomás és a folyadékháztartás fiziológiás szabályozásában. Ennek következtében fontos szerepet tölt be a diabéteszhez társuló magasvérnyomás, a szívelégtelenség és a veseelégtelenség pathogenezisében. Számos bizonyíték támasztja alá, hogy az angiotenzin II befolyásolja a veseszövet és a szívizom károsodásának kialakulását 1-es típusú diabéteszben, valamint az 1-es típusú diabétesz kísérletes állatmodelljében is. Intravénás STZ injekciót követően a renin és az angiotenzin II szintjének emelkedése, valamint a renális AT1R megváltozott mennyisége figyelhető meg a diabéteszessé tett patkányokban [130]. Ezen kívül STZ-DM-ben a RAS blokkolása csökkenti az albuminuriát és késlelteti a végállapotú vesekárosodás kialakulását. Klinikai vizsgálatok is alátámasztják, hogy az ACE-gátlók és AT1R-blokkolók lassítják a nefropátia progresszióját [43]. A RAS specifikus gátlószerei az AT2R blokkoló szerek, például a losartan vagy a candesartan. A losartan per os adandó, kompetitív, szelektív AT1R antagonista. A losartan gátolja az angiotenzin II hatására adott presszor választ, csökkenti a vérnyomást, a proteinuriát, a fibrózis és az apoptózis mértékét, ezzel a vesekárosodás progresszióját lassítja [131, 132]. Felmerül, hogy a diabéteszes vesekárosodás kialakulásában szerepe lehet az ANGII NKA-t befolyásoló hatásának. A DNP-ban szenvedő állatokban ezért megvizsgáltuk az ANGII és a losartan kezelés hatását a NKA-ra, bízva abban, hogy eredményeink által jobban megérthetjük a RAS rendszer gátlásának antihipertenzív hatásán túlmutató jótékony terápiás hatását. A magyar és a nemzetközi ajánlások szerint 2-es típusú DM-ban a kezelés elsőként választandó szere az antihiperglikémiás metformin. A metformin egy biguanid típusú vegyület, amelynek hatásmechanizmusa a mai napig nem tisztázott teljesen. Ismert, hogy csökkenti a máj endogén glukóz kibocsátását és javítja a harántcsíkolt izom glukóz felvételét. A metforminról tudjuk, hogy a szerves kation transzporteren keresztül jut be a célsejtekbe (máj, izom), ahol az LKB1 (szerin/treonin protein kináz) és az AMPK (AMP aktiválta protein kináz) aktiválásán keresztül a Glut4 transzporter inzulintól független membrán transzlokációjáért felelős [133]. Mivel a harántcsíkolt izomban kifejeződő Glut4
33
és a NKA sejten belüli viselkedése, a szabályozásukban résztvevő jelátviteli elemek átfedik egymást, ezért felmerül, hogy a diabétesz kezelésben használt metformin a NKA működését is befolyásolja (10. ábra). 10. ábra Metformin feltételezett hatása Met LKB OCT1 ?
? Met
ACC-P
NKA
AMPK-P
Glut4 SREBP-1
NKA
Glut4
TORC2-P
SREBP-1 TORC2 sejtmag Zsírsav oxidáció
PGC-1α
Glukoneogenezis
Shu, Y, 2007. módosítva
10. ábra. A metformin egy biguanid származék, mely antihiperglikémiás gyógyszer, mert csökkenti a glukóz felszívódását és a máj glukoneogenezisét, valamint javítja a harántcsíkolt izom glukóz felvételét. A májsejtekben az OCT1, szerves kation transzporter szabályozza a metformin sejten belüli koncentrációját. Intracellulárisan foszforilációs kaszkádot indít el, az LKB1-által AMPK aktiválódik, mely gátolja a máj glukoneogenezisét, elősegíti a Glut4 transzporter plazmamembránba helyeződését és a zsírsavak oxidációját is fokozza. Felmerül, hogy a metformin befolyásolja a NKA szubcelluláris elhelyezkedését is. Rövidítések: ACC-P: foszforilált acetil-KoA karboxiláz, AMPK-P: foszforilált AMP aktiválta protein kináz, Glut4: glukóz transzporter 4, LKB: szerin/treonin protein kináz, Met: metformin, NKA: Na+/K+ -ATPáz, OCT1: szerves kation transzporter 1, SREBP: Sterol Regulatory Element Binding Protein, TORC2: target of rapamycin complex 2 [133] Különösen érdekes, hogy- bár az irodalmi adatok ellentmondásosak [134-136] - a gyógyszer számos vizsgálatban befolyásolta a vérnyomás alakulását. DNP-ban szenvedő patkányokban ezért megvizsgáltuk a metformin kezelés hatását a NKA-ra, bízva abban, hogy eredményeink által jobban megérthetjük a metformin antihiperglikémiás hatásán túlmutató kedvező terápiás hatását.
34
6. CÉLKITŰZÉSEK
A cukorbetegség hosszútávú szövődményeinek etiológiai faktorai között az oxidatív stressz, a hiperglikémia és a RAS aktivációja is szerepel. Kísérleteinkben, vesekéregben és szívizomban kerestük a patológiás morfológiai (tubulussejt és kardiomiocita hipertrófia, atrófia és interstíciális fibrózis) és molekuláris biokémiai elváltozások (pl NKA
megváltozott
Megvizsgáltuk,
működése)
hogy
a
összefüggéseit
diabétesz
kezelésében
ezen
etiológiai
gyakran
használt
faktorokkal. vegyületek
megváltoztatják-e a szívben és vesében észlelt elváltozásokat. Célul tűztük ki, hogy megvizsgáljuk: 1) szívizomban, a) a diabétesz, a krónikus inzulin kezelés és az ANGII hatását az antioxidáns státuszra (TSC) és a bal kamra hipertrófiára, valamint b) az akut inzulin kezelés hatását a NKA izoformáinak kifejeződésére, sejten belüli elhelyezkedésére és a pumpa aktivitására kontroll (K) és STZ diabéteszes (D) patkánymodellen; 2) vesekéregben a) a diabéteszes (D) állapot hatását a NKA izoformáinak kifejeződésére, szubcelluláris elhelyezkedésére és az enzim aktivitására, b) az ANGII kezelés hatását a NKA izoformáinak kifejeződésére, szubcelluláris elhelyezkedésére és az enzim aktivitására, c) az inzulinnal (DI), losartannal (DL) és metforminnal (DMet) kezelt diabéteszes állatokban változik-e a NKA szubcelluláris lokalizációja és aktivitása. Várható szakmai haszon: A diabéteszes szövődmények megelőzésében gyakorlati haszna lenne felismerni azokat az ANGII-re és inzulinra is érzékeny szövettípusokat, ahol a két hormon jelátviteli útjának kölcsönhatása befolyásolja a szöveti funkciót. Az interferenciapontok megismerése megteremthetné a célzott, specifikus terápia molekuláris alapjait, s így hozzájárulhatna a DM szövődményeinek kialakulásának késleltetéséhez.
35
7. MÓDSZEREK
Első kísérletsorozatunk során a STZ diabéteszes patkányokban kialakuló diabéteszes kardiomiopátiát és okait vizsgáltuk. 3 hétig fennálló kezeletlen és krónikus inzulin kezelésben részesülő STZ diabéteszes állatok teljes antioxidáns kapacitását (TSC) és az esetlegesen kialakuló bal kamrai hipertrófiát vizsgáltuk. Mivel a diabétesz szívizmot érintő szövődményei gyakran társulnak emelkedett ANGII szinttel, ezért megmértük a TSC változását 24 órás ANGII kezelés után. Munkacsoportunk már évekkel ezelőtt kimutatta, hogy STZ diabéteszben szívizomban a NKA expressziója és aktivitása csökken. A krónikus inzulin kezelés a változásokat kompenzálni tudta [113]. Nem vizsgálták azonban eddig az inzulin akut hatását a szívizomban kifejeződő NKA izoformákra, pedig az akut inzulinkezelés (ahogyan más szövetekben már leírták) a NKA foszforilációs
állapotának
és
szubcelluláris
elhelyezkedésének
befolyásolásával
hatékonyan képes a NKA működésének megváltoztatására. Második kísérletsorozatunk során a STZ diabéteszes patkányokban kialakuló veseszövődményeket és okait vizsgáltuk. A veseszövődmény etiológiai faktorai közül különös figyelmet szenteltünk az ANGII-nek. A szöveti károsodást ebben az esetben is klinikai és szövettani vizsgálatokkal jellemeztük. Mivel a vesebetegség kialakulásában is központi szerepe lehet a NKA működésének, ezért 7 hétig fennálló STZ diabéteszben vizsgáltuk a NKA alegységeinek kifejeződését, intracelluláris lokalizációját és foszforiláltsági állapotát. Megvizsgáltuk a NKA működés változásait a gyakorlatban használt losartan és metformin kezelés hatására is.
7.1. Kísérleti állatok
Vizsgálatainkat 4 hetes, hím Wistar patkányokon (testtömeg: 10030g) végeztük. Az állatokat állandó hőmérsékleten (20°C) és páratartalmon tartottuk 12 órás fény-sötétség ciklusban. Ivóvízhez és standard táplálékhoz ad libitum hozzáférhettek. A kísérletek során betartottuk az állatkísérletek végzéséről szóló 243/1998. XII.31. Kormányrendelet hatályos rendelkezéseit és a Semmelweis Egyetem ide vonatkozó TUKEB 99/94 rendelkezését.
36
A patkányokat az alábbi csoportokba osztottuk: 1) kontroll (K), 2) STZ-diabéteszes (3 hetes, 4 hetes, 7 hetes), 3) diabéteszes inzulinnal kezelt (DI), 4) angiotenzin II-vel kezelt kontroll (KA), 5) angiotenzin II-vel kezelt STZ-diabéteszes (DA), 6) losartannal kezelt STZ-diabéteszes (DL) 7) metforminnal kezelt STZ-diabéteszes (DMET) csoportokra. Valamennyi csoportban minimum n=5 kísérleti állatot vizsgáltunk.
7.2. Kísérleti körülmények beállítása; az állatok kezelése
7.2.1. STZ- diabétesz indukálása
A farokvénába injektált streptozotocint (STZ: 65 mg/kg iv, Sigma Chemical Co. Budapest) 0,1M citrát pufferben (pH 4,5) oldottuk fel. A nem-diabéteszes állatok ekvivalens térfogatú vivőanyagot kaptak. Csak azokat az állatokat választottuk be a kísérleti diabéteszes csoportba, amelyeknél a vércukor koncentráció értéke megegyezett vagy meghaladta a 15 mmol/l értéket.
7.2.2. Akut és krónikus inzulin kezelés a szívizom vizsgálatai során
A kísérlet folyamán altatásban (40 mg/kg pentobarbital, Abbott Laboratories, Budapest) 4 IU Humulin R inzulint (Lilly) adtunk az állatok farok vénájába, majd 20 perc elteltével dekapitáltuk az állatokat, vért és vizeletet vettünk, a megfelelő szerveket eltávolítottuk, ezeket felhasználásig -80°C-on tartottuk. Krónikus inzulin kezelés során az állatok napi két alkalommal kaptak közepes hatású inzulin készítményt (5-5 IU Humulin N, Lilly, szubkután) a diabétesz teljes fennállási ideje alatt.
37
7.2.3. Angiotenzin kezelés a szívizom és a vesekéreg vizsgálata során
Az angiotenzin hatásának vizsgálata során 24 órás angiotenzin hatást elemeztünk 3 és 7 héttel a cukorbetegség indukálása után. Anesztéziában (40 mg/kg ip. pentobarbital Na, Abbott Laboratóriumok, Budapest) egy ANGII-t (Sigma Chemical Co., Budapest) tartalmazó ozmotikus minipumpát (Alzet, Palo Alto, Kalifornia, USA; anyagáramlás sebessége: 33µg/kg/h, 24 h [137]) ültettünk a patkányok hátába a szubkután szövet közé. A kontroll állatok bőre alá a műtéti stressz, kísérletet befolyásoló hatásainak kizárása érdekében fiziológiás sóoldatot tartalmazó minipumpát ültettünk.
7.2.4. Losartan és metformin kezelés a vesekéreg vizsgálata során Következő kísérletünk alkalmával az AT1R blokkoló losartan hatását vizsgáltuk K és D állatokon. A losartant (Losartan-ratiopharm 50 mg filmtabletta, Ratiopharm Hungária, Budapest) per os adagoltuk 4 hetes diabéteszes és 4 hetes kontroll állatoknak 5 mg/ttkg/nap dózisban három héten keresztül. Harmadik kísérletünkben 7 hetes diabéteszben szenvedő patkányoknak per os 250 mg/ttkg metformint (Adimet 500 mg filmtabletta Ratiopharm Hungária, Budapest) adagoltunk 18 napon keresztül. A kísérleti állatoktól általános anesztéziában (40 mg/kg ip. pentobarbital Na, Abbott Laboratóriumok, Budapest), a mellkas és a has megnyitása után vér- és vizeletmintát vettünk, majd dekapitálás után eltávolítottuk az állatok jobb veséjét, amelyet folyékony nitrogénnel lefagyasztottunk és feldolgozásig -80°C-on tároltunk.
7.3. Általános és laboratóriumi paraméterek vizsgálata (metabolikus és renális)
A testsúlyt és a vese súlyát megmértük és a vese/testsúly hányadost kiszámoltuk. A szérum és vizelet nátrium, kálium szintjeit és a vesefunkció paramétereit (BUN, kreatinin) a forgalomban lévő fotometriás elven működő kitek segítségével (BoehringerMannheim Diagnostic Systems) Hitachi-917 típusú automata spektrofotométerrel határoztuk meg.
38
A szérum glükóz koncentrációt a Boehringer Mannheim Diagnostic Systems, a szérum fruktózamin koncentrációt a Roche Diagnostics Kft. kitjei segítségével határoztuk meg. A frakcionált Na kiválasztás (FeNa) számítása a következő képlet alapján történt: (Nátriumvizelet×Kreatininplazma)/(Nátriumplazma×Kreatininvizelet)×100.
7.4. Az artériás középnyomás mérése
Az artériás középnyomást (MAP) radiotelerimetriás módszerrel mértük. A TL11M2-C50-PXT típusú transzmittereket (Data Sciences International) műtéti eljárás során patkányok hasüregébe ültettük be. A patkányokat steril körülmények között elaltattuk (pentobarbital sodium, 40 mg/kg, ip. Abott Laboratóriumok, Budapest), majd a transzmitter katéterét az abdominális aortába juttattuk, a transzmitter készüléket pedig a hasfalhoz varrtuk. A műtét után a patkányok antibiotikumot kaptak egyszeri dózisban (1 ml/ttkg im. Tardomyocel, Bayer AG). 7 napig tartó lábadozási periódus után az állatok teljesen felépültek. A vérnyomásmérő készülék rádiohullámú jelet vevő RLA1000 típusú részét az állatok ketrece alá helyeztük. Az adatgyűjtéshez, mentéshez és feldolgozáshoz Dataquest IV programot (Data Sciences International) alkalmaztunk. A számítógép 24 órán keresztül minden második percben 10 másodpercen keresztül analizálta a vérnyomásértékeket. A Dataquest IV rendszer segítségével 30 perces periódusok átlagértékét számoltuk, ahol az alsó és a felső határértékek úgy voltak beállítva, hogy a biológiailag valószínűtlen értékek ne kerüljenek számításba.
7.5. Teljes szabadgyökfogó kapacitás mérése (total scavenger capacity, TSC)
A módszer elméleti alapja, hogy az antioxidánsok abszorbciós kapacitását mérjük hidroxil gyökökkel szemben, amelyek hatékony oxidáló szerek [5]. A teljes gyökfogó kapacitást (TSC) az állatok plazmájában kemilumineszcenciás módszerrel mértük (Lumat LB 9501) luminométert használva Blázovics és mtsai által leírt módszer alapján [138]. Ez a luminométer képes a szabadgyök és a luminol kémiai reakciója során képződő egyes fotonokat érzékelni a 390-620 nm hullámhossztartományban. Számítógépes feldolgozás 39
segítségével a teljes hullámhossztartományt analizáltuk, majd ezt követően a plazmából 0,15 ml mennyiségű mintát adtunk a H2O2-luminol-mikroperoxidáz tartalmú rendszerhez. 30 másodpercig mértük a fotonkibocsátást, amelyet RLU%-ban (relatív light unit %) adtunk meg. Az állatcsoportokban patkányonként öt párhuzamos mérést végeztünk (CI<5%,
p<0.05).
Az
1,1-difenil-2-pikril-hidrazil,
5,5-ditiobisz-2-nitrobenzoesav,
luminolt a Sigmától (Sigma Chemical Co., Budapest), míg az egyéb reagenseket a Reanaltól (Reanal Laborvegyszer Kft., Budapest) vásároltuk.
7.6. RT-PCR
Az összes reagenst, az enzimeket és izolációs kitek származási helye: Quiagen GmBH, Hilden, Németország. Az RNS izolálás (RNeasy total RNS Isolation Kit), c-DNS szintézis és a PCR reakció a NKA alfa 1 alegységére és a glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenázra (GAPDH) Fekete és mts. 2004-ben leírt módszerei alapján történtek [95]. 1 µg total RNS-ből minden mintából egyszálú cDNS-t szintetizáltunk, a felhasznált master mix összetétele a következő volt: 5xPCR puffer, 200U SuperScript II RNáz H- reverz transzkriptáz, 20 U RNázOUT inhibitor és 3,75 pg l-1 oligo dT12–18 primer. A PCR reakcióhoz a master mix elegy a következő komponenseket tartalmazta: 10xPCR puffer, 2 mM MgCl2, 2 mM dNTP, 1,5 U AmpliTaq DNS polimeráz,valamint 0,5 M forward (F) és reverz (R) primer. Az amplifikáció thermocycler készülékben történt, a denaturációt 94°C-on 15 másodpercig, az anneálást (NKA 1) 58°C-on 15 másodpercig, az amplifikációt 72°C-on 30 másodpercig, 35 cikluson keresztül folytattuk. Primerek: GenBank NKA1 (NM 012504), szekvencia F: 5'-AGA TTT GAG CCG AGG CCT AAC ACC-3'; szekvencia R: 5'-TCC GCC CTT CAC CTC CAC CAG AT-3' (418 bp-nyi termék). A mintákból glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) mRNS-t is izoláltunk, mennyiségét meghatároztuk és belső kontrollként használtuk. F: 5'-GGT GAA GGT CGG AGT CAA CG-3'; R: 5'-CTC ATC GCG CTT GCC AGT G-3' (496 bpnyi termék). Az amplifikáció paraméterei megegyeztek a NKA1-éval, kivéve az anneálás hőmérséklete, amely GAPDH esetén 55°C volt. A PCR termékeket 2,5%-os etidiumbromid agaróz gélen futtattuk.
40
7.7. Vese homogenizálás és szubcelluláris fehérjék szétválasztása
A vesekéreg mintát homogenizáltuk 4ºC-os hideg pufferben (60 mM HEPES; 1 mM EDTA; 1 mM EGTA; 100 mM NaCl; 100 mM NaF; 0,5 mM PMSF; 0,75 mg/L leupeptin és 0,1 mM DTT, pH:7,4) Potter-Elvehjem homogenizátor segítségével. A teljes (TOT) vesekéreg homogenizátumot centrifugáltuk (680 g 5 perc 4ºC) és -80ºC-on tároltuk.
Centrifugálás és Triton X-100 segítségével elválasztható egymástól a citoszkeletonhoz kapcsolódó, plazmamembránhoz asszociált NKA frakció (PM) és a szolubilis, nem citoszkeletális, intracelluláris membránokhoz asszociált NKA frakció (IM). Ezt a módszert már számos kutatócsoport használta, így megbízhatónak tekinthetjük a NKA szubcelluláris szétválasztására [139]. Hideg, 0,1%-os, 4 ºC-os Triton X-100 oldatot adtunk a homogenizáló pufferhez és ebben homogenizáltuk a vesekéreg szövetet. A homogenizátumot centrifugáltuk (35000g, 15 perc, 4ºC). A csapadékot, amely a PM-t tartalmazza homogenizáló pufferben szuszpendáltuk, és -80 ºC-on tároltuk. Az IM frakciót tartalmazó felülúszót (100000g, 60 perc, 4ºC). centrifugáltuk és a csapadékot homogenizáló pufferben szuszpendálva -80 ºC -on tároltuk.
7.8. Western blot analízis
A fehérje kifejeződés mérése Western blot analízissel történt. A felhasznált reagensek származási helye: Quiagen GmBH, Hilden, Németország. A mintákat szolubizáltuk 31,25 mM TRIS-HCl (pH 6,7), 1% SDS, 6,5% glicerin, 0,005% brómfenolkék
elegyében.
A
proteinek
azonos
mennyiségét
(5-50g)
10%-os
poliakrilamid gélen elektroforetikusan elválasztottuk, majd nitrocellulóz membránra transzferáltuk. A membránt Tween-20-at tartalmazó Western blot pufferben blokkoltuk 1 órán át szobahőmérsékleten. A membránokat NKA α1 alegység ellenes (UBI, Lake Placid, NY, USA 1:750 [95] hígítású poliklonális, illetve Santa Cruz, Ca, USA 1:1000 hígítású monoklonális) antitestekkel és 1:1000 hígítású NKA β1 alegység ellen termelt poliklonális antitesttel (UBI) 1 órán keresztül, szobahőmérsékleten inkubáltuk. A
41
Tweent- tartalmazó foszfát pufferrel történő mosást követően peroxidáz konjugált kecske ellenes (DAKO, Glostrup, Denmark, 1:2000 hígításban, Santa Cruz, Ca, USA 1:6000 higításban), illetve egér ellenes (Transduction Laboratories, USA 1:15000 higításban) másodlagos IgG antitesttel inkubáltuk 30 percen keresztül szobahőmérsékleten, majd ismét mostuk Western blot pufferrel. Az NKA foszforilációjának vizsgálatakor az alábbi antitesteket használtuk: NKA Ser23 (Santa Cruz 1:100 hígitásban) specifikus elsődleges antitest, valamint nyúl ellenes másodlagos antitest (Santa Cruz 1:6000 hígításban). A
fehérjéket
kemilumineszkáló
rendszer
segítségével
(AP-Biotech,
Buckinghamshire, UK) előhívtuk, és számítógépes denzitometriával analizáltuk, a GelPro Analyzer 3.1 szoftver alkalmazásával. Belső standardnak a -aktint (Sigma Chemical Co,
Budapest)
tekintettük,
1:10000-szeres
hígításban.
Az
értékeket
-aktinra
normalizáltuk, és relatív optikai denzitásként ábrázoltuk.
