Onkogenomikai vizsgálatok a vastag- és végbéldaganatok keletkezésére, áttétképző képességére és a melanóma tumor-stróma interakció mechanizmusára vonatkozóan PhD doktori értekezés
Dr. Pócza Péter Semmelweis Egyetem, Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető: Prof. Dr. Falus András, egyetemi tanár, az MTA rendes tagja Hivatalos bírálók: Dr. Sebestyén Anna, tudományos főmunkatárs, PhD Dr. Bálint B. László, egyetemi tanársegéd, PhD Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Kovalszky Ilona, egyetemi tanár Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Váradi András, egyetemi tanár Dr. Kiss András, egyetemi docens
Budapest 2010
TARTALOMJEGYZÉK
1.
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ............................................................ 4
2.
BEVEZETÉS ....................................................................................... 8
3.
IRODALMI ÁTTEKINTÉS............................................................... 9 3.1. A VASTAGBÉLDAGANATOK ÉS A MELANÓMA EPIDEMIOLÓGIÁJA ÉS KLINIKAI JELENTŐSÉGE ...9 3.1.1. A CRC és a melanóma epidemiológiája ...............................................................................9 3.1.2. A CRC és a melanóma rizikófaktorai .................................................................................11 3.1.3. Klinikai megfontolások .......................................................................................................14 3.2. A CRC ÉS A MELANÓMA PATOGENEZISE ...................................................................................16 3.2.1. A daganatok keletkezésének általános szempontjai............................................................16 3.2.2. A CRC patogenezise ...........................................................................................................19 3.2.3. A melanóma patogenezisében szerepet játszó tényezők......................................................24 3.3. A VASTAG- ÉS VÉGBÉLRÁK, ILLETVE A MELANÓMA GÉNEXPRESSZIÓS VIZSGÁLATAINAK ÁTTEKINTÉSE ...............................................................................................................................25 3.3.1. Microarray: a nagyfelbontású génexpressziós vizsgálati módszer.....................................25 3.3.2. Irodalmi áttekintés a vastag- és végbéldaganatok microarray vizsgálatairól....................26 3.3.3. Génexpressziós vizsgálatok a melanóma-kutatásban .........................................................28 3.4. A TUMOR ÉS A STRÓMA INTERAKCIÓJÁNAK EGY ASPEKTUSA: AZ ELASZTIN FEHÉRJE ÉS A MELANÓMA KAPCSOLATA ...........................................................................................................30
4.
CÉLKITŰZÉSEINK......................................................................... 32
5.
FELHASZNÁLT ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ........................ 34 5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5. 5.6. 5.7. 5.8. 5.9. 5.10. 5.11. 5.12. 5.13. 5.14. 5.15. 5.16. 5.17. 5.18. 5.19.
6.
BETEGEK ÉS MINTÁK ...................................................................................................................34 SEJTVONALAK TENYÉSZTÉSE, JELLEMZŐI .................................................................................35 PEPTID-SZINTÉZIS ÉS PEPTID-KEZELÉSEK..................................................................................36 RNS SZEPARÁLÁS, KONCENTRÁCIÓMÉRÉS ÉS MINŐSÉGELLENŐRZÉS ......................................37 GÉNEXPRESSZIÓS MICROARRAY MÉRÉS .....................................................................................37 A MICROARRAY ADATOK STATISZTIKAI ÉS BIOINFORMATIKAI ÉRTÉKELÉSE ...........................38 GENE ONTOLOGY ELEMZÉS ........................................................................................................39 INGENUITY ÚTVONALELEMZÉS (INGENUITY PATHWAY ANALYSIS, IPA) .................................40 REVERZ TRANSZKRIPCIÓ ÉS A TAQMAN VALÓSIDEJŰ PCR MÓDSZER .....................................40 SZÖVETTANI VIZSGÁLAT .............................................................................................................41 ÁRAMLÁSI CITOMETRIA ..............................................................................................................42 FEHÉRJE-IZOLÁLÁS .....................................................................................................................43 WESTERN BLOT ...........................................................................................................................43 IMMUNHISZTOKÉMIAI ANALÍZIS .................................................................................................44 TRANSZMISSZIÓS ELEKTRONMIKROSZKÓPIA ............................................................................45 MTT-ASSAY: A PROLIFERÁCIÓ MÉRÉSE .....................................................................................45 KVANTITATÍV MIGRÁCIÓS (HAPTOTAXIS) ASSAY .......................................................................46 ADHÉZIÓ VIZSGÁLATA ................................................................................................................46 STATISZTIKAI MÓDSZEREK .........................................................................................................47
KUTATÁSI EREDMÉNYEK .......................................................... 48 6.1. NYIROKCSOMÓ-ÁTTÉT NEGATÍV ÉS A TÁVOLI ÁTTÉT POZITÍV VASTAGBÉL TUMOROS MINTÁK GÉNEXPRESSZIÓS PROFILJÁNAK VIZSGÁLATA ...........................................................................48 6.1.1. A kétcsatornás Agilent teljes humán genom microarray vizsgálat eredményei..................48 6.1.2. Gene Ontology elemzés ......................................................................................................51 6.1.3. Jelátviteli útvonalkeresés az Ingenuity Pathway Analysis program segítségével...............52 6.1.4. A jelátviteli útvonal tagjainak validálása TaqMan valósidejű PCR módszerrel ................53 6.1.5. Fehérje szintű validálás: immunhisztokémia és Western blot.............................................55
2
6.1.6. A feltételezett útvonal validálása humán vastagbéltumor-sejtvonalakon ...........................58 6.1.7. Funkcionális vizsgálatok a vastagbéltumor-sejtvonalakon ................................................60 6.2. GÉNEXPRESSZIÓS VIZSGÁLATOK A MELANÓMA ÉS A STRÓMA INTERAKCIÓJÁNAK A TANULMÁNYOZÁSÁRA .................................................................................................................61 6.2.1. Elasztin fehérje és elasztin eredetű fragmentumok kimutatása...........................................61 6.2.2. A VGVAPG és VAPG elasztin eredetű peptidek receptorai................................................62 6.2.3. A peptidek hatása a melanómasejtek inváziós paramétereire ............................................63 6.2.3.1. 6.2.3.2. 6.2.3.3. 6.2.3.4.
7.
A migráció vizsgálata ............................................................................................................ 64 Az elasztint hasító MMP-2 és MMP-3 expressziójának vizsgálata ................................... 66 Az adhézió vizsgálata ............................................................................................................ 67 A lymphangiogenetikus VEGF-C expressziójának vizsgálata........................................... 69
EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE .............................................. 70 7.1. AZ IGF1 – MAPK3 – MDR1 JELÁTVITELI ÚTVONAL AZONOSÍTÁSA GÉNEXPRESSZIÓS MICROARRAY TECHNOLÓGIA SEGÍTSÉGÉVEL ............................................................................70 7.2. A TUMOR ÉS A STRÓMA KAPCSOLATÁNAK EGY ASPEKTUSA: AZ ELASZTIN EREDETŰ PEPTIDEK NÖVELIK A MELANÓMASEJTEK INVÁZIÓS KÉPESSÉGÉT .............................................................77
8.
KÖVETKEZTETÉSEK ................................................................... 81
9.
ÖSSZEFOGLALÁS .......................................................................... 83
10. SUMMARY........................................................................................ 84 11. IRODALOMJEGYZÉK ................................................................... 85 12. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK........................................................................... 104 13. EGYÉB KÖZLEMÉNYEK............................................................ 105 14. TUDOMÁNYOS KONFERENCIÁK............................................ 107 15. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS......................................................... 108
3
1. Rövidítések jegyzéke ABCB1 = ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), member 1 ADH1A = Alcohol dehydrogenase 1A APC = adenomatosis polyposis coli BAX = Bcl2-asszociált X BCL2 = B-cell lymphoma protein 2 BMPR1A = bone morphogenetic protein receptor, type IA BRAF = V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1 BSA = szarvasmarha szérum albumin (bovine serum albumin) CA2 = carbonic anhydrase II CD = Crohn-betegség (Crohn’s disease) CDH3 = 3-as típusú (placental) kadherin (P-cadherin) CDK4 = ciklin-dependens kináz 4 CDKI = ciklin-dependens kináz inhibitor cDNS = komplementer dezoxiribonukleinsav CEA = carcinoembrionális antigén CGH = comparative genomic hybridization CEACAM1 = carcinoembrionális antigénszerű sejtadhéziós molekula CIN = kromoszómális instabilitás COX-2 = ciklo-oxigenáz 2 CRC = vastag- és végbélrák (colorectal cancer) cRNS = komplementer ribonukleinsav CXCL = kemokin (C-X-C motívum) ligandum CXCR = kemokin (C-X-C motívum) receptor DCC = deleted in colorectal cancer DNS = dezoxiribonukleinsav DSS = dextran sodium sulfate EBP = elasztin-kötő fehérje ECM = extracelluláris mátrix EDTA = etiléndiamin-tetraecetsav EGFR = epidermális növekedési faktor receptor
4
EMEM = Eagle's Minimum Essential Medium ERK = extracellular signal-regulated kinase FAP = familiáris adenomatosus polyposis FAS = tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 (= APO1 = CD95) FCS = fetal calf serum bFGF = bázikus fibroblaszt eredetű növekedési faktor GADD45 = növekedést megállító és DNS károsodás hatására indukálódó transzkriptum (growth arrest and DNA-damage-inducible) GD-AIF = glioma-derived angiogenesis inhibitory factor HNPCC = herediter nem-polyposus colorectális carcinoma HSP90 = hősokk fehérje 90 IBD = gyulladásos bélbetegség (inflammatory bowel disease) ICAM-1 = intercelluláris sejtadhéziós molekula 1 IGF-1 = inzulinszerű növekedési faktor 2 IGF-2 = inzulinszerű növekedési faktor 2 IGFBP-3 = inzulinszerű növekedési faktor receptor kötő fehérje 3 IL-8 = interleukin 8 IL1β = interleukin 1β IPA = Ingenuity Pathway Analysis JPS = Familiáris juvenilis polyposis K-RAS = v-Ki-ras2, Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog LFA-1 = lymphocyte function-associated molecule-1 LOH = heterozigótaság elvesztése (loss of heterozigosity) MAPK = mitogén aktivált protein kináz MDM2 = egér double minute 2 homológ MDR1 = multidrug rezisztencia protein 1 (= ABCB1 = P-glycoprotein) MEK = mitogén aktivált protein kináz kináz (= MAP2K = ERK kináz) MET = met protoonkogén MKP2/DUSP4 = dual specificity phosphatase 4 MLH1 = MutL homológ 1 MMP = mátrix metalloproteináz MMR = DNS hibajavító (mismatch repair)
5
mRNS = hírvivő ribonukleinsav (messenger RNS) MSI = mikroszatellita instabilitás MSI-H = magas szintű mikroszatellita instabilitás MSI-L = alacsony szintű mikroszatellita instabilitás MSH2 = MutS homológ 2 MSS = mikroszatellita stabilitás MT-MMP = membrán típusú mátrix metalloproteináz MTT = 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolium bromid MYH = MUTYH (mutY Homolog, E. coli) NCAM-1 = neurális sejtadhéziós molekula 1 NEAA = Non Essential Amino Acids NOXA = forbol-12-mirisztát-13-acetát-indukált protein 1 (PMAIP1) PAC1/DUSP2 = dual specificity phosphatase 2 PBS = foszfátsó puffer (Phosphate Buffer Saline) PCR = polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction) PDGF = vérlemezke eredetű növekedési faktor P-gp = P-glycoprotein (= ABCB1 = MDR1) PJS = Peutz-Jeghers szindróma PTEN = phosphatase and tensin homolog PUMA = BCL2-kötő komponens 3 (BBC3) RB1 = retinoblastoma 1 RGP = radial growth phase RT = reverz transzkripció RT-PCR = reverz transzkripciós polimeráz láncreakció S-100 = S100 calcium binding protein B SDF-1 = stromal cell-derived factor-1 TCF4 = transzkripciós faktor 4 THBS2 = trombospondin 2 TGF-β = transzformáló növekedési faktor-β TIMP = szöveti metalloproteináz gátló TNFα = tumor nekrózis faktor α UC = colitis ulcerosa
6
UVA = ultraibolya A sugárzás UVB = ultraibolya B sugárzás VEGF = vaszkuláris endoteliális növekedési faktor VGF = vertical growth phase WHO = World Health Organisation
7
2. Bevezetés A tumorok keletkezése, a carcinogenezis egy komplex, több tényező által befolyásolt folyamat, amelyben a sejt homeosztázisát fenntartó megszámlálhatatlan gén összehangolt
működésében
bekövetkező
zavar
játszik
főszerepet,
klinikai
megjelenéséhez azonban a genetikai hajlamosító tényezők mellett a környezeti hatások is elengedhetetlenül szükségesek. A betegség kialakulásának hátterében álló összetett genetikai mechanizmusok feltárása jelenleg is intenzív kutatások tárgya. A humán genom megszekvenálásának, valamint a molekuláris genetika és az informatika napjainkban zajló ugrásszerű fejlődésének köszönhetően új tudomány jött létre, mely megteremtette a genom léptékű molekuláris genetikát, a genomikát. A genomika egyik nagy ágának, az úgynevezett strukturális genomikának egyik legfontosabb feladata a betegséget
okozó,
illetve
az
arra
hajlamosító
génváltozatok
(mutációk,
polimorfizmusok) azonosítása, valamint azok együttes öröklődésének, haplotípusainak a vizsgálata, mely nagy segítséget nyújthat a tumorok hátterének felderítésében, valamint új diagnosztikai és terápiás eljárások kifejlesztésében. A genomika másik nagy irányzata, a gének kifejeződését (expresszióját) vizsgáló funkcionális genomika lehetőséget nyújt a betegségek összetett patomechanizmusainak hátterében zajló génszintű változások monitorozására. A nagyfelbontású, több tízezer gén együttes expresszióját vizsgálni képes génexpressziós microarray módszerek segítségével képesek lehetünk új, a tumorok patogenezisében eddig még nem vizsgált, esetlegesen kulcsfontosságú
szerepet
játszó
gének
azonosítására,
valamint
azok
kapcsolatrendszerének a feltárására. A jelen dolgozatban bemutatom a vastag- és végbélrák, illetve a melanóma klinikai jelentőségét, a már megismert molekuláris biológiai összefüggéseket, microarray eredményeket. Saját kísérleteinkben funkcionális genomikai módszerekkel gének kifejeződését vizsgáljuk, amelyek szerepet játszanak a tumorok keletkezésében, az
áttétképzés
mechanizmusában,
a
tumor-stróma
interakcióban.
Vizsgálati
eredményeink újabb adatokat szolgáltatnak a tumorok bonyolult patomechanizmusának felderítéséhez és mélyebb megértéséhez.
8
3. Irodalmi áttekintés 3.1. A vastagbéldaganatok és a melanóma epidemiológiája és klinikai jelentősége Az Európai Unióban a legfrissebb statisztikák szerint 3,19 millió rákos megbetegedést regisztráltak 2006-ban (a nem melanómás bőrdaganatokon kívül), és a daganatos betegségek halálozása 1,7 milliónak bizonyult, ennek 56%-a férfi és 44%-a nő (1). Látható, hogy a rosszindulatú daganatos megbetegedések változatlanul fontos egészségügyi problémát jelentenek, és az európai lakosság öregedését figyelembe véve ez a szám emelkedni fog még akkor is, ha a ”korra specifikus arányok” változatlanok maradnak. Az elmúlt években tapasztalhatóak bizonyos kedvező tendenciák a rákhalálozás területén számos európai országban és az Egyesült Államokban, de sajnos Magyarországon éppen ellentétes folyamatok figyelhetők meg (2, 3). Az európai halálozási gyakoriságot a tüdőrák vezeti, amely az összes halálozás 20%-a, ezt a vastagés végbélrák, a gyomorrák, valamint az emlőrák követi a rangsorban. Férfiaknál a tüdőrák a listavezető, míg nőknél az emlőrák. A nemzetközi szakirodalomban megjelent epidemiológiai adatok alapján Európában Magyarországon a legmagasabb a daganatos megbetegedések miatt bekövetkező halálozás. Hazánk, a férfiak esetében az összes daganatos halálozás sorrendjében az első, míg a nők tekintetében a második helyen áll. Magyarországon kétszer akkora az esélye a férfiaknak a daganatos megbetegedésben meghalni, mint az azonos korosztálynak Svédországban (4). 3.1.1. A CRC és a melanóma epidemiológiája A vastag- és végbélrák (colorectális carcinoma, CRC) az egyik leggyakoribb daganatféleség. A világ fejlett országaiban évtizedek óta a második leggyakoribb daganatos halálokként szerepel. Így nem meglepő, hogy a colorectális daganatokkal foglakozó vizsgálatok az elmúlt évtizedek egyik fontos kutatási területévé váltak. Ennek egyik oka, hogy a vastag- és végbélrák ma is az egészségügy egyik legsúlyosabb, megoldatlan problémája: világszerte a harmadik leggyakrabban előforduló rosszindulatú megbetegedés és a negyedik leggyakoribb daganatos halálok. Másik ok, hogy a
9
tudományos vizsgálatok eredményei alapján már számos adat áll rendelkezésünkre a háttérben álló molekuláris alapokról, melyek ismerete egyre nagyobb lehetőséget biztosít a többlépcsős carcinogenesis folyamatába való korai beavatkozásra, illetve a megelőzésre, a szűrővizsgálatokra. Természetesen a betegség kialakulásában résztvevő összes tényező még korántsem ismert. A WHO adatai szerint évente kb. 945000 új esetet diagnosztizálnak világszerte, illetve kb. 492000 ember hal meg colorectális carcinomában. (5, 6). Magyarországon a számunkra oly kedvezőtlen statisztikákból is kiemelkedik a colorectális daganatok magas száma. Hazánk a CRC tekintetében az európai országok között nők esetében az első helyet, férfiaknál a második helyet foglalja el (7). A prognosztikai adatok hazánkban az európai országokhoz képest lényegesen kedvezőtlenebbek: 2003-ban 2787 férfi és 2311 nő halt meg vastag- illetve végbéldaganat következtében (8). 2004ben összesen 8841 újonnan felfedezett colorectális carcinomát jelentettek be Magyarországon, ebből 4705 férfi és 4136 nő volt. Ezek az adatok még mindig inkább incidencia emelkedést vagy legalábbis stagnálást mutatnak az európai javuló adatokhoz képest (1. táblázat).