7.9. Sejtfelszíni biotiniláció
1. A biotiniláció elve A biotin kötődik a fehérjék lizinjének ε-, illetve N-terminális aminocsoportjához, Protein-biotin komplex alakul ki. A kísérlet során kizárólag a sejt felszínén elhelyezkedő fehérjék jelölődnek meg biotinnal, a későbbiekben ezeket tudjuk kimutatni. 2. A vizsgálat menete A vizsgálatokat n=12 hím patkányokon végeztük. Az állatokat két egyenlő csoportra osztottuk: kontroll (K) és (D) csoportra. Kardiomiocitákat izoláltunk [140]. Az állatok szívét pentobarbital anesztéziában (5 mg/100 g testsúly ip pentobarbital Na, Abbott Laboratóriumok, Budapest) perfundáltuk, eltávolítottuk és az alábbi oldatban 126 mM NaCl; 4,4 mM KCl; 1 mM MgCl; 4 mM NaHCO3; 10 mM HEPES, 30 mM 2,3-butanedione monoxime; 5,5 mM glukóz; 1,8 mM piruvát; 0,04 mM CaCl2 (pH 7.3) és I-es típusú kollagenáz 0,9 mg/ml, 8–10 percig inkubáltuk, mostuk emelkedő kálcium kontcentrációjú oldattal (1 mM-ig). A sejteket leülepítettük és módosított Eagle’s médiumban 10% borjú embrió szérumban (fetal calf
42
serum, Invitrogen) tartottuk. A sejtek egy részét 10 nM inzulin, egy másik részét inzulin és Wortmannin (200 nmol/l; Sigma) jelenlétében 30 percig inkubáltuk. A biotiniláció során EZ-link Sulfo-NHS-SS-biotint tartalmazó PBS oldatot (1,5 mg/ml) használtunk, amelyben a kardiomiocitákat 4 ºC-on 60 percig finoman rázogattuk. Ezután a médiumot eltávolítottuk és a reakciót 100 mM glicint tartalmazó PBS-sel leállítottuk. A miocitákat háromszor átmostuk jéghideg PBS-sel, a maradék PBS-t eltávolítottuk. A sejteket homogenizáltuk (10 mM HEPES, 5 mM EDTA, 250 mM szacharóz, 10 g/ml aprotinin, 10 g/ml leupeptin és 0.1% Triton X-100 oldatban. 1 mg izomfehérje
lizátumhoz
50
µl
streptavidin-agaróz
gyöngyöt
(50%-os
PBS
szuszpenzióban) kevertünk. A mintákat másfél órán át inkubáltuk 4°C-on. 10 perc centrifugálás után a streptavidin gyöngyöket négyszer mostuk 0,1 % Triton-X-100-at tartalmazó PBS-sel és kétszer PBS-sel. Ezután Laemmli puffert adtunk az elegyhez és 56°C-on 20 percig melegítettük. A keresett fehérjéket Western blot analízissel mutattuk ki.
7.10. A NKA enzim aktivitás mérése
A NKA aktivitását strofantidin érzékeny 3-O-metilfluoreszceinfoszfatáz aktivitással mértük [47, 113]. Az aktivitást 19.5 mmol/L M 3-O-metilfluoreszceinfoszfát, 4 mmol/l MgCl2, 1 mmol/l EDTA, 80 mmol/l Tris-HCl (pH 7.6), 10 mmol/l KCl jelenlétében 100 µg szövethomogenizátumban mértük meg, amelyet 30 percig előzetesen 1%-os Nadezoxikoláttal (pH 7.4) 24°C-on inkubáltunk. 5 mmol/l strofantin jelenlétében, majd megmértük a gátlás mértékét és összehasonlítottuk a gátlószer nélküli aktivitással, így kiszámolható volt a strofantin érzékeny NKA aktivitás (mikromol fluoreszcein/mg fehérje/óra egységekben).
43
7.11. Fluoreszcens immunohisztokémia
Vese metszeteket hirtelen fagyasztottuk 30% szacharózban az immunhisztokémiai analízishez. A metszeteket beágyaztuk Shandon cryomatrixba (ThermoElectron Co.), 510 µm vastag szeletekre vágtuk thick cryostat-tal és felhasználásig -80ºC –on tároltuk. A szeleteket 10 percig mostuk PBS-ben és inkubáltuk 2 órán át szobahőmérsékleten az elsődleges antitesttel (megegyezik a Western blot analízisnél alkalmazottal: NKA α1 1:100 hígításban). Ismételt mosás után a szeleteket inkubáltuk a másodlagos antitesttel (Alexa Fluor 488, Invitrogen) 30 percig szobahőmérsékleten. A DNS-t 10 percen át szobahőmérsékleten festettük (Hoechst 33342 Sigma Co.). Ezután a szeletekre PBS-ben történt fürdetés után Vectashield fluoreszcens médiumot cseppentettünk (Vector Laboratories, Biomarker Ltd.). Kontroll szeletek esetében kihagytuk az elsődleges antitestet, hogy biztosak legyünk a Western blot analízis megegyező specificitásában és elkerüljük az autofluoreszcenciát. Konfokális felvételeket készítettünk Zeiss Axiovert LSM510 mikroszkóppal. PAS festéssel igazoltuk, hogy a vizsgált szövetminták a vese proximális tubulusait tartalmazzák [141].
7.12. Statisztikai analízis
Az adatokat STATISTICA.6 software (StatSoft® Inc.) programmal értékeltük ki. Ezek átlagát és szórását tüntettük fel, normál eloszlásukat Kolmogorov-Smirnov teszttel vizsgáltuk. A többszörös összehasonlításokat ill. lehetséges kapcsolatokat kétutas ANOVA teszttel elemeztük, majd Scheffe-féle post-hoc tesztet végeztünk. A nemparametrikus adatok esetében Kruskal-Wallis rank tesztet alkalmaztunk. A szignifikancia feltétele p < 0.05 volt.
44
8. EREDMÉNYEK
8.1. A bal kamra szívizmának morfológiai és biokémiai jellemzői STZ diabéteszben
8.1.1. A STZ diabétesz, a krónikus inzulin kezelés, valamint az ANGII adagolás hatása a metabolikus paraméterekre (2. táblázat)
Három hétig fennálló patkány STZ diabéteszben a laboratóriumi paraméterek a kezeletlen cukorbetegségnek megfelelően változtak. Az emelkedett vércukorszint mellett a fruktózamin szint is szignifikánsan magasabb volt a D állatokban a K állatokhoz képest. Az ANGII kezelés a fenti a paramétereket nem befolyásolta. Krónikus inzulin kezelés hatására a vércukorszint csökkent, de a terápia ellenére szignifikánsan magasabb maradt, mint a K patkányokban mért értékek. A fruktózamin szint inzulin kezelés hatására a Khoz hasonló értékre csökkent. 2. táblázat A STZ diabétesz, a krónikus inzulin kezelés, valamint az ANGII adagolás hatása a metabolikus paraméterekre A feltüntetett számok átlagértékeket±SEM jelölnek, n=kísérletek száma, nt: nem történt mérés, statisztikailag szignifikáns különbség: a p<0,05 A D állatok testsúlya csökkent a K állatokéhoz képest. A D állatok vércukor szintje szignifikánsan magasabb volt, mint K és a DI, DIA csoportban. Az állatok koleszterin és TG értékeiben nem volt szignifikáns eltérés. K: kontroll, D: diabéteszes, KA: kontroll angiotenzinnel kezelt, DA: diabéteszes angiotenzinnel kezelt, DI: diabéteszes 2 hétig inzulinnal kezelt, DIA: diabéteszes angiotenzinnel és inzulinnal kezelt csoport. Inzulin kezelés és ANGII adagolás módját illetően lásd Módszerek fejezet. Csoport Testsúly 8 hetes kor Vércukorszint (mM) Fruktózamin mol/l Koleszterin mmol/l Triglicerid mmol/l
K n=16 380±1 8,4±1 1234 2,350,1 1,610,1
D n=25 298±9 a 28,7±1 a 2449 2,110,05 1,650,29
KA n=14 385±6 9,7±0,2 1415 2,380,1 1,60,07
45
DA n=13 291±6 25,3±2 a 2601 2,130,09 1,940,22
DI n=15 305±3 a 17,7±1 a 1414 nt nt
DIA n=15 286±2 15,5±0,8 a 1396 nt nt
A testtömeghez viszonyított bal kamra tömeg az inzulin kezelésben részesült csoportokban növekedett (K vs. DI, DIA). A teljes gyökfogó kapacitás (TSC) mérésekor minden állat plazmáját külön-külön értékeltük. A plazma antioxidáns aktivitása három hét alatt a diabéteszes állatcsoportban ötszörösére növekedett (TSC: K: 0,665±0.097; D: 3,439±0.548;
p<0,0000307).
Azokban
a
csoportokban,
ahol
ANGII
kezelést
alkalmaztunk a TSC szignifikánsan csökkent. Krónikus inzulin kezelés hatására a diabéteszben szenvedő állatok antioxidáns kapacitása jelentősen csökkent. Az inzulin kezelés nagyobb mértékben csökkentette a TSC-t, mint az ANGII adagolás. A két kezelés együttesen nem fokozta tovább (nem volt additív hatású) a TSC csökkenést (11.ábra). 11.ábra Az ANGII és az inzulin hatása a bal kamra/testsúly arányra és a TSC-ra kontroll és diabéteszes patkányokban
A bal kamra súly/testsúly (fehér) és a TSC (fekete) a K százalékában
600
* 500
400
300
+ 200
° + 100
°
+
+
0
K
D
KA
DA
DI
DIA
11. ábra. Statisztikailag szignifikáns különbség a K vs D (*p<0.01), a K vs DI, DIA (°p<0.01) és a D vs KA,DI, DIA, DA csoportok (+p<0.05) között. TSC mérés módszerét és kiértékelését, valamint a 2 hetes inzulin kezelés módját lásd a Módszerek fejezetben. K: Kontroll, D: Diabéteszes, KI: inzulinnal kezelt kontroll, DI: inzulinnal kezelt diabéteszes, DIA: inzulinnal és angiotenzinnel kezelt diabéteszes patkányok.
46
8.1.2 Az akut inzulin kezelés hatása a vércukor szintre
4 hétig fennálló STZ diabéteszben az akut inzulin adása a vércukor szintet szignifikánsan csökkentette. A kontroll állatokban 8,25±0,52 mmol/l-ről 5,15 mmol/l-re, diabéteszes patkányokban 21,2±3.7 mmol/l-ről 19,8 ±3,7mmol/l-re (p<0.05) csökkent a vércukorszint 20 perccel az inzulin adása után (12. ábra). Az egyszeri rövid hatású inzulin adagolás nem befolyásolta a fruktózamin szintet. A szérum K+ koncentráció változásai követték a vércukorszint változásait. 12. ábra A vércukorszint változása 20 perccel az inzulin beadása után 25
* +*
Vércukor (mmol/l)
20
15
10
* 5
0 K
KI
D
DI
12. ábra. Statisztikailag szignifikáns különbség *p<0,05 K vs D, K vs KI és K vs DI; +p<0,05, D vs DI. A DI csoport vércukra magasabb maradt, mint a K (K vs DI). A vércukorszintet 20 perccel 4 IU Humulin R inzulin beadását követően mértük. Inzulin adagolás módját lásd a Módszerek fejezetben. K: kontroll, KI: kontroll inzulin kezelt, D: diabéteszes, DI: diabéteszes inzulin kezelt csoport.
47
8.1.3. A kontroll és a diabéteszes állatok bal kamrájának enzimatikus jellemzése
K és D állatcsoportokban bal kamra szövethomogenizátumban összehasonlítottuk a különböző szubcelluláris frakciók jellemzésére szolgáló enzimek aktivitását. Vizsgáltuk a sejthártya lokalizációjú 5'-nukleotidáz, az endo/szarkoplazmás retikulumra jellemző 2+
+
Ca /K -ATP-áz (SERCA), a sejtben diffúzan eloszló Mg2+-ATPáz (strofantidinrezisztens 3-O-metilfluorescein-foszfatáz (SR-OMFF)) és a Na+/K+-ATPáz (strofantidinérzékeny
3-O-metilfluorescein-foszfatáz
(SÉ-OMFF)
aktivitását.
Az
összfehérje
kinyerésben nem volt különbség a K és a D csoportok között (K 17,7±2,2 mg fehérje/g szövet vs. D 15,7±2,1 mg fehérje/g szövet). A strofantidin-rezisztens 3-Ometilfluorescein-foszfatáz (amely a szívizomban a Mg2+ ATPázt képviseli) és az 5'nukleotidáz (PM asszociált enzim) aktivitása diabétesz hatására nem változik. A D csoportban jelentősen csökkent a SÉ-OMFF aktivitása, amely a Na+/K+-ATPáz 2+
+
aktivitását tükrözi és a Ca /K -ATPáz aktivitása is (SÉ-OMFF aktivitása 31,9 %-kal, 2+
+
Ca /K -ATPáz 35,7 %-kal csökkent a K-hoz képest, p0,05) (3. táblázat). 3. táblázat A kontroll és diabéteszes patkányok bal kamra homogenizátumainak enzimatikus jellemzése A feltüntetett számok átlagértékeket ±SEM jelölnek, n=kísérletek száma, Statisztikailag szignifikáns különbség (a p0,05) a kontroll (K) és a STZ diabéteszes (D) csoportok + + között. Strofantidin érzékeny-OMFFáz aktivitás (S-OMFFáz) képviseli a Na /K -ATPáz aktivitást. Csoport Fehérje kinyerés (mg)/ szívtömeg (g) 5’nukleotidáz aktivitás (mol foszfát/mg fehérje/óra) Strofantidin rezisztens-OMFFáz aktivitás (molfluorescein/mg fehérje/óra) Strofantidin érzékeny-OMFFáz aktivitás (molfluorescein/mg fehérje/óra) 2+ + Ca /K -ATPáz (mol foszfát/mg fehérje/óra)
48
K n=5 17,7 ±2,2 4,31± 0,59 3,0 ± 0,39
D n=5 15,7±2,1 4,6±0,58 2,99±0,35
2,35 ± 02,6
1,6 ±0,23a
11,2±1.7
7,2±07 a
8.1.4. A NKA katalitikus alegységeinek megoszlása kontroll és diabéteszes szívizomban; inzulin kezelés hatása a NKA aktivitás sejten belüli eloszlására.
Az akut inzulin kezelés nem befolyásolta a homogenizátumban mért NKA aktivitását. Lépcsőzetes szacharóz sűrűség grádiens centrifugálással szétválasztottuk a szívizom homogenizátumot. Legmagasabb specifikus aktivitását a PM-hoz kötött 5’-nukleotidáz enzimnek a 0,72 mol/l koncentrációjú szacharóz rétegben mértük, mind a K, mind pedig a D csoportban több mint ötszörösére dúsult az enzim aktivitása a homogenizátumhoz képest (K 5,4-szeres, D 5,37-szeres). Azok a membrán vezikulák, melyek az 1,07 mol/l szacharóz koncentrációjú rétegbe kerültek az intracelluláris membránokat reprezentálják. A Ca2+/K+-ATPáz, amely intracelluláris membránhoz kötött enzim 4,07-szeresére és 4,33-szorosára dúsult K és D mintákban. A SÉ-OMFF aktivitás kimutatható volt mindkét membránfrakcióban. Diabéteszben mind a PM, mind az IM frakcióban csökkent az enzimaktivitás a kontrollhoz képest. (K vs D PM 21,01 % ,p0,05 és IM 44,27 % ,p 0,01) (4. táblázat). A NKA katalitikus alegységének 1 izoformája alacsony, míg az 2 magas affinitással köti az ouabaint. Az 1 alegység elsősorban a PM-ban található mind K, mind pedig a D csoportban. Diabéteszben az 1 alegység Bmax értéke 25,39 %-kal csökkent (p0,05) a PM frakcióban és 25,06 %-kal (p0,05) csökkent az IM frakcióban. Az 2 izoforma az inzulin szenzitív Glut4 glukóz transzporterhez hasonlóan főként az intracelluláris membrán poolban található K és D csoportban, de az 2 izoforma Bmax értéke diabéteszben 50%-kal (p0,01) csökkent. (4. táblázat). Akut inzulin kezelés hatására az 2 alegység izoforma mennyisége 3,33-szorosára nőtt a PM frakcióban a K csoportban. Diabéteszben is megfigyelhető volt az inzulin hatása az 2 alegység elhelyezkedésére, de csak 1,99-szeresére növekedett a PM-ban kimutható mennyisége. Az akut inzulin hatás nem befolyásolta szignifikánsan az alacsony affinitású 1 alegység izoforma sejten belüli eloszlását, ha a membrán frakciókat grádiens centrifugálással választottuk el egymástól.
49
4. táblázat Az inzulin akut hatása a NKA intracelluláris lokalizációjára A feltüntetett adatok átlag értékeket±SEM jelölnek, n=kísérletek száma. Strofantidin érzékeny-OMFFáz aktivitás (SÉ-OMFFáz) képviseli a NKA aktivitást. aStatisztikailag szignifikáns különbség (p0.05) a kontroll (K) és a STZ diabéteszes (D) csoportok között. b (p0.05) az inzulin kezelt és kezeletlen csoportok között. 5’nukleotidáz PM, 2+ + Ca /K ATPáz az ER/SR-ra jellemző. Az alacsony affinitású kötőhelyek a NKA α1, a magas affinitású kötőhelyek az α2 alegység izoformát reprezentálják. Enzim aktivitás, Western blot és ouabain kötés meghatározás és kiértékelés módját lásd a Módszerek fejezetben. Csoport
K n=5 PM
IM
D n=5 PM
IM
Fehérje mg/g szívtömeg Bazális Inzulin (20 perc)
0,290.03 0,310,03
1,780,15 1,760,15
0,300,036 0,290,04
1,810,2 1,790,19
5 Nukleotidáz (mol foszfát/mg/h) Bazális Inzulin (20 perc)
23,343,22 23,313,22
2,120,21 2,100,21
24,743,7 23,8135
1,950,24 1,810,35
Ca /K ATPáz (mol foszfát/mg/h) Bazális Inzulin (20 perc)
3,250,40 2,970,34
45,624,09 47,824,81
2,760,33 2,970,40
31,23,6a 32,73,4a
GLUT4 (rel. egység) Bazális Inzulin (20 perc)
0,470,05 1,520,12b
2,010,11 0,640,03b
0,280,33 a 0,570,39 a b
1,19026a 0,670,17 b
13,822,2 16,052,1 b
3,750,4 2,980,3b
10,911,5a 11,911,7a
2,090,2a 1,290,16ab
34,223,21 113,8510,4b
82,577.2 51,93 31,143.21 5,2b 61,936,22 ab
41,284,2a 14,963,1ab
324,2031,8 342,5431,8
36,364.2 27,454,3b
241,9230,8a 255,8228,7 a
27,263,2a 24,153,17
2+
+
SÉ-OMFFáz (mol fluorescein/mg/h) Bazális Inzulin (20 perc) Bmax magas affinitás (pmol/mg fehérje) Bazális Inzulin (20 perc) Bmax alacsony affinitás (pmol/mg fehérje) Bazális Inzulin (20 perc)
50
8.1.5. Az inzulin kezelés akut hatása a NKA alegységeinek sejten belüli elhelyezkedésére szubcelluláris frakcionálás módszerét használva
Inzulin kezelés hatását a NKA alegységek intracelluláris megoszlására lépcsőzetes szacharóz grádiens centrifugálással elválasztott szubcelluláris frakciókban (PM és IM) Western blot analízissel vizsgáltuk. A K és a D szívizomban az 1 izoforma nagy része a PM-hoz kötötten helyezkedett el, mennyisége diabétesz hatására 17,3%-kal csökkent a Khoz képest (13.ábra).
13. ábra Az inzulin kezelés akut hatása a szubcelluláris frakciókban mért α1 alegység mennyiségére kontroll és diabéteszes patkányok bal kamrájában
0.8 0.7
Denzitás
0.6
*
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
PM IM K
PM IM KI
1
PM IM D
PM IM DI
13. ábra. Statisztikailag szignifikáns különbség (*p<0.05) a K és D csoportok között. Szubcelluláris frakcionálás és Western blot analízis módszerét és kiértékelését, valamint az inzulin kezelés akut hatásának mérését lásd a Módszerek fejezetben. K: Kontroll, D: Diabéteszes, KI: inzulinnal kezelt kontroll, DI: inzulinnal kezelt diabéteszes patkányok, PM: plazma membrán, IM: intracelluláris membránok
51
Az 2 alegység izoforma mind a kontroll, mind a diabéteszes szívizom intracelluláris membránokat tartalmazó frakciójában található. Diabéteszben ennek az alegységnek a relatív mennyisége 40,2 % -kal (p0,01) csökken (14.ábra).
14. ábra Inzulin kezelés akut hatása a szubcelluláris frakciókban mért α2 alegység mennyiségére 0.8
b
0.7
Denzitás
0.6 0.5
a
b
0.4 0.3
c
0.2
a
0.1 0
PM IM K
PM IM
1
PM IM
PM IM
D
DI
KI
14. ábra. Statisztikailag szignifikáns különbség a K és D (ap<0,05), a K és KI (bp<0,05) és a D és DI csoportok (cp<0,05) között. Szubcelluláris frakcionálás és Western blot analízis módszerét és kiértékelését, valamint az inzulin kezelés akut hatásának mérését lásd a Módszerek fejezetben. K: kontroll, D: diabéteszes, KI: inzulinnal kezelt kontroll, DI: inzulinnal kezelt diabéteszes patkányok, PM: plazma membrán, IM: intracelluláris membránok A alegység izoformák mindkét membránfrakcióban kimutathatóak voltak, a 1 alegység nagyobb mértékben fejeződött ki szívizomban, mint a 2 izoforma (ábrán nincs bemutatva). Diabétesz hatására a 1 izoforma mennyisége a PM-ban 25,9 %-kal (p0,05) az IM frakcióban 51,8 %-kal (p0,01) csökkent (15. ábra). A 2 alegység izoforma is jelentős mértékben csökkent DM-ban mindkét membránfrakcióban (PM 21,22,9 % p 0,05 és IM 23,7 % p0,05) (ábrán nincs bemutatva).
52
15. ábra Inzulin kezelés akut hatása a szubcelluláris frakciókban mért β1 alegység mennyiségére
a
0.9 0.8
Denzitás
0.7
c
0.6 0.5
a
b
0.4
a
0.3 0.2 0.1 0
PM IM K
PM IM
1
KI
PM IM D
PM IM DI
15. ábra. Statisztikailag szignifikáns különbség a K és D (ap<0.05), a K és KI (bp<0,01) és a D és DI csoportok (cp<0,05) között. Szubcelluláris frakcionálás és Western blot analízis módszerét és kiértékelését, valamint az inzulin kezelés akut hatásának mérését lásd a Módszerek fejezetben. K: Kontroll, D: Diabéteszes, KI: inzulinnal kezelt kontroll, DI: inzulinnal kezelt diabéteszes patkányok, PM: plazma membrán, IM: intracelluláris membránok A NKA alegységeinek transzlokációját 20 perccel az akut inzulin kezelés után vizsgáltuk. Inzulin hatására az 1 alegység sejten belüli elhelyezkedésében nem észleltünk változást ezzel a módszerrel (13. ábra). Az 2 és a 1 alegységek mennyisége K szívizomban inzulin hatására a PM-ban 3,3-szorosára (p0,01) illetve 1,51-szeresére (p0,01) növekedett. DM-ban kevésbé kifejezett 2 és 1 transzlokációt tapasztaltunk (1,92-szeres (p0,01) és 1,34-szeres (p0,01) (14. és 15. ábra). A kontroll mintákban a PM-ban észlelt alegység mennyiségének növekedését követte az IM-ban mért 21 alegység csökkenés mértéke. DM-ban azonban az 21 alegység csökkenés az IM-ben, nagyobb mértékű volt a PM-hoz asszociált növekedésnél (14. és 15. ábra).
53
A NKA inzulin függő transzlokációjához hasonlóan a Glut4 is kihelyeződött a PM-ba inzulin hatására, mind K, mind pedig D szívizomban (K 2,52-szörös p0,01 és D 1,61szeres p0,01) (ábrán nincs bemutatva).
8.1.6. Sejtfelszíni biotinilációs technikával kimutatott PM-hoz kötött fehérjék változása inzulin hatására
A módszer lényege, hogy a szubcelluláris frakcionálás és szaharóz grádiens centrifugálás technikai hátrányaiból adódó fehérjeveszteség nélkül a sejt felszínéhez, tehát a PM-hoz kötött fehérjék kimutathatóak biotinilációs technika segítségével. Hasonlóan a
szubcelluláris
frakcionálás
után
Western blot
analízissel
nyert
eredményekhez az akut inzulin hatására biotinilációs módszerrel is kimutattuk az 2 és a 1 alegységek mennyiségének növekedését a PM-ban (16. ábra) (K 2,89-szeres, KI 1,72szeres, D 2,34-szeres; DI 1,51-szeres). A harántcsíkolt izomban megfigyeltekhez hasonlóan [99], a szívizomban is kimutatható az 1 alegység inzulin függő kihelyeződése a PM-ba (K 1,37-szeres és D 1,25-szeres) (16. ábra). A NKA alegységeinek transzlokációja a PI3 kináz inhibitor wortmaninnal gátolható volt mind kontroll, mind pedig diabéteszben az összes inzulinra érzékeny alegység esetében (2, 1, 1) (16. ábra).
54
16. ábra Az inzulin kezelés akut hatása és PI3K gátló (wortmannin) hatása a PM NKA α1, α2, β1 alegység izoformáinak mennyiségére sejtfelszíni biotinilációs módszerrel mérve 1.20
*
1.00
KWI
D
DI
DWI Relatiív denzitás
K KI
0.80
α1 alegység a
0.60
0.40
0.20
0.00
K 0.60
0.80
* α2 alegység
0.70 0.60 0.50
a
0.40
*
0.50
Relatív denzitás
R elatív denzitás
KI
+
0.30
a
0.40
KWI
C
D
DI
DWI
β1 alegység a
+
0.30
0.20
0.20
0.10 0.10
0.00
0.00
K
KI KWI
1
D
DI
DWI
K
KI KWI
1
D
DI
DWI
16. ábra. Statisztikailag szignifikáns különbség a K és KI (*p<0,05), a KI és KWI , DI és DWI (+p<0,01) és a D és DI csoportok (+p<0,05) között. Biotiniláció módszerét lásd a Módszerek fejezetben. K: Kontroll, D: Diabéteszes, KI: inzulinnal kezelt kontroll, DI: inzulinnal kezelt diabéteszes, KWI: inzulinnal és wortmanninnal kezelt kontroll, DWI: inzulinnal és wortmanninnal kezelt diabéteszes patkányok PM: plazma membrán
55
8.2. A vesekéreg morfológiai és biokémiai jellemzői STZ diabéteszben
8.2.1 A STZ diabétesz és az angiotenzin hatása a metabolikus paraméterekre és a vesefunkcióra
Az általános, metabolikus és vesefunkciós paramétereket az 5. táblázatban foglaltam össze. Hét héttel a diabétesz indukciója után a diabéteszes patkánycsoport testsúlya alacsonyabb volt, mint a kontroll csoporté (+p<0,05 K vs. D és DA). A nem éhomi vércukor és fruktózamin szintek emelkedettek voltak a D csoportban a K-hoz képest.(+p<0,05 K vs. D; KA vs. DA), míg az ANGII adagolás nem változtatta ezeket a metabolikus értékeket. 5. táblázat: Klinikai paraméterek változásai A feltüntetett számok átlagértékeket±SEM jelölnek, n=kísérletek száma Statisztikailag szignifikáns különbség + p<0,05 K vs. D, * p<0,05 K vs. KA, × p<0,05 KA vs. DA, # p<0,05 D vs. DA. A klinikai paraméterek mérésének, illetve számításának módját a Módszerek fejezetben részleteztem. K: kontroll, D: diabéteszes, KA: angiotenzinnel kezelt kontroll, DA angiotenzinnel kezelt diabéteszes patkány, BUN: szérum urea nitrogén koncentrációja K
KA
D
DA
n=6
n=6
n=6
n=6
Vesesúly/testsúly
0,4±0,1
0,4±0,1
0,7±0,3+
0,7±0,4×
Fruktózamin (µmol/l)
137±4
143±4
252±8+
265±32+
Szérum kreatinin (µmol/l)
68±5
65±2
81±10+
97±5×
BUN (mM)
4,7±0,3
7,5±1,3*
10±1,9+
21±3,0×#
Vizelet Na (mM)
69±11
55±27
35±8+
13±1×#
Vizelet urea nitrogén (mM)
83±44
95±63
69±22
181±26×#
Frakcionált Na kiválasztás (%)
2,8±0,6
4,5±0,3*
8,1±0,3+
6,3±0,3×
A vese/ testsúly aránya, a szérum kreatinin és urea nitrogán szintek magasabbak voltak a cukorbeteg állatcsoportban, mint a kontrollban ( +p<0,05 K vs. D; KA vs. DA). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a diabéteszes nefropátia kialakult a cukorbeteg állatokban.
56
Mind a STZ diabétesz és az ANGII adagolás növelte a frakcionált Na + kiválasztást a kontroll csoporthoz képest (+*p<0.05 K vs. D; K vs. KA).
17. ábra A kontroll és a diabéteszes állatok artériás középnyomása ANGII nélkül és 24 órás ANGII kezelés mellett
Artériás középnyomás (Hgmm) 24 óra méréseinek átlaga
140
*
120 100 80 60 40 20 0
K
KA
D
DA
17. ábra. Statisztikailag szignifikáns különbség (*p<0.05) a K és KA csoportok között. 24 órás ANGII adagolás ozmotikus minipumpával, a vérnyomásmérés telerimetriás módszerrel történt részletesen lásd Módszerek fejezet. K: kontroll, D: diabéteszes, KA: kontroll angiotenzin kezelt, DA: diabéteszes angiotenzin kezelt csoportok A kontroll állatokban megnövekedett az artériás középnyomás ANGII adagolás hatására (K vs. KA, *p<0,05), míg a cukorbetegségben szenvedő patkányoknál szignifikáns vérnyomás növekedést nem tapasztaltunk.
57
8.2.2. A STZ diabétesz és az angiotenzin adagolás hatása a NKA alfa-1 alegységének mRNS és fehérje kifejeződésére, valamint az enzim aktivitására vesekéreg homogenizátumban
A diabéteszes patkányokban mért NKA α1 alegység mRNS (18. ábra) és fehérje kifejeződése (19. ábra) megnövekedett a kontroll állatokhoz képest (p<0,05 K vs. D, KA vs. DA). Az ANGII adagolása tovább növelte a fehérje szinteket. (p<0,05 K vs. KA, D vs. DA). Az enzim aktivitása (20. ábra) is ennek megfelelően növekedett mind az STZ diabéteszes, mind pedig az ANGII kezelt csoportokban (p<0.0001 K vs. D, p< 0,001; K vs. KA, p<0,01 D vs. DA).
18. ábra A NKA α1 alegységének mRNS kifejeződése kontroll és diabéteszes patkányok vesekérgében NKA K
KA
D
DA
GAPDH
NKA α1 alegység mRNS/ GAPDH NKAalpha-1 mRNA/GPADHarbitary units relatív egység
2,5
** ++
mRNS *
2,0
+
1,5
1,0
0,5
0,0 C
K
KA CA
DD7
DA
D7A
18. ábra. Statisztikailag szignifikáns különbség *p<0,05 K vs. KA; **p<0,05 D vs. DA; +p<0,05 K vs. D; ++p<0,05 KA vs. DA. Az ANGII kezelés, RT-PCR módszerét és kiértékelési módját a Módszerek fejezet tartalmazza. K: kontroll, KA: angiotenzinnel kezelt kontroll, D: diabéteszes, DA: angiotenzinnel kezelt diabéteszes patkányok
58
19. ábra A NKA α1 alegységének fehérje kifejeződése kontroll és diabéteszes patkányok vesekérgében NKA K
KA
D
DA
β-aktin
N K Aalpha-1protein/beta-actinarbitaryunit
NKA α1 alegység fehérje/ β-aktin relatív egység
fehérje
** ++
3,5 3,0 2,5
*
+
CA KA
D7 D
2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 C K
D7A DA
19. ábra. Statisztikailag szignifikáns különbség *p<0,05 K vs. KA; **p<0,05 D vs. DA; +p<0,05 K vs. D; ++p<0,05 KA vs. DA. Az ANGII adagolás, a Western blot analízis és kiértékelésének módja a Módszerek fejezetben kerül részletezésre. K: kontroll, KA: angiotenzinnel kezelt kontroll, D: diabéteszes, DA: angiotenzinnel kezelt diabéteszes patkányok
µmol fluorescein/mg fehérje/óra micromol fluorescein/mgprotein/hour
20. ábra A NKA aktivitása ANGII kezelt kontroll és diabéteszes patkányok vesekérgében
7,0
+
6,0
** ++
*
5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 CK
KA CA
D D7
DA D7A
20. ábra. Statisztikailag szignifikáns különbség *p<0,05 K vs. KA; **p<0,05 D vs. DA; +p<0,05 K vs. D; ++p<0,05 KA vs. DA. Az ANGII adagolás, az NKA (strofantidin érzékeny 3-O-metilfluoreszceinfoszfatáz) aktivitás mérése és kiértékelés módja a Módszerek fejezetben kerül részletezésre. Rövidítés 19. ábrán.
59
8.2.3. A STZ diabétesz és az angiotenzin adagolás hatása a NKA alfa-1 alegységének
sejten belüli megoszlására A NKA sejten belüli megoszlását Triton X-100 detergens oldószerrel végzett elválasztással vizsgáltuk. A Tritonnal oldható frakció a citoszolban lévő membránfrakció fehérjéit, míg a Tritonnal oldhatatlan a plazmamembránhoz asszociált fehérjéket tartalmazza. Az alfa-1 alegység az IM frakcióban.
A teljes vesekéreg homogenizátumhoz hasonlóan az IM frakcióban is megnövekedett az NKA alfa-1 alegységének fehérje mennyisége a diabéteszes patkányokban a kontroll csoporthoz képest (+ P<0.002 K vs. D; **P<0.05 KA vs. DA, (21. ábra)). Az ANGII adagolása mind a K, mind pedig a D csoportban tovább emelte a fehérje szintet (*,++P<0.01, K vs. KA; D vs. DA).
Az alfa-1 alegység a PM frakcióban.
A plazmamembrán fehérjéit reprezentáló frakcióban nem mutattunk ki szignifikáns változást egyik csoportban sem (ábrán nincs bemutatva).
60
21. ábra A NKA α1 alegységének fehérje kifejeződése a citoplazmatikus frakcióban kontroll és diabéteszes patkányok vesekérgében K
KA
D
DA
NKA α1 alegység fehérje/ β-aktin relatív egység
NKAalpha-1protein/beta-actin arbitaryunit
Cytosol representing fraction (SUP) Citoplazmatikus frakció (felülúszó)
** ++
2,50
2,00
+
*
1,50
1,00
0,50
0,00 C K
CA KA
D7 D
D7A DA
21. ábra. Statisztikailag szignifikáns különbség *p<0,05 K vs. KA; **p<0,05 D vs. DA; +p<0,05 K vs. D; ++p<0,05 KA vs. DA. Az ANGII adagolás, a szubcelluláris frakcionálás, a Western blot analízis és kiértékelésének módja a Módszerek fejezetben kerül részletezésre. K: kontroll, KA: angiotenzinnel kezelt kontroll, D: diabéteszes, DA: angiotenzinnel kezelt diabéteszes patkányok.
Az alfa-1 alegység fehérje mennyisége az IM és a PM frakciókban a teljes vesekéreg homogenizátumhoz viszonyítva (százalékos eloszlás)
Bár a NKA α1 alegységek mennyisége abszolút értékben nem változott a PM asszociált frakcióban, a teljes vesekéreg homogenizátumban mért mennyiséghez képest a cukorbeteg vagy az ANGII kezelt állatokban kisebb százalékban volt kimutatható (22. ábra) Az IM frakcióban ezzel egyidejűleg megnövekedett a NKA α1 alegységének fehérje szintje. Ezek a változások arra utalnak, hogy diabéteszben és ANGII kezelés hatására a pumpák abszolút mennyisége megnövekszik, azonban feltehetően a pumpák jelentős része az intracelluláris raktárakba helyeződik (esetleg marad).
61
NKA α1 alegység fehérje mennyisége a homogenizátumban mért százalékában
22. ábra A NKA α1 alegységének fehérje mennyisége az IM/PM membránfrakciókban a teljes homogenizátunban kifejeződő α1 százalékában
PEL/SUP ratio of/Citoplazmatikus TOT (%) Membránkötött Αz α1 alegység mennyisége frakció a teljes homogenizátum a membránkötött / citoplazmatikus frakcióban százalékában a teljes homogenizátum százalékában
% of TOT NKA alpha-1 protein level
120%
100%
80%
60%
40%
20%
0% CK
KA CA
D D7
DA D7A
22. ábra. Az ANGII adagolás, a szubcelluláris frakcionálás, a Western blot analízis és kiértékelésének módja a Módszerek fejezetben kerül részletezésre. K: kontroll, KA: angiotenzinnel kezelt kontroll, D: diabéteszes, DA: angiotenzinnel kezelt diabéteszes patkányok
8.2.4. A STZ diabétesz és az angiotenzin adagolás hatása a NKA α1 alegységének szerin foszforilációjára
A Ser23 foszforiláció csak az IM frakcióban volt kimutatható. A diabéteszes állapot fokozta az α1 alegység Ser23 foszforilációjának mértékét (p<0.05 K vs. D, KA vs. DA). Az ANGII adagolás után is szignifikánsan növekedett a Ser23 foszforiláció mértéke mind a K, mind a D patkányokban (p<0.05; K vs. KA, D vs. DA, (23. ábra)). A Ser943 foszforiláció mértéke egyik kísérleti csoportban sem változott (ábrán nincs bemutatva)
62
2,5
** ++
2,0
relatív egység
SNKA e r23α1ph os ph/beta-ac tin arbitary alegység Ser23 foszforilációja/ β-aktinunit
23. ábra NKA α1 alegység Ser foszforilációja a citoplazmatikus frakcióban kontroll és diabéteszes patkányok veséjében
+
*
1,5 1,0 0,5 0,0 KC
KA CA
D D7
DA D7A
23. ábra Statisztikailag szignifikáns különbség *p<0,05 K vs. KA; **p<0,05 D vs. DA; +p<0,05 K vs. D; ++p<0,05 KA vs. DA. Az ANGII adagolás, a szubcelluláris frakcionálás, a Western blot analízis és kiértékelésének módja a Módszerek fejezetben kerül részletezésre. Ser23 foszforiláció csak a IM frakcióban volt kimutatható. K: kontroll, KA: angiotenzinnel kezelt kontroll, D: diabéteszes, DA: angiotenzinnel kezelt diabéteszes patkányok 8.2.5. Fluoreszcens immunhisztokémia
Az 24. ábrán a vesekéregből készült metszetek láthatóak, ahol jelen vannak a glomerulusok (GL). Kontroll vesében a NKA festődése igen intenzív a vastag felszálló szárban. Gyengébb festődésű a proximális tubulusok bazális membránján látható NKA. A diabéteszes állatok proximális tubulusában a fluoreszcens festék intenzitása kissé megnövekedett, az α1 alegység a bazálmembránban és a citoszolban is megtalálható.
63
24. ábra Fluoreszcens immunohisztokémia
K
KA
D
DA
24. ábra. A négy ábracsoport a vese kérgi részéről mutat reprezentatív mintát, ahol megfigyelhetjük a glomerulusokat is. A K vesekéregben a NKA α1 alegység intenzív megjelenése a vastag felszálló szár keresztmetszetét jelzi. Alacsonyabb intenzítású festődés a proximális kanyarulatos csatornák bazolaterális membránját jelzi. Az ANGII adagolás nem befolyásolta az egyes nefronszakaszok közti különbségeket, de a tubulusok bazális membránja enyhén kiszélesedett. A D vesekéregben a proximális tubulusban a NKA festődésének intenzitása megnövekedett és a bazálmembrán még kifejezettebben kiszélesedett, azaz a NKA-t jelző festék az apikális régió felé is megjelent. A DA vesekéregben a NKA festődés még kifejezettebb volt a proximális tubulusokban. A bazális membrántól az apikális membránig a tubulusokat alkotó sejtek egész szélességében ki lehetett mutatni a NKA α1 alegységét. K: kontroll, D: diabéteszes, KA: angiotenzinnel kezelt kontroll, DA: angiotenzinnel kezelt diabéteszes patkányok. Zöld fluoreszcens festék: NKA-t jelzi, kék festék: sejtmagok
64
Az angiotenzin adagolás nem változtatta meg szignifikánsan a NKA fluoreszcens festésének intenzitását a KA csoportban, de megfigyelhető a bazális membrán enyhe kiszélesedése, azaz a NKA megjelenése a citoszolban, az apikális membrán irányába. A diabéteszes angiotenzinnel kezelt állatok proximális tubulusában látszik a tubulussejtek nagyfokú károsodása. A bazális membrántól szinte az apikális oldalig mindenütt jelen van a NKA alfa1 alegysége, a festés fokozott intenzitású mind a K, mind pedig a D mintákhoz képest.
8.2.6. Az AT1R gátló losartan kezelés hatása a NKA-ra STZ diabéteszes patkányok vesekéregben Diabéteszes patkányokban a NKA α1 alegység izoforma mRNS és fehérje (25. és 26. ábra) expressziója losartan kezelésének hatására a kontrollhoz hasonló mértékűre csökken, ellensúlyozva a diabétesz és az ANGII kezelés fentiekben megfigyelt hatásait. Kontroll állatok losartan kezelése után nem tapasztaltunk változást sem a mRNS, sem a fehérje kifejeződésben. 25. ábra Losartan kezelés hatása a NKA α1 alegységének mRNS expressziójára diabéteszes patkányok vesekérgében mRNS
Relatív denzitás
2.5 *
2
**
+
1.5 ++
1 0.5 0 K
KA
D
DA
DL
25. ábra. Statisztikailag szignifikáns különbség *p<0,05 K vs. KA; **p<0,05 D vs. DA; +p<0,005 K vs. D; ++p<0,005 DL vs. D, DA. Az ANGII és losartan adagolás, az RTPCR analízis és kiértékelésének módja a Módszerek fejezetben kerül részletezésre. K: kontroll, KA: angiotenzinnel kezelt kontroll, D: diabéteszes, DA: angiotenzinnel kezelt diabéteszes, DL: diabéteszes losartannal kezelt patkányok
65
26. ábra Losartan kezelés hatása a NKA α1 alegységének fehérje expressziójára diabéteszes patkányok vesekérgében
fehérje
3.5
**
Relatív denzitás
3.0
*
2.5
+ ++
2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 K
KA
D
DA
DL
26. ábra. Statisztikailag szignifikáns különbség *p<0,05 K vs. KA; **p<0,05 D vs. DA; +p<0,005 K vs. D; ++p<0,05 D vs. DL. Az ANGII és losartan adagolás, az Western blot analízis és kiértékelésének módja a Módszerek fejezetben kerül részletezésre. K: kontroll, KA: angiotenzinnel kezelt kontroll, D: diabéteszes, DA: angiotenzinnel kezelt diabéteszes, DL: diabéteszes losartannal kezelt patkányok Losartan kezelés után végzett immunfluoreszcens festés alátámasztja, hogy a kezelés hatására a NKA expressziója a K patkányok proximális tubulusában megfigyelhető mértékűre csökken és a jelölt α1 alegység a kontrollban tapasztaltakhoz hasonlóan a bazális membránhoz asszociáltan helyezkedik el (27. ábra).
66
27. ábra A NKA α1 alegység lokalizációjának és immunopozitivitás intenzitásának változása a vese proximális tubulusában losartan kezelés hatására
Kontroll
STZ diabétesz
STZ diabétesz+angiotenzin Zöld: NKA α1 alegység Kék: sejtmag
Kontroll+angiotenzin
STZ diabétesz+losartan
27. ábra. Az ábrák proximális tubulusokat ábrázolnak. Az ANGII adagolás hatására a tubulusok bazális membránja enyhén kiszélesedett. A D vesekéregben a proximális tubulusban a NKA festődésének intenzitása megnövekedett és a bazálmembrán még kifejezetten kiszélesedett, azaz a NKA-t jelző festék az apikális régió felé is megjelent. A DA vesekéregben a NKA festődés még kifejezettebb volt a proximális tubulusokban. A bazális membrántól az apikális membránig a tubulusokat alkotó sejtek egész szélességében ki lehetett mutatni a NKA α1 alegységét. A losartan kezelés mind az intenzitást, mind pedig a lokalizációt a kontrollhoz hasonlóvá normalizálta. A losartan kezelés a kontrollban nem okozott változást. K: kontroll, D: diabéteszes, KA: angiotenzinnel kezelt kontroll, DA: angiotenzinnel kezelt diabéteszes, DL losartannal kezelt diabéteszes patkányok. Zöld fluoreszcens festék: NKA-t jelzi, kék festék: sejtmagok
67
Losartan kezelés hatására a DL patkányokban a kontrollhoz hasonló szintre csökkent Ser23 foszforiláció mértéke (28. ábra).