1. Táblázat Magyarországi daganatos halálozási sorrend (KSH 1999-2004), a két nem együtt.
ESETSZÁM
LOKALIZÁCIÓ 1999
2000
2001
2002
2003
2004
1.
Tüdő
7883
7824
7902
7939
8201
8260
2.
Colorectális
4912
4886
4852
4790
5098
4979
3.
Emlő
2387
2356
2342
2270
2349
2285
4.
Gyomor
2306
2310
2166
2114
2035
1938
5.
Nyirok- és vérképző
1997
1895
1936
1934
1847
1971
6.
Ajak és szájüreg
1618
1531
1737
1717
1760
1690
7.
Hasnyálmirigy
1562
1546
1561
1670
1658
1683
8.
Prostata
1387
1413
1372
1292
1308
1275
9.
Máj
972
946
893
916
987
970
10.
Epehólyag
867
843
862
877
810
838
33821
33280
33318
33013
33530
33502
Összesen:
10
A colorectális carcinomával szemben a melanóma előfordulási gyakorisága továbbra is rohamosan nő világszerte, és a betegek túlélési esélyi sem javultak. Magyarországon és az USA-ban is 3%-a az összes diagnosztizált daganatnak. Gyakoribb, mint a Hodgkin lymphoma, illetve a primer agydaganatok. Az európai országok statisztikai adatai alapján 100000 lakosra 4-14 melanóma esik. Leggyakrabban érett felnőttkorban fordul elő, nagyon ritka a pubertás előtt. Dominánsan a középkorú populációt érinti, ritka 15 évnél fiatalabb korban. Míg nőkön a lábszár, illetve az arc érintett, addig férfiaknál a hát felső szakaszán jelenik meg. Magyarországon 1975 óta kétszeresére nőtt a melanóma mortalitása (9). Sokkal gyakrabban fordul elő a fehérbőrű populációban, mint a fekete, vagy az ázsiai rasszban, illetve gyakoribb vörös, vagy szőke hajú és kék szemű embereken. 3.1.2. A CRC és a melanóma rizikófaktorai A vastag- és végbélrák kialakulásának kockázata az egyén élete során kb. 5-6%, azaz ma Magyarországon 100 ember közül minden 5. esetében számolhatunk a colorectális carcinoma megjelenésével és ebből 3 a betegség következtében hal meg (10). Epidemiológiai és experimentális adatokból tudjuk, hogy az öröklött génállományon, illetve a génmutációkon kívül az ezeket befolyásoló táplálkozási szokásoknak és a környezeti tényezőknek is kulcsszerepe van a malignus daganatok kialakulásában (11, 12). Családi prediszpozícióval hozható kapcsolatba a rákok 20-30%-a, míg ezen belül a colorectális carcinomák 3-5%-áért tehetők felelőssé a genetikailag meghatározott, örökletes,
autoszomális
dominánsan
öröklődő
szindrómák,
melyekben
nagy
penetranciájú gének játszanak szerepet a daganat kialakításában. A betegség familiáris halmozottsága igen fontos rizikótényező: amennyiben a családi anamnézisben colorectális carcinoma szerepel, az a sporadikus vastag- és végbélrák kifejlődésének kockázatát jelentősen növeli (13). Legalább egy elsőfokú rokon betegsége esetén a CRC kifejlődésének kockázata megduplázódik (14, 15). Amennyiben a beteg anamnézisében colorectális polyp, adenoma előfordult, akkor nagyobb a valószínűsége a carcinoma kialakulásának. Egy korábbi colorectális carcinomát követően a rizikó 1,5-3%-os a második malignus bélelváltozás kifejlődésére a diagnózist követő első 5 évben. Egyéb
11
rosszindulatú megbetegedés (vékonybél, endometrium, emlő vagy ovarium daganat) után szintén nagyobb a kockázat a colorectális carcinoma kifejlődésére. A családi halmozottságot mutató, hosszabb ideje fennálló gyulladásos bélbetegségek (IBD) talaján a vastagbélrák kialakulásának fokozott a kockázata, amely összefüggést mutat a betegség kiterjedésével és a diagnózis óta eltelt idővel (16, 17). A colitis ulcerosa rákos elfajulásának kockázata jobban ismert, mint a Crohn-betegségé. A colitis ulcerosa (másképpen fekélyes vastagbélgyulladás) a vastagbél krónikus gyulladásos betegsége. Hosszanti kiterjedésben a betegség mindig a végbél felől indul és különböző magasságig összefüggően érinti a vastagbelet. Amennyiben csak a végbél betegszik meg, a diagnózis proctitis ulcerosa. Kiterjedtebb kórforma a szigmabelet és a vastagbél leszálló szárát is érintő baloldali colitis ulcerosa. A legsúlyosabb betegségforma az egész vastagbelet érintő pancolitis. A betegség folyamán a kiterjedés változhat. A colitis ulcerosás betegek 5-10%-ában fejlődik ki CRC, míg a Crohn-betegségben szenvedők 0,4-0,8%-ában. A colitis ulcerosa 8-10 éves fennállása során még nem vagy alig növekszik a malignus transzformáció gyakorisága, míg 20 éves betegségtartam után 510%-os, 30 évet követően 12-20%-os (18). A vastagbélrák kialakulása többször fordul elő olyan esetekben, amikor az IBD kezdete fiatal korra esik, vagy ha a colitis kiterjedt, különösen, ha a gyulladás az egész vastagbelet érinti. A CRC rizikó proctitis ulcerosa esetén nem nagyobb az átlagpopulációhoz képest, míg baloldali colitis ulcerosa esetén négyszeres, pancolitis esetén pedig hússzoros. Hosszú ideig fennálló kiterjedt Crohnbetegség a pancolitishez hasonló vastagbélrák kockázatot jelent (19). Sajnos a felsorolt, külön-külön független prognosztikai markerek sok esetben együttesen fordulnak elő, így hatásuk összegződve növelheti a CRC kialakulásának valószínűségét. A vastag- és végbéldaganatok legalább 75%-a sporadikus (20). A sporadikus CRC esetében feltételezhetően nagyobb szerepet kapnak azok a környezeti tényezők és életmódbeli sajátosságok, amelyek a betegség kialakulásában fontos géneket befolyásolják (21). Számos tanulmányban vizsgálták a környezeti faktorok jelentőségét, hatását a CRC etiológiájában. Egyértelműen kiderült, hogy a táplálkozási és életviteli szokások megváltoztatásával a colorectális daganatok nagyobb részénél van esély a rizikó csökkentésére (22). A táplálkozás során felmerült lehetséges befolyásoló tényezők: a nagyfokú kalória, hús, zsír, fehérje bevitel szemben az alacsony diétás rost, vitamin, gyümölcs, zöldség, mikroelem fogyasztásával (23). A teljes kalóriabevitel és
12
az elhízás a vizsgálatok szerint független prognosztikai markernek bizonyultak a CRC kialakulását illetően. A magasabb testtömegindex megduplázta a kockázatot. Az összefüggés kifejezettebb férfiak és a colon carcinoma relációjában (24, 25). A vörös húsféleségek nagymennyiségű fogyasztása szintén független prognosztikai tényezőnek számít a CRC etiológiájában (26, 27). A táplálkozás során a szervezetbe került zsírok abnormális bélhámsejt proliferációt indíthatnak be. Ellentmondásos adatok szólnak arról, hogy a zsírok mely fajtái jelentenek fokozott kockázatot (28). Korábbi adatok szerint magasabb rosttartalmú diéta esetén a CRC incidenciája alacsonyabb. Ezt az összefüggést annak tulajdonítják, hogy a rostok a belekben képződő carcinogén anyagokat eliminálják, és gyorsítják a táplálék áthaladását az emésztőrendszeren. Azonban több nagy vizsgálat sem tudta igazolni a rostok protektív hatását (29, 30). A kalcium, az antioxidáns vitaminok (E, C, A), illetve a folsav esetleges kemopreventív hatásának eldöntése további vizsgálatok feladata lesz, mivel a jelenleg rendelkezésre álló adatok nem egyértelműek. A dohányzás viszont egyértelműen növeli mind az adenoma, mind a CRC előfordulási gyakoriságát (31). A felsoroltakon kívül egyéb rizikófaktorok is szerepet játszhatnak, így az idősebb életkor, a férfi nem, a cholecystectomia a beteg anamnézisében, az alkoholfogyasztás, a különböző hormonális faktorok, mint a korai menopausa, az első terhesség idősebb életkorban, illetve a nulliparitás. A CRC-hez hasonlóan a melanóma keletkezésében is számos tényező játszik szerepet (genetikai: családi halmozódás, rassztípus, bőrszín, nem, kor, anyajegyek száma, nagysága, elhelyezkedése, alakja, illetve környezeti: napsugárzás, mechanikus ingerek, kémiai ingerek). A melanóma több mint 50%-ban az ép bőrön jelentkezik, körülbelül 10-15%-ban lentigo maligna, 30%-ban naevussejtes naevus és viszonylag kis százalékban kék naevus lehet a kiindulási alap (32, 33). A környezeti ártalmak közül a krónikus actinicus laesio jelentősen hozzájárul a melanóma kialakulásához. Az erős és idült napfénybehatásra elsősorban a világos bőrű egyénekben jön létre a betegség. Dysplasiás és atypiás anyajegyek szintén növelik a melanóma előfordulásának rizikóját. Az UVA és UVB sugárzás egyforma mértékben növeli a melanóma kialakulásának lehetőségét, ezért a védekezéshez elégtelenek a csak UVB sugárzás ellen védő naptejek, illetve egyéb UVA sugárzás ellen kevésbé hatásos készítmények (34, 35).
13
További fontos rizikófaktornak tekinthetők a családban előfordult melanómás esetek. Az újonnan diagnosztizált betegek körülbelül 5-12%-ánál előfordult egy vagy több elsőfokú rokonnál ilyen típusú malignus elváltozás. Meghatározó tényezők továbbá a bőr, a haj, a szem színe, a naevusok száma és pigmentáltsága valamint a nem. A betegség megjelenését és felismerését követően a prognózist befolyásolja az életkor, a daganat lokalizációja és vastagsága, a tumor felszínének kifekélyesedése, az infiltrált nyirokcsomók száma és az infiltráció mértéke (mikro- és makrometasztázisok). A beteg túlélési esélyei és az alkalmazott terápia sikere nők esetében jobb (36-42). 3.1.3. Klinikai megfontolások A vastag- és végbélrák legtöbbször hasmenéssel vagy székrekedéssel, hasi fájdalmakkal
(görcsök,
puffadás,
teltségérzet),
étvágytalansággal
és
testsúlycsökkenéssel, illetve a daganat vérzéséből eredő tünetekkel, panaszokkal (véres széklet ürítése, jelentősebb vérveszteség esetén vérszegénység, fáradékonyság) jelentkezik. Az előrehaladott vastag- és végbélrák kezelése komoly megpróbáltatás a betegnek, az egészségügyi ellátó rendszernek, ezen keresztül pedig az egész társadalomnak. A CRC szakszerű kezelése számos orvosi szakma szoros együttműködését igényli. Leghatékonyabban olyan, erre a célra szakosodott onkológiai központokban történik, ahol valamennyi érintett diszciplína magas szinten képviseltetve van, együttműködésük lehetősége adott, és nagyszámú beteg ellátása révén a kellő tapasztalat is rendelkezésre áll. Az egyes betegek részletes kezelési tervére minden esetben a Multidiszciplináris Onkológiai Teamnek kell javaslatot tenni. Ebben diagnosztikus képalkotó szakember, patológus,
sebész,
sugárterapeuta
és
belgyógyász-onkológus
vesz
részt.
Konzultációjukra a rutin belgyógyászati és sebészeti vizsgálat, a patológiai diagnózis és a stádiumot felmérő teljes kivizsgálás birtokában kerül sor, mielőtt bármilyen kezelés elkezdődne. A már kialakult CRC kezelése az utolsó két évtized alatt rohamosan fejlődött. Az adjuváns és neoadjuváns kemoterápia, a multidiszciplináris terápia részeként, mindössze 20 éve vált a bizonyítékokon alapuló orvoslás elvei szerint általánosan elfogadottá (43). A gyorsütemű fejlődés eredményeként a CRC a kevéssé kemoszenzitív daganatok közül
14
a közepesen kemoszenzitív rákok közé került, és a kemoterápia – az új évezredben a biológiai célzott terápiával kiegészítve – a komplex kezelés egyre jelentősebb összetevőjévé vált. Mindazonáltal a CRC multidiszciplináris kezelésének a legfontosabb eleme ma is a daganat sebészi eltávolítása. A CRC vonatkozásában is igaz, hogy a legjobb terápiánál is eredményesebb a megelőzés. A primer prevenció, azaz a betegség kialakulását elősegítő kockázati tényezők kiküszöbölése nemcsak szűkebb értelemben vett orvosi, hanem össztársadalmi feladat. A hazai táplálkozási szokások (kalóriadús, állati fehérjékben, vörös húsokban és zsírokban gazdag étkezés), az elhízás és a mozgásszegény életmód fokozhatják a CRC kockázatát. Hatékony egészségneveléssel a kalóriaszegény, kevés állati fehérjét és zsírt tartalmazó, zöldségekben, gyümölcsökben és rostos ételekben, természetes antioxidáns anyagokban (E-,A-,C-vitamin, szelén, kalcium) dús táplálkozás népszerűsítésével, az elhízást kerülő, aktív mozgásban gazdag életmóddal jelentősen csökkenthető a CRC előfordulása és a halálozás. A CRC olyan daganat, amely már korai stádiumában is jól szűrhető, és az idejében történt felismerés után igen eredményesen gyógyítható (szekunder prevenció). A CRC okozta halálozás visszaszorításának kulcsa tehát – mint annyi más daganatféle esetében – a széleskörű szűrőprogramok beindítása, és az azokon való magas arányú részvétel. E stratégia eredményességére kézzelfogható bizonyítékok születtek egyes európai országokban (Svédország, Dánia, Anglia) és az Egyesült Államokban, ahol a kísérleti programok tapasztalatai szerint a fokozottan veszélyeztetett korcsoport (nagyjából a 4575 év közötti tünetmentes felnőttek) évenkénti-kétévenkénti szűrése a CRC-ből eredő halálozást akár 13-18%-kal (!) csökkentheti. A melanóma esetében már a bőr tumoros elváltozásainak differenciáldiagnosztikája sem könnyű feladat kizárólag a klinikum alapján. A makroszkópos klinikai kép alapján felállított diagnózis esetében a tévedések aránya körülbelül 10-20%. Nehézséget jelenthet a melanómától elkülöníteni az alábbi kórképeket: naevussejtes naevus, kék naevus, basalioma, angiokeratoma. A bőrben játszódó folyamatok differenciáldiagnosztikájában segítséget nyújt az American Academy of Dermatology által kidolgozott ”ABCDE szabály”: •
A: aszimmetria;
•
B: szabálytalan szél (border);
15
•
C: egyenetlen színezet (colour);
•
D: >5 mm átmérő (diameter);
•
E: elevált, kiemelkedő folyamat.
A pontosabb tájékozódásban segít a dermatoszkóp (10X-es nagyítás, olajimmerzió), de a pontos diagnózis felállításához feltétlenül szükség van szövettani vizsgálatra. Az egyedüli helyes eljárás az in toto (épben) jellegű kimetszés általános vagy regionális érzéstelenítésben. Egyidejűleg a kivett mintából fagyasztott metszetet kell készíteni. Az in toto kimetszést 2,5 cm-es margóval kell, hogy történjék az ép szövet felé. A cryostatos metszetből több mint 90%-os bizonyosságú diagnózishoz lehet jutni. Ezek után a betegség stádiumát kell meghatározni, és ezek tükrében felállítani az adott betegnek legmegfelelőbb terápiás protokollt. Az immunhisztokémiai vizsgálat általában elengedhetetlen kelléke a patológiai diagnózisnak. A ”legősibb” marker az S-100 antigén, amely igen szenzitíven jelzi a melanómasejtek jelenlétét, de specifitása alacsonyabb, hiszen nem csak a melanómában expresszálódik. A HMB-45, melanoszómában található antigén kevésbé szenzitív, de sokkal specifikusabb marker, mint az S-100 antigén. Ma a mindennapi patológiai gyakorlatban egy melanoszómában található fehérjét, a MART-1/Melan-A antigént mutatják ki, ami szenzitíven és specifikusan jelzi a melanómát (44).