28. ábra Losartan kezelés hatása a NKA α1 alegységének Ser23 foszforilációjára diabéteszes patkányok vesekérgében
*
Relatív denzitás
0.8
+
0.6
*
0.4
+
0.2 0 K
KA
D
DA
DL
28. ábra. Statisztikailag szignifikáns különbség *p<0,05 K vs. KA, D vs. DA; +p<0,005 K vs. D; DA vs DL és D vs. DL. Az ANGII és losartan adagolás, valamint a Western blot analízis és kiértékelésének módja a Módszerek fejezetben kerül részletezésre. K: kontroll, KA: angiotenzinnel kezelt kontroll, D: diabéteszes, DA: angiotenzinnel kezelt diabéteszes, DL: diabéteszes losartannal kezelt patkányok. Ser23 foszforiláció teljes vesekéreg homogenizátumban mérve.
68
8.2.7. A metformin kezelés hatása a NAK α1 alegységére STZ diabéteszes patkányok vesekérgében
Diabéteszes patkányokban a NKA α1 alegység izoforma fehérje mennyisége vesekéreg homogenizátumban mérve megnövekszik. A metformin kezelés a homogenizátumban nem csökkentette szignifikánsan a NKA mennyiségét (29. ábra).
29. ábra Metformin kezelés hatása a NKA α1 alegységének fehérje kifejeződésére diabéteszes patkányok vesekéreg homogenizátumában 1
*
0.9 0.8
relatív denzitás
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 K
D
D+Met
29. ábra. Statisztikailag szignifikáns különbség a K vs D (*p<0.007). A metformin adagolás, valamint a Western blot analízis és kiértékelésének módja a Módszerek fejezetben kerül részletezésre. K: kontroll, D: diabéteszes, D+Met: metforminnal kezelt diabéteszes
69
Szubcelluláris frakcionálás után az IM-t tartalmazó membránfrakcióban az inzulin kezelés akut hatása nem, a metformin kezelés ellenben megváltoztatta meg az α1 izoforma mennyiségét. A plazma membránt jellemző frakcióban a metformin hatására szignifikánsan megnőtt a NKA α1 alegység izoforma fehérje mennyisége (p<0,007) (30. ábra).
30. ábra Metformin kezelés hatása a NKA α1 alegységének szubcelluláris lokalizációjára diabéteszes patkányok vesekéregében 1
IM
0.9
+
PM
0.8
*
relatív denzitás
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
D
DI
D+Met
1 DI+Met
D
DI
D+Met DI+Met
30. ábra. Statisztikailag szignifikáns különbség volt a PM frakcióban: D vs D+Met (*p<0,007); D vs DI+Met (+p<0,006); az IM frakcióban D vs D+Met (**p<0,033) az α1 alegységek mennyisége között. A metformin adagolás, szubcelluláris frakcionálás, valamint a Western blot analízis és kiértékelésének módja a Módszerek fejezetben kerül részletezésre. K: kontroll, D: diabéteszes, D+Met: metforminnal kezelt diabéteszes, IM: intracelluláris membrán frakció, PM plazma membránt tartalmazó frakció
70
A proximális tubulusok immunfluoreszcens festése alátámasztja, hogy metformin kezelés hatására a NKA α1 alegysége a kontrollban tapasztaltakhoz hasonlóan a bazális membránhoz asszociáltan helyezkedik el (31. ábra).
31. ábra A NKA α1 alegység lokalizációjának és immunopozitivitás intenzitásának változása a vese proximális tubulusában metformin kezelés hatására
Kontroll
Diabéteszes
Metforminnal kezelt diabéteszes
31. ábra. Zöld: NKA α1 alegység, kék: sejtmag A kontroll vesekéregben a NKA α1 alegység a proximális kanyarulatos csatornák területén alacsonyabb intenzitással festődik és a bazolaterális membránban helyezkedik el. A diabéteszes vesekéregben a proximális tubulusban a NKA festődésének intenzitása megnövekedett és a bazálmembrán kifejezetten kiszélesedett, azaz a NKA-t jelző festék az apikális régió irányában is megjelent. Metformin kezelés visszafordította a diabéteszben látott elváltozást a proximális kanyarulatos csatornák területén: az NKA a kontrollhoz hasonlóan festődik és a bazolaterális membránban helyezkedik el.
71
9. MEGBESZÉLÉS
9.1. A diabéteszes kardiopátia biokémiai háttere és a NKA lehetséges szerepe kialakulásában
Az utóbbi 20 évben hatalmas mennyiségű adat gyűlt össze az oxidatív stressz szerepéről a diabéteszes szívbetegség
kialakulásában.
Az oxidatív
stressz a
kardiomiociták apoptózisát indukálja [21], a kamrai struktúra patológiás átépüléséhez vezet [142], mechano-elektrikus szétkapcsolódást [143] és endothel működészavart [144] eredményez. Saját megfigyeléseink szerint DM-ban a TSC mintegy ötszörösére növekszik a K plazmában mért értékekhez képest. Ez azt jelenti, hogy diabéteszben jelentősen megnő az antioxidáns védelmi rendszerben résztvevő, a fenti módszerrel mérhető gyökfogók mennyisége. Ez a vizsgálat nem ad információt arról, hogy cukorbetegekben a prooxidánsok mennyisége és aktivitása hogyan változik. Irodalmi adatokból tudjuk, hogy a DM-ra jelentős oxidatív stressz jellemző [142], amely valószínűleg fokozott kompenzatorikus antioxidáns védelmet aktivál. Az irodalmi adatok alapján az antioxidáns enzimekre az oxidatív stressznek többféle hatása lehet [145-149], melyet a vizsgált állatok kora, a diabétesz fennállásának ideje, a vizsgált szövettípus jelentős mértékben befolyásol. Megfigyeléseinket számos irodalmi adat is alátámasztja, melyek azt igazolják, hogy a szuperoxid dizmutáz, a glutation peroxidáz és a kataláz aktivitás [148] megnövekszik diabéteszes patkányok szívizmában [147, 150], de ellentmondó aktivitás változásokat is megfigyeltek diabéteszes szívizomban. A megnövekedett aktivitású antioxidáns védelem a diabétesz progressziójával kimerül [151] és oxidatív stressz, következményes
perivaszkuláris
fibrózis
és
endothel
károsodás
alakul
ki
a
miokardiumban. Az endothel károsodás miatt csökken a NO szintézis és megnövekszik az oxigén alapú szabadgyökök mennyisége, amely hozzájárul a progresszív szöveti károsodáshoz [152].
72
Vizsgálatunkból kiderült, hogy a krónikus inzulin kezelés hatására a TSC (ami az antioxidáns védelem mértékéről nyújt információt) csökkent és a diabéteszben kialakuló bal kamra hipertrofia mértéke fokozódott. A hosszútávú inzulin kezelés exogén hiperinzulinémiához vezet, amely egymást követő alacsony és magas inzulin szintekkel járó periódusokból áll. Bár az inzulin szubsztitúció számos jótékony hatását ismerjük (javítja a betegek metabolikus paramétereit), felmerül, hogy az inzulin koncentráció hirtelen változásai oxidatív stresszt indukálnak a szervezetben. A hiperinzulinémia káros hatását az érrendszerben korábbi vizsgálatok eredményei támasztják alá. [153]. Újabb vizsgálatok azonban azt bizonyítják, hogy az inzulinnak szerepe van az endothel-függő vazodilatáció hatékony működésében [154, 155]. Az inzulin serkenti a konstitutív nitrogén oxid szintáz (eNOS) enzim szintézisét és aktivitását, ezáltal megnöveli a nitrogén monoxid (NO) elérhetőségét a szövetekben. A NO kulcsfontosságú szerepet játszik az érelmeszesedés elleni védelemben, a vaszkuláris működés válaszkészségének megtartásában [156, 157]. Mindezek alapján az inzulin rezisztens állapotokra jellemző endothel károsodást valószínűleg az inzulin relatív vagy abszolút hiányából származó jelpálya károsodások okozzák. Ebben központi szerepet tulajdonítanak a PI3K által beindított jelpályák kóros működésének, melyek az eNOS elégtelen működéséhez és rosszul kontrollált apoptózishoz vezetnek [158]. Az inzulin nem csak a NO szintézisét serkenti, hanem az endothelin rendszer működését is aktiválja [159]. Az endothelin-1 megnövekedett koncentrációja az endothel NADPH oxidáz enzim működését serkenti, amely megnöveli az agresszív szuperoxid anionok keletkezését. Az exogén vagy iatrogén hiperinzulinémia növeli az endothelium NADPH oxidáz aktivitását patkányok aortájában [160]. Feltehető, hogy a hiperinzulinémia hozzájárulhat a prooxidáns és antioxidáns rendszer működésének megváltozásához. Elképzelhető, hogy az antioxidáns rendszer hosszan fennálló hiperglikémia során eléri maximális kapacitását. Ilyen állapotban a hiperinzulinémia indukálta további oxidatív stressz kimeríti az antioxidáns rendszer kapacitását és hozzájárulhat a szívizom funkciójának romlásához. Az inzulin kezelés hatására csökkent TSC lehet annak a következménye is, hogy az inzulin kezelés hatására mérséklődik az oxidatív stressz a szervezetben. Az inzulin kezelés és a következményes vércukor koncentráció esés csökkentheti a szabadgyökök
73
felszabadulását, ezáltal csökkenhet a kompenzatorikus antioxidáns védelmi kapacitás is. Kísérleteinkben ez a magyarázat kevésbé valószínű, hiszen az állatok vércukorszintje inzulin kezelés után is igen magas maradt. Az exogén hiperinzulinémia más jelpályák befolyásolásán keresztül járul hozzá a szívizomsejt hipertrófia kialakulásához. A kontraktilitás romlása összefüggésben van a szívizom struktúrájának kóros megváltozásával, amelynek makroszkóposan a bal kamra hipertrófia az egyik indikátora, mikroszkóposan pedig a kontraktilis elemek pusztulása, interstíciális és perivaszkuláris fibrózis kialakulása [142]. Kardiomiopátiára ugyancsak jellemző a kationtranszport rendszerek csökkent működése. Az irodalmi adatokkal egyezően kísérleti eredményeink szerint STZ diabéteszben csökkent a NKA-ra jellemző ouabain kötőhelyek száma, a NKA aktivitása, valamint az enzim mennyisége, hasonló csökkenést tapasztaltunk a SERCA esetében is, ugyanakkor más vizsgált enzimek aktivitását nem befolyásolta a dabéteszes állapot. Ismert, hogy szívelégtelenségben digitálisz kezeléssel a szívizom NKA gátlásán keresztül a pumpafunkció, a kontraktilitás javítható. A digitálisz kezelés miatt gátolt NKA átmeneti Na+ koncentráció emelkedést indukál a citoplazmában, ami a sejtmembrán Na +/Ca2+ antiporterének működési irányát megfordítja, ezáltal emelkedik az ic. Ca2+ koncentráció, mely a SR-ban Ca2+ szekvesztrációt és következményes pozitív inotróp hatást fejt ki [113, 161], [162], [163]. Diabetes mellitusban [92], szívelégtelenségben [164], hipertóniában [165] az endogén digitáliszok szintje emelkedett. Irodalmi adatok alapján STZ diabéteszes patkányokban és cukorbetegekben kb. másfélszeresére emelkedik az angiotenzin koncentrációja a nem cukorbetegekben mért értékekhez képest [166-168]. A megnövekedett
ANGII
koncentráció,
a
diabétesszel
igen
gyakran
társuló
magasvérnyomáshoz vezető szív és érrendszeri szövődmények az endogén digitáliszok szintézisét serkentik a mellékvesekéreg zona fasciculatajában. Az alacsonyabb pumpaexpresszió mellett diabéteszben még további tényezők is csökkentik a NKA működését. Eckel és Reinauer feszültség-függő festékkel kimutatták, hogy egészséges szívizomban az akut inzulin adagolás hiperpolarizálta a sejteket [169]. Egy másik vizsgálatban az akut inzulin hiperpolarizáló hatása szívglikozidokkal visszafordítható volt
74
[170]. A Na+ és K+ transzport által fenntartott membránfeszültséget a NKA működése befolyásolja, amely inzulin hatásra reagál [171, 172]. A NKA által fenntartott membránfeszültség akut inzulin hatásra változik. A koncentráció változás hátterében feltehetően a NKA aktiválódás áll. Eredményeink szerint azonban nem mutatható ki akut inzulin hatást követően NKA aktivitás változás a sejthomogenizátumban. A tisztított sejthártyában inzulin előkezelést követően azonban fokozódott mind a NKA aktivitás, mind a strofantin kötés. Szívizomban eddig nem vizsgálták az inzulin indukálta NKA transzlokációt. Vizsgálatunkban az α katalitikus alegységek izoformáit ouabain kötési erősség szerint, valamint Western blot analízissel analizáltuk. Az akut inzulin hatás vizsgálatához kísérletünkben pozitív kontrollként a szívizomban is kifejeződő, akut inzulin hatásra ismerten reagáló fehérje, a Glut4 szubcelluláris lokalizációját követtük. Eredményeink szerint az α1 és az α2 alegységek sejten belül, különböző kompartmentekban találhatóak a szív bal kamrájának kardiomiocitáiban. Mind a kontroll, mind pedig a cukorbeteg szívizomban az alacsony ouabain affinitású 1 alegység nagyrészt a plazmamembránhoz kötötten helyezkedik el, míg a magas ouabain affinitású α2 alegység izoforma nagy része intracelluláris poolokhoz kötött. Harántcsíkolt izomban ugyanezt a megoszlást találták Omatsu-Kanbe és mtsai. 1990-ben [173]. A cukorbeteg patkányok szívizmának membránfrakcióiban mért Na+/K+-ATPáz aktivitása az IM és a PM frakcióban is alacsonyabb volt, mint a kontrollé. A diabéteszben mért aktivitás csökkenés követte az alegységek mennyiségének csökkenését, ennek megfelelően az egységnyi
pumpamennyiségre
számított
aktivitás
nem
változott
szignifikánsan
(642±86 /perc és 626±78 /perc a PM-ban és 55374 /perc és 51983 /perc az IM-ban a kontroll és a diabéteszes csoportokban). Ezek a változások arra utalnak, hogy cukorbeteg patkányok szívizomzatában az ATPáz mennyiségi csökkenése okozza az aktivitás csökkenést, nem kovalens módosítás, vagy affinitáscsökkenés miatt kialakult inaktiváció. A Western blot analízis megerősítette előző eredményeinket. Diabéteszes szívizomban szignifikánsan csökkent mindkét katalitikus és a β1 nem katalitikus alegység izoforma mennyisége - ez a megfigyelés alátámasztotta az irodalomban már leírt változásokat [113]. A nagyrészt intracelluláris poolokban elhelyezkedő 2 és 1 alegyég izoformák mennyisége nagyobb mértékben
75
csökkent cukorbetegségben, mint a plazmamembránhoz kötött 1 és 1 alegységek mennyisége. Akut inzulin adagolás hatására az 2 és 1 alegyég izoformák nagyobb mennyiségben helyeződtek ki a plazmamembránra, ennek megfelelően mennyiségük csökkent az intracelluláris membránfrakciókban. Sejtfelszín biotinilációs módszerrel az α1 alegység plazmamembrán transzlokációja is kimutatható volt, bár sokkal kisebb mértékben, mint az 2 alegységé. Az irodalomban az akut inzulin kezelésnek ugyanezt a hatását figyelték meg a Glut4 glukóz transzporter membrántranszlokációjában szívizomban [174] és a NKA alegységek redisztribúciójában harántcsíkolt izomban [99]. Vizsgálataink elsőként igazolják a Na+/K+-ATPáz 1, 2 katalitikus és 1 nemkatalitikus alegységeinek inzulin-függő membrántranszlokációját kontroll és diabéteszes szívizomban. Eredményeink nem meglepőek a harántcsíkolt izommal végzett számos vizsgálat fényében [97],[175],[176]. Munkacsoportunk mutatta ki először, hogy inzulin hatására a NKA alegységeinek redisztribúciója diabéteszben jelentősen csökken. A diabéteszben megfigyelt elégtelen NKA transzlokációt magyarázza, hogy a NKA 2 alegységének mennyisége jelentősen csökkent az intracelluláris poolokban. Az 2 alegység sokkal nagyobb mértékben reagál az inzulin jelre, mint az 1 alegység. Eredményeinkkel ellentétben a Glut4 fehérjét overexpresszáló transzgenikus, diabéteszes egerekben az inzulin hatására fokozott NKA 2 transzlokáció figyelhető meg harántcsíkolt izomban [176, 177]. Az általunk vizsgált STZ diabéteszes modellben mind a Glut4, mind a NKA expressziója csökkent, az intracelluláris membrán frakciókban is kevesebb fehérje mutatható ki. Vizsgálataink szerint diabéteszben szívizomban akut inzulin adagolás hatására nagyobb mértékű intracelluláris Na+/K+-ATPáz aktivitás csökkenés figyelhető meg, mint a plazmamembránban mért növekedés. Úgy tűnik, hogy diabéteszben az inzulin hatás összességében csökkent mértékű és a mozgósított NKA egy része transzlokáció közben “elveszik”. Ennek a megfigyelésnek a hátterében elképzelhető az a magyarázat, hogy az aktív pumpafunkcióhoz mind az , mind pedig alegységek szükségesek. A nem katalitikus alegységek közül a 1 alegység kifejeződése nagyobb mértékben csökken cukorbetegségben, mint az 2 alegységé. A 1 alegység nagyrészt a plazmamembránhoz
76
kötve heterotetramert képez az amúgy is túlsúlyban lévő 1 alegységgel és az 11 összetételű NKA kisebb mértékben reagál az inzulin hatásra. Felmerül, hogy a 1 alegység mennyiségének nagymértékű csökkenése szab gátat a kihelyeződésre alkalmas 21 heterotetramerek kialakulásának. A alegységek szerepe a NKA működésében teljes mértékben a mai napig sem tisztázott. Vitatott, hogy az / arány megváltoztatja-e a pumpa aktivitását, stabilitását a membránokban, az enzim transzlokációjában azonban a szerepe egyértelműnek látszik [178],[60]. Eredményeink szerint az inzulin indukálta NKA transzlokáció wortmanninnal, egy szelektív PI3 kináz gátlószerrel kivédhető. A PI3 kináz az inzulin jelpálya olyan központi szereplője, amelyről már ismert, hogy harántcsíkolt izomban az inzulin függő GLUT4 és NKA membránhoz való kihelyeződésében szerepet játszik [173]. Vizsgálataink eredményeit összesítve elmondhatjuk, hogy a rövid távú inzulin stimuláció szívizomban a NKA 21 és 11 izoformáinak membránhoz való transzlokációját serkenti, a harántcsíkolt izomban megfigyelthez hasonlóan. A diabéteszes állapot csökkenti a szívizom válaszkészségét akut inzulin hatásra. Feltehető, hogy az inzulin hatásának csökkenése főként az 2 és a 1 alegység izoformák mennyiségének jelentős csökkenésével magyarázható. Az 1 izoforma kisebb mértékben vesz részt az akut inzulinválaszban. Diabéteszes szívizomban tehát csökken az össz NKA mennyisége és az iontranszportban központi szerepű plazmamembránhoz kötött NKA aktivitás is. Feltehető, hogy a NKA működésének változása adaptív mechanizmus része, amely a diabéteszben romló szívizom kontraktilitást és pumpafunkció romlást hivatott kompenzálni.
77
9.2. A NKA szerepe a diabeteszes nefropátiában A diabéteszes nefropátia és a végstádiumú vesebetegség multifaktoriális etiológiájú. Patogenézisében egyértelműen szerepel a diabéteszes állapotra jellemző hiperglikémia és a hipertónia, amelyek felgyorsítják a veseszövődmény progresszióját. Számos klinikai vizsgálat igazolta, hogy az egészségesekét megközelítő szénhidrátanyagcsere és a vérnyomás célértéken tartása képes lassítani vagy megelőzni a vesekárosodás előrehaladását [179, 180]. A magas vércukorszint és a magas vérnyomás különböző mechanizmusokon keresztül fejt ki hatást a vesében észlelhető strukturális és funkcionális eltérésekhez vezető molekuláris biológiai változásokra. Számos olyan klinikai helyzet adódhat cukorbetegeknél, amikor az
amúgy is emelkedett angiotenzin szint mellett RAS aktiváció is fellép. Ilyen szituáció például a diabéteszes ketoacidózishoz, hiperozmoláris nem-ketotikus kómához, akut szívelégtelenségehez társuló RAS aktiváció. Ilyen esetekben a diabéteszhez és a diabéteszes nefropátiához akut ANGII koncentráció emelkedés társul. Peti-Peterdi és mtsai. egy éve kimutatták, hogy a magas vércukorszint a JGA sejtjein keresztül renin kiáramlást indukál (32. ábra). A hiperglikémia emelkedett szukcinát szintet eredményez, amely a citrát körben normálisan is termelődő metabolit. A szukcinát képes aktiválni a vese juxtaglomeruláris apparátusán lévő GPR91 receptort. A GPR91 aktivációja renin felszabadulást, következményes ANGII szint emelkedést eredményez [181]. A hiperglikémia tehát önmagában is megemeli a RAS rendszer aktivitását diabéteszben.
78
32. ábra A hiperglikémia a túlzott szukcinát termelés hatására renin felszabadulást és ANGII szintézist okoz Afferens arteriola Érfalsimaizom Endothel
Juxtaglomeruláris apparátus
Angiotenzinogén
renin JG sejtek Glukóz Szukcinát
eNOS GPR91
JG sejtek
Ca2+ COX1/2
ANGI
JG sejtek
ANGII
Peti-Peterdi, J., 2008.
32. ábra. A magas vércukorszint növeli a szukcinát koncentrációját a plazmában és a glomerulusok endotheliumában. Az érfal endotheliumában a szukcinát receptorán keresztül (GPR91) megnöveli az endothel ic.Ca2+ koncentrációját. A Ca2+ jel nitrogén monoxid és prosztaglandin E2 koncentráció növekedéshez vezet, amely a juxtaglomeruláris apparátus renin szekrécióját fokozza, ez közvetve emeli az ANGII koncentrációt. ANG: angiotenzin, COX: ciklooxigenáz, eNOS: endotheliális konstitutív nitrogén monoxid szintáz, GPR91: szukcinát receptora , JG: juxtaglomeruláris apparátus sejtjei [181] A magas vércukorszint emellett AGE-k keletkezését segíti elő diabéteszes nefropátiában, amelyek irodalmi adatok szerint megnövelik a PKCα izoformájának kifejeződését és elősegítik transzlokációját [11]. A PKC az ANGII jelpálya egyik központi tagja, az ANGII és a PKC mennyiségének együttes növekedése fokozott jelpropagációhoz vezethet, amelynek eredménye a NKA Ser23 foszforilációja és internalizációja lehet. Vizsgálataink során a diabéteszben szenvedő patkányoknál a magas vércukorszint mellett a patkányok vesefunkciójának károsodását figyeltük meg. Eredményeink számos egyéb irodalmi adattal egybehangzóan [28, 37, 50] a szérum kreatinin érték és BUN emelkedését, a vese/testsúly arány növekedését, a vizelettel kiválasztott kreatinin és urea nitrogen emelkedését, valamint a frakcionált Na+ kiválasztás megnövekedését igazolták. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a 7 hetes STZ diabéteszben szenvedő patkányoknál súlyos strukturális és funkcionális vesekárosodás alakult ki.