3.2.
A CRC és a melanóma patogenezise
3.2.1. A daganatok keletkezésének általános szempontjai A sejtciklus szabályozásában résztvevő gének felfedezése óta több mint 30 év telt el (45), ez idő alatt tanúi lehettünk annak a jelentős és látványos fejlődésnek, ami a malignus folyamatok molekuláris hátterének feltárásában következett be. Az elmúlt évtizedekben talán ebben a témában jelent meg az egyik legtöbb tudományos közlemény, így ma már nem könnyű kiigazodni a rendkívül szerteágazó, de egymással szorosan összegfüggő mechanizmusok között. Mielőtt felvázolnám az eddigi ismeretek alapján az általam vizsgált daganatok kialakulásának molekuláris mechanizmusát, mindenképpen szeretnék néhány, mindenki által elfogadott alapvetést leszögezni:
16
1. a sejt számára nem letális genetikai hiba áll a tumoros átalakulás középpontjában; 2. ez a genetikai módosulás négy fő géncsoportot érint elsősorban: a protoonkogéneket,
a
tumorszupresszor
géneket,
a
programozott
sejthalál
szabályozásában szerepet játszó és a DNS-hibajavító apparátusához tartozó géneket; 3. a tumoros átalakulás mind fenotípusosan, mind a gének szintjén többlépcsős folyamat, amely során a hibák felhalmozódnak (1. ábra).
1. ábra A tumorsejtek keletkezésének általános mechanizmusa. Az ábrán a carcinogenezis főbb állomásai láthatók: a genetikai hiba létrejöttétől a daganatsejtek inváziójáig.
17
A malignus transzformáció során a sejtszaporodás szabályozásában szerepet játszó proto-onkogének (növekedési faktorok, növekedési faktor receptorok, jelátvivők, transzkripciós faktorok) aktiváló mutációi közül – melyeknek szerepük lehet a malignus folyamatok létrejöttében – főképp az amplifikáció, minor pontmutációk, transzlokációk játszanak fontos szerepet. Tekintettel a proliferációt aktiváló hatásukra, az onkogének esetében általában elég, ha az egyik allél károsodik, mivel ezekben a génekben a mutációk általában dominánsak. Az ellenpólust a tumorszupresszor gének képviselik, melyek replikációs őrként ellenőrzik a sejtciklust. Normális körülmények között, a sejtciklus G1 fázisában leállítják a sejtosztódást, de erre később is képesek, amennyiben a génállományban károsodás jött létre. Ennek a funkciónak az elvesztése – amelyhez legtöbb esetben mindkét allél inaktivációja szükséges – egyrészt genetikai instabilitáshoz vezet, másrészt az osztódás-szabályozás felbomlásán keresztül a malignus transzformációhoz. Mutációk szempontjából igen jellegzetesek a kis deléciók, mindkét alléljüknek sérülnie kell ahhoz, hogy funkcióvesztés jöjjön létre. A 70-es években fedezték fel a harmadik csoportba tartozó géneket, a DNS repair géneket, amelyeknek fontos szerepük van a mutációk kijavításában. Funkcióvesztésük esetén felhalmozódnak a hibák a DNS állományban, ezen belül a proto-onkogénekben és a tumorszuppresszor génekben (46). A sejtrendszerek működését szabályozó egyik legfontosabb mechanizmus a programozott sejthalál, az apoptózis. A daganatok esetében két ok vezethet az apoptózis programjának sérüléséhez, szabályozásának zavarához, végső soron a daganatsejt ”halhatatlanná” válásához. Az egyik a program hibás működése valamelyik résztvevő működészavara miatt (antiapoptotikus fehérjék túltermelése, proapoptotikus fehérjék csökkent termelése), a másik a program gátoltsága (például a túlélési faktorok túltermelése miatt). A daganatsejtek kialakulásához, túléléséhez és inváziójához több rendszer működésének a zavara szükséges. A fentebb felsoroltakon kívül sérülhetnek még a sejtciklus és a sejtöregedés szabályozásában szerepet játszó gének, illetve a genom stabilitását és működését szabályozó tényezők.
18
3.2.2. A CRC patogenezise A daganatok keletkezésében szerepet játszó génhibák lehetnek veleszületettek, vagy szerzettek. Az előbbiek vagy öröklöttek, vagy az intrauterin élet során alakulnak ki. Ha egy génhiba öröklött, akkor nem csak a csírasejtekben, hanem minden szomatikus sejtben megtalálható. A penetrancia azt jelzi, hogy a génhibát hordozókban az életük során milyen valószínűséggel jelenik meg a kérdéses daganat. Az öröklődő formák jellegzetessége, hogy általában a kérdéses daganattípus sporadikus formáinál fiatalabb életkorban jelentkeznek és multiplexek (47). A vastag- és végbélrákoknál több öröklődő kórkép ismert. Az öröklődő formák genetikai hátterének tanulmányozása segített a sporadikus forma kialakulása során zajló genetikai változások alaposabb megismerésében (2. táblázat).
2. Táblázat Öröklődő és familiáris CRC-szindrómák genetikai és klinikai jellemzői.
Familiáris adenomatosus polyposis (FAP)
Herediter nonpolyposis colon cancer (HNPCC)
Familiáris juvenilis polyposis (JPS)
PeutzJeghers szindróma (PJS)
Gyakoriság
1:10 000
1: 2 000
1: 100 000
1: 200 000
Penetrancia
100% kb. 40 éves korban
80% kb. 45 éves korban
kb. 50% kb. 40% kb. 35 éves korban kb. 45 éves korban
Diagnózis
> 100 polyp, legalább két érintett családtag
Amszterdam – Bethesda kritérium
> 100 juvenilis polyp a colonban, pozitív családi anamnézis
Mutációk
APC (>90%), MYH (kb. 5%)
MLH1 55-60% MSH2 35-40% MSH6, PMS2, PMS1 kb. 1-1%
SMAD4, BMPR1A, PTEN
>2 Peutz-Jeghers polyp a gastrointestinalis traktusban, periorális pigmentáció
LKB1
Ezekben az öröklődő és familiáris CRC-szindrómákban a genetikai változások proto-onkogéneket és tumorszuppresszor géneket egyaránt érintenek, amelyek involválódnak a daganatfejlődés összetett folyamatába.
19
A vastag- és végbélrák kialakulásának legfontosabb molekuláris elmélete az adenoma – dysplasia – carcinoma szekvencia modell (48), ez azt a folyamatot jelenti, amelynek során az adenomából (a dysplasia különböző fokozatain keresztül) in situ carcinoma, majd pedig invazív tumor alakul ki. A normál vastagbélnyálkahártya környezeti mutagének hatására és az életkor előrehaladtával
szaporodó
promoter
metiláció
következtében
hiperproliferatív
nyálkahártyává alakul. Ezekben, a karcinogén hatásokra fokozottan érzékennyé váló, osztódó sejtcsoportokban további mutációk (az APC gén mutációja) hatására enyhe dysplasiát mutató, 1 cm-nél kisebb, tubuláris adenoma jöhet létre (49). A carcinogenezisben többféle jelátviteli folyamat is szerepet játszik. A Wnt-útvonalhoz tartozó APC gén mutációja a colorectális carcinogenezis egyik legkorábbi molekuláris eseménye, amely a sporadikus vastag- és végbéldaganatok 75-80%-ára jellemző (50). Az APC gén mutációja esetén a β-catenin fehérje degradációja nem történik meg, nem tudja megkötni azt az APC fehérje, így a felhalmozódott β-catenin a sejtmagba kerülve a TCF-4-hez (T-sejt faktor) kötődik. Ez a komplex transzkripciós faktorok segítségével különböző onkogéneket aktivál (pl.: C-MYC, JUN, FOS, CYCLIN D1, TCF/LEF, az antiapoptotikus survivin), amelyek serkentik a proliferációt, a dedifferenciációt és gátolják az apoptózist (51). Klasszikus esetben az APC mutációja korai esemény, ami már a kis adenomákban is kimutatható, ezt követi további gének változása. A colorectális carcinogenezis korai szakaszában a ciklooxigenáz-2 (COX-2) génnek is szerepe lehet. Erre utal, hogy a vastagbélrákok 85%-ában COX-2 túlműködést mutattak ki az ép nyálkahártyához képest, és ez az expressziós változás már az adenomák egy részében (50%-ában) is jelentkezett (52). Az enyhén dysplastikus adenomából 1-2 cm-es tubulovillózus, közepesen dysplastikus adenoma alakul ki. E folyamatban fontos szerepet tulajdonítanak a K-RAS proto-onkogén mutációinak, amelyek fokozzák a géntermék aktivitását és a vastagbélrákok mintegy 40-50%-ában fordulnak elő (53, 54). A következő lépésben, a 2 cm-nél nagyobb villózus, súlyosan dysplastikus adenoma kialakulásában a 18. kromoszóma hosszú karján lévő gének allélvesztése (LOH) játszik szerepet a vastagbélrákok 70%-ában. A DCC (deleted in colon carcinoma) tumorszuppresszor gén deléciója legkorábban súlyos dysplasiában mutatható ki. Szintén ebben a kromoszóma régióban helyezkedik el további két tumorszuppresszor gén, a SMAD2 és a
20
SMAD4/DPC4. Mindkét gén által kódolt fehérje a TGF-β jelátviteli úthoz tartozik (55), amely számos sejtélettani folyamatot (sejtosztódás, apoptózis, sejtdifferenciáció) szabályoz. A SMAD2 és a SMAD4 mutációit is azonosították többféle humán daganatban, többek között megtalálhatóak vastag- és végbélrákban, illetve colorectális sejtvonalakban (56, 57). Ezekkel a folyamatokkal együtt további genetikai változások is végbemennek, ilyen például a sejtciklust reguláló p53, az apoptózisban szerepet játszó BAX, BCL2, FAS, a telomeráz gének mutációi és egyéb epigenetikus eltérések (58, 59). Ezen lépések közben a kromoszóma instabillá válik. A kromoszómainstabilitás (CIN) számeltéréseket, kariotípus heterogenitást jelent. Lényege, hogy egyes kromoszóma részletek, vagy teljes kromoszómák elveszhetnek, illetve többletként jelentkezhetnek. Ezek a kromoszómális eltérések már a praemalignus léziókban is kimutathatóak (60). Ez a jellemző út a sporadikus rákok 80-85 %-ában (2. ábra).
2. ábra A CRC kialakulásának klasszikus mechanizmusa. Az APC mutációja alapvető lépése az adenoma – carcinoma átalakulásnak. Az APC mutációja esetén a βcatenin fehérje degradációja nem történik meg, így számos proto-onkogén aktiválódik, és elindítják a malignus transzformációt.
A másik alapvető útja a vastagbélrák kialakulásának az, amikor normál kariotípus mellett genetikai instabilitás alakul ki a mikroszatellita lokuszban, mert a DNS mismatch repair (MMR) gének nem működnek vagy csökkent aktivitásúak. A mikroszatelliták normál állapotban stabilan öröklődnek, azonban nagymértékben instabillá válhatnak az MMR gének hiánya esetében. HNPCC-kban ez a változás a
21
csírasejteket érinti. Amennyiben szomatikus sejtekben alakul ki a DNS repair enzimek zavara, ez mikroszatellita instabilitást (MSI) okozhat. Ez a mutáció figyelhető meg a sporadikus colorectális carcinomák közel 15%-ában (61). Az MMR inaktiválódását, expressziójának változását nemcsak a gének pontmutációi, hanem MSI, ill. epigenetikus mechanizmusok, például hipermetiláció is okozhatja. Az MSI során a DNS rövid repetitív szekvenciáinak a mutációja figyelhető meg. Az MMR gének mutációja számos genetikai változást indít el. Az előzőekben említett APC, β-katenin, hMSH3, hMSH6, TCF4, C-MYC kaszkádban résztvevő géneken, faktorokon kívül a TGF-β és az apoptózis regulátor, BAX gének is károsodnak. Ezeken keresztül az apoptózis ill. a proliferáció szabályozásának zavara alakul ki. Így (MSI-útvonal) alakul ki a sporadikus vastag- és végbéldaganatok 15%-a (3. ábra). Ezek a tumorok gyakrabban jelentkeznek idősebb korban, proximális lokalizációjúak, diploidok, differenciálatlanabbak.
3. ábra A CRC kialakulásának egy másik lehetséges mechanizmusa: az MSI-útvonal. Az MMR gének mutációja számos következményes genetikai változást indít el, amelynek során bekövetkezik az adenoma – carcinoma átalakulás.
További klasszikus genetikai eltérések ismertek a colorectális rákokban, mint például a p53 tumorszuppresszor gén mutációja. A p53 a humán daganatokban leggyakrabban károsodott gén (62), amely mutációja 70%-os gyakorisággal következik be az adenoma-carcinoma szekvenciában, közvetlenül az invazív növekedési fázis előtt. A p53 gén terméke egy DNS-kötő fehérje, amely transzkripciós faktorként számos gén
22
expresszióját szabályozza. A p53 fehérje indukál géneket, amelyek aktiválhatják az apoptózist (BAX, PIDD, NOXA, PUMA), valamint szerepet játszanak a túlélési szignál gátlásában (IGFBP3, PTEN). Fontos szerepe van sejtciklus megállításában és a DNSjavításban (CDKI1A, p53-indukált ribonukleotid-reduktáz, B-sejt transzlokációs gén 2, GADD45 gének által) Szerepet játszik az angiogenezis és a daganatos invázió folyamatában (trombospondin-1, GD-AIF, MMP2, maspin géneken keresztül). A saját hatását is képes befolyásolni különböző gének (MDM2, CYCLIN G1, tumor protein 73, tumor protein 63) aktivitásának a szabályozásával (63, 64). A p53 fehérjét a ”genom őrének” is nevezik, mivel a sejtciklus G1 és G2 fázis közötti ellenőrzési pont (restrikciós pont) fehérjéjeként blokkolja a sejtproliferációt DNS-károsodás esetén, és aktiválni képes a DNS-javító mechanizmusokat, illetve a programozott sejthalált, ha a javítás nem megfelelő (65). A p53 elvesztése, illetve mutáció miatti funkcióvesztése miatt lehetetlenné válik a sejtciklus megállítása, ez növeli a mutációs gyakoriságot, valamint a genomiális instabilitást. Az in situ carcinoma állapotot a valódi invázió követi (invazív rák), ennek jele a lamina basalis mucosae áttörése (66, 67). Sporadikus rákok esetén, a DNS metiláció megváltozásának is kiemelkedő szerepe van. A DNS-metil-transzferáz enzim minden egyes egyénben egy jellegzetes metiláltsági állapotot alakít ki. Sporadikus rákokban a hipermetiláció tehető felelőssé döntő
többségben
a
MMR
gének
inaktivációjáért,
de
egyéb,
a
sejtciklus
szabályozásában fontos, illetve az APC gén hipermetilációját is igazolták. A sporadikus tumorok 10-30 %-ában mutatható ki valamilyen gén hipermetilációja (68). Az előbbiekben említett lehetőségeken kívül egyéb változások is carcinoma keletkezését indukálhatják. Colitis ulcerosa esetében a krónikusan fennálló gyulladás lehet a feltételezett mechanizmus. A hosszú évekig fennálló krónikus gyulladás a bélhám integritásának károsodását eredményezi. A fekélyes vastagbélgyulladásban az adenoma stádium hiányzik, az APC, K-RAS mutációk ritkábban fordul elő. A sporadikus rákokhoz képest a p53 mutáció korábban észlelhető, már a morfológiailag épnek tűnő nyálkahártyában igazolható. A bélben jelen lévő karcinogénekkel együttesen p53 mutációt, aneuploidiát okoznak. Majd a carcinoma kialakulását ezekben az esetekben dysplasia előzi meg (69, 70).
23
3.2.3. A melanóma patogenezisében szerepet játszó tényezők A melanóma keletkezésének okairól nagyon keveset tudunk, a genetikai tényezők szerepe a melanóma kialakulásában nem egyértelműen bizonyított, de tény, hogy a melanóma viszonylag gyakori (10-15%) az öröklött dysplasiás naevus szindróma tünetit mutató családok körében (71). A családi halmozódás esetén (ilyenkor beszélhetünk familiáris melanóma szindrómáról) sikerült a genetikai konstellációt is megtalálni, a betegek 92%-ában a 9p21 kromoszómán található p16INK4A gén (ciklin-dependens kináz inhibitor 2, CDKI2) mutációja áll a halmozódás hátterében (72, 73). Sporadikus esetekben csak mindössze 10%-ban sikerült ezt a mutációt kimutatni. A mutáció következtében eltolódik az olvasási keret (frame-shift mutáció), a transzkripció során így két hibás fehérje jön létre: a p16INK4A és a p14ARF. Mindkét fehérje a sejtciklus szabályozásában játszik fontos szerepet. Még két gén mutációja tűnik fontosnak: az egyik a CDK4, amely kis részében a familiáris melanómákban megtalálható, de ennél sokkal fontosabb a BRAF gén mutációja, amely a melanómák 60-70%-ában és a melanocytás naevusokban is kimutatható (74-76). A BRAF mutációja azonban önmagában valószínűleg nem elegendő a malignus transzformációhoz, hiszen a naevusban is kimutatható. A melanoma malignum a melanocytákból kiinduló rosszindulatú daganat. A malignus transzformáció következtében többnyire a bőrön alakul ki az elváltozás, de előfordulhat a nyálkahártyán, a conjunktíván, vagy az uveán is. Több mint 50%-ban az ép bőrön jelentkezik, körülbelül 10-15%-ban lentigo maligna, 30%-ban naevussejtes naevus és viszonylag kis százalékban kék naevus lehet a kiindulási alap (77). A melanóma malignum általában sötétbarna, barnásfekete színű, de lehet amelanotikus is. Általában aszimmetrikus, széle és színe egyenleten, az elváltozás kiemelkedik, és élesen elhatárolódik környezetétől. A daganat kialakulása során az alábbi öt, morfológiailag és biológiailag jól elkülönülő fázis különböztethető meg: 1.) születéskor már meglévő vagy később kialakult szabályos (típusos) szerkezetű naevus, 2.) morfológiailag atípiát mutató ún. diszplasztikus naevus, 3.) radiális-növekedési irányú (radial growth phase: RGP), 4.) vertikális-növekedési irányú (vertical growth phase: VGP), 5.) metasztatikus melanóma. Az első szakaszban a melanocyták exogén és endogén indukciós hatásra malignusan
24
átalakulnak. A következő szakaszban a tumorsejtek elkezdenek növekedni, terjedni az epidermisz síkjában, ez a RGP. Ez a folyamat hosszú évekig eltarthat, akár észrevétlenül is fennállhat. Ekkor még általában nem alakulnak ki áttétek, a sebészi excízió is gyógyulást eredményezhet. Később azonban a tumorsejtek függőleges irányban is terjednek, ez a VGP. Ekkor már a melanómasejtek beszűrték a környezetet, mikrometasztázisok alakultak ki, illetve bejutottak a nyirok- és véráramba. A jelenlegi módszerek többnyire már nem eredményeznek gyógyulást a betegségnek e szakaszában. A következő fázis az eredeti daganat mellett, de azzal össze nem függő tumorgöbök, a szatelliták megjelenése. Ez a jelenség a metasztáziskészség bizonyítéka. A betegek halálát általában a gyorsan kialakuló, agresszívan terjedő távoli metasztázisok okozzák, amelyek testszerte bárhol kialakulhatnak, de leggyakrabban a tüdőben, a májban, az agyban és a csontokban jönnek létre (77).
3.3.
A vastag- és végbélrák, illetve a melanóma génexpressziós vizsgálatainak áttekintése
3.3.1. Microarray: a nagyfelbontású génexpressziós vizsgálati módszer Az elmúlt évtizedben tért hódított microarray technikákkal lehetővé vált nagyszámú gén expressziójának összehasonlítása különböző sejtekben, szövetekben, ugyanazon típusú sejtek vagy szövetek eltérő állapotaiban. A tumorok kialakulásának hátterében álló összetett genetikai mechanizmusok feltárása jelenleg is intenzív kutatások tárgya. Az mRNS expressziós microarray-k lehetőséget nyújtanak a tumorgenom genetikai eltéréseinek és a gének expressziós mintázatának átfogó analízisére, új, eddig ismeretlen betegségspecifikus genetikai alterációk azonosítására. Ezek az eltérések azokra a kromoszómális régiókra, génekre hívják fel a figyelmet, melyek eltérései specifikusak lehetnek egy adott daganat típusra, továbbá a tumor progresszió meghatározott stádiumára. Az mRNS expressziós microarray technika lényege az, hogy a vizsgálatban szereplő génekkel komplementer, úgynevezett target oligonukleotidokat szilárd hordozóhoz kötik, ezek a próbák. Ezekhez hibridizáltatják például az adott sejttípusból származó RNS-ről készített jelölt egyszálú cDNS vagy cRNS molekulákat. A hibridizáció
25
mértékéből következtetnek a vizsgált gének expressziós szintjére. A nagyszámú gén kifejeződésének gyors vizsgálata útján szerzett óriási tömegű információ lehetőséget nyújt arra, hogy a microarray-k segítségével újabb és újabb diagnosztikai és terápiás célpontokat térképezzünk fel. Az expressziós microarray technika egyik problémája, hogy szemikvantitatív. A microarray-re rögzített target szekvenciák megválasztása, és a hibridizáció körülményei egyaránt befolyásolják azt, hogy az adott microarray rendszerrel milyen pontossággal lehet egy adott génexpressziós változást detektálni. A fenti okok miatt, annak megerősítésére, hogy a chipen kapott jelintenzitás valóban korrelál-e a gén expressziós szintjével, független vizsgálati módszert kell alkalmaznunk. A leginkább elfogadott validáló módszer a microarray vizsgálat során alul-, illetve túlexpresszáltnak mutatkozó, a statisztikai szűrés során fennakadó gének real-time (valósidejű) PCR-rel történő megerősítése. 3.3.2. Irodalmi áttekintés a vastag- és végbéldaganatok microarray vizsgálatairól A vastagbélrák nagyfokú heterogenitása, magas incidenciája és korai diagnózisának nehézségei miatt szükségessé vált a betegség fenotípusára utaló, mRNS szinten bekövetkező
változások
nagy
teljesítményű
monitorozása.
A
vastagbélrák
génexpressziós microarray vizsgálatának viszonylag kiterjedt irodalma van, azonban a kutatócsoportok által használt mintakezelési eljárások, microarray rendszerek, jelölési és hibridizációs technikák és elemzési módszerek nagy különbségeket mutatnak. Mindez megnehezíti az eddigi eredmények komplex megjelenítését (78). A génexpressziós profil vizsgálata sok, a tumorok progresszióját vizsgáló kérdésben segítségünkre lehet. Régi vita az irodalomban, hogy a tumorok progressziója, illetve áttétképzése milyen genetikai feltételek között zajlik. Az egyik tábor azt állítja, hogy a primer tumor reprezentatív kolóniáiból keletkeznek a szervi áttétek, így annak pontos genetikai jellemzése egyértelműen megjósolja az áttét genetikai képét is, míg a kevésbé optimista tábor azt állítja, hogy a genetikai instabilitás talaján olyan fokú lehet a klonális heterogenitás, hogy az áttétek alig hasonlítanak a primer tumorra, így annak jellemzői nem használhatók fel az áttétek biológiai jellemzésére. Nagyobb számú CRC primer tumor, máj- és tüdőáttét szövetének genetikai analízise alapján bizton állítható,
26
hogy a második modell a valószínűbb. Részletes kromoszómális és CGH vizsgálatok azt igazolták, hogy egyre több genetikai és kromoszómális hiba halmozódik fel a primer tumor – nyirokcsomóáttét – szervi áttét szekvencia során (79). Ugyanakkor a máj- vagy tüdőbeli CRC áttét genetikai profilja is eltért egymástól, más kromoszómális hibákkal voltak jellemezhetőek. Ennek a megfigyelésnek a következményei egyelőre még beláthatatlanok, de azt vetítik előre, hogy kezelés előtt, különösen célzott terápia esetében, az áttéti szövet ismételt vizsgálata válhat szükségessé. A vastagbélrák kialakulásának génexpressziós hátterét, az adenoma – dysplasia – carcinoma átalakulást is vizsgálták már microarray technológia segítségével. Nosho és munkatársai az adenoma-carcinoma átmenettel összefüggő releváns génexpressziós eltéréseket (többek között emelkedett IGF2, Ki-67 expressziót és csökkent p21, HSP90, kaszpáz-7 expressziót) azonosítottak lokálisan malignus transzformációt mutató adenomás esetek cDNS microarray (550 target szekvencia) vizsgálatával (80). Ugyanez a kutatócsoport, szintén a fenti kis denzitású cDNS microarray-vel műtétileg eltávolított colorectális adenoma és invazív carcinoma között szignifikáns TIMP-1, EGFR-1, c-jun expresszió növekedést, illetve csökkent glutation-S-transzferáz, mucin-2 expressziót tapasztalt (81). Agrawal és munkatársai közepes oligonukleotid microarray (12000 target
szekvencia)
vizsgálattal
107
fokozódó
vagy
csökkenő
expressziójú
transzkriptumot azonosított a korai adenoma - késői CRC - áttétes CRC szekvencia előrehaladtával (82). A témában legszéleskörűbb vizsgálatot van der Flier és munkatársai végezték: adenomás biopsziás mintákon, teljes genom oligonukleotid microarray rendszerrel végzett vizsgálataikkal elsősorban a Wnt/TCF jelátviteli út expressziós változásait térképezték fel az adenoma-carcinoma átmenet során (83). Gyulladásos bélbetegségek expressziós chip elemzéséből meghatározták az IBD-s betegek nyálkahártya mintáinak az ép, kontrollhoz viszonyított teljes (globális) génexpressziós profilját (84). A mintázatot a colitis ulcerosára és/vagy a Crohnbetegségre hajlamosító genetikai állapot lehetséges új markereinek azonosítására (85, 86), az IBD-asszociált carcinogenezis markergénjeinek felderítésére (87), egy teljes kemokin család expressziójának IBD-s és ép minták közötti összehasonlítására (88), valamint IBD-s betegekben a perifériás vér mononukleáris sejtjeiben fellépő génexpressziós változások kimutatására használták fel (89).
27
3.3.3. Génexpressziós vizsgálatok a melanóma-kutatásban A
melanómák
microarray-alapú
vizsgálatai
eddig
elsősorban
melanóma
metasztázisokra és melanóma-sejtvonalakra korlátozódtak (90-95). Számos átfogó tanulmány
született
melanóma-sejtvonalak
és
primer
sejtkultúrák
microarray
eredményeiből (96), ugyanakkor egy in vitro rendszer kísérletes eredményeinek extrapolálása in vivo rendszerré nem könnyű feladat. A tumorszövet sejtjeinek háromdimenziós
térben
történő
kommunikációja
mellett
számolnunk
kell
a
daganatsejtek és a stróma, valamint a gazdaszövet sejtjeinek interakciójával is. Ezek a kapcsolatok, legyen szó akár autokrin, parakrin szabályozási folyamatokról másodlagos hírvivő molekulák és jelátviteli útvonalak részvételével, illetve sejt-sejt, valamint sejtmátrix adhéziós molekulák fizikai interakciójáról, szervesen befolyásolják a melanóma génexpressziós mintázatát, hatással vannak a tumorsejtek viselkedésére. A melanóma minták expressziós analízisét megnehezíti az egységes kontroll minta hiánya. A közlemények egy részében naevus mintát (97), mások a tumor minták RNS elegyét használják viszonyítási alapként (98, 99). A primer melanóma biopsziákon eddig elvégzett expressziós analízisekben kimutatott progresszióval összefüggő génexpressziós változások nem fednek át egymással. Az adatok összehasonlíthatóságát megnehezíti az eltérő kontroll minták használatán kívül, a különböző array platform és bioinformatikai rendszerek alkalmazása is. Nehézséget jelent még a fentieken kívül, hogy az egyes tanulmányokban eltérő vastagsági kategóriákat alkalmaztak. Az expressziós eredmények heterogenitását jelzi, hogy a 2000-ben elsőnek közölt, melanóma biopsziákon elvégzett microarray tanulmányban egyik klinikai paraméterhez sem tudták társítani a szignifikáns mértékű expressziós változásokat (100). Génexpressziós vizsgálatainkhoz a melanóma progressziójában (migráció, ECMremodeling, adhézió, angiogenezis) fontos szerepet játszó molekulákat választottunk ki irodalmi adatok alapján. A melanómasejtek sokféle mátrix metalloproteinázt expresszálnak. Az aktív MMP-2 és MMP-3 enzimek szintje korrelációt mutat a metasztatikus képesség növekedésével (101, 102), illetve az MMP-2 gén hiányában csökken az áttétek száma (103). A mátrix metalloproteinázok szabályozásában fontos szerepet játszanak a szöveti gátló faktorok (tissue inhibitor of mátrix metalloproteinases, TIMP), a membránhoz kötött MMP-k (membrane-type mátrix metalloproteinase, MT-
28
MMP), citokinek (IL-8, IL-1β, TNF-α) és adhéziós molekulák (CD44, integrin αvβ3 és α2β1). Az MMP-1, MMP-2, MMP-13 és MT1-MMP enzimek egymás hatásának erősítésén keresztül beindítják a proteolítikus kaszkádot, amely végül a tumorsejtek inváziójához vezet (104). A melanómasejtek számos adhéziós molekulát is expresszálnak, amelyek nélkülözhetetlenek a tumorsejtek növekedése és inváziója során. A CD44 egy sejtfelszíni kondroitin-szulfát proteoglikán. Több tanulmány megállapította, hogy a CD44H és a CD44 splice-változatai fontos szerepet játszanak a melanóma progressziójában (105-107). A CD44 szerepet játszik az MMP-2 (108) és az MMP-9 (109) enzimek szabályozásában is. Az intercellular adhesion molecule-1 (CD54, ICAM1) homophil és heterophil kapcsolatot egyaránt ki tud alakítani a tumorsejtek és a stróma elemei között. Az ICAM-1 korrelál a nagyobb metasztatikus képességgel: a tumorsejtek kapcsolódnak a lymphocytákkal a lymphocyte function-associated molecule-1 (LFA-1) és az ICAM-1 adhéziós molekulán keresztül, így a létrejövő új kötődés csökkenti a melanómasejtek egymással kialakított kapcsolatait (a tumorsejt leválik a primer tumorról) (110). A neural cell adhesion molecule-1 (CD56, NCAM-1) az immunglobulinok családjába tartozó adhéziós molekula (111), mely Ca2+ independens homophil sejt-sejt közötti kapcsolat kialakításáért felelős. Fontos szerepet játszik a sejtek migrációjában (112). A migráció és metasztázis képzés fontos mozzanata a kemotaktikus (migrációt befolyásoló) citokinek, a kemokinek expressziója a tumorsejtek és a strómális sejtek által. Az elmúlt években született tanulmányok rávilágítanak, hogy a CXCR-4 kemokin receptor és ligandja, a CXCL-12 (stromal cell-derived factor-1, SDF-1) kiemelkedő szerepet játszik a melanóma adhéziójában, migrációjában és aktivációjában (113-115). A tumorsejtek disszeminációját és túlélését meghatározza az angiogenetikus molekulák expressziója. A melanómasejtek jelentős mennyiségű VEGF növekedési faktort termelnek (116). A VEGF-C egy lymphangiogenetikus képességgel is rendelkező faktor, amelynek expressziója szignifikánsan korrelál a tumorba benövő nyirokerek mennyiségével és a melanóma megnövekedett regionális nyirokcsomó áttéteivel (117).
29
3.4.
A tumor és a stróma interakciójának egy aspektusa: az elasztin fehérje és a melanóma kapcsolata
Az elmúlt évek kutatásai irányították rá a figyelmet a daganatot körülvevő szöveti elemekre. A daganatok szerkezetileg daganatsejtekből (parenchyma) és nem daganatos elemekből (stróma) állnak. A melanóma progressziójának molekuláris szintű megismerése nyilvánvalóvá tette, hogy a betegség minden szakaszában kiemelkedő jelentőségű a tumorsejtek és a stróma kapcsolata. A metasztatikus kaszkád minden lépésében szerepet kapnak a stróma elemei (118). A sejtközötti állomány (extracelluláris mátrix, ECM) fő alkotóelemei a kötőszöveti rostok és az amorf alapállomány. Rostokból alapvetően négy altípust különíthetünk el: kollagén-, elasztikus, rács- és fibrillin rostokat. Ezek az ún. amorf alapállományba ágyazódnak, amelynek alapvázát hialuronsav-láncok és az ehhez asszociálódó proteoglikánok (ECMmolekulák) alkotják. Az ECM-ben sejtek helyezkednek el, amelyek lehetnek fix és mobilis kötőszöveti sejtek, ezek felelősek a rostok és a makromolekulák állandó szintéziséért. A strómában számos szabályozó molekula is megtalálható szolubilis vagy kötött formában, különböző molekulákhoz kihorgonyozva (növekedési faktorok, citokinek, kemokinek, adhéziós molekulák és számos enzim). A stróma elemei által közvetített hatások alapvetően meghatározzák a tumor progresszióját (119-121). A stróma nem csak passzív, támasztó funkcióval rendelkezik, hanem közvetlen és közvetett hatásokkal aktív módon befolyásolja a tumor lokális növekedését, migrációját, invázióját, az angiogenezist, az intravazációt, a tumorsejtek túlélését és megtapadást egy másik szervben. A funkcionális kapcsolat sejt-sejt és sejt-ECM kölcsönhatások útján valósul meg. A strómában tárolt és onnét felszabaduló citokinek, kemokinek és növekedési
faktorok
autokrin
és
parakrin
hatásmechanizmussal
serkentik
a
melanómasejtek proliferációját, növelik az inváziós potenciálját. Fontos szerepet játszanak a kölcsönhatásban a melanómasejtek által termelt, strómális elemekre ható növekedési faktorok: bFGF, PDGF, VEGF és a TGF-β. A tumorsejtek átrendezik a strómát a saját igényeiknek megfelelően (ECM remodelling). A tumorsejtek és a strómális sejtek által termelt, illetve a strómában raktározott faktorok között vannak, amelyek gátló hatást fejtenek ki a melanóma növekedésére (interleukin-1, TGF-β, TNFα), de csak a korai stádiumban (122-125).