79
Az ANG II adagolás a kontroll állatokban vérnyomás emelkedést indukált és rontotta a mért vesefunkciós paramétereket. Vizsgálatunk elsőként mutat rá arra, hogy az emelkedett angiotenzin szint a cukorbetegség okozta vesekárosodást tovább rontja, amely arra utal, hogy az angiotenzin hatás önmagában “rárakódásos nefropátiát” okoz cukorbetegségben. A DA kezelt állatoknál súlyos vesefunkció romlást tapasztaltunk (emelkedett szérum kreatinin, BUN koncentráció, K+ és FeNa ürítés), kifejezettebbet, mint a KA és a D csoportban. Az artériás középnyomás a DA csoportban, ha nem is szignifikánsan, de magasabb volt, mint a diabéteszes, ANGII kezelésben nem részesült állatoknál.
Az
magyarázható
ANGII a
7
hatására
hetes
bekövetkező
diabéteszben
vérnyomásemelkedés
szenvedő
állatok
elmaradása
jelentős
mértékű
folyadékvesztésével, amit a magas BUN érték is jelez. Kezeletlen, súlyos mértékű cukorbetegségben ez a jelenség gyakori. Ismert továbbá, hogy hosszan tartó diabéteszes állapotban a vérnyomást fiziológiás esetben emelő hormonok hatása elmarad, presszor válasz elégtelenség alakul ki, amely 1-es típusú diabétesz állatmodelljeiben is kimutatható [182-184]. Irodalmi adatok szerint a szív- és érrendszeri, valamint a vesét érintő funkció károsodás megváltoztatja az artériás középnyomást és a kardiovaszkuláris reakciókészséget [184]. STZ diabéteszes patkányok esetében ezt a jelenséget már 3 héttel a diabétesz kialakulása után kimutatták [185]. Kísérleteink szerint a presszor válasz elégtelensége akár 7 héttel a diabétesz indukciója után is fennmarad. Mivel a filtrált Na+ legnagyobb része a vese proximális kanyarulatos csatornáin keresztül szívódik vissza, ezért a proximáis kanyarulatos csatornák bazolaterális membránján igen nagy mértékben fejeződik ki a NKA, amely a Na+ visszaszíváshoz szükséges iongrádienst tartja fenn, azáltal, hogy Na+-ot pumpál az intersticium felé. Mivel a Na+ legnagyobb része NKA segítségével szívódik vissza, ezért az NKA működésének fiziológiástól való eltérései szerepet játszhatnak a vesekárosodás kialakulásában. STZ diabéteszben az irodalomban már számos szövetben megfigyelték a NKA α1 alegységének megnövekedett expresszióját és ezzel párhuzamosan aktivitásának növekedését is [112, 128]. Az ANGII hatását cukorbeteg patkányok NKA-ának működésére azonban eddig még nem vizsgálták. Irodalmi adatok szerint ANGII hatására megnövekedett a NKA mRNS expressziója hiperinzulinémiás diabéteszben szenvedő patkányok aortájában és az endothel ANGII -vel végzett inkubációja után ez a hatás még
80
kifejezettebb volt, de ebben a vizsgálatban a NKA fehérje kifejeződését, aktivitását, szubcelluláris elhelyezkedését nem vizsgálták [168]. Vesekéreggel végzett vizsgálataink újdonsága, hogy kísérleteink során nemcsak különkülön vizsgáltuk a STZ diabétesz és az emelkedett angiotenzin szint hatását a NKA-ra, de a cukorbeteg állatok ANGII kezelésével a két patológiás állapot kombinációjának hatását is megfigyeltük. Az ANGII adagolásával modelleztük a cukorbetegségben számos esetben előforduló akut RAS aktiváció hatását a NKA-ra és a vesebetegség progressziójára. Mind az STZ diabétesz, mind pedig az ANGII kezelés megemelte a NKA mRNS és fehérje expresszióját valamint az enzim aktivitását. Az STZ diabéteszes patkányok ANGII kezelése után még kifejezettebb mRNS és fehérje expressziót, valamint aktivitást mértünk. A diabétesz és az ANGII kezelés hatása összegződött. Feltehető, hogy a NKA expressziójának és aktivitásának növekedése diabétesz és/vagy ANGII emelkedés (RAS aktiváció) hatására a vese adaptív válaszának része, amely a diabéteszben megnövekedett vérnyomást és a diabétesz során kialakuló kezdeti hiperfiltrációt hivatott kompenzálni. A NKA pumpafunkciója és az effektív ion traszport részben a kifejeződő enzim mennyiségétől, az aktivitást befolyásoló poszttranszlációs módosulásoktól és az enzim szubcelluláris elhelyezkedésétől függ. Azuma és mtsai kimutattak egy régiót a NKA α1 alegységének génjén, amely a megnövekedett Na + terhelésre a gén expresszióját növeli [186]. Érfal simaizmában az ANGII által okozott α1 alegység gén expresszió növekedését a PI3K-MAPK kaszkád szabályozza [187]. Feltehető, hogy a vesében is működnek hasonló szabályozó mechanizmusok, de pontos jelátviteli útvonalak azonosítására további vizsgálatok szükségesek. Korábbi irodalmi adatokkal egyezően [37, 188, 189] a vesekéreg homogenizátumban mind az STZ diabétesz hatására, mind pedig ANGII kezelés hatására megnövekedett a NKA α1 fehérje kifejeződése és az enzim aktivitása. Mivel a Tritonnal oldhatatlan, citoszkeletonhoz kötött, plazmamembránt is tartalmazó frakcióban a NKA abszolút fehérje mennyisége nem változott szignifikánsan, feltehető, hogy a homogenizátumban mért fehérje expresszió növekedésért az intracelluláris poolokban lévő α1 alegységek mennyiségének növekedése felelős.
81
Eredményeink azt igazolják, hogy mind a diabéteszes állapot, mind az ANGII kezelés elősegíti a NKA α1 alegységének internalizációját, erre utal a pumpák megoszlása a PM-t tartalmazó és az IM-t tartalmazó frakciók között. Nem zárható ki azonban az a lehetőség sem, hogy a kísérleteink során rögzített pillanatkép azt az állapotot tükrözi, amikor a DM és az ANGII kezelés hatására fokozott mennyiségben keletkező pumpák még nem érték el a fiziológiás céljukat - a PM-t - és átmenetileg a citoszolban találhatóak. Mindezek az adatok azt igazolják, hogy a NKA szövethomogenizátumban mért változásainak értékelésekor nem szabad figyelmen kívül hagyni azt a tényt, hogy a PMhoz kötött aktivitás nem feltétlenül követi a homogenizátumban detektált változásokat. A pumpa fehérje mennyiségén kívül a pumpafunkciót a poszttranszlációs kovalens módosítások is befolyásolják. Számos munkacsoport igazolta, hogy a NKA aktivitása foszforilációval befolyásolható [86, 190, 191]. Foszforilációval és defoszforilációval szabályozható a pumpák szubcelluláris lokalizációja is. A proximális tubulusban az enzimaktivitást protein kináz függő foszforiláció is szabályozza [192, 193]. A proximális tubulusban a Ser23 foszforiláltsági szint magasabb mint a Henle kacs vastag felszálló szárában. Az NKA α1 alegységének Ser23 foszforilációja PKC függő, specifikus gátlószerrel gátolható volt. A dopamin, a NKA ismert inaktivátora, a PKC-t aktiválja és az α1 alegység Ser23 helyén foszforilálja [88, 194]. Irodalmi adatok támasztják alá, hogy az ANGII a proximális tubulusok területén a NKA α1 alegységét Ser23 foszforilálni képes. Ez az ANGII által indukált kovalens módosítás a PKC aktivációján keresztül valósul
meg
[103].
A
Ser23
foszforilált
α1
alegységek
az
intracelluláris
kompartmentekben helyezkednek el. A Ser23 foszforilációs hely az α1 alegység amino terminusához közeli PKC motivumnál történik, fajspecifikus, kifejezetten patkányokra jellemző és eddigi ismereteink szerint más kináz által nem foszforilálódik [89]. A legújabb adatok azt bizonyítják, hogy a NKA α1 alegységének Ser18-as helyén történt foszforiláció nem járul hozzá a homogenizátumban mért aktivitás növekedéséhez, de a pumpák intracelluláris kompartmentekbe történő transzlokációjának elindítója [86, 195]. Vizsgálataink azt mutatták, hogy a citoszolban tartózkodó α1 alegység mennyisége és Ser23 foszforilációjának mértéke is jelentősen megnövekedett STZ diabétesz és ANGII hatására. Ez arra utal, hogy a PM-ból az IM poolba mozduló alegységek Ser23 foszforiláltak. A Ser23 foszforiláció a pumpák internalizációját okozza, de aktivitásukat
82
nem gátolja, ellentétben a Ser18 foszforilációval. A citoszkeleton asszociált, plazmamembránhoz kötött NKA-ok esetében Ser 23 forszforiláció nem volt tapasztalható. Mivel a PKC, amelynek direkt szerepe van a Ser23 foszforliációban, számos egyéb jelátvivő fehérje működésére is hatással van, amelyeknek szerepe lehet a NKA működésének befolyásolásában, ezért a Ser23 foszforiláció pontos szerepe így sem teljesen tisztázott [196]. A megváltozott sejten belüli megoszlást immunfluoreszcens festés után konfokális mikroszkóppal vizualizáltuk. Kontroll vesében a NKA többsége a proximális tubulusok bazolaterális membránjában, vagy ahhoz szorosan asszociálva helyezkedett el. A kontroll állatok veséjében ANGII kezelés után a citoplazmában megnövekedett a detektálható NKA-ok mennyisége és a NKA-ok a bazális membrántól apikális irányban is megjelentek. Diabéteszes vesében a proximális tubulusok területén a szövettani kép típusos nefropátiás képet mutatott, megnövekedett NKA mennyiséggel és kiszélesedett bazálmembránnal, ami esetünkben a NKA internalizációjának felelt meg. A cukorbeteg állatokban ANGII kezelése után “rárakódásos” vesekárosodást figyeltünk meg: megemelkedett az α1 alegység specifikus festés intenzitása és megváltozott a NKA sejten belüli eloszlása. Tekintettel arra, hogy a diabetes mellitus önmagában is ANGII koncentráció emelkedést okoz, megvizsgáltuk, hogy az AT1R antagonista losartan hogyan befolyásolja a NKA α1 alegységének mRNS, fehérje expresszióját, aktivitását és intracelluláris elhelyezkedését. Megfigyeléseink szerint a losartan kezelés visszafordította a NKA expressziójának növekedését, a pumpák nagy része a bazolaterális membránban helyezkedett el és a detektálható Ser23 forszforiláció mértéke is a kontrollhoz közeli értékre csökkent. Ez a megfigyelés alátámasztja azt a klinikai tapasztalatot, hogy az ANGII receptor blokkolók használata cukorbetegeknél tekintet nélkül a vérnyomás kontroll sikerességére, a nefropátia előrehaladását is késlelteti [197, 198]. Összefoglalva elmondhatjuk, hogy vesekéreggel történt vizsgálataink igazolják, hogy: 1., diabetes mellitusban megnövekszik a NKA mRNS és fehérje kifejeződése valamint az enzim aktivitása; 2., ANGII kezelés hatására ugyanezeket a változásokat észleltük;
83
3., DM és ANGII-vel kezelt patkányok veséjében az mRNS, fehérje és enzim aktivitás additív módon növekedett; 4., a Ser23 foszforiláció mértéke mind a DM-ban szenvedő, mind az ANGII-vel kezelt állatok vesekérgében megnövekedett, amely feltehetően a NKA internalizácóját eredményezi a proximális kanyarulatos csatornák bazolaterális membránjából; 5., Losartan és metformin kezelés a NKA diabéteszben észlelt változásait kivédte.
Eredményeink alapján feltehető, hogy a DM-ban megfigyelhető hormonális környezet megváltozása, a csökkent inzulin jel, a megnövekedett szisztémás és helyi ANGII szint és az emelkedett endogén digitálisz koncentráció hatásainak eredőjeként a proximális tubulusokban a NKA internalizálódik. Irodalmi adatok alátámasztják, hogy az ANGII egyéb Na+ csatornák redisztribúciójában is szerepet játszik [199]. A NKA sejten belüli transzlokációjának pontos mechanizmusa és szerepe mindezidáig nem tisztázott.
84
9.3. A NKA patológiás változásainak szerepe a szöveti átépülésben, a szövődmények progressziójában
A DCCT (Diabetes Control and Complications Trial) és a UKPDS (United Kingdom Prospective Diabetes Study) vizsgálatok óta tudjuk, hogy az egészségesekét megközelítő szénhidrát anyagcsere kialakítása a leghatékonyabb tényező a cukorbetegség késői szövődményeinek késleltetésében. Az agressziv hipertónia-ellenes terápiáról, a RAS gátlásának hatékonyságáról klinikai vizsgálatok állnak rendelkezésünkre diabéteszes nefropátiában [197, 198, 200]. Vizsgálataink szerint az ANGII fokozza a diabéteszben megfigyelt NKA elváltozásokat, amely alátámasztja a klinikai gyakorlatban gyakran használt RAS gátlószerek használatát cukorbetegeknél. A RAS rendszer gátlószereinek jótékony hatása összefüggésben lehet a NKA fiziológiás lokalizációjának megőrzésében mind diabéteszben, mind pedig a diabéteszben fellépő RAS aktiváció során. A NKA normális működésének szerepe lehet az egészséges szöveti struktúra és funkció megőrzésében is.
A diabéteszhez társuló nefropátia klinikai jellemzője az emelkedő artériás vérnyomás, az albuminuria és a vesefunkció romlása. A diabéteszes nefropátiában szenvedőknek fokokozott a rizikója kardiovaszkuláris megbetegedések kialakulására, esetükben a kardiovaszkuláris mortalitás [201] is fokozott. Vizsgálatunk alátámasztotta, hogy diabétesz hatására a szívizomban mért NKA aktivitás csökken, míg a vesekéregben mért aktivitás növekszik. Szívizomban az aktivitásra vonatkozó adatok az irodalomban egységesek, míg a veseszövetben leírt adatok ellentmondásosak. Kísérleteink során elválasztottuk a plazmamembránhoz asszociált funkcionálisan aktív NKA poolt az intracellulárisan elhelyezkedő aktív, de iongrádienst ki nem alakító NKA pooltól. Feltehető, hogy a NKA szabályozása cukorbetegségben is kívánatos, azaz a szervezet a szívizom tekintetében a megfelelő kontraktilitás fenntartására törekszik, a vesében pedig a vérnyomásingadozások ellen dolgozik. Ha ezt a feltételezést elfogadjuk, akkor ebből az következhet, hogy a vesében a sejtfelszíni NKA aktivitás csökkentése lehet a felelős a cukorbetegségben kialakult szisztémás és lokális magasvérnyomás kompenzálásáért a betegség korai stádiumában. A megnövekedett expresszió ellenére a mobilizálható pumpák intracelluláris poolokban maradnak, így a bazálmembránban elhelyezkedő aktív NKA-k száma nem 85
növekszik és a Na+ visszaszívás mértéke sem nő. A cukorbetegség előrehaladtával feltehetően felbomlik a kihelyeződést serkentő inzulin és az intracelluláris poolba való transzlokációt elősegítő jelpályák aránya (endogén digitalisz, angiotenzin, inzulin, 33. ábra).
33. ábra A diabéteszes állapot befolyásolja a NKA transzlokációját vesében és a szívizomban I
AngII AT1R
ED Kav EGFR
metformin OCT
IR Kav NKA Kav IRS1,2,3,4
Src PKC
PI3K
AMPK
EGFR Kav NKA
behelyez
behelyez
kihelyez
kihelyez
33. ábra. A megnövekedett ANGII, ED koncentráció, a csökkent inzulin hatás és a diabétesz kezelésében használt gyógyszerek hatással vannak a NKA szubcelluláris elhelyezkedésére. Rövidítések: AMPK: AMP-aktivált protein kináz, ANGII: angiotenzin II, AT1R: angiotenzin II 1-es típusú receptora, ED: endogén digitálisz, EGFR: epidermális növekedési faktor receptor, I: inzulin IR: inzulin receptor, IRS: inzulin receptor szubsztrát, Kav: kaveolin, NKA: Na+/K+ -ATPáz, PI3K: foszfatidil-inozitol-3-kináz, PKC: protein kináz C, OCT: szerves kation transzporter, Src: tirozin kináz Diabéteszben megnő az endogén digitáliszok keringő mennyisége, amely a NKA gátlásán kívül a pumpa intracelluláris poolba való transzlokációját serkenti. Ma már tudjuk, hogy az endogén digitáliszok és a NKA receptor-ligand kapcsolat kialakulása után számos jelátviteli út aktiválódik. Ouabain kötődés után a kaveolákhoz asszociált NKA aktiválja a Src kinázt, ami az EGFR-t és a PI3K-t aktiválja. Feltehető, hogy a NKA/Src/EGFR/PI3K komplex az AP-2-höz és a klatrinhoz kapcsolódik, ezzel kialakítva az endocitózis klatrinnal fedett vezikuláit [202]. 86
A kaveolinoknak szerepük lehet a NKA intracelluláris szállításában [203]. Diabetes mellitusban csökkent a kaveolin-1 mennyisége [204]. A kaveolin-1 fiziológiás funkciójának változása diabéteszben az inzulin receptor, valamint a Glut4 glukóz transzporter membránhoz való kihelyeződését károsítja, így rontja az inzulin jelpálya hatékonyságát és a glukóztranszportot [205], amely számos egyéb transzporter funkcióját is befolyásolja. Az AT1R és az NKA is megtalálható a kaveolák területén [206]. Kaveolin1 nullmutáns egerekben a vesében 55%-kal csökken az AT1R-ok száma a kontrollhoz képest. Bár az AT1R-ok nem kaveolákban helyezkednek el, a kaveolin-1 chaperonként szolgál a receptorok szállításában. Kaveolin fehérjék hiányában számos jelpálya működik kórosan [207]. A kaveolák olyan felületet biztosítanak a hozzájuk asszociált fehérjéknek, amely által a fehérje-fehérje, fehérje-lipid interakciók valószínűsége térben és időben megnövekszik. A kaveolákhoz asszociált NKA internalizáció megváltoztathatja a NKA aktivitását, és több jelpálya működését is befolyásolhatja [208]. Kobayashi és mtsai. vizsgálatai azt bizonyították, hogy mind a diabéteszes állapot, mind pedig az ANGII kezelés csökkentette a kaveolin 1 fehérje kifejeződését szívizomban. A kóros strukturális és funkcionális változások javíthatóak voltak AT1R gátlószerrel [209]. Figyelembe véve ezeket az eredményeket feltehető, hogy a diabéteszben megváltozott kaveolin fehérjék befolyásolhatják a kaveolákhoz asszociált transzmembrán fehérjék mennyiségét, integrációjukat a kaveolák területére, szállításuk fluxusát és ezzel kompartmentekhez kötött aktivitását. Igen érdekes, hogy a kaveolin-1 nullmutáns egerekben, ahol egyébként a kardiomiociták nem is fejezik ki ezt a fehérjét, szignifikánsan megnagyobbodott jobb kamrát, megvastagodott bal kamra falat és szisztolés diszfunkciót észleltek. A kardiomiociták között elhelyezkedő nem osztódó sejtekben: a fibroblasztokban és az endothel sejtekben a kaveolin-1 fiziológiásan nagymértékben kifejeződik. Szövettani vizsgálatok során azt tapasztalták, hogy a Kav-1 nullmutáns egerek szívizmában a kardiomiociták hipertrófiások és az interstíciumban, valamint perivaszkulárisan jelentős mértékű fibrózis figyelhető meg. Ez a szövettani kép jellemző a diabéteszes kardiomiopátiában szenvedő patkányok szívére is. A kaveolin-1-nek szerepe van a p42/44 MAP kináz kaszkád gátlásában, a KAV-1 nullmutáns állatokban a MAP kináz kaszkád hiperaktivációja figyelhető meg [210]. Feltehető, hogy a diabéteszes szövődmények kialakulásának egyik közös etiológiai faktora lehet a NKA megváltozott aktivitása illetve sejten belüli redisztribúciója. A sejtplazmába 87
került membránszigetekről jelpályák sokasága aktiválódhat és gátlódhat. Az endogén digitáliszok által aktivált NKA szignaloszóma megnöveli a sejtfelszínhez asszociált halál receptorok (DR4, DR5) és a kaszpázok aktivitását [76]. A megnövekedett intracelluláris Ca2+ koncentráció csökkenti számos transzkripciós faktor expresszióját (pl aktivátor protein-1) és ezzel számos gén expresszióját befolyásolja. Az AP-1-ről ismert, hogy szerepe van a szív fibroblasztjainak proliferációjában és a matrix metalloproteázok szintézisének serkentésében oxidatív stresszben [211], így diabetes mellitusban is. Az Ang II-ről kimutatták, hogy a PARP-1-et aktiválja, amely a c-Jun és c-Fos poly-ADPribozilációjáért felelős. A c-Jun és c-Fos complex alkotja az AP-1 transzkripciós faktort, amely felelős a diabéteszes kardiomiopátiában is kimutatható fibrózisért és kóros szöveti átépülésért [212, 213]. Az angiotenzin szerepe a diabétesz során kialakult patológiás folyamatokban nem tisztázott és vizsgálataink alapján sem mondhatjuk ki, hogy a NKA kóros viselkedésének a RAS rendszer fiziológiástól eltérő működése lenne az egyetlen oka. Vizsgálatainkban elsőként mutattuk ki, hogy a diabétesz és az ANGII kezelés vesefunkciót rontó hatása összeadódik, ún. “rárakódásos” vesekárosodást hoz létre. Az AT1R blokkoló losartannal végzett vizsgálatainkban kimutattuk, hogy a hatóanyag képes visszafordítani a vesében észlelt funkcionális és morfológiai változásokat. Úgy tűnik, hogy az ANGII egyike a NKA lokalizációját megváltoztatni képes enzimeknek diabéteszben. Az endogén digitálisz-szint emelkedésében az ANGII koncentráció növekedésének direkt szerepe van [77]. Vizsgálatunk új fényben tünteti fel a RAS gátlás jelentőségét cukorbetegségben. Az eddigi vizsgálatok a RAS gátlókkal szerzett pozitív tapasztalatokat az ANGII hemodinamikai hatásának vagy nem hemodinamikai (növekedési faktor, nephrin, gyulladás, glomerulus pórus méret) hatásainak antagonizálásával magyarázták. Kutatócsoportunk vizsgálatai azt mutatják, hogy a NKA redisztribuciójának is alapvető szerepe lehet a diabéteszes nefropátia kialakulásában. Metforminnal végzett kísérleteinkben is megfigyeltük a diabétesz során kialakult kóros NKA működés normalizálódását, ami arra utal, hogy számos jelpálya befolyásolhatja még a NKA működését. Az AMPK az egyik fő energia-érzékelő enzim a sejtekben, amelyet a metformin aktiválni képes. Relatív vagy abszolút hiperglikémiában, hipoxiában, ischémiában számos energiát igénylő folyamatot gátol. Szabályozásában az ATP/AMP arány szerepet játszik, de úgy tűnik, hogy a Ca2+/calmodulin kináz kináz II (CaMKKII) és az oxidatív stresszben megjelenő reaktív oxigén szabadgyökök is aktiválják. Colombo és mtsai. kimutatták, hogy az AMPK hiányos sejtvonalban az antioxidáns 88
rendszer kucsfontosságú enzimei (MnSOD, KAT, thioredoxin) jelentősen kisebb mértékben fejeződnek ki [214]. Feltehető, hogy diabéteszben az AMPK működése is károsodott, sem energiahiányra, sem pedig oxidatív stresszre nem következik be megfelelő aktiváció. Ez nemcsak a kompenzáló mechanizmusok hatékonyságát ronthatja cukorbetegségben, de tovább fokozhatja a szöveti károsodást is. Farmakológiai aktivációja a NKA működésének helyreállításán kívül feltehetően több jelpálya utat is érint, amelyek vizsgálata a jövőben jelentős lehet. Az endogén és exogén szabályozó anyagok hatásának eredője határozza meg vélhetően a pumpafunkciót, illetve annak a NKA jelátvitelben betöltött szerepét (34. ábra). A cukorbetegségben érintett, az inzulin jelpálya, a szignaloszóma, az ANGII és az endogén digitáliszok által befolyásolt jelátviteli folyamatok központi szereplőinek a MAPK kaszkád, a PI3K illetve a PKC tűnik. Ezek olyan elágazási pontok a jelátviteli folyamatokban, amelyek többszörösen érintettek a diabéteszben kialakult kóros körülmények által. Működésük
megváltozása
fibrózishoz,
89
apoptózishoz,
hipertrófiához
vezet.