30
Az elmúlt évtized vizsgálatainak eredményeiből kiderül, hogy nemcsak a stróma sejtjei és az ott tárolt citokinek, kemokinek és növekedési faktorok befolyásolják a tumorsejtek proliferációját, invázióját és a metasztázis képzést, hanem az ECM fehérjéi és proteoglikánjai is. A bőr az egyik elasztinban leggazdagabb szervünk. A melanómás betegek metszeteit vizsgálva megállapítható, hogy jelentős elasztolízis (elasztin hasítás) megy végbe a tumor inváziós zónájának közelében. Ez a két megfigyelés okkal irányította a figyelmet az elasztin szerepére a melanóma progressziójában. Sandberg és munkatársai 1981-ben rátaláltak a humán elasztinban többször ismétlődő VGVAPG aminosav szekvenciára (126). Ezt követően több sejttípuson (monocyta, fibroblast, tumorsejtek) vizsgálták az elasztin és az elasztin eredetű VGVAPG peptid hatásait. Azt tapasztalták, hogy a peptid kemotaktikus hatású (pozitív hatást fejt ki a sejtek migrációjára) (127) és elősegíti a vizsgált sejtek adhézióját (128-130). Több munkacsoport vizsgálta az elasztin fehérje kötődését a sejtek felszínéhez, és a nyolcvanas évek végén egymástól függetlenül identifikálták a 67 kDa molekulatömegű elastin-binding protein (EBP, S-gal) receptort (131-133). Az elasztin kötődését vizsgálva megállapították, hogy nagy affinitással és gyorsan képes kötődni receptorához és az EBP receptor magasabb expressziója több tumorban korrelál a nagyobb inváziós és metasztatizáló képességgel (134). Később a jelátviteli utak feltérképezésekor megállapították, hogy az elasztin fehérje és a degradációs peptidek proliferációra és migrációra kifejtett pozitív hatásai G-protein mediált útvonalon (foszfolipáz C és protein kináz C) valósulnak meg (135). Feinmasser és munkatársai megállapították, hogy a nagyobb mennyiségű elasztin korrelál a melanóma rosszabb prognózisával (136). Az elasztin eredetű peptidek növelték
az
MMP-1
és
MMP-2
enzimek
aktivitását
és
expresszióját
a
melanómasejtekben az EBP receptoron keresztül (137). Hasonló hatást figyeltek meg a fibroblastok esetében is: a peptidek növelték az MMP-1 és MMP-3 expresszióját (138). Az elasztin eredetű peptidek növelték az endothelsejtek migrációját és a tubulogenezist, ezáltal
serkenthetik
az
érinváziót
a
tumorokban
(139).
Az
eredményekből
megállapíthatjuk, hogy az elasztin fehérje és a degradációja során felszabaduló peptidek fontos amplifikációs mechanizmust indítanak el, ami a melanómasejtek metasztatikus potenciáljának növekedéséhez vezet (140, 141).
31
4.
CÉLKITŰZÉSEINK Két fő irány mentén terveztük meg kísérleteinket: egyrészt vizsgálataink során a
vastag- és végbéldaganat keletkezésének a patomechanizmusát, illetve új prognosztikai, diagnosztikai markereket kerestünk, másrészt a tumorok áttétképző képességének, a tumor és a stróma kölcsönhatásának a hátterében lévő genomikai tényezők vizsgálatához
eltérő
invazivitású
melanóma-sejtvonalakon
végeztünk
in
vitro
vizsgálatokat. 1. Vastagbél tumoros betegek műtéti resecatumából származó szövetek expressziós mintázatát vizsgáltuk génexpressziós microarray mérések felhasználásával. Kísérleteink során a következő szempontok megválaszolására helyeztük a hangsúlyt: •
különböző
bioinformatikai
módszerek
segítségével
olyan
gének,
géncsoportok azonosítása, melyek eltérő expressziót mutatnak a tumoros és a hozzá tartozó nem tumoros szövetek, illetve a nyirokcsomó-áttét negatív és a távoli áttét pozitív stádiumok között, •
a kiválasztott gének expressziójának többszintű validálása,
•
esetleg olyan gének, géncsoportok, biológiai jelátviteli útvonalak felismerése, melyeket eddig a CRC szempontjából még nem vizsgáltak,
•
amennyiben sikerül új géneket, útvonalakat találni, azok in vitro, vastagbéltumor-sejtvonalakon történő validálása,
•
ha lehetséges, funkcionális vizsgálatokkal igazolni hipotézisünket.
2. A tumor-stróma kölcsönhatásának vizsgálatához eltérő invazivitású melanómasejtvonalakon, a következő szempontok alapján terveztük el kísérleteinket: •
elsztin és elasztin-eredetű fragmentumok kimutatása melanómás betegek metszetein hisztokémiai, immunhisztokémiai és elektronmikroszkópos módszerek segítségével,
32
•
elasztin eredetű peptidek és az irodalomból feltételezett három receptor (galektin-3, integrin αvβ3 és elasztin-kötő fehérje vagy EBP) kapcsolatának bizonyítása,
•
elasztin eredetű peptidek hatásának vizsgálata különböző, általunk kiválasztott inváziós markerekre az eltérő invazivitású melanómasejtvonalakon.
33
5.
FELHASZNÁLT ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
5.1.
Betegek és minták
A kuratív célú sebészeti beavatkozás előtt a betegek a Tudományos Kutatásetikai Bizottság által jóváhagyott betegtájékoztatót és beleegyezési nyilatkozatot aláírták, melyben beleegyeztek a mintáik kutatási célú felhasználásába. A microarray vizsgálathoz szigorú feltételek szerint választottuk ki a betegeket: azonos nemű és hasonló korú betegeket kerestünk, akik nem részesültek (különböző indikációk miatt) kemo-, vagy radioterápiában a beavatkozás időpontjában, illetve azt megelőzően. A mintavétel menete az 4. ábrán látható. A mintavételben és a szakszerű tárolásban az Uzsoki Kórház Sebészeti Osztályának munkatársai segítettek.
4. ábra A mintavétel menete. RNS-izolálás céljából RNAlater oldatba, fehérje-izolálás céljából üres eppendorf csőbe és a szövettani, immunhisztokémiai vizsgálatra formalinba helyeztük a mintákat.
A resecátumból kivett tumoros, illetve hozzá tartozó, a műtéti szélről származó nem tumoros nyálkahártyát három részre osztottuk: 1. az RNS-izolálás céljából vett mintákat
34
azonnal
RNAlater
stabilizáló
reagensbe
helyeztük
és
-80°C-on
tároltuk
felhasználásukig, 2. a fehérje szintű vizsgálatra a natív darabot folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, 3. a harmadik részt szövettani diagnosztika és immunhisztokémiai vizsgálatok céljából formalinban fixáltuk. Az 3. táblázatban a vizsgálatokban résztvevő betegek legfontosabb adatait tüntettem fel.
3. Táblázat A vizsgálatokban résztvevő betegek adatai.
Esetszám
Nő/férfi
Életkor
6
0/6
64.1±5
6
0/6
67.4±4
18
9/9
62.8±8
18
9/9
68.8±9
MICROARRAY: nyirokcsomó-áttét negatív távoli áttét pozitív VALIDÁLÁS: nyirokcsomó-áttét negatív távoli áttét pozitív
5.2.
Sejtvonalak tenyésztése, jellemzői
Microarray eredményeink funkcionális validálásához három humán vastagbéltumorsejtvonalat használtunk: HCT-116 (carcinoma), HT-29 (adenocarcinoma) és WiDr (adenocarcinoma). A sejteket 2mM Glutamine + 1% Non Essential Amino Acids (NEAA) + 10% Foetal Calf Serum (FCS) + 0.6 g/l gentamicint tartalmazó EMEM-ban (Eagle's Minimum Essential Medium) tenyésztettük inkubátorban (37ºC, 5% CO2). A tumor-stróma interakciójának modellkísérletéhez két eltérő invazivitású humán melanóma-sejtvonalon végeztük kísérleteinket: a primer tumorból származó WM35 és a nagy májáttétképző képességre szelektált HT168 variánson, a HT168-M1-en. A sejteket 2mM Glutamine + 1% Non Essential Amino Acids (NEAA) + 10% Foetal Calf Serum (FCS) + 0.6 g/l gentamicint tartalmazó RPMI-1640 médiumban tenyésztettük inkubátorban (37ºC, 5% CO2). A sejteket addig tenyésztettük, amíg nem nőtték be a tenyésztőaljzat 80-90%-át.
35
5.3.
Peptid-szintézis és peptid-kezelések
A peptideket az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportja szintetizálta Dr. Süliné Vargha Helga vezetésével. Kilencféle peptidet szintetizáltak: a két alap peptidet (VGVAPG és VAPG), az ezekhez tartozó kevert peptideket (VPVGGA és PGVA ”scrambled peptidek”: ellenőrzésként használjuk, ugyanazokat az aminosavakat tartalmazzák, de élettani hatást nem tulajdonítunk ezeknek a peptideknek), illetve ezeknek az 5-carboxi-fluorescein-nel jelölt változatát és az EBP-receptor blokkolásához a V14 (H-VVGSPSAQDEASPL-OH) peptidet. Liofilizálás előtt a peptidek tisztaságát ellenőrizték és meghatározták a molekulatömegüket. A tumor és a stróma interakcióját az 5. ábrán látható kísérleti elrendezés szerint vizsgálatuk.
5. ábra A tumor-stróma interakció vizsgálata: az elasztin eredetű peptiddel történő kezelés menete.
Minden kísérletnél előkezelést alkalmaztunk funkcionális gátlószerekkel: anti-galektin3 (Millipore, Billerica, MA) és anti-integrin αvβ3 (Millipore), illetve az EBP receptor blokkolásához V14 blokkoló peptiddel 1 órán keresztül (37ºC, 5% CO2). A gátlószereket minden kombinációban (7-féle lehetőség) alkalmaztuk minden kísérletnél: önmagukban, párban és mindhárom együtt. Az ábrákon mindig csak a legnagyobb
36
gátlást elérő kombinációt tüntettük fel. Mindegyik blokkolás hatásos koncentrációját előzetesen meghatároztuk a receptor-kötődési kísérlet során (lsd. 6.2.2.), az antitesteket 5 μg/ml, a V14 peptidet 100 μg/ml végkoncentrációban alkalmaztuk. Ezt követően kezeltük a sejteket a VGVAPG és VAPG peptidekkel, illetve a scrambled peptidekkel. Intracelluláris jelölés előtt, a szekréció-gátlást alkalmaztunk 8 μg/ml Brefeldin A (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO) kezeléssel.
5.4.
RNS szeparálás, koncentrációmérés és minőségellenőrzés
Az RNS-t a szövetekből és a sejtvonalakból RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) szeparáló oszlopok felhasználásával izoláltuk a gyártó utasításai szerint. A kinyert RNS koncentrációját NanoDrop ND-1000 spektrofotométerrel (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) mértük meg, minőségét Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) készülék segítségével határoztuk meg. A továbbiakban csak azokat a mintákat használtuk fel a különböző microarray, valamint valós idejű PCR mérésekhez, melyek RNS integritás száma meghaladta a 8.0-ás értéket, tiszta gélszerű képet mutattak, nem tartalmaztak DNS kontaminációt, valamint a NanoDrop készüléken mért 260/280 és a 260/230 arányuk nagyobb volt, mint 1.8.
5.5.
Génexpressziós microarray mérés
A génexpressziós microarray vizsgálatunkhoz Agilent Whole Human Genome Oligo Microarray 4x44K (Agilent Technologies) lemezeket használtunk. Vastagbél tumoros betegek szöveteiből származó, 1000-1000 ng minőségellenőrzött RNS-ből reverz transzkripcióval, Low-input RNA Linear Amplification Kit (Agilent Technologies) felhasználásával cDNS-t szintetizáltunk olyan oligo-dT primerek alkalmazásával, amelyek a T7 RNS polimeráz enzim promoter szekvenciáját tartalmazták. Ezután egy in vitro transzkripciós reakcióban a T7 RNS polimerázzal a cDNS molekulákról Cy3, illetve Cy5 fluoreszcens molekulákkal jelölt cRNS-t készítettünk a gyártó utasításai szerint. Az adott beteg tumoros szövetéből származó RNS mintákat külön-külön Cy5val, a hozzá tartozó nem tumoros nyálkahártyából izolált RNS-t pedig Cy3-vel jelöltük és a továbbiakban kontrollként használtuk. A jelölt cRNS-t tisztítottuk (RNeasy Mini
37
kit, Qiagen), és ezután NanoDrop ND-1000 spektrofotométer készüléken (NanoDrop Technologies) megmértük a festék beépülésének a hatékonyságát, valamint a tisztított cRNS koncentrációját. Azokkal a mintákkal dolgoztunk csak tovább, amelyeknél a festékbeépülési hatékonyság elérte a 9.0 pmol festék / μg cRNS értéket. Ezt követően 825 ng Cy3, illetve Cy5-val jelölt cRNS-t összekevertünk a hibridizációs reakcióhoz szükséges Agilent Gene Expression Hybridization Kit (Agilent Technologies) megfelelő komponenseivel, majd kémiai módszerrel fragmentáltuk a jelölt cRNS molekulákat. A fragmentáció megkönnyíti a jelölt cRNS molekuláknak az array felületén található próbákhoz való kötődését. A fragmentációs reakció leállítását követően a mintákat 65oC-on 17 órán keresztül Agilent Whole Human Genome Oligo 4x44K microarray lemezekhez hibridizáltattuk. A hibridizáció során a mintákból származó különböző fluoreszcens jelöléssel rendelkező cRNS molekulák versengenek a microarray felületén lévő, velük komplementer 60 nukleotid hosszúságú próbákhoz való kötődésért. A hibridizáció során kialakult Cy5/Cy3 jelintenzitás arány megmutatja, hogy egy adott transzkriptum az egyes mintákban egymáshoz képest milyen mértékben fejeződött ki. Ezután a lemezeket az ózon biztos módszer szerint mostuk Stabilizing and Drying Solution (Agilent Technologies) oldat felhasználásával, majd Agilent Microarray Scanner segítségével leolvastuk. A műveletek során alkalmazott összes lépés a gyártó utasításainak megfelelően történt (Agilent Technologies, twocolor protocol version 5.6). A leolvasás során nyert TIFF képeket a Feature Extraction software version 7.5 (Agilent Technologies) programmal tömörítettük ki, majd a kapott adatokat a kétszínű oligonukleotid
microarray
formátumokra
javasolt
paraméterek
alkalmazásával
normalizáltuk.
5.6.
A microarray adatok statisztikai és bioinformatikai értékelése
A microarray adatok további bioinformatikai és statisztikai értékelését a GeneSpring GX program (Agilent Technologies) felhasználásával végeztük. A GeneSpring programban a normalizálás és az adatok transzformációja a gyártó által, a kétszínű microarray formátumokra javasolt műveletek és paraméterek szerint történt. A kísérleti értelmezés megadása után az expresszálódó transzkriptumok közül a legalább kétszeres up-, vagy down-regulációt mutató géneket vetettük alá statisztikai elemzésnek a
38
továbbiakban. A nyirokcsomó áttét negatív és a távoli áttét pozitív csoporton belül a kontrollhoz képest eltérő változást mutató gének statisztikai értékelését párosítatlan tpróbával végeztük. Ebben az esetben a kétszínű technológiából következően azt vizsgáljuk, hogy a hibridizáció során kialakult Cy5/Cy3 intenzitás arány (log2-es skálán, ha egyformán expresszálódik az adott gén, akkor a hányados 0) szignifikánsan eltér-e a nullától. Az előnormalizálás során kiszűrtük a háttér alatti jeleket (not above background), csak egy bizonyos pixelintenzitás felett vettük figyelembe a jelet (present or marginal), illetve csak a minimum 2X-es különbséget mutató változásokkal dolgoztunk tovább. Mivel a microarray adatok kiértékelésénél, a statisztikai próbák során nagyszámú gén esetében tesszük fel a nullhipotézist, feltétlenül szükséges korrekciót használni az álpozitív találatok (úgynevezett első fajú hiba) számának a csökkentésére. Ezért az összehasonlítások során a Benjamini-Hochberg többszörös hipotézis korrekciót használtuk minden esetben. A statisztikai összehasonlítások alkalmával a korrigált p értéket 0.05 alatt fogadtuk el szignifikánsnak.
5.7.
Gene Ontology elemzés
A microarray adatértékelés során kapott eredmények alapján a különbözőképpen expresszálódó géneket génontológiai analízisnek vetettük alá. A Gene OntologyTM (GO) konzorcium adatbázisa a géntermékek jellemzésének (úgynevezett GO terminusok, osztályok) ellenőrzött rendszere, melyben tájékoztatást kaphatunk a génekről kifejeződő fehérjék molekuláris funkciójáról, valamint a különböző biológiai folyamatokban való részvételéről. Ezen kívül megtudhatjuk azt is, hogy az adott protein (ha szerkezeti elemről van szó például) milyen celluláris alkotórész kialakításában vesz részt. A GeneSpring program GO elemzés modulja azt vizsgálja, hogy egyes GO terminusok a microarray adatfeldolgozás során kapott génlistán belül milyen gyakorisággal fordulnak elő ahhoz a gyakorisághoz képes, amivel a teljes adathalmazon belül előfordulnak. Szemléletesen: vegyünk egy bizonyos GO osztályt, és nevezzük el „G”-nek. Tegyük fel, hogy van egy olyan microarray adatsorunk, amely „n” gént tartalmaz, ebből „m” gén a „G” GO terminusba sorolható. Ezután az adatfeldolgozás során az „n” génből valamilyen statisztikai próba felhasználásával „x” gént szignifikánsan megváltozott expressziójúnak találtunk. Tegyük fel, hogy ebből az „x” génből „y” a „G” GO
39
terminusba tartozik. A kérdés az, hogy vajon van-e valamilyen feldúsulása „G”-nek, vagyis y/x szignifikánsan nagyobb-e, mint m/n. A GeneSpring program a hipergeometrikus eloszlás alapján p értéket számol az említett szignifikancia kifejezésére. A p érték az adott GO terminus relatív fontosságát (az úgynevezett „enrichment score” értékét) jelzi a kiválasztott génlistán belül az összes gént tartalmazó adatsorhoz képes. Természetesen a többszörös összehasonlítások miatt itt is kellett p érték korrekciót alkalmazni. Az elemzéseink során csak azokkal a GO terminusokkal foglalkoztunk, amelyeknek a Benjamini-Yekutelli módszerrel korrigált p értéke kisebb volt, mint 0,05.
5.8.
Ingenuity útvonalelemzés (Ingenuity Pathway Analysis, IPA) A GeneSpring GX (Agilent Technologies) programból a statisztikailag megszűrt
listát feltöltöttük az Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA) program szerverére, amely a már publikált irodalmi adatok alapján képes feltételezett jelátviteli útvonalak megjelenítésére a bevitt adatok alapján. A programban az elemzést követően több lehetőség közül választhattunk. Ebben a dolgozatban a kanonikus útvonalakat vizsgáltuk. Jól karakterizált biológiai jelátviteli utakra (”cell signaling” és ”metabolic pathways”) vetítjük rá a listánkon szereplő génexpressziós adatokat. A következő kérdésre kerestük a választ: melyik ismert jelátviteli útvonal elemei a leginkább reprezentáltak, relevánsak a listánkon.
5.9.
Reverz transzkripció és a TaqMan valósidejű PCR módszer
1 μg teljes RNS-ből kiindulva reverz transzkripciós reakcióban 1U MuLV reverz transzkriptáz enzim (Applied Biosystems, Foster City,CA), random hexamer primerek (Promega, Madison, WI), ), 5mM MgCl2, 1mM dNTP, valamint RNasin RN-áz gátló (Promega) felhasználásával 40 μl végtérfogatban cDNS-t szintetizáltunk 42 oC-on, 55 percen keresztül. Ezután az MuLV enzimet 5 perc alatt 95oC-on inaktiváltuk. A valósidejű PCR reakciókat ABIPrism 7000 készüléken végeztük a gyártó utasításai szerint
(Applied
Biosystems)
1,5μl
cDNS/well
felhasználásával
25
μl-es
végtérfogatban. A mérések során a humán 18S riboszómális gént használtuk háztartási
40
kontrollnak (housekeeping). A 18S riboszómális génhez normalizált szignálértékeket az összehasonlító Ct (delta CT) módszer felhasználásával határoztuk meg. Minden esetben az Applied Biosystems által előregyártott TaqMan real-time PCR primerekkel dolgoztunk (4. táblázat).
4. Táblázat Az általunk alkalmazott és előregyártott TaqMan real-time PCR primerek. Taq Man Gene Expression Assays Human 18S ribosomal Human activin A Human CD44 Human cFOS Human CXCL1 Human CXCL12 Human CXCR4 Human ICAM1 Human IGF1 Human IGFBP3
Taq Man Gene Expression Assays Human MAPK3 Human MDR1 Human MKP2 Human MMP11 Human MMP2 Human MMP3 Human NCAM1 Human p90 RSK Human PAC1 Human VEGFC
Assay ID Hs99999901_s1 Hs00170103_m1 Hs01075861_m1 Hs00170630_m1 Hs00236937_m1 Hs00171022_m1 Hs00976734_m1 Hs99999152_m1 Hs01547657_m1 Hs00181211_m1
Assay ID Hs00385075_m1 Hs00184500_m1 Hs00154826_m1 Hs00171829_m1 Hs00234422_m1 Hs00968308_m1 Hs00941821_m1 Hs00177257_m1 Hs00358879_m1 Hs01099206_m1
5.10. Szövettani vizsgálat A vastagbél tumoros betegek resecatumának a mintáját három részre osztottuk, az egyik darabot fixáló oldatba (4% pufferelt formaldehid, pH 7.4) tettük, majd 24 óráig fixáltuk. A dehidrálás és paraffinba ágyazás után készített 5 μm vastagságú metszeteket hematoxilin-eosinnal festettünk meg, majd fénymikroszkóp alatt vizsgáltuk a minta alkalmasságát,
illetve
az
ezekből
származó
metszeteken
végeztük
el
az
immunhisztokémiai vizsgálatokat (lsd. 5.14. fejezet). Primer melanómával (n=8) és melanóma bőrmetasztázisával (n=8) diagnosztizált betegek blokkjaiból származó metszeteken a rugalmas rostok feltüntetésére alkalmas rezorcin-fukszin festés Weigert-féle módosított változatát alkalmaztuk: rezorcin-fukszin oldattal a rugalmas rostokat sötétlilára, majd telített pikrinsav oldattal a hátteret sárgára (kontrasztfestés) és végül a sejtmagokat timsós hematoxilinnal barnára festettük.
41
5.11. Áramlási citometria A sejteket 0.02%-os etilén-diamin-tetra-ecetsav (EDTA) segítségével a tenyészedényből felpasszáltuk (a sejtfelszíni molekulák vizsgálatakor úgynevezett ”scraperrel” mechanikusan
szedtük
fel).
Ezt
követően
PBS-sel
mostuk,
majd
2%-os
paraformaldehidet tartalmazó PBS-ben fixáltuk (15 perc, sötét, szobahőmérséklet). A mintákat háromszor mosópufferben (2% BSA-t tartalmazó PBS oldat) mostuk. Intracelluláris jelölés esetén a mosópuffert kiegészítettük 0.1% szaponinnal (SigmaAldrich), hogy a sejtek membránját megfelelően permeabilizáljuk, míg a sejtfelszíni vizsgálatok esetén a mosópuffer nem tartalmazott szaponint. A sejtek nem specifikus kötőhelyeit
blokkoltuk
5%
BSA-t
tartalmazó
PBS-sel
(30
perc,
sötét,
szobahőmérséklet). Ezt követően az anti-humán primer ellenanyagokkal (30 perc, sötét, szobahőmérséklet) jelölést végeztünk. Az áramlási citometria során: egér anti-humán Pglycoprotein (Sigma-Aldrich, 10 μg/ml), egér anti-humán CXCR-4 és CXCL-12 primer (Sigma-Aldrich, 10 μg/ml), egér anti-humán MMP-2 és MMP-3 (Millipore, 10 μg/ml) és egér anti-humán VEGF-C (Sigma-Aldrich, 10 μg/ml) primer ellenanyagokat használtunk. Háromszor PBS-ben mostuk, majd inkubáltuk a sejteket a jelölt szekunder ellenanyaggal (30 perc, sötét, szobahőmérséklet). A kecske anti-mouse IgG PE (SigmaAldrich, 5 μg/ml) és kecske anti-mouse FITC (Sigma-Aldrich, 5 μg/ml) jelölt szekunder ellenanyagokat használtuk. Az anti-humán CD44 és CD54 (ICAM-1) FITC, illetve a CD56 (NCAM-1) PE antitestek (BD Biosciences) jelölt ellenanyagok voltak. Végül a sejteket utófixáltuk 2% paraformaldehidet tartalmazó PBS oldattal és mintánként 20 000 sejtet mértünk le a FACS Calibur (BD Biosciences) áramlási citométeren. A kiértékelés a Cell Quest Pro szoftver (BD Biosciences) segítségével történt: a minták “X Geo Mean” értékéből kivontuk az izotípus kontroll (a primer ellenanyagot nem immunogén szerummal helyettesítettük) “X Geo Mean” értékét, és a különbséget (relatív jelintenzitás) ábrázoltuk a diagramokon. Azonos körülmények között, mintánként három paralellel dolgoztunk.
42
5.12. Fehérje-izolálás A fehérje izolálásához a szöveteket a következő összetételű puffer oldatban homogenizáltuk: 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0, Sigma-Aldrich) 10 mg/mL leupeptin, 0.5 mmol/L EGTA, 2% NaF, 1% Triton X-100, 25 mmol/L fenil-metilszulfonil- fluorid, és 2% Na-ortovanadát. Ezután rövid centrifugálással (12 000 g, 5 perc) eltávolítottuk a lizátumokból visszamaradt szövettörmeléket, végül 595 nm-en végzett Bradford szerinti spektrofotometriás méréssel megállapítottuk az izolálás hozamát.
5.13. Western blot A Western blot-tal analizálni kívánt fehérje-extraktumokat 10 μg-os aliquotokban vizsgáltuk. A mintákat első lépésben egy 30% glicerin, 10% β-merkaptoetanol, 0.7 M SDS, 0.25 M TRIS-HCl és 0,0001 % brómfenolkék összetételű, 4x-es töménységű loading buffer-ben vettük fel, majd előbb 3 percig 100ºC-on főzve, majd azonnal jégre téve denaturáltuk. Ezután a denaturált fehérje-frakciókat a ténylegesen kimutatni kívánt fehérje méretétől függő töménységű, 10-15%-os SDS-PAGE-ban molekulasúly szerint elválasztottuk egymástól. A megfutatott géleket PVDF membránokra (BioRad) blottoltuk át, majd az aspecifikus antitest-kötődés megakadályozására a blot-membránt 60 percen keresztül blokkoltuk 5% zsírmentes tejport tartalmazó PBS-es oldatban, folyamatosan rázatva. A blokkolt membránokat ezután 1% zsírmentes tejport, és 0,1% Tween-20-at tartalmazó oldatban (mosó oldat) 60 percen keresztül, rázatás mellett inkubáltuk a kimutatni kívánt fehérjéket felismerni képes primer antitestekkel. Az egérben előállított anti-humán IGF-1 (R&D Systems), IGFBP-3 (R&D Systems) és Pglycoprotein (Sigma-Aldrich, az MDR1 által kódolt fehérje) elsődleges antitesteket (törzsoldat
koncentrációja
1mg/ml)
1:1000
arányú
hígításban,
1
μg/ml
végkoncentrációban használtuk. Housekeeping fehérjének az aktint választottuk és egérben előállított anti-humán actin (Sigma-Aldrich) ellenanyagot 1:2000-es hígításban, 0.5 μg/ml végkoncentrációban használtunk. Ezután háromszori, egyenként 20 perces, friss mosó oldattal történő, rázatás mellett végzett inkubációt követően a fentiekkel azonos körülmények között alkalmaztuk az anti-mouse IgG HRP jelölt (Sigma-Aldrich) szekunder antitestet (1:10 000-es higításban). Végül újabb három, az előbbiekben
43
leírtnak megfelelő mosási szakaszt követően az immunreaktív fehérje-sávokat egy chemilumineszcens ECL Plus Western blotting Detection System (Amersham Biosciences) felhasználásával tettük láthatóvá. A kimutatási eljárás által gerjesztett lumineszcens jeleket Retina XBM röntgenfilmeken (Fotochemische Werke) detektáltuk. Ezután a specifikus fehérje-sávokat a géleken a mintákkal párhuzamosan futtatott Full Range Rainbow Molecular Weight Marker (Amersham Biosciences) segítségével, a Swissprot adatbázisában megadott konszenzusos molekula-méret alapján azonosítottuk. Az elkészült filmeket végül egy Fluorchem™ 8000 képanalizáló rendszeren (Alpha Innotech) a ChemiImager™5500 képelemző szoftvercsomag (Alpha Innotech) segítségével értékeltük ki.
5.14. Immunhisztokémiai analízis A paraffinba ágyazott metszeteket deparaffináltuk, és immunhisztokémiai vizsgálatot végeztünk Biogenex i6000 automatizált rendszer segítségével (BioGenex Laboratories, San Ramon, CA, USA), a gyártó utasításainak megfelelően. Az egérben előállított anti-humán IGF-1 (R&D Systems), IGFBP-3 (R&D Systems), P-glycoprotein (Sigma-Aldrich, az MDR1 által kódolt fehérje) és elasztin (Sigma-Aldrich) elsődleges antitesteket (törzsoldat koncetrációja 1mg/ml) 1:200 arányú hígításban, 5 μg/ml-es végkoncetrációban használtuk. Az automatizált immunhisztokémiai jelölést és festést SS
Non-Biotin
Polymer
HRP/DAB
Detection
Kit
(BioGenex
Laboratories)
felhasználásával végeztük a gyártó utasításainak megfelelően. A tárgylemezeket PBSben, majd desztillált vízben tisztított fedőlemezekkel Hyper-mount (Shandon Inc., Pittsburgh, PA, USA) segítségével fedtük le. Az immunfestődés mértékét Nikon Eclipse E600
microscope
(Nikon
Spot
Advanced
Program,
Nikon,
Tokyo,
Japan)
mikroszkóppal vizsgáltuk. Minden negatív kontroll (elsődleges antitest nélkül) elhanyagolható mértékű hátteret mutatott. A jel intenzitását denzitometriás módszerrel határoztuk meg lemezenként 10x-es nagyítás mellett három véletlenszerűen kiválasztott területet megmérésével az NIH Image program (Scion, Frederick, MD, USA) segítségével. A statisztikai értékelést egy-utas ANOVA alkalmazása után Holm-Sidak többszörös páronkénti összehasonlítás felhasználásával végeztük. Reprezentatív célokra 20x-os nagyítással készítettünk felvételeket.
44
5.15. Transzmissziós elektronmikroszkópia Primer melanómával (n=8) és melanóma bőrmetasztázisával (n=8) diagnosztizált betegek blokkjaiból egy kis darabot kimetszettünk, ezeket deparaffináltuk, majd szobahőmérsékleten 30 percig, azt követően 4°C-on 24 óráig fixáltuk 2% glutáraldehidet, 0.5% paraformaldehidet, 0.1 M szacharózt és 3 mM CaCl2-ot tartalmazó 0.1 M-os nátrium-kakodilát-pufferben (pH 7.4). A mintákat derítettük 3 mM CaCl2-ot tartalmazó 0.15 M-os nátrium-kakodilát-pufferben (pH 7.4) és utófixáltuk 4°C-on 2 óráig 2% ozmium-tetroxidot és 1.5 mM CaCl2-ot tartalmazó 0.07 M-os nátrium-kakodilát-pufferben (pH 7.4). Végül dehidráltuk és műgyantába ágyaztuk a mintákat. A félvékony metszeteket toluidinkékkel festettük meg fénymikroszkópos értékelés céljából. A kiválasztott mintákból ezt követően ultravékony metszeteket (4050 nm) készítettünk, amiket uranil-acetáttal és ólom-citráttal történő kontrasztozás után Philips CM10 típusú transzmissziós elektronmikroszkóppal 80kV gyorsító feszültségen vizsgáltuk.
5.16. MTT-assay: a proliferáció mérése A sejtszám meghatározásához a proliferáció mérése során – az elsőként Mosmann által 1983-ban leírt – mitokondriális dehidrogenáz aktivitás kimutatásán alapuló MTT próbát alkalmaztuk. A reakció során az élő sejtekben működő mitokondriális dehidrogenáz hatására az MTT (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolium bromid) tetrazólium gyűrűje felhasad és a sejtekben kék formazán kristályok keletkeznek. A sejtek és a kristályok detergenssel (pl: DMSO) történő szolubilizálása után, az 540 és 620 nm-es hullámhosszon mért abszorbancia különbség arányos lesz az élő sejtek számával és aktivitásával. Vizsgálataink során steril PBS-ben oldott (0.05 M foszfát-puffer, pH 7.2, 0.9 M NaCl) 5% -os MTT-t oldatot alkalmaztunk, melyet 1:10 térfogat arányban adtunk a sejtekhez. Termosztátban történő 12 órás inkubációt követően a sejtek felszínéről injekciós tű segítségével távolítottuk el az MTT-t tartalmazó médiumot, majd 100 μl DMSO-t hozzáadva, 20 percig rázógépbe helyezve szolubilizáltuk a kristályokat. Az abszorbancia mérése ELISA-readerrel (Labsystems Multiskan MS, Finnország) történt 540 és 620 nm-es hullámhosszokon. A mért értéket csak médiumot tartalmazó vakok
45
levonásával történt korrekció után használtuk fel a statisztikák készítéséhez. Az eredmények kiértékelésekor lényeges szempont az, hogy a minták spektorfotometriás leolvasása során nem a teljes tartomány tekinthető lineárisnak, ezért a vizsgálatok előtt kalibrációs görbe felvételére került sor minden esetben.