34. ábra Strukturális károsodások kialakulásának feltételezett módja vesében és a szívizomban I
AngII
AngII
ED
AT1R
Kav EGFR
Kav NKA
Ras Raf
Grb2 Kav IRS1,2,3,4
Src PLC
SHC
Sos
PI3K PKC
NADPH oxidáz
IP3
Mek Erk1/2
Bcl-XL Bcl-2
Akt
Citoszkeletális fehérjék változása
Hipertrófia
AT1R IR
AP1
Apoptózis
Tubulusatrófia Szívizomsejt pusztulás
ROS
Glut 4/ NKA transzlokáció
Fibrózis, kóros kötőszöveti proliferáció
34. ábra. A NKA szubcelluláris lokalizációja számos jelpálya működését befolyásolja. A MAPK kaszkád, a PI3K illetve a PKC működésének változásai fibrózishoz, apoptózishoz, hipertrófiához vezethetnek. Rövidítések: ANGII: angiotenzin II, AT1R: angiotenzin II 1-es típusú receptora, AP-1: adaptor protein, Bcl-XL: anti-apoptotikus fehérje, Bcl-2: antiapoptotikus fehérje, ED: endogén digitálisz, EGFR: epidermális növekedési faktor receptor, I: inzulin IR: inzulin receptor, IRS: inzulin receptor szubsztrát, Grb2: adaptor protein, Kav: kaveolin, MAPK: mitogén aktivált protein kináz, Mek:szerin-treonin protein kináz ,NKA: Na+/K+ -ATPáz, OCT: szerves kation transzporter, PI3K: foszfatidil-inozitol3-kináz, PKC: protein kináz C, PLC: foszfolipáz C, Ras: kis GTPáz, Raf: szerin-treonin protein kináz, ROS: reaktív oxigén gyökök, Sos: Son of sevenless, Src: tirozin kináz
Vizsgálataink új, fontos kérdésekhez és számos újabb kísérlet elvégzéséhez vezetnek. Felmerül a kérdés, hogy az STZ diabéteszre jellemző hiperglikémia és a vele társuló ANGII hatás, a digitáliszok megnövekedett koncentrációja vajon azonos jelátviteli utakon keresztül, vagy esetleg különböző támadásponttal változtatják meg a NKA működését. Lehetséges, hogy az internalizált és a PM-hoz kötött pumpák megváltozott arányának szerepe van a diabéteszben kialakult szövetkárosodások progressziójában.
90
10. EREDMÉNYEK RÖVID ÖSSZEFOGLALÁSA
Röviden összefoglalva a diabéteszes szívizomban észlelt változásokat, különös tekintettel a NKA működésére a következőket állapítottuk meg: 1. Kimutattuk, hogy korai 1-es típusú diabéteszes állatmodellben a teljes szabadgyökfogó kapacitás a kontrollhoz képest növekszik. A szabadgyökfogó kapacitás növekedése feltehetően kompenzálja a diabétesz korai stádiumában megnövekedett szabadgyökök mennyiségét. 2. Kimutattuk, hogy hosszútávú inzulin adagolás és az ANGII adagolás csökkenti a plazmában mért szabadgyökfogó kapacitást három hetes diabéteszben szenvedő állatokban. 3. Vizsgálataink igazolják a NKA 1, 2 katalitikus és 1 nem-katalitikus alegységeinek inzulin függő transzlokációját kontroll és diabéteszes szívizomban. 4. Kimutattuk, hogy mind a kontroll, mind pedig a diabéteszes szívizomban az alacsony affinitású ouabain kötőhelyek (1 alegység izoforma) nagyrészt a plazmamembránhoz kötötten helyezkednek el, míg a magas affinitású ouabain kötőhelyek (α2 alegység izoforma) nagy része intracelluláris poolokhoz kötött. 5. Diabéteszes patkányok szívizmában a NKA aktivitása az intracelluláris és a plazmamembrán frakcióban is alacsonyabb, mint a kontrollé. Az aktivitás csökkenés elsődleges oka a diabéteszben jelentősen csökkent katalítikus alegység kifejeződés. 6. A nagyrészt intracelluláris poolokban elhelyezkedő 2 és 1 izoformák mennyisége nagyobb mértékben csökken cukorbetegségben, mint a plazmamembránhoz kötött 1 és 1 alegységek mennyisége. 7. Akut inzulin adagolás hatására az 2 és 1 izoformák nagyobb mennyiségben helyeződtek ki a plazmamembránra, mint az α1 alegység. 8. Diabéteszes állatokban az inzulin akut hatása kisebb mértékben érvényesül valószínűleg a jelentősen csökkent alegység expresszió miatt. Az inzulin hatásának csökkenése főként az 2 és a 1 alegység izoformák mennyiségének jelentős csökkenésével magyarázható. Az 1 izoforma kisebb mértékben vesz részt az akut inzulinválaszban. 91
9. Eredményeink szerint az inzulin indukálta NKA transzlokációt szívizomban a wortmannin, egy szelektív PI3 kináz gátlószer megakadályozza.
Röviden összefoglalva a NKA működésének változásait diabéteszes patkányok vesekérgében a következőket állapítottuk meg: 1. Kimutattuk, hogy diabetes mellitusban a vesekéregben megnövekszik a NKA mRNS és fehérje kifejeződése és az enzim aktivitása. 2. ANGII kezelés hatására ugyanezeket a változásokat észleltük. 3. A diabéteszes ANGII-vel kezelt patkányok veséjében az mRNS, fehérje és enzim aktivitás additív módon növekedett. 4. Kimutattuk, hogy a diabéteszben és az ANGII hatásra megfigyelt aktivitás növekedés nem a plazmamembránban lévő NKA aktivitásából származik, hanem az intracelluláris poolokban lévő pumpamennyiség növekszik meg. 5. A Ser23 foszforiláció mértéke mind a DM-ban szenvedő, mind az ANGII-vel kezelt
állatok
vesekérgében
megnövekedett,
ami
feltehetően
a
NKA
internalizácóját eredményezi a proximális kanyarulatos csatornák bazolaterális membránjából. 6. Az AT1R gátló losartannal, a diabéteszben megfigyelt változások kivédhetőek. 7. A NKA diabéteszben megfigyelt kóros lokalizációját a metformin kezelés helyreállítja.
Tervezett vizsgálataink: 1. Az
ANGII
hatásának
vizsgálata
a
NKA
expressziójára,
sejten
belüli
elhelyezkedésére, aktivitására diabéteszes patkányok szívizmában. 2. Losartan és metformin terápia hatásának vizsgálata diabéteszes szívizomban a NKA működésére. 3. A metformin hatásának molekuláris biológiai vizsgálata, különös tekintettel az AMPK szerepére a NKA transzlokációjában.
92
11. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Mindenekelőtt köszönetemet fejezem ki Dr. Vér Ágotának, témavezetőmnek, aki másodéves orvostanhallgató koromban felajánlotta nekem, hogy az általa vezetett laboratóriumban TDK munkát végezhessek. Szakértelmével, kritikus hozzáállásával és ötletekre mindig nyitott gondolkodásmódjával munkámat irányította, megtanított kísérletet tervezni és segített az elméleti és gyakorlati nehézségeken túljutni. Kutatásaink során rájöttem, hogy a klinikai tapasztalatok mögött rejlő elméleti hattér megismerése izgalmas és nem elhanyagolható további szakmai munkám során sem. Remélem, munkánkat lehetőségünk lesz a jövőben is együtt folytatni. Köszönöm Prof. Dr. Somogyi Jánosnak a téma elméleti áttekintésében nyújtott segítségét és kutatásainkkal kapcsolatos építő kritikai észrevételeit. Köszönöm Dr. Fekete Andreának, hogy barátságával, önzetlen szakmai segítségével a felmerülő nehézségek megoldásában, valamint a tudományos közlemények megírásában mindenkor segítségemre volt.
Köszönöm Végh Editnek a kutatómunka gyakorlati részében nyújtott felbecsülhetetlen segítségét. Köszönöm Dr. Prókai Ágnesnek nélkülözhetetlen segítségét a kísérletes munkák kivitelezésében. Köszönöm Prof. Dr. Rigó Jánosnak, az I. számú Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika vezetőjének, hogy a klinikai munka mellett kutatómunkámat mindvégig támogatta.
Végül köszönettel tartozom az Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Patobiokémiai Intézet valamennyi munkatársának, hogy jó hangulatban, baráti légkörben végezhettem doktori munkámat.
Köszönöm családomnak a szakmai segítséget valamint a szeretetteljes biztatást és támogatást.
93
12. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK BIBLIOGRÁFIAI ADATAI
Az értekezés témájában megjelent közlemények (IF:6,017) 1. Somogyi J, Szalai J, Pandics T, Rosta K, Csermely P, Ver A. (2004) Új szteroidhormon-család: az endogén szívglikozidok és szerepük a szervezetben fiziológiás és patológiás körülmények között. Orv Hetil, 145: 259-66. 2. Somogyi A, Ruzicska E, Blazovics A, Ver A, Rosta K,Toth M. (2005) Insulin treatment decreases the antioxidant defense mechanism in experimental diabetes. Med Sci Monit, 11: BR206-11. 3. Somogyi A, Nagy G, Rosta K. (2006) Az oxidatív stressz szerepe a diabetes mikrovaszkularis szövődményeinek kialakulásában. Diabetologia Hungarica, 14: 33-39. 4. Somogyi A, Rosta K, Pusztai P, Tulassay Z, Nagy G. (2007) Antioxidant measurements. Physiol Meas, 28: R41-55. (IF: 1,412) 5. Fekete A*, Rosta K*, Wagner L, Prokai A, Degrell P, Ruzicska E, Vegh E, Toth M, Ronai K, Rusai K, Somogyi A, Tulassay T, Szabo AJVer A. (2008) Na+,K+-ATPase is modulated by angiotensin II in diabetic rat kidney--another reason for diabetic nephropathy? J Physiol, 586: 5337-48. (IF: 4,605) *osztott elsőszerző 6. Rosta K. (2008) Vitaminok és ásványi anyagok szerepe a cukorbetegségben. Medicus Universalis. XXXXI. (1): 37-41. 7. Rosta K., Énzsöly A, Rónai K, Vér Á. (2008) .Az inzulin szerepe a központi idegrendszerben, Magyar Belorvosi Archivum. 61(2):93-100. 8. Rosta K, Somogyi A. (2008) Az inzulinrezisztencia jelentősége szepszisben. Medicina Thoracalis, 61: 22-28. 9. Rosta K, Tulassay E, Enzsoly A, Ronai K, Szantho A, Pandics T, Fekete A, Mandl P, Ver A. (2009) Insulin induced translocation of Na+/K+-ATPase is decreased in the heart of streptozotocin diabetic rats. Acta Pharmacol Sinica, (elbírálás alatt)
94
Az értekezés témájában megjelent absztraktok (IF: 26,896) 1. Rosta K, Pandics T, Kiss G, Somogyi J, Ver A. (2002) Musle type specific alterations in insulin signal transduction in streptozotocin-diabetes. Diabetologia, 45: S2, A193, (IF: 5.136) 2. Tulassay E, Kiss G, Pandics T, Rosta K, Somogyi J, Ver A. Recruitment of Na+/K+-ATPase by insulin in rat heart in streptozotocin-induced diabetes. (2002) Diabetologia, 45: S2, A195 (IF: 5.136) 3. Rosta K, Fekete A, Somogyi A, Végh E, Somogyi J, Vér A: Angiotensin II stimulates the renal Na+/K+-ATPase expression in type I diabetes mellitus. (2003) Diabetes Metab, 29: 4S7-4S428. (IF: 1,1) 4. Rosta K, Fekete A, Vegh E, Ruzicska E, Somogyi A, Ver A. Angiotensin II modulates Na+/K+-ATPase subunits in diabetic rat kidney. (2006) Diabetologia, 49: 346 (IF:5.247) 5. Fekete A, Rosta K, Vegh E, Rusai K, Toth M, Ruzicska E, Somogyi A, Ver A. (2007) Angiotensin II modulates Na+/K+ -ATPase subunits in diabetic rat kidney Nephrology Dialysis Transplantation 22, 270, (IF:3,167) 6. Fekete A, Rosta K, Degrell P, Ruzicska E, Vegh E, Prokai A, Szabo JA, Somogyi A, Ver A. (2008) Na+/K+ -ATPase (NKA) is modulated by angiotensin II (ANGII) in diabetic rat kidney- Another reason for diabetic nephropathy? J Am Soc Nephrol 19: 647A. (IF: 7,11)
Más témában megjelent publikációk (IF: 5,965) 1. Somogyi A, Rosta K, Herold M, Tulassay Z.(2000) Effect of low temperature storage on the alpha-tocopherol (vitamin E) content of human lipoproteins determined by high performance liquid chromatography, ACH- Models in Chemistry. 137 (5-6): pp 807-15.(IF: 0,454) 2. Rosta K. (2004) A polycystás ovarium szindróma (PCOS) patofiziológiája. Diabetologia Hungarica, 12: 245-257.
95
3. Rigo J, Szendei G, Rosta K, Fekete A, Bogi K, Molvarec A, Ronai Z, Ver A. Leptin receptor gene polymorphisms in severely pre-eclamptic women. (2006) Gynecol Endocrinol, 22: 521-5 (IF: 0,995) 4. Somogyi A, Nagy G, Rosta K, Pusztai P. Inzulinkezelés 2-es típusú diabetes mellitusban. (2006) Granum, 9: 39-42. 5. Nagy G, Rosta K, Ruzicska E, Somogyi A, Sasvari M. Újabb eredmények a 2-es tipusú diabetes mellitus genetikai tenyezőiről. (2007) Magyar Belorvosi Archivum, 60: 115-122. 6. Molvarec A, Ver A, Fekete A, Rosta K, Derzbach L, Derzsy Z, Karadi I, Rigo J, Jr. (2007) Association between estrogen receptor alpha (ESR1) gene polymorphisms and severe preeclampsia. Hypertens Res, 30: 205-11. (IF: 2,951) 7. Rosta K, Molvarec A, Enzsöly A, Nagy B, Ronai Z, Fekete A, Sasvári- Szekely M, Rigo J Jr, Ver A. (2009) Association of extracellular superoxide dismutase (SOD3) Ala40Thr gene polymorphism with pre-eclampsia complicated by severe fetal growth restriction. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 142(2): 134-8. (IF: 1,565)
96
13. Irodalomjegyzék: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
9.
10. 11.
12.
13.
14. 15. 16. 17.
Kreisberg RA. (1998) Diabetic dyslipidemia. Am J Cardiol, 82: 67U-73U; discussion 85U-6U. Van den Berghe G. (2004) How does blood glucose control with insulin save lives in intensive care? J Clin Invest, 114: 1187-95. Rosta K, Somogyi A. (2008) Az inzulinrezisztencia jelentősége szepszisben. Medicina Thoracalis. 61: 6. van Heerebeek L, Somsen A, Paulus WJ. (2009) The failing diabetic heart: focus on diastolic left ventricular dysfunction. Curr Diab Rep, 9: 79-86. Somogyi A, Rosta K, Pusztai P, Tulassay Z, Nagy G. (2007) Antioxidant measurements. Physiol Meas, 28: R41-55. Shen X, Bornfeldt KE. (2007) Mouse models for studies of cardiovascular complications of type 1 diabetes. Ann N Y Acad Sci, 1103: 202-17. Cooper ME. (2004) Importance of advanced glycation end products in diabetesassociated cardiovascular and renal disease. Am J Hypertens, 17: 31S-8S. Guzik TJ, Mussa S, Gastaldi D, Sadowski J, Ratnatunga C, Pillai R, Channon KM. (2002) Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NAD(P)H oxidase and endothelial nitric oxide synthase. Circulation, 105: 1656-62. Berg TJ, Snorgaard O, Faber J, Torjesen PA, Hildebrandt P, Mehlsen J, Hanssen KF. (1999) Serum levels of advanced glycation end products are associated with left ventricular diastolic function in patients with type 1 diabetes. Diabetes Care, 22: 1186-90. Singh R, Barden A, Mori T, Beilin L. (2001) Advanced glycation end-products: a review. Diabetologia, 44: 129-46. Thallas-Bonke V, Lindschau C, Rizkalla B, Bach LA, Boner G, Meier M, Haller H, Cooper ME, Forbes JM. (2004) Attenuation of extracellular matrix accumulation in diabetic nephropathy by the advanced glycation end product cross-link breaker ALT-711 via a protein kinase C-alpha-dependent pathway. Diabetes, 53: 2921-30. Haffner SM, Lehto S, Ronnemaa T, Pyorala K, Laakso M. (1998) Mortality from coronary heart disease in subjects with type 2 diabetes and in nondiabetic subjects with and without prior myocardial infarction. N Engl J Med, 339: 229-34. Rubler S, Dlugash J, Yuceoglu YZ, Kumral T, Branwood AW, Grishman A. (1972) New type of cardiomyopathy associated with diabetic glomerulosclerosis. Am J Cardiol, 30: 595-602. Kannel WB, Hjortland M, Castelli WP. (1974) Role of diabetes in congestive heart failure: the Framingham study. Am J Cardiol, 34: 29-34. Fein FS, Sonnenblick EH. (1994) Diabetic cardiomyopathy. Cardiovasc Drugs Ther, 8: 65-73. Spector KS. (1998) Diabetic cardiomyopathy. Clin Cardiol, 21: 885-7. van Hoeven KH, Factor SM. (1990) A comparison of the pathological spectrum of hypertensive, diabetic, and hypertensive-diabetic heart disease. Circulation, 82: 848-55. 97
18.
19.
20. 21.
22.
23.
24.
25.
26. 27. 28.
29. 30.
31. 32. 33. 34.
Aneja A, Tang WH, Bansilal S, Garcia MJ, Farkouh ME. (2008) Diabetic cardiomyopathy: insights into pathogenesis, diagnostic challenges, and therapeutic options. Am J Med, 121: 748-57. Shimizu M, Umeda K, Sugihara N, Yoshio H, Ino H, Takeda R, Okada Y, Nakanishi I. (1993) Collagen remodelling in myocardia of patients with diabetes. J Clin Pathol, 46: 32-6. Dhalla NS, Liu X, Panagia V, Takeda N. (1998) Subcellular remodeling and heart dysfunction in chronic diabetes. Cardiovasc Res, 40: 239-47. Ferrari R, Guardigli G, Mele D, Percoco GF, Ceconi C, Curello S. (2004) Oxidative stress during myocardial ischaemia and heart failure. Curr Pharm Des, 10: 1699-711. Tesfamariam B, Brown ML, Cohen RA. (1991) Elevated glucose impairs endothelium-dependent relaxation by activating protein kinase C. J Clin Invest, 87: 1643-8. Ziegelhoffer A, Bundgaard H, Ravingerova T, Tribulova N, Enevoldsen MT, Kjeldsen K. (2003) Diabetes- and semi-starvation-induced changes in metabolism and regulation of Na,K-ATPase in rat heart. Diabetes Nutr Metab, 16: 222-31. Andersen AR, Christiansen JS, Andersen JK, Kreiner S, Deckert T. (1983) Diabetic nephropathy in Type 1 (insulin-dependent) diabetes: an epidemiological study. Diabetologia, 25: 496-501. Parving HH, Andersen AR, Smidt UM, Christiansen JS, Oxenboll B, Svendsen PA. (1983) Diabetic nephropathy and arterial hypertension. The effect of antihypertensive treatment. Diabetes, 32 Suppl 2: 83-7. Tulassay Z, ed. A belgyógyászat alapjai. Diabeteses nephropathia, ed. Wittmann I, N.J. 2007, Medicina: Budapest. 1115-7. Ziyadeh FN. (1993) The extracellular matrix in diabetic nephropathy. Am J Kidney Dis, 22: 736-44. Vallon V, Richter K, Blantz RC, Thomson S, Osswald H. (1999) Glomerular hyperfiltration in experimental diabetes mellitus: potential role of tubular reabsorption. J Am Soc Nephrol, 10: 2569-76. Herold G. Belgyógyászat. 2005, Budapest: B+V (medical and technical),p: 564611 Sudar E, Velebit J, Gluvic Z, Zakula Z, Lazic E, Vuksanovic-Topic L, Putnikovic B, Neskovic A, Isenovic ER. (2008) Hypothetical mechanism of sodium pump regulation by estradiol under primary hypertension. J Theor Biol, 251: 584-92. Ziyadeh FN, Cohen MP. (1993) Effects of glycated albumin on mesangial cells: evidence for a role in diabetic nephropathy. Mol Cell Biochem, 125: 19-25. Zhang C, Mayeux PR. (1998) Angiotensin II signaling activities the NO-cGMP pathway in rat proximal tubules. Life Sci, 63: PL75-80. Miller JA. (1999) Impact of hyperglycemia on the renin angiotensin system in early human type 1 diabetes mellitus. J Am Soc Nephrol, 10: 1778-85. Zimpelmann J, Kumar D, Levine DZ, Wehbi G, Imig JD, Navar LG, Burns KD. (2000) Early diabetes mellitus stimulates proximal tubule renin mRNA expression in the rat. Kidney Int, 58: 2320-30.