5.17. Kvantitatív migrációs (haptotaxis) assay A migráció vizsgálatához a CHEMICON QCM Haptotaxis Cell Migration Assay – Fibronectin, Colorimetric (Millipore) kitet használtuk a gyártó utasításait követve. Ebben a rendszerben fibronektinnel, illetve kontrollként BSA-val bevont Boyden kamrákban történik a sejtek migrációja. A P-gp fehérjét működésében gátló, az extracelluláris
részhez
kötődő
antitesttel
(Millipore,
MAB4334,
50
μg/ml
végkoncentrációban) kezeltük elő a HCT-116 (carcinoma), a HT-29 (adenocarcinoma) és a WiDr (adenocarcinoma) humán vastagbéltumor-sejtvonalakat. A melanómasejtvonalakat az 5.3-as fejezetben ismertetett módon előkezeljük, majd 1 x 106 sejt/ml-t hozzáadunk a kamrákhoz. Lefedjük és 18 órán át inkubáljuk (37°C, 5% CO2). A 8 μmes póruson átvándorolt sejteket felvesszük az extrakciós oldatban, majd megfestjük (0.25% crystal violet festékkel 4 órán át). Az optikai denzitás (OD) korrelál a migrált sejtek számával. Megmérjük az OD-t ELISA leolvasó (Labsystems Multiskan MS) segítségével 560 nm-en.
5.18. Adhézió vizsgálata A HCT-116, a HT-29 és a WiDr humán vastagbéltumor-sejtvonalakat a P-gp fehérjét működésében gátló, az extracelluláris részhez kötődő antitesttel (Millipore, MAB4334, 50 μg/ml végkoncentrációban) kezeltük elő. A sejek adhéziós vizsgálatához fibronektinnel, illetve kontrollként BSA-val inkubáltuk a 24-lyukú plate-et 18 órán át 4°C-on. A WM35 és a HT168-M1 melanóma-sejtvonalak adhéziójának vizsgálatakor VGVAPG és VAPG peptideket 150 mM NaCl, 50 mM Tris pufferben (TBS, pH 8.0) vettünk fel és ezzel inkubáltuk a 24-lyukú plate-et 18 órán át 4°C-on, míg a kontroll lyukakat TBS-sel inkubáltuk. Blokkoltuk az aspecifikus kötőhelyeket 1 mg/ml BSA (Sigma–Aldrich) oldattal (szobahőmérséklet, 1 óra). A melanóma sejteket előkezeltük
46
az 5.3-as fejezetben ismertetett módon az adhéziós vizsgálat előtt 1 órán át (37°C, 5% CO2). Hozzáadtuk a sejteket a bevont lyukakhoz (3.5 x 104 sejt/lyuk) és 4 órán keresztül inkubáltuk a plate-eket (37°C, 5% CO2). Kétszer mostuk a sejteket PBS (pH 7.4) pufferrel. A letapadt sejteket fixáltuk 20 percig 4% pufferelt formaldehiddel (pH 7.4), majd megfestettük (0.25% crystal violet festékkel 4 órán át). Ezután derítettük a sejteket desztillált vízzel és a festéket feloldottuk 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) oldattal és megmértük az optikai denzitást (OD) ELISA leolvasó (Labsystems Multiskan MS) segítségével 560 nm-en.
5.19. Statisztikai módszerek A statisztikai elemzésekhez a Microsoft Excel és a SigmaStat 3.5 programokat használtuk. T-próbát, egyutas és kétutas ANOVA-t és Holm-Sidak többszörös páronkénti összehasonlítást alkalmaztunk a kiértékelendő adatoktól függően. A speciális kiértékelést igénylő vizsgálatoknál az ott leírtak szerint jártunk el. Szignifikancia: * – p < 0.05; ** – p< 0.01; *** – p < 0.001
47
6. KUTATÁSI EREDMÉNYEK A továbbiakban az értekezés alapját képező funkcionális genomikai vizsgálataink eredményeit a vastagbéldaganat génexpressziós profil analíziséről, illetve a melanóma és a stróma interakciójának a tanulmányozását két külön alfejezetben (6.1 és 6.2) ismertetem.
6.1.
Nyirokcsomó-áttét negatív és a távoli áttét pozitív vastagbél tumoros minták génexpressziós profiljának vizsgálata
6.1.1. A kétcsatornás Agilent teljes humán genom microarray vizsgálat eredményei Munkánk során a legnagyobb kihívást a megfelelő minták összegyűjtése jelentette. Egy éven keresztül dolgoztunk a sebész kollegákkal karöltve, míg végül 24-24 betegből rendelkezésünkre állt a tumoros szövet és a hozzá tartozó ép nyálkahártya mind a két csoportban (nyirokcsomó áttét negatív és távoli áttét pozitív). Ezek a minták megfeleltek a szigorú kritériumoknak és a szövettani kép, az RNS és a fehérje minősége is kifogástalan volt (6. ábra).
6. ábra A minták szövettani, RNS és fehérje kontrollja. A: nem tumoros nyálkahártya (40X, HE); B: tumorszövet (20X, HE); C: reprezentatív Bioanalyzer-kép a megfelelő RNS-ekről; D: reprezentatív blot (a housekeeping actin fehérje kimutatása)
48
Kísérletünkben 6-6 nyirokcsomó-áttét negatív, illetve távoli áttét pozitív vastagbél tumoros férfi beteg tumoros nyálkahártyájának génexpresszióját hasonlítottuk össze a hozzá tartozó, tumorsejteket nem tartalmazó, legtávolabbi nyálkahártyával kétcsatornás Agilent Whole Human Genome Oligo 4x44K Microarray-vel. A szigorú statisztikai értékelés mellett (not above background, present or marginal, >2.0 fold change, t-test p<0.05, Benjamini-Hochberg többszörös hipotézis korrekció) is jelentős génexpressziós változásokat tapasztaltunk: a nyirokcsomó-áttét negatív csoportban 2314 gén, míg a távoli áttét pozitív csoportban 1496 gén változott szignifikánsan az adott beteg nem tumoros nyálkahártyájához képest. A 5-6. táblázatban a 10-10 legnagyobb eltérést mutató gént foglaltam össze. 5. Táblázat Top 10 gének a nyirokcsomó-áttét negatív csoportban. NYIROKCSOMÓÁTTÉT NEGATÍV
Fold Corrected change p-value
Common name
Gene Symbol
1. 2. 3.
30.79 26.64 18.26
0.0083 0.023 0.017
NM_002423 NM_015515 NM_033260
MMP7 KRT23 FOXQ1
4.
15.93
0.045
NM_000582
SPP1
14.03 12.07 11.43
0.0062 0.0244 0.0128
NM_001793 NM_002192 NM_020980
CDH3 INHBA AQP9
9. 10.
11.29 11.28 10.17
0.0155 0.023 0.0076
NM_001511 NM_002421 NM_003714
CXCL1 MMP1 STC2
1.
0.055
0.0128
NM_000036
AMPD1
2.
0.058
0.010
NM_004827
ABCG2
3.
0.063
0.038
NM_020973
GBA3
4.
0.065
0.015
NM_001192
TNFRSF 17
5. 6. 7.
0.068 0.072 0.038
0.016 0.018 0.016
NM_181795 NM_019016 NM_152338
PKIB KRT24 ZG16
8.
0.076
0.014
NM_005382
NEFM
9.
0.081
0.023
NM_144646
IGJ
10.
0.093
0.0232
NM_021153
CDH19
5. 6. 7. 8.
49
Description mátrix metallopeptidase 7 keratin 23 forkhead box Q1 secreted phosphoprotein 1 (osteopontin) cadherin 3, type 1, Pcadherin inhibin, beta A aquaporin 9 chemokine (C-X-C motif) ligand 1 mátrix metallopeptidase 1 stanniocalcin 2 adenosine monophosphate deaminase 1 (isoform M) ATP-binding cassette, subfamily G, member 2 glucosidase, beta, acid 3 (cytosolic) tumor necrosis factor receptor superfamily, member 17 protein kinase, inhibitor beta keratin 24 zymogen granule protein 16 neurofilament, medium polypeptide 150kDa immunoglobulin J polypeptide, cadherin 19, type 2
6. Táblázat Top 10 gének a távoli áttét pozitív csoportban. TÁVOLI ÁTTÉT POZITÍV
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Fold Corrected change p-value
Common name
Gene Symbol
22.72 16.24 15.27 14.13 13.72 12.74
0.0122 0.0177 0.0317 0.0385 0.026 0.0136
NM_002704 NM_033260 NM_002421 NM_002422 NM_021101 NM_002192
PPBP FOXQ1 MMP1 MMP3 CLDN1 INHBA
10.31
0.0198
NM_001793
CDH3
9. 10.
9.92 6.26 5.95
0.0248 0.0316 0.0317
NM_001445 NM_006393 NM_005940
FABP6 NEBL MMP11
1.
0.054
0.0179
NM_000870
HTR4
2. 3.
0.062
0.0206
NM_019016
KRT24
0.078
0.0145
NM_003012
SFRP1
4. 5.
0.08
0.0177
NM_006790
MYOT
0.084
0.0144
NM_003881
WISP2
6. 7. 8. 9.
0.09 0.093 0.093
0.0177 0.0208 0.0227
NM_000667 NM_021153 NM_152338
ADH1A CDH19 ZG16
0.107
0.0115
NM_001076
UGT2 B15
10.
0.109
0.0144
NM_000669
ADH1C
8.
Description pro-platelet basic protein forkhead box Q1 mátrix metallopeptidase 1 mátrix metallopeptidase 3 claudin 1 inhibin, beta A cadherin 3, type 1, Pcadherin fatty acid binding protein 6, ileal (gastrotropin) nebulette mátrix metallopeptidase 11 5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 4 keratin 24 secreted frizzled-related protein 1 myotilin WNT1 inducible signaling pathway protein 2 alcohol dehydrogenase 1A cadherin 19, type 2 zymogen granule protein 16 UDP glucuronosyltransferase 2 family, polypeptide B15 alcohol dehydrogenase 1C
Ekkora nagyságú adtahalmazt önmagában nagyon nehéz feldolgozni, interpretálni, ezért van szükség a bioinformatika segítségére. A hagyományos génexpressziós adatértékelési munkafolyamat elsősorban a statisztikailag eltérően regulálódó gének felismerésére helyezi a hangsúlyt, mely esetleg számos, valamilyen betegséghez, illetve fenotípushoz szorosan kapcsolódó gén figyelmen kívül hagyásához vezethet. Emiatt a microarray kísérletekből származó adathalmazok kiterjedtebb elemzése gyakran más, alternatív statisztikai módszerek alkalmazását követeli meg, különösképpen olyan esetekben, amikor a különbözőképpen regulálódó gének száma túl alacsony vagy túl magas, mely nehézkessé teszi a biológiailag helytálló következtetések levonását. A kapott génlistákat ezért tovább elemeztük a GeneSpring GX Gene Ontology (GO) és az Ingenuity Pathway Analysis (IPA) programok segítségével.
50
6.1.2. Gene Ontology elemzés A microarray adatértékelés során kapott eredmények alapján a különbözőképpen expresszálódó géneket tartalmazó listákon génontológiai elemzést hajtottunk végre. Az elemzés célja az volt, hogy statisztikailag szignifikánsan (p<0.05) felülreprezentált géncsaládokat találjunk a nyirokcsomó-áttét negatív, illetve távoli áttét pozitív csoportokban. A különböző mértékben feldúsult géncsaládokról a 7-8. táblázat nyújt bővebb tájékoztatást. Amint várható volt, az immun és gyulladásos válaszhoz, valamint a citokin és kemokin működéshez kapcsolódó géncsaládok elemei mindkét vizsgálati csoportban nagymértékben indukálódtak a kontrollhoz képest. A nyirokcsomó-áttét negatív csoportot több és nagyobb mértékű kemokin, citokin és extracelluláris mátrixot bontó enzim expressziója jellemezte, míg a műtét pillanatában már távoli áttéttel rendelkező csoportban az adhéziós molekulák, citoszkeletális elemek és a transzportfehérjék expressziói mutattak feldúsulást.
7. Táblázat Génontológiai elemzés a nyirokcsomó-áttét negatív csoportban.
GO ACCESSION
GO Term
corrected p-value
GO:0016020 GO:0002376 GO:0016021 GO:0005886 GO:0006955 GO:0005125
membrane immune system process integral to membrane plasma membrane immune response cytokine activity glycerol metabolic process membrane part intrinsic to membrane
0,016765578 0,02697631 0,02697631 0,02697631 0,02697631 0,02697631
GO:0006071 GO:0044425 GO:0031224
0,02697631 0,02697631 0,038278254
8. Táblázat Génontológiai elemzés a távoli áttét pozitív csoportban.
GO ACCESSION
GO Term
corrected p-value
GO:0005576 GO:0005125 GO:0007626
extracellular region cytokine activity locomotory behavior regulation of cell proliferation
0,020000918 0,03697631 0,03319724
GO0042127
0,04665631
51
6.1.3. Jelátviteli útvonalkeresés az Ingenuity Pathway Analysis program segítségével Az Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA) program segítségével a kanonikus útvonalakat vizsgáltuk. Jól karakterizált biológiai jelátviteli utakra (”cell signaling” és ”metabolic pathways”) vetítettük rá a listánkon szereplő génexpressziós adatokat. A következő kérdésre kerestük a választ: melyik ismert jelátviteli útvonal elemei a leginkább reprezentáltak, relevánsak a listánkon. Több érdekes útvonalat találtunk, de ezeket már jól ismertük az irodalomból: •
Wnt/β-catenin signaling,
•
chemokine signaling,
•
VEGF signaling,
•
IL-6 signaling,
•
TGFβ signaling.
Az ”IGF-1 signaling” mindkét csoportban megjelent és az útvonal három eleme (IGF1, IGFBP3 és ERK1/MAPK3) mind a nyirokcsomó-áttét negatív, mind a távoli áttét pozitív mintákban azonos irányban, szignifikánsan változott a hozzá tartozó nyálkahártyához képest. A jelátviteli út többi tagja is szignifikánsan változott, de nem mindkét csoportban. Az ”IL-6 signaling” részeként azt tapasztaltuk, hogy két tagja (ERK1/MAPK3,
ABCB1/MDR1),
amelyek
ok-okozati
összefüggést
mutatnak,
egyformán változtak mindkét csoport esetében (9. táblázat).
9. Táblázat A feltételezett új útvonal génexpressziós változásai a microarray adatok alapján.
nyirokcsomó-áttét negatív
IGFBP3 IGF1 MAPK3 PAC1 MKP2 p90 RSK cFOS MDR1
távoli áttét pozitív
Fold change
Corrected pvalue
Fold change
Corrected pvalue
3.11 0.381 0.6 1.72 1.61 0.57 0.47 0.247
0.014 0.025 0.0089 0.047 0.071* 0.085* 0.082* 0.026
2.72 0.514 0.68 1.54 1.7 0.75 0.63 0.375
0.017 0.034 0.012 0.061* 0.042 0.042 0.049 0.027
52
A két csoport génexpressziós változásait figyelembe véve feltételeztük az IGF1 – MAPK3 – MDR1 útvonalat a humán vastagbéltumor esetében (7. ábra).
7. ábra Az útvonal analízis eredménye. A színek jelentése: zöld szín - génexpresszió csökkent, piros szín - génexpresszió nőtt a hozzá tartozó, tumoros sejteket nem tartalmazó, legtávolabbi nyálkahártyához képest.
6.1.4. A jelátviteli útvonal tagjainak validálása TaqMan valósidejű PCR módszerrel A microarray adatok statisztikai elemzését követően több érdekes gén expresszióját mértük vissza először a méréshez felhasznált 6-6 beteg esetében, majd pedig újabb 1818 beteg mintáján TaqMan valósidejű PCR módszerrel. Megvizsgáltuk az egyik
53
legnagyobb mértékben emelkedett expressziójú activin A (inhibin beta A, activin AB alpha polypeptide) és MMP11, az egyik legnagyobb mértékben lecsökkent CXCL12 géneket, valamint a CXCL1 gént, amely esetében több mint 2X-es expressziót mértünk a nyirokcsomó-áttét negatív csoportban a távoli áttét pozitívhoz képest. Amint az a 10. táblázatból kitűnik, a microarray által mért értékek tökéletesen hasonló génexpressziós változásokat mutattak, így bizonyítottuk az általunk kapott microarray eredmények megbízhatóságát. 10. Táblázat A microarray és a TaqMan valósidejű PCR eredményeinek összehasonlítása.