98
35.
36.
37.
38.
39.
40. 41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
Walther T, Schuitheiss HP, Tschope C. (2001) Impaired angiotensin II regulation of renal C-type natriuretic peptide mRNA expression in experimental diabetes mellitus. Cardiovascular research, 51: 562-6. Hakam AC, Hussain T. (2006) Angiotensin II type 2 receptor agonist directly inhibits proximal tubule sodium pump activity in obese but not in lean Zucker rats. Hypertension, 47: 1117-24. Marwaha A, Banday AA, Lokhandwala MF. (2004) Reduced renal dopamine D1 receptor function in streptozotocin-induced diabetic rats. Am J Physiol Renal Physiol, 286: F451-7. Wolf G, Mueller E, Stahl RA, Ziyadeh FN. (1993) Angiotensin II-induced hypertrophy of cultured murine proximal tubular cells is mediated by endogenous transforming growth factor-beta. J Clin Invest, 92: 1366-72. Erman A, Veksler S, Gafter U, Boner G, Wittenberg C, van Dijk DJ. (2004) Renin-angiotensin system blockade prevents the increase in plasma transforming growth factor beta 1, and reduces proteinuria and kidney hypertrophy in the streptozotocin-diabetic rat. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst, 5: 146-51. Lai KN, Leung JC, Lai KB, To WY, Yeung VT, Lai FM. (1998) Gene expression of the renin-angiotensin system in human kidney. J Hypertens, 16: 91-102. Hadjadj S, Tarnow L, Forsblom C, Kazeem G, Marre M, Groop PH, Parving HH, Cambien F, Tregouet DA, Gut IG, Theva A, Gauguier D, Farrall M, Cox R, Matsuda F, Lathrop M, Hager-Vionnet N. (2007) Association between angiotensin-converting enzyme gene polymorphisms and diabetic nephropathy: case-control, haplotype, and family-based study in three European populations. J Am Soc Nephrol, 18: 1284-91. Rudnicki M, Mayer G. (2009) Significance of genetic polymorphisms of the renin-angiotensin-aldosterone system in cardiovascular and renal disease. Pharmacogenomics, 10: 463-76. Lewis EJ, Hunsicker LG, Bain RP, Rohde RD. (1993) The effect of angiotensinconverting-enzyme inhibition on diabetic nephropathy. The Collaborative Study Group. N Engl J Med, 329: 1456-62. Anderson S, Jung FF, Ingelfinger JR. (1993) Renal renin-angiotensin system in diabetes: functional, immunohistochemical, and molecular biological correlations. Am J Physiol, 265: F477-86. Lingrel JB, Van Huysse J, O'Brien W, Jewell-Motz E, Askew R, Schultheis P. (1994) Structure-function studies of the Na,K-ATPase. Kidney Int Suppl, 44: S32-9. Hilgemann DW, Yaradanakul A, Wang Y, Fuster D. (2006) Molecular control of cardiac sodium homeostasis in health and disease. J Cardiovasc Electrophysiol, 17 Suppl 1: S47-S56. Ver A, Szanto I, Csermely P, Kalff K, Vegh E, Banyasz T, Marcsek Z, Kovacs T, Somogyi J. (1995) Effect of streptozotocin-induced diabetes on kidney Na+/K+ATPase. Acta Physiol Hung, 83: 323-32. Korner A, Eklof AC, Celsi G, Aperia A. (1994) Increased renal metabolism in diabetes. Mechanism and functional implications. Diabetes, 43: 629-33.
99
49.
50.
51.
52.
53. 54.
55.
56.
57.
58.
59. 60. 61.
62.
63.
Shah S, Hussain T. (2006) Enhanced angiotensin II-induced activation of Na+, K+-ATPase in the proximal tubules of obese Zucker rats. Clin Exp Hypertens, 28: 29-40. Hakam AC, Siddiqui AH, Hussain T. (2006) Renal angiotensin II AT2 receptors promote natriuresis in streptozotocin-induced diabetic rats. Am J Physiol Renal Physiol, 290: F503-8. Siddiqui AH, Hussain T. (2007) Impaired angiotensin II AT(1) receptor function and enhanced Na+, K+-ATPase affinity for sodium in proximal tubule of streptozotocin-treated diabetic rats. Clin Exp Hypertens, 29: 435-44. Kwon TH, Nielsen J, Kim YH, Knepper MA, Frokiaer J, Nielsen S. (2003) Regulation of sodium transporters in the thick ascending limb of rat kidney: response to angiotensin II. Am J Physiol Renal Physiol, 285: F152-65. Rose AM, Valdes R, Jr. (1994) Understanding the sodium pump and its relevance to disease. Clin Chem, 40: 1674-85. Feraille E, Doucet A. (2001) Sodium-potassium-adenosinetriphosphatasedependent sodium transport in the kidney: hormonal control. Physiol Rev, 81: 345-418. Wetzel RK, Sweadner KJ. (2001) Immunocytochemical localization of Na +-K+ATPase alpha- and gamma-subunits in rat kidney. Am J Physiol Renal Physiol, 281: F531-45. Molitoris BA, Nelson WJ. (1990) Alterations in the establishment and maintenance of epithelial cell polarity as a basis for disease processes. J Clin Invest, 85: 3-9. Lee DI, Klein MG, Zhu W, Xiao RP, Gerzanich V, Xu KY. (2009) Activation of Na+/ K+-ATPase modulates cardiac L-type Ca2+ channel function. Mol Pharmacol, 75: 774-81. Purhonen P, Thomsen K, Maunsbach AB, Hebert H. (2006) Association of renal Na,K-ATPase alpha-subunit with the beta- and gamma-subunits based on cryoelectron microscopy. The Journal of membrane biology, 214: 139-46. Geering K. (2001) The functional role of beta subunits in oligomeric P-type ATPases. Journal of bioenergetics and biomembranes, 33: 425-38. Chow DC, Forte JG. (1995) Functional significance of the beta-subunit for heterodimeric P-type ATPases. J Exp Biol, 198: 1-17. Vagin O, Tokhtaeva E, Sachs G. (2006) The role of the beta1 subunit of the Na,K-ATPase and its glycosylation in cell-cell adhesion. The Journal of biological chemistry, 281: 39573-87. Contreras RG, Flores-Maldonado C, Lazaro A, Shoshani L, Flores-Benitez D, Larre I, Cereijido M. (2004) Ouabain binding to Na+,K+-ATPase relaxes cell attachment and sends a specific signal (NACos) to the nucleus. J Membr Biol, 198: 147-58. Mercer RW, Biemesderfer D, Bliss DP, Jr., Collins JH, Forbush B, 3rd. (1993) Molecular cloning and immunological characterization of the gamma polypeptide, a small protein associated with the Na+,K+-ATPase. The Journal of cell biology, 121: 579-86.
100
64.
65.
66.
67. 68.
69.
70. 71.
72.
73.
74.
75.
76. 77.
78.
Therien AG, Goldshleger R, Karlish SJ, Blostein R. (1997) Tissue-specific distribution and modulatory role of the gamma subunit of the Na+,K+-ATPase. The Journal of biological chemistry, 272: 32628-34. Kim JW, Lee Y, Lee IA, Kang HB, Choe YK, Choe IS. (1997) Cloning and expression of human cDNA encoding Na+, K+-ATPase gamma-subunit. Biochimica et biophysica acta, 1350: 133-5. Dempski RE, Lustig J, Friedrich T, Bamberg E. (2008) Structural arrangement and conformational dynamics of the gamma subunit of the Na +/K+-ATPase. Biochemistry, 47: 257-66. Blanco G, Mercer RW. (1998) Isozymes of the Na-K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function. Am J Physiol, 275: F633-50. Lucking K, Nielsen JM, Pedersen PA, Jorgensen PL. (1996) Na-K-ATPase isoform (alpha 3, alpha 2, alpha 1) abundance in rat kidney estimated by competitive RT-PCR and ouabain binding. The American journal of physiology, 271: F253-60. Lucchesi PA, Sweadner KJ. (1991) Postnatal changes in Na,K-ATPase isoform expression in rat cardiac ventricle. Conservation of biphasic ouabain affinity. The Journal of biological chemistry, 266: 9327-31. Sweadner KJ. (1989) Isozymes of the Na+/K+-ATPase. Biochim Biophys Acta, 988: 185-220. Vagin O, Turdikulova S, Tokhtaeva E. (2007) Polarized membrane distribution of potassium-dependent ion pumps in epithelial cells: different roles of the Nglycans of their beta subunits. Cell biochemistry and biophysics, 47: 376-91. Welker P, Geist B, Fruhauf JH, Salanova M, Groneberg DA, Krause E, Bachmann S. (2007) Role of lipid rafts in membrane delivery of renal epithelial Na+-K+-ATPase, thick ascending limb. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 292: R1328-37. Efendiev R, Das-Panja K, Cinelli AR, Bertorello AM, Pedemonte CH. (2007) Localization of intracellular compartments that exchange Na,K-ATPase molecules with the plasma membrane in a hormone-dependent manner. British journal of pharmacology, 151: 1006-13. DeTomaso AW, Blanco G, Mercer RW. (1994) The alpha and beta subunits of the Na,K-ATPase can assemble at the plasma membrane into functional enzyme. The Journal of cell biology, 127: 55-69. Bachmann S, Schlichting U, Geist B, Mutig K, Petsch T, Bacic D, Wagner CA, Kaissling B, Biber J, Murer H, Willnow TE. (2004) Kidney-specific inactivation of the megalin gene impairs trafficking of renal inorganic sodium phosphate cotransporter (NaPi-IIa). J Am Soc Nephrol, 15: 892-900. Newman RA, Yang P, Pawlus AD, Block KI. (2008) Cardiac glycosides as novel cancer therapeutic agents. Mol Interv, 8: 36-49. Liu J, Kesiry R, Periyasamy SM, Malhotra D, Xie Z, Shapiro JI. (2004) Ouabain induces endocytosis of plasmalemmal Na+/K+-ATPase in LLC-PK1 cells by a clathrin-dependent mechanism. Kidney Int, 66: 227-41. Vasilets LA, Schmalzing G, Madefessel K, Haase W, Schwarz W. (1990) Activation of protein kinase C by phorbol ester induces downregulation of the Na+/K+-ATPase in oocytes of Xenopus laevis. J Membr Biol, 118: 131-42.
101
79.
80.
81.
82.
83.
84. 85.
86.
87.
88.
89.
90.
91.
Grahnquist L, Chen M, Gerasev A, Aizman R, Celsi G. (2001) Regulation of K+ transport in the rat distal colon via angiotensin II subtype receptors and K+ pathways. Acta Physiol Scand, 171: 145-51. Beguin P, Beggah AT, Chibalin AV, Burgener-Kairuz P, Jaisser F, Mathews PM, Rossier BC, Cotecchia S, Geering K. (1994) Phosphorylation of the Na+,K+ATPase alpha-subunit by protein kinase A and C in vitro and in intact cells. Identification of a novel motif for PKC-mediated phosphorylation. J Biol Chem, 269: 24437-45. Yingst DR, Massey KJ, Rossi NF, Mohanty MJ, Mattingly RR. (2004) Angiotensin II directly stimulates activity and alters the phosphorylation of Na-KATPase in rat proximal tubule with a rapid time course. Am J Physiol Renal Physiol, 287: F713-21. Bertorello AM, Ridge KM, Chibalin AV, Katz AI, Sznajder JI. (1999) Isoproterenol increases Na+-K+-ATPase activity by membrane insertion of alphasubunits in lung alveolar cells. The American journal of physiology, 276: L20-7. Efendiev R, Bertorello AM, Pressley TA, Rousselot M, Feraille E, Pedemonte CH. (2000) Simultaneous phosphorylation of Ser11 and Ser18 in the alphasubunit promotes the recruitment of Na(+),K(+)-ATPase molecules to the plasma membrane. Biochemistry, 39: 9884-92. Middleton JP. (1996) Direct regulation of the Na,K pump by signal transduction mechanisms. Miner Electrolyte Metab, 22: 293-302. Pedemont CH, Bertorello AM. (2001) Short-term regulation of the proximal tubule Na+,K+-ATPase: increased/decreased Na+,K+-ATPase activity mediated by protein kinase C isoforms. Journal of bioenergetics and biomembranes, 33: 43947. Chibalin AV, Ogimoto G, Pedemonte CH, Pressley TA, Katz AI, Feraille E, Berggren PO, Bertorello AM. (1999) Dopamine-induced endocytosis of Na+,K+ATPase is initiated by phosphorylation of Ser-18 in the rat alpha subunit and is responsible for the decreased activity in epithelial cells. J Biol Chem, 274:1920-7. Chibalin AV, Pedemonte CH, Katz AI, Feraille E, Berggren PO, Bertorello AM. (1998) Phosphorylation of the catalyic alpha-subunit constitutes a triggering signal for Na+,K+-ATPase endocytosis. The Journal of biological chemistry, 273: 8814-9. Logvinenko NS, Dulubova I, Fedosova N, Larsson SH, Nairn AC, Esmann M, Greengard P, Aperia A. (1996) Phosphorylation by protein kinase C of serine-23 of the alpha-1 subunit of rat Na+,K(+)-ATPase affects its conformational equilibrium. Proc Natl Acad Sci U S A, 93: 9132-7. Feschenko MS, Sweadner KJ. (1995) Structural basis for species-specific differences in the phosphorylation of Na,K-ATPase by protein kinase C. J Biol Chem, 270: 14072-7. Efendiev R, Budu CE, Cinelli AR, Bertorello AM, Pedemonte CH. (2003) Intracellular Na+ regulates dopamine and angiotensin II receptors availability at the plasma membrane and their cellular responses in renal epithelia. J Biol Chem, 278: 28719-26. Schoner W. (2002) Endogenous cardiac glycosides, a new class of steroid hormones. Eur J Biochem, 269: 2440-8.
102
92.
93.
94.
95.
96. 97.
98. 99.
100.
101. 102.
103.
104. 105.
106.
Somogyi J, Szalay J, Pandics T, Rosta K, Csermely P, Ver A. (2004) [New steroid hormone family: endogenous cardiac glycosides and their role in physiologic and pathologic conditions]. Orv Hetil, 145: 259-66. Hansen O. (2003) No evidence for a role in signal-transduction of Na+/K+ATPase interaction with putative endogenous ouabain. European journal of biochemistry / FEBS, 270: 1916-9. Buhagiar KA, Hansen PS, Bewick NL, Rasmussen HH. (2001) Protein kinase Cepsilon contributes to regulation of the sarcolemmal Na(+)-K(+) pump. Am J Physiol Cell Physiol, 281: C1059-63. Fekete A, Vannay A, Ver A, Vasarhelyi B, Muller V, Ouyang N, Reusz G, Tulassay T, Szabo AJ. (2004) Sex differences in the alterations of Na( +), K(+)ATPase following ischaemia-reperfusion injury in the rat kidney. J Physiol, 555: 471-80. Sweeney G, Klip A. (1998) Regulation of the Na+/K+-ATPase by insulin: why and how? Mol Cell Biochem, 182: 121-33. Lavoie L, Roy D, Ramlal T, Dombrowski L, Martin-Vasallo P, Marette A, Carpentier JL, Klip A. (1996) Insulin-induced translocation of Na+-K+-ATPase subunits to the plasma membrane is muscle fiber type specific. Am J Physiol, 270: C1421-9. Clausen T. (2003) Na+-K+ pump regulation and skeletal muscle contractility. Physiol Rev, 83: 1269-324. Al-Khalili L, Yu M, Chibalin AV. (2003) Na+,K+-ATPase trafficking in skeletal muscle: insulin stimulates translocation of both alpha 1- and alpha 2-subunit isoforms. FEBS Lett, 536: 198-202. Banday AA, Siddiqui AH, Menezes MM, Hussain T. (2005) Insulin treatment enhances AT1 receptor function in OK cells. Am J Physiol Renal Physiol, 288: F1213-9. Garvin JL. (1991) Angiotensin stimulates bicarbonate transport and Na+/K+ ATPase in rat proximal straight tubules. J Am Soc Nephrol, 1: 1146-52. Levin K. (1970) The stimulating effect of angiotensin and vasopressin on adenosine triphosphatase activity in vitro. Acta physiologica Scandinavica, 79: 37-49. Rangel LB, Caruso-Neves C, Lara LS, Lopes AG. (2002) Angiotensin II stimulates renal proximal tubule Na(+)-ATPase activity through the activation of protein kinase C. Biochim Biophys Acta, 1564: 310-6. Yingst DR, Davis J, Schiebinger R. (2000) Inhibitors of tyrosine phosphatases block angiotensin II inhibition of Na(+) pump. Eur J Pharmacol, 406: 49-52. De Souza AM, Lopes AG, Pizzino CP, Fossari RN, Miguel NC, Cardozo FP, AbiAbib R, Fernandes MS, Santos DP, Caruso-Neves C. (2004) Angiotensin II and angiotensin-(1-7) inhibit the inner cortex Na+ -ATPase activity through AT2 receptor. Regul Pept, 120: 167-75. Lara Lda S, Cavalcante F, Axelband F, De Souza AM, Lopes AG, Caruso-Neves C. (2006) Involvement of the Gi/o/cGMP/PKG pathway in the AT2-mediated inhibition of outer cortex proximal tubule Na+-ATPase by Ang-(1-7). The Biochemical journal, 395: 183-90.
103
107.
108.
109.
110.
111.
112.
113.
114.
115.
116.
117.
118.
119. 120.
121.
Hakam AC, Hussain T. (2006) Angiotensin II AT2 receptors inhibit proximal tubular Na+-K+-ATPase activity via a NO/cGMP-dependent pathway. American journal of physiology, 290: F1430-6. Muscella A, Greco S, Elia MG, Storelli C, Marsigliante S. (2002) Angiotensin II stimulation of Na+/K+ATPase activity and cell growth by calcium-independent pathway in MCF-7 breast cancer cells. J Endocrinol, 173: 315-23. Efendiev R, Bertorello AM, Pedemonte CH. (1999) PKC-beta and PKC-zeta mediate opposing effects on proximal tubule Na+,K+-ATPase activity. FEBS letters, 456: 45-8. Das PK, Bray GM, Aguayo AJ, Rasminsky M. (1976) Diminished ouabainsensitive, sodium-potassium ATPase activity in sciatic nerves of rats with streptozotocin-induced diabetes. Exp Neurol, 53: 285-8. Gnanaprakasam MS, Srivastava LM. (1978) Effect of starvation, alloxan diabetes and adrenalectomy on Na+K+-ATPase of the mucosa of the small intestine of rat. Biochem Exp Biol, 14: 257-62. Scherzer P, Popovtzer MM. (2002) Segmental localization of mRNAs encoding Na(+)-K(+)-ATPase alpha(1)- and beta(1)-subunits in diabetic rat kidneys using RT-PCR. Am J Physiol Renal Physiol, 282: F492-500. Ver A, Szanto I, Banyasz T, Csermely P, Vegh E, Somogyi J. (1997) Changes in the expression of Na+/K+-ATPase isoenzymes in the left ventricle of diabetic rat hearts: effect of insulin treatment. Diabetologia, 40: 1255-62. Iannello S, Milazzo P, Belfiore F. (2007) Animal and human tissue Na,K-ATPase in obesity and diabetes: A new proposed enzyme regulation. Am J Med Sci, 333: 1-9. Djemli-Shipkolye A, Raccah D, Pieroni G, Vague P, Coste TC, Gerbi A. (2003) Differential effect of omega3 PUFA supplementations on Na,K-ATPase and MgATPase activities: possible role of the membrane omega6/omega3 ratio. J Membr Biol, 191: 37-47. Nishida K, Ohara T, Johnson J, Wallner JS, Wilk J, Sherman N, Kawakami K, Sussman KE, Draznin B. (1992) Na+/K+-ATPase activity and its alpha II subunit gene expression in rat skeletal muscle: influence of diabetes, fasting, and refeeding. Metabolism, 41: 56-63. Cohen MP, Dasmahapatra A, Shapiro E. (1985) Reduced glomerular sodium/potassium adenosine triphosphatase activity in acute streptozocin diabetes and its prevention by oral sorbinil. Diabetes, 34: 1071-4. Tsimaratos M, Coste TC, Djemli-Shipkolye A, Vague P, Pieroni G, Raccah D. (2001) Gamma-linolenic acid restores renal medullary thick ascending limb Na(+),K(+)-ATPase activity in diabetic rats. J Nutr, 131: 3160-5. Chibalin AV. (2007) Regulation of the Na,K-ATPase: Special implications for cardiovascular complications of metabolic syndrome. Pathophysiology, 14: 153-8. Sennoune S, Gerbi A, Duran MJ, Grillasca JP, Compe E, Pierre S, Planells R, Bourdeaux M, Vague P, Pieroni G, Maixent JM. (2000) Effect of streptozotocininduced diabetes on rat liver Na+/K+-ATPase. Eur J Biochem, 267: 2071-8. Ohara T, Sussman KE, Draznin B. (1991) Effect of diabetes on cytosolic free Ca2+ and Na(+)-K(+)-ATPase in rat aorta. Diabetes, 40: 1560-3.
104
122.
123.
124.
125.
126.
127.
128.
129.
130.
131.
132. 133.
134.
135.
Aydemir-Koksoy A, Turan B. (2008) Selenium inhibits proliferation signaling and restores sodium/potassium pump function of diabetic rat aorta. Biol Trace Elem Res, 126: 237-45. Temel HE, Akyuz F. (2007) The effects of captopril and losartan on erythrocyte membrane Na+/K+-ATPase activity in experimental diabetes mellitus. J Enzyme Inhib Med Chem, 22: 213-7. Carnovale CE, Roma MG, Monti JA, Rodriguez Garay EA. (1991) Studies on the mechanism of bile salt-independent bile flow impairment in streptozotocininduced hepatotoxicity. Toxicology, 68: 207-15. Ver A, Csermely P, Banyasz T, Kovacs T, Somogyi J. (1995) Alterations in the properties and isoform ratios of brain Na+/K+-ATPase in streptozotocin diabetic rats. Biochim Biophys Acta, 1237: 143-50. Zarros A, Liapi C, Galanopoulou P, Marinou K, Mellios Z, Skandali N, AlHumadi H, Anifantaki F, Gkrouzman E, Tsakiris S. (2009) Effects of adult-onset streptozotocin-induced diabetes on the rat brain antioxidant status and the activities of acetylcholinesterase, (Na(+),K (+))- and Mg(2+)-ATPase: modulation by L-cysteine. Metab Brain Dis, 24: 337-48. Nowak TV, Castelaz C, Ramaswamy K, Weisbruch JP. (1995) Impaired rodent vagal nerve sodium-potassium-ATPase activity in streptozotocin diabetes. J Lab Clin Med, 125: 182-6. Wild GE, Thompson JA, Searles L, Turner R, Hasan J, Thomson AB. (1999) Small intestinal Na+,K+-adenosine triphosphatase activity and gene expression in experimental diabetes mellitus. Dig Dis Sci, 44: 407-14. Coste T, Pierlovisi M, Leonardi J, Dufayet D, Gerbi A, Lafont H, Vague P, Raccah D. (1999) Beneficial effects of gamma linolenic acid supplementation on nerve conduction velocity, Na+, K+ ATPase activity, and membrane fatty acid composition in sciatic nerve of diabetic rats. J Nutr Biochem, 10: 411-20. Tamura J, Konno A, Hashimoto Y, Kon Y. (2005) Upregulation of renal reninangiotensin system in mouse diabetic nephropathy. The Japanese journal of veterinary research, 53: 13-26. Andersen S, Tarnow L, Rossing P, Hansen BV, Parving HH. (2000) Renoprotective effects of angiotensin II receptor blockade in type 1 diabetic patients with diabetic nephropathy. Kidney international, 57: 601-6. Aulakh GK, Sodhi RK, Singh M. (2007) An update on non-peptide angiotensin receptor antagonists and related RAAS modulators. Life sciences, 81: 615-39. Shu Y, Sheardown SA, Brown C, Owen RP, Zhang S, Castro RA, Ianculescu AG, Yue L, Lo JC, Burchard EG, Brett CM, Giacomini KM. (2007) Effect of genetic variation in the organic cation transporter 1 (OCT1) on metformin action. J Clin Invest, 117: 1422-31. Calle-Pascual AL, Garcia-Honduvilla J, Martin-Alvarez PJ, Vara E, Calle JR, Munguira ME, Maranes JP. (1995) Comparison between acarbose, metformin, and insulin treatment in type 2 diabetic patients with secondary failure to sulfonylurea treatment. Diabete Metab, 21: 256-60. Giugliano D, De Rosa N, Di Maro G, Marfella R, Acampora R, Buoninconti R, D'Onofrio F. (1993) Metformin improves glucose, lipid metabolism, and reduces blood pressure in hypertensive, obese women. Diabetes Care, 16: 1387-90.
105
136.
137.
138.
139.
140.
141. 142.
143. 144. 145.
146.
147.
148.
149.
150.
Majithiya JB, Balaraman R. (2006) Metformin reduces blood pressure and restores endothelial function in aorta of streptozotocin-induced diabetic rats. Life Sci, 78: 2615-24. Ruzicska E, Foldes G, Lako-Futo Z, Sarman B, Wellmann J, Szenasi G, Tulassay Z, Ruskoaho H, Toth M, Somogyi A. (2004) Cardiac gene expression of natriuretic substances is altered in streptozotocin-induced diabetes during angiotensin II-induced pressure overload. J Hypertens, 22: 1191-200. Blazovics A, Kovacs A, Lugasi A, Hagymasi K, Biro L, Feher J. (1999) Antioxidant defense in erythrocytes and plasma of patients with active and quiescent Crohn disease and ulcerative colitis: a chemiluminescent study. Clin Chem, 45: 895-6. Aufricht C, Bidmon B, Ruffingshofer D, Regele H, Herkner K, Siegel NJ, Kashgarian M, Van Why SK. (2002) Ischemic conditioning prevents Na,KATPase dissociation from the cytoskeletal cellular fraction after repeat renal ischemia in rats. Pediatr Res, 51: 722-7. Abel ED, Graveleau C, Betuing S, Pham M, Reay PA, Kandror V, Kupriyanova T, Xu Z, Kandror KV. (2004) Regulation of insulin-responsive aminopeptidase expression and targeting in the insulin-responsive vesicle compartment of glucose transporter isoform 4-deficient cardiomyocytes. Mol Endocrinol, 18: 2491-501. Ivanyi B, Olsen TS. (1991) Immunohistochemical identification of tubular segments in percutaneous renal biopsies. Histochemistry, 95: 351-6. Aragno M, Mastrocola R, Alloatti G, Vercellinatto I, Bardini P, Geuna S, Catalano MG, Danni O, Boccuzzi G. (2008) Oxidative stress triggers cardiac fibrosis in the heart of diabetic rats. Endocrinology, 149: 380-8. Nabben M, Hoeks J. (2008) Mitochondrial uncoupling protein 3 and its role in cardiac- and skeletal muscle metabolism. Physiol Behav, 94: 259-69. Esper RJ, Vilarino JO, Machado RA, Paragano A. (2008) Endothelial dysfunction in normal and abnormal glucose metabolism. Adv Cardiol, 45: 17-43. Bhor VM, Raghuram N, Sivakami S. (2004) Oxidative damage and altered antioxidant enzyme activities in the small intestine of streptozotocin-induced diabetic rats. Int J Biochem Cell Biol, 36: 89-97. Ceriello A, Morocutti A, Mercuri F, Quagliaro L, Moro M, Damante G, Viberti GC. (2000) Defective intracellular antioxidant enzyme production in type 1 diabetic patients with nephropathy. Diabetes, 49: 2170-7. Wohaieb SA, Godin DV. (1987) Alterations in free radical tissue-defense mechanisms in streptozocin-induced diabetes in rat. Effects of insulin treatment. Diabetes, 36: 1014-8. Genet S, Kale RK, Baquer NZ. (2002) Alterations in antioxidant enzymes and oxidative damage in experimental diabetic rat tissues: effect of vanadate and fenugreek (Trigonellafoenum graecum). Mol Cell Biochem, 236: 7-12. Matkovics B, Kotorman M, Varga IS, Hai DQ, Varga C. (1997) Oxidative stress in experimental diabetes induced by streptozotocin. Acta Physiol Hung, 85: 2938. Zobali F, Avci A, Canbolat O, Karasu C. (2002) Effects of vitamin A and insulin on the antioxidative state of diabetic rat heart: a comparison study with combination treatment. Cell Biochem Funct, 20: 75-80.
106
151.
152. 153. 154. 155.
156. 157. 158.
159.
160.
161.
162.
163.
164. 165.
166.
Gumieniczek A, Hopkala H, Wojtowicz Z, Nikolajuk J. (2002) Changes in antioxidant status of heart muscle tissue in experimental diabetes in rabbits. Acta Biochim Pol, 49: 529-35. Giugliano D, Ceriello A, Paolisso G. (1995) Diabetes mellitus, hypertension, and cardiovascular disease: which role for oxidative stress? Metabolism, 44: 363-8. Stout RW. (1990) Insulin and atheroma. 20-yr perspective. Diabetes Care, 13: 631-54. Mikhail N, Tuck ML. (2000) Insulin and the vasculature. Curr Hypertens Rep, 2: 148-53. Steinberg HO, Chaker H, Leaming R, Johnson A, Brechtel G, Baron AD. (1996) Obesity/insulin resistance is associated with endothelial dysfunction. Implications for the syndrome of insulin resistance. J Clin Invest, 97: 2601-10. Kubes P, Suzuki M, Granger DN. (1991) Nitric oxide: an endogenous modulator of leukocyte adhesion. Proc Natl Acad Sci U S A, 88: 4651-5. Lloyd-Jones DM, Bloch KD. (1996) The vascular biology of nitric oxide and its role in atherogenesis. Annu Rev Med, 47: 365-75. Zeng G, Nystrom FH, Ravichandran LV, Cong LN, Kirby M, Mostowski H, Quon MJ. (2000) Roles for insulin receptor, PI3-kinase, and Akt in insulinsignaling pathways related to production of nitric oxide in human vascular endothelial cells. Circulation, 101: 1539-45. Cardillo C, Nambi SS, Kilcoyne CM, Choucair WK, Katz A, Quon MJ, Panza JA. (1999) Insulin stimulates both endothelin and nitric oxide activity in the human forearm. Circulation, 100: 820-5. Kashiwagi A, Shinozaki K, Nishio Y, Maegawa H, Maeno Y, Kanazawa A, Kojima H, Haneda M, Hidaka H, Yasuda H, Kikkawa R. (1999) Endotheliumspecific activation of NAD(P)H oxidase in aortas of exogenously hyperinsulinemic rats. Am J Physiol, 277: E976-83. Kato K, Lukas A, Chapman DC, Rupp H, Dhalla NS. (2002) Differential effects of etomoxir treatment on cardiac Na+-K+ ATPase subunits in diabetic rats. Mol Cell Biochem, 232: 57-62. Vlkovicova J, Javorkova V, Stefek M, Kysel'ova Z, Gajdosikova A, Vrbjar N. (2006) Effect of the pyridoindole antioxidant stobadine on the cardiac Na(+),K(+)ATPase in rats with streptozotocin-induced diabetes. Gen Physiol Biophys, 25: 111-24. Gerbi A, Barbey O, Raccah D, Coste T, Jamme I, Nouvelot A, Ouafik L, Levy S, Vague P, Maixent JM. (1997) Alteration of Na,K-ATPase isoenzymes in diabetic cardiomyopathy: effect of dietary supplementation with fish oil (n-3 fatty acids) in rats. Diabetologia, 40: 496-505. Schoner W, Scheiner-Bobis G. (2005) Endogenous cardiac glycosides: hormones using the sodium pump as signal transducer. Semin Nephrol, 25: 343-51. Nesher M, Shpolansky U, Rosen H, Lichtstein D. (2007) The digitalis-like steroid hormones: new mechanisms of action and biological significance. Life Sci, 80: 2093-107. Hollenberg NK, Stevanovic R, Agarwal A, Lansang MC, Price DA, Laffel LM, Williams GH, Fisher ND. (2004) Plasma aldosterone concentration in the patient with diabetes mellitus. Kidney Int, 65: 1435-9.
107
167.
168.
169. 170.
171. 172.
173.
174.
175.
176.
177.
178.
179. 180. 181. 182.
Zhang L, Ma J, Gu Y, Lin S. (2006) Effects of blocking the renin-angiotensin system on expression and translocation of protein kinase C isoforms in the kidney of diabetic rats. Nephron Exp Nephrol, 104: e103-11. Kobayashi T, Hayashi Y, Taguchi K, Matsumoto T, Kamata K. (2006) ANG II enhances contractile responses via PI3-kinase p110 delta pathway in aortas from diabetic rats with systemic hyperinsulinemia. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 291: H846-53. Eckel J, Reinauer H. (1990) Modulation of transmembrane potential of isolated cardiac myocytes by insulin and isoproterenol. Am J Physiol, 259: H554-9. Shamraj OI, Grupp IL, Grupp G, Melvin D, Gradoux N, Kremers W, Lingrel JB, De Pover A. (1993) Characterisation of Na/K-ATPase, its isoforms, and the inotropic response to ouabain in isolated failing human hearts. Cardiovasc Res, 27: 2229-37. Weil E, Sasson S, Gutman Y. (1991) Mechanism of insulin-induced activation of Na(+)-K(+)-ATPase in isolated rat soleus muscle. Am J Physiol, 261: C224-30. Hansen PS, Buhagiar KA, Gray DF, Rasmussen HH. (2000) Voltage-dependent stimulation of the Na( +)-K(+) pump by insulin in rabbit cardiac myocytes. Am J Physiol Cell Physiol, 278: C546-53. Omatsu-Kanbe M, Kitasato H. (1990) Insulin stimulates the translocation of Na+/K+-dependent ATPase molecules from intracellular stores to the plasma membrane in frog skeletal muscle. Biochem J, 272: 727-33. Kessler A, Tomas E, Immler D, Meyer HE, Zorzano A, Eckel J. (2000) Rab11 is associated with GLUT4-containing vesicles and redistributes in response to insulin. Diabetologia, 43: 1518-27. Dimitrakoudis D, Ramlal T, Rastogi S, Vranic M, Klip A. (1992) Glycaemia regulates the glucose transporter number in the plasma membrane of rat skeletal muscle. Biochem J, 284 ( Pt 2): 341-8. Dombrowski L, Marette A. (1995) Marked depletion of GLUT4 glucose transporters in transverse tubules of skeletal muscle from streptozotocin-induced diabetic rats. FEBS Lett, 374: 43-7. Ramlal T, Ewart HS, Somwar R, Deems RO, Valentin MA, Young DA, Klip A. (1996) Muscle subcellular localization and recruitment by insulin of glucose transporters and Na+-K+-ATPase subunits in transgenic mice overexpressing the GLUT4 glucose transporter. Diabetes, 45: 1516-23. Lavoie L, Levenson R, Martin-Vasallo P, Klip A. (1997) The molar ratios of alpha and beta subunits of the Na+-K+-ATPase differ in distinct subcellular membranes from rat skeletal muscle. Biochemistry, 36: 7726-32. Bilous R. (2008) Microvascular disease: what does the UKPDS tell us about diabetic nephropathy? Diabet Med, 25 Suppl 2: 25-9. Bretzel RG. (2004) Intensive insulin regimens: evidence for benefit. Int J Obes Relat Metab Disord, 28 Suppl 2: S8-13. Peti-Peterdi J, Kang JJ, Toma I. (2008) Activation of the renal renin-angiotensin system in diabetes--new concepts. Nephrol Dial Transplant, 23: 3047-9. Fitzgerald SM, Brands MW. (2000) Nitric oxide may be required to prevent hypertension at the onset of diabetes. Am J Physiol Endocrinol Metab, 279: E7628.
108
183.
184. 185.
186.
187.
188.
189. 190.
191.
192.
193.
194.
195.
196.
Ishikawa T, Kohno F, Kawase R, Yamamoto Y, Nakayama K. (2004) Contribution of nitric oxide produced by inducible nitric oxide synthase to vascular responses of mesenteric arterioles in streptozotocin-diabetic rats. Br J Pharmacol, 141: 269-76. Yu Z, McNeill JH. (1992) Blood pressure and heart rate response to vasoactive agents in conscious diabetic rats. Can J Physiol Pharmacol, 70: 1542-8. Nagareddy PR, Xia Z, McNeill JH, MacLeod KM. (2005) Increased expression of iNOS is associated with endothelial dysfunction and impaired pressor responsiveness in streptozotocin-induced diabetes. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 289: H2144-52. Azuma KK, Hensley CB, Tang MJ, McDonough AA. (1993) Thyroid hormone specifically regulates skeletal muscle Na(+)-K(+)-ATPase alpha 2- and beta 2isoforms. Am J Physiol, 265: C680-7. Isenovic ER, Jacobs DB, Kedees MH, Sha Q, Milivojevic N, Kawakami K, Gick G, Sowers JR. (2004) Angiotensin II regulation of the Na + pump involves the phosphatidylinositol-3 kinase and p42/44 mitogen-activated protein kinase signaling pathways in vascular smooth muscle cells. Endocrinology, 145: 115160. Wald H, Popovtzer MM. (1984) The effect of streptozotocin-induced diabetes mellitus on urinary excretion of sodium and renal Na+-K+-ATPase activity. Pflugers Arch, 401: 97-100. Khadouri C, Barlet-Bas C, Doucet A. (1987) Mechanism of increased tubular NaK-ATPase during streptozotocin-induced diabetes. Pflugers Arch, 409: 296-301. Cheng XJ, Fisone G, Aizman O, Aizman R, Levenson R, Greengard P, Aperia A. (1997) PKA-mediated phosphorylation and inhibition of Na(+)-K(+)-ATPase in response to beta-adrenergic hormone. Am J Physiol, 273: C893-901. Vasilets LA, Fotis H, Gartner EM. (1997) Regulatory phosphorylation of the Na+/K+-ATPase from mammalian kidneys and Xenopus oocytes by protein kinases. Characterization of the phosphorylation site for PKC. Ann N Y Acad Sci, 834: 585-7. Ibarra FR, Cheng SX, Agren M, Svensson LB, Aizman O, Aperia A. (2002) Intracellular sodium modulates the state of protein kinase C phosphorylation of rat proximal tubule Na+,K+-ATPase. Acta Physiol Scand, 175: 165-71. Nowicki S, Chen SL, Aizman O, Cheng XJ, Li D, Nowicki C, Nairn A, Greengard P, Aperia A. (1997) 20-Hydroxyeicosa-tetraenoic acid (20 HETE) activates protein kinase C. Role in regulation of rat renal Na +,K+-ATPase. J Clin Invest, 99: 1224-30. Bertorello AM, Aperia A, Walaas SI, Nairn AC, Greengard P. (1991) Phosphorylation of the catalytic subunit of Na+,K+-ATPase inhibits the activity of the enzyme. Proc Natl Acad Sci U S A, 88: 11359-62. Lecuona E, Dada LA, Sun H, Butti ML, Zhou G, Chew TL, Sznajder JI. (2006) Na,K-ATPase alpha1-subunit dephosphorylation by protein phosphatase 2A is necessary for its recruitment to the plasma membrane. FASEB J, 20: 2618-20. Andersson RM, Aizman O, Aperia A, Brismar H. (2004) Modulation of Na+,K+ATPase activity is of importance for RVD. Acta Physiol Scand, 180: 329-34.
109
197.
198.
199.
200.
201. 202.
203. 204.
205.
206. 207.
208.
209.
210.
Brenner BM, Cooper ME, de Zeeuw D, Keane WF, Mitch WE, Parving HH, Remuzzi G, Snapinn SM, Zhang Z, Shahinfar S. (2001) Effects of losartan on renal and cardiovascular outcomes in patients with type 2 diabetes and nephropathy. N Engl J Med, 345: 861-9. Parving HH, Lehnert H, Brochner-Mortensen J, Gomis R, Andersen S, Arner P. (2001) The effect of irbesartan on the development of diabetic nephropathy in patients with type 2 diabetes. N Engl J Med, 345: 870-8. Sandberg MB, Riquier AD, Pihakaski-Maunsbach K, McDonough AA, Maunsbach AB. (2007) ANG II provokes acute trafficking of distal tubule Na+Cl- cotransporter to apical membrane. Am J Physiol Renal Physiol, 293: F662-9. Rossing K, Christensen PK, Hovind P, Parving HH. (2005) Remission of nephrotic-range albuminuria reduces risk of end-stage renal disease and improves survival in type 2 diabetic patients. Diabetologia, 48: 2241-7. Schiffrin EL, Lipman ML, Mann JF. (2007) Chronic kidney disease: effects on the cardiovascular system. Circulation, 116: 85-97. Liu J, Shapiro JI. (2007) Regulation of sodium pump endocytosis by cardiotonic steroids: Molecular mechanisms and physiological implications. Pathophysiology, 14: 171-81. Liang M, Tian J, Liu L, Pierre S, Liu J, Shapiro J, Xie ZJ. (2007) Identification of a pool of non-pumping Na/K-ATPase. J Biol Chem, 282: 10585-93. Komers R, Schutzer WE, Reed JF, Lindsley JN, Oyama TT, Buck DC, Mader SL, Anderson S. (2006) Altered endothelial nitric oxide synthase targeting and conformation and caveolin-1 expression in the diabetic kidney. Diabetes, 55: 1651-9. Cohen AW, Combs TP, Scherer PE, Lisanti MP. (2003) Role of caveolin and caveolae in insulin signaling and diabetes. Am J Physiol Endocrinol Metab, 285: E1151-60. Liu J. (2005) Ouabain-induced endocytosis and signal transduction of the Na+/K+ATPase. Front Biosci, 10: 2056-63. Wyse BD, Prior IA, Qian H, Morrow IC, Nixon S, Muncke C, Kurzchalia TV, Thomas WG, Parton RG, Hancock JF. (2003) Caveolin interacts with the angiotensin II type 1 receptor during exocytic transport but not at the plasma membrane. J Biol Chem, 278: 23738-46. Liu J, Liang M, Liu L, Malhotra D, Xie Z, Shapiro JI. (2005) Ouabain-induced endocytosis of the plasmalemmal Na+/K+-ATPase in LLC-PK1 cells requires caveolin-1. Kidney Int, 67: 1844-54. Kobayashi N, Mori Y, Nakano S, Tsubokou Y, Kobayashi T, Shirataki H, Matsuoka H. (2001) TCV-116 stimulates eNOS and caveolin-1 expression and improves coronary microvascular remodeling in normotensive and angiotensin IIinduced hypertensive rats. Atherosclerosis, 158: 359-68. Cohen AW, Park DS, Woodman SE, Williams TM, Chandra M, Shirani J, Pereira de Souza A, Kitsis RN, Russell RG, Weiss LM, Tang B, Jelicks LA, Factor SM, Shtutin V, Tanowitz HB, Lisanti MP. (2003) Caveolin-1 null mice develop cardiac hypertrophy with hyperactivation of p42/44 MAP kinase in cardiac fibroblasts. Am J Physiol Cell Physiol, 284: C457-74.
110
211.
212.
213.
214.
Xie S, Nie R, Wang J, Li F, Yuan W. (2009) Transcription factor decoys for activator protein-1 (AP-1) inhibit oxidative stress-induced proliferation and matrix metalloproteinases in rat cardiac fibroblasts. Transl Res, 153: 17-23. Sadoshima J, Izumo S. (1993) Molecular characterization of angiotensin IIinduced hypertrophy of cardiac myocytes and hyperplasia of cardiac fibroblasts. Critical role of the AT1 receptor subtype. Circ Res, 73: 413-23. Huang D, Wang Y, Yang C, Liao Y, Huang K. (2009) Angiotensin II promotes poly(ADP-ribosyl)ation of c-Jun/c-Fos in cardiac fibroblasts. J Mol Cell Cardiol, 46: 25-32. Colombo SL, Moncada S. (2009) AMPKalpha1 regulates the antioxidant status of vascular endothelial cells. Biochem J,
111