MICROARRAY
CXCL12 CXCL1 MMP11 Activin A
nyirokcsomó-áttét negatív Fold Corrected change p-value 0,127 0,029 11,235 0,0155 5,775 0,0294 12,041 0,0108
REAL TIME PCR
távoli áttét pozitív Fold change 0,134 5,241 5,938 12,728
Corrected p-value 0,0057 0,0371 0,03 0,0132
nyirokcsomó-áttét negatív Fold Corrected change p-value 0,176 0,00217 12,48 0,01622 6,655 0,01366 11,454 0,00664
távoli áttét pozitív Fold change 0,188 4,763 6,527 11,741
Corrected p-value 0,00239 0,01709 0,00501 0,02022
Az általunk feltételezett jelátviteli út génjeinek expresszióját mind a 24-24 beteg mintáján validáltuk. A microarray eredményekkel összhangban, szinte teljes mértékben azonos változásokat detektáltunk a feltételezett IGF1 – MAPK3 – MDR1 útvonal résztvevői esetében is. Rendkívül érdekes megfigyelés volt számunkra a kemoterápiában nem részesült betegek csökkent bazális MDR1 expressziója. Az irodalmi adatoknak megfelelően jelentősen emelkedett IGFBP3 és csökkent IGF1 expressziót mértünk vissza a tumoros szövetben a hozzá tartozó tumormentes nyálkahártyához képest. Kisfokú, de szignifikáns eltérést detektáltunk a szignáltranszdukciós molekulák között: a csökkent MAPK3, p90 RSK és c-FOS expresszió mellett a MAPK3 foszfatázainak (PAC1/DUSP2 és MKP2/DUSP4) emelkedett mRNS szintjét mértük a TaqMan valósidejű PCR módszer segítségével (8. ábra).
54
8. ábra A feltételezett IGF1 – MAPK3 – MDR1 útvonalban résztvevő gének validálása TaqMan valósidejű PCR módszerrel.
6.1.5. Fehérje szintű validálás: immunhisztokémia és Western blot Ezt követően arra voltunk kíváncsiak, hogy a microarray, valamint a valósidejű PCR mérés szerint is jelentős mértékben változott IGF1 – MAPK3 – MDR1 útvonal génjeinek mRNS expressziója mellett valóban változott-e a kódolt fehérjék szintje is. A feltételezett jelátviteli útvonal fő pontjait fehérjeszinten is megvizsgáltuk. A génexpressziós eredmények megerősítését a szövettanra eltett mintákon (24-24 minta)
Biogenex
i6000
automatizált
immunhisztokémiai
rendszer
(BioGenex
Laboratories) és SS Non-Biotin Polymer HRP/DAB Detection Kit (BioGenex
55
Laboratories) segítségével végeztük a gyártó utasításainak megfelelően. Az anti-humán IGF-1 (R&D Systems), IGFBP-3 (R&D Systems) és az MDR1 által kódolt fehérje, az anti-humán P-glycoprotein (Sigma-Aldrich,) elsődleges antitesteket használtuk. A jel intenzitását denzitometriás módszerrel határoztuk meg lemezenként 10x-es nagyítás mellett három véletlenszerűen kiválasztott területet megmérésével az NIH Image program (Scion) segítségével. Reprezentatív célokra 10x-es és 20x-os objektívvel készítettünk felvételeket. Szemmel látható a különbség: az IGF-1 és a P-gp csökkent, míg az IGFBP-3 emelkedett expressziót mutat a tumoros szövetben a hozzá tartozó nem tumoros nyálkahártyához képest. Az IGF-1 és az IGFBP-3 expressziója az enterocytákban ugyanúgy, mint a tumorsejtekben diffúzan látható a sejtek cytoplasmájában. A P-gp esetében - a fehérje funkciójának megfelelően - döntő mértékben az apikális felszínen látható a jel. Az antitestek specifitását normál nyálkahártyából származó mintákon (n=5) igazoltuk Western blot segítségével. Minden esetben egyetlen, a várt mérettartományban kaptuk a jelet (9-11. ábra).
9. ábra Az IGF-1 expressziójának változása. Az IGF-1 fehérje kimutatása normál nyálkahártyán (10X – A és 20X – B nagyítás) és vastagbéltumor mintán (10X – C és 20X – D nagyítás); E: a denzitometrálás eredménye; F: az antitestek specifitásának bizonyítása Western blot segítségével.
56
10. ábra Az IGFBP-3 expressziójának változása. Az IGFBP-3 fehérje kimutatása normál nyálkahártyán (10X – A és 20X – B nagyítás) és vastagbéltumor mintán (10X – C és 20X – D nagyítás); E: a denzitometrálás eredménye; F: az antitestek specifitásának bizonyítása Western blot segítségével.
11. ábra A P-glycoprotein expressziójának változása. A P-glycoprotein fehérje kimutatása normál nyálkahártyán (10X – A és 20X – B nagyítás) és vastagbéltumor mintán (10X – C és 20X – D nagyítás); E: a denzitometrálás eredménye; F: az antitestek specifitásának bizonyítása Western blot segítségével.
57
6.1.6. A feltételezett útvonal validálása humán vastagbéltumor-sejtvonalakon A vastagbél tumoros betegek mintáin az IGF1 – MAPK3 – MDR1 általunk feltételezett, új, lehetséges biológiai jelátviteli útvonal elemeiről szöveti környezetben igazoltuk, hogy mRNS és fehérje szinten is az IPA által jósoltak szerint változtak. Ezekkel a kísérletekkel nem bizonyítottuk az ok-okozati összefüggést az IGF1 és az MDR1 között. A közvetlen kapcsolat vizsgálatát három humán vastagbéltumor-sejtvonalon végeztük: a HCT-116 (carcinoma), a HT-29 (adenocarcinoma) és a WiDr (adenocarcinoma) vonalakon. A sejteket előkezeltük 4, 8 és 16 órán át 100 ng/ml humán rekombináns IGF-1 (Sigma-Aldrich) fehérjével és vizsgáltuk az érintett gének expressziójának változását TaqMan valósidejű PCR módszer segítségével. A 4 órás IGF-1 kezelés hatására szignifikánsan megnőtt a MAPK3, a p90 RSK, a cFOS és az MDR1, míg lecsökkent az MKP2/DUSP4, illetve nem változott a PAC1/DUSP2 gének expressziója a kontrollhoz képest mindhárom sejtvonal esetében. A 8 és 16 órás kezelések hatására szignifikánsan nem változott egyik gén sem (12. ábra).
12. ábra Az IGF-1 kezelés hatása a HCT-116, a HT-29 és a WiDr sejtek génexpressziójára. A: MAPK3, B:MKP2/DUSP4, C: PAC1/DUSP2, D: p90RSK, E:cFOS, F: MDR1 gének expressziójának változásait mutatja.
58
A génexpressziós vizsgálatokat követően az MDR1 által kódolt fehérje, a Pglycoprotein változását vizsgáltuk a HCT-116, a HT-29 és a WiDr vastagbéltumorsejtvonalakon áramlási citometria segítségével. A sejtfelszíni jelöléshez anti-humán P-glycoprotein (Sigma-Aldrich) primer és antimouse IgG PE jelölt szekunder ellenanyagot (BD Biosciences) használtunk. A sejteket 100 ng/ml humán rekombináns IGF-1 (Sigma-Aldrich) fehérjével előkezeltük és megvizsgáltuk az IGF-1 P-gp expresszióra gyakorolt hatásának kinetikáját. A P-gp sejtfelszíni expressziójának maximális emelkedését 36 óra elteltével tapasztaltuk mindhárom sejtvonal esetében. Ezt követően megvizsgáltuk a MAPK3 útvonal érintettségét. Az U0126 (SigmaAldrich, U120) egy MEK1/2 (a cFOS gént is gátolja), míg a PD098059 (Sigma-Aldrich, P215) egy szelektív MEK1 inhibitor, más-más támadóponton, de mindkettő gátolja a MAPK3 szignalizációt. A kontroll kivételével 50 μM U0126 és 50 μM PD098059 gátlószerekkel 30 percen keresztül előkezeltük a sejteket, majd ezt követően kezdtük a 100 ng/ml humán rekombináns IGF-1 (Sigma-Aldrich) kezelést. Kísérleteinkkel egyértelműen igazoltuk, hogy bármelyik inhibitor jelenléte felfüggeszti az IGF-1 P-gp expresszióját növelő hatását. A génexpressziós és fehérjeszintű vizsgálataink egyértelműen a MAPK rendszer, kifejezetten a MAPK3 érintettségét jelzik az IGF-1 hatásmechanizmusában (13. ábra).
59
13. ábra Az IGF-1 kezelés hatása a HCT-116, a HT-29 és a WiDr sejtek P-gp expressziójára. A: a P-gp expressziós változásának kinetikája IGF-1 kezelés hatására; B: 50 μM U0126 és 50 μM PD098059 MAPK inhibitorok gátolják az IGF-1 hatását; C: a hisztogram plotokon a MAPK gátlás hatására balra tolódó görbék láthatóak.
6.1.7. Funkcionális vizsgálatok a vastagbéltumor-sejtvonalakon A P-glycoprotein egy nagy transzporter család, az ATP-binding cassette (ABC) superfamily egyik tagja. Számos molekula extra-, illetve intracelluláris transzportjában vesz részt, de az utóbbi években számos közlemény számolt be újabb és újabb funkciójáról. Miért jó a tumorsejteknek a normál bélhámsejtekhez képest alacsonyabb MDR1, illetve P-glycoprotein expresszió? Funkcionális vizsgálataink során erre kerestük a magyarázatot. A P-gp fehérjét működésében gátló, az extracelluláris részhez kötődő antitesttel (Millipore, MAB4334) kezeltük elő a HCT-116, a HT-29 és a WiDr humán vastagbéltumor-sejtvonalakat. Az irodalmi adatok alapján és a gyártó utasításainak megfelelően 50 μg/ml koncentrációban alkalmaztuk a gátló antitestet. A P-gp gátlásának hatására a sejtek proliferációja (MTT-assay) egyik sejtvonal esetében sem változott, míg az adhézió (adhéziós assay), illetve a sejtek migrációja
60
(kvantitatív migrációs assay) szignifikánsan megnőtt a kontroll sejtekhez képest (14. ábra).
14. ábra Az anti-MDR1 gátló antitest hatása a HCT-116, a HT-29 és a WiDr sejtekre. A: a proliferáció vizsgálata (MTT-assay); B: az adhézió vizsgálata (adhéziós assay); C: kvantitatív migrációs (haptotaxis) assay.
6.2.
Génexpressziós vizsgálatok a melanóma és a stróma interakciójának a tanulmányozására
6.2.1. Elasztin fehérje és elasztin eredetű fragmentumok kimutatása Kísérleteink elején igazoltuk az elasztin jelenlétét a tumor inváziós zónájában elektronmikroszkópos, hisztológiai és immunhisztokémiai technikákkal superficialspreading melanómából (n=8) és melanóma bőrmetasztázisából (n=8) származó metszeteken. A Weigert-féle módosított rezorcin-fukszin festéssel a rugalmas rostokat lila képletekként láthatjuk. Az elasztin fehérje halvány, üvegszerű struktúraként ábrázolódik a transzmissziós elektronmikroszkópiával készült felvételeken. Az elasztin eredetű peptideket is kimutattuk ezeken a metszeteken indirekt immunhisztokémiai vizsgálat segítségével (monoklonális anti-humán elasztin; Sigma-Aldrich). Az ellenanyag specifikusan a tropoelasztint és a VGVAPG peptidet ismerte fel. Az immunreakció végtermékének megfelelően barnás-vöröses pontokként és vonalakként
61
ábrázolódnak az elasztin eredetű fragmentumok, melyek nagy mennyiségben mutathatók ki a tumor körül, de magában a tumorban is láthatóak (15. ábra, nyilak).
15. ábra Elasztin fehérje és elasztin eredetű fragmentumok kimutatása. Elasztin fehérje kimutatása Weigert-féle rezorcin-fukszin festéssel (A, D), immunhisztokémia (B, E) és TEM (C, F) segítségével superficial-spreading melanomával (A, B, C) és melanóma bőrmetasztázisával (D, E, F) diagnosztizált betegek metszetein.
6.2.2. A VGVAPG és VAPG elasztin eredetű peptidek receptorai Az irodalomban három receptort írtak le, amelyekről feltételezik, hogy szerepet játszanak a VGVAPG elasztin eredetű peptid hatásainak közvetítésében: az elasztinkötő fehérjét (elastin-binding protein; EBP), a galektin-3 és az integrin αvβ3 receptorokat. Az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportja 5-carboxi-fluorescein jelöléssel szintetizálta meg a VGVAPG és VAPG elasztin eredetű peptideket. A sejteket 1 órán át inkubáltuk a receptorokat blokkoló ellenanyagokkal (Millipore), majd 30 percen keresztül a fluoreszcensen jelzett peptidekkel. Háromszori PBS-sel történő mosást követően áramlási áramlási citométer segítségével mértük a sejtek jelintenzitását (mennyire kötődött be a jelzett molekula). Kontrollként egyrészt natív, festetlen sejteket alkalmaztunk, másrészt jelöletlen peptidekkel merítettük ki a kötőhelyeket. Kísérletünk során igazoltuk az elasztin eredetű VGVAPG és VAPG peptidekről, hogy kötődnek
62
mindkét humán melanóma-sejtvonal felszínén található galektin-3, integrin αvβ3 és elasztin-kötő fehérje (EBP) receptorokhoz (16. ábra). A receptorok blokkolását követően a jelzett peptid nem tudott a sejtfelszínhez kötődni. Meghatároztuk a blokkoló ellenanyagok hatásos koncentrációját is.
16. ábra A VGVAPG és VAPG elasztin eredetű peptidek receptorai. Az 5-carboxi-fluorescein-VAPG (a, b, és c) és VGVAPG (d, e és f) kötődés a melanómasejtek felszínén található galektin-3, integrin αvβ3 és elasztin-kötő fehérje (EBP) receptorokhoz a WM35 (a és d), illetve a HT168-M1 (b és e) sejtek esetében. A hisztogram plotokon az egyenes vonal = autofloureszcenciát, a szaggatott vonal = konjugálatlan peptiddel előkezelt, a vastag vonal = jelölt peptidet ábrázol.
6.2.3. A peptidek hatása a melanómasejtek inváziós paramétereire Négy különböző aspektusát vizsgáltuk a melanómasejtek inváziós képességének és a tumor-stróma kölcsönhatásnak: 1.) a migrációt, 2.) az adhéziót, 3.) az ECM-hasító MMP2 és MMP3 enzimek és 4.) az angiogenetikus VEGF-C expresszióját. Vizsgálataink során VGVAPG és VAPG elasztin peptidekkel, illetve a receptorok gátlószereivel kezeltük a sejteket (lsd. 5.3. fejezet) majd 12 és 18 óra után a változásokat mRNS szinten TaqMan valósidejű PCR-rel (a primereket az 5.9. fejezetben soroltuk fel), míg 24 órás előkezelés után áramlási citometria segítségével vizsgáltuk a fehérje szintű változásokat.
63
6.2.3.1. A migráció vizsgálata Az elasztin hasítása során keletkező peptidek humán melanómasejtek migrációjára kifejtett hatását kétféle módszerrel vizsgáltuk: egyrészt a közvetlen hatásukat kvantitatív migrációs (haptotaxis) assay segítségével, másrészt a közvetett hatásukat, a CXCR-4 és CXCL-12 (SDF1) kemokinek expressziójának nyomon követésével. A migrációs (haptotaxis) assay eredményeink alapján megállapítottuk, hogy mindkét peptid kemoattraktánsnak bizonyult, de a rövidebb, a VAPG peptid mindkét sejtvonalon nagyobb hatást fejtett ki. Azonban a két sejtvonal eltérő mértékben válaszolt az adott peptidre: a hosszabb VGVAPG elasztin eredetű peptid a primer tumorból származó WM35 humán melanóma-sejtvonalon hatásosabbnak bizonyult, míg a rövidebb VAPG peptid a nagyobb invazivitású HT168-M1 sejtek esetében váltott ki nagyobb migrációt. A scrambled peptidek hatástalanok voltak, és a migráció legnagyobb mértékű gátlását a galektin-3 és integrin αvβ3 receptorok kombinált blokkolása esetén tapasztaltuk (17. ábra). A CXCR-4 kemokin receptor mRNS-ének relatív mennyisége jelentősen több volt a nagyobb invazivitású HT168-M1 sejtvonalban, míg a CXCL-12 ligand esetében fordított volt a helyzet: a primer tumorból származó WM35 sejtekben található nagyobb mennyiségű mRNS. Mindkét elasztin eredetű peptid szignifikánsan növelte a kemokinek expresszióját mRNS és fehérje szinten egyaránt. A scrambled peptidek hatástalanok voltak. A peptidkezelés hatására bekövetkező CXCR-4 és a CXCL-12 expressziónövekedés legnagyobb mértékű gátlását a galektin-3 és integrin αvβ3 receptorok kombinált blokkolása esetén tapasztaltuk Kísérleteinkkel igazoltuk a galektin-3 és integrin αvβ3 receptorok szerepét (17. ábra).
64
17. ábra Elasztin eredetű peptidek hatása humán melanómasejtek migrációjára. A: a migráció direkt vizsgálata kvantitatív migrációs (haptotaxis) assaysegítségével; B: a CXCR-4 expressziója a WM35 és a HT168-M1 sejtvonalakon, baloldalon: az áramlási citometria eredménye, jobb oldalon a TaqMan valósidejű PCR eredménye; C: a CXCL-12 expressziója a WM35 és a HT168-M1 sejtvonalakon, baloldalon: az áramlási citometria eredménye, jobb oldalon a TaqMan valósidejű PCR eredménye.
65
6.2.3.2. Az elasztint hasító MMP-2 és MMP-3 expressziójának vizsgálata Az elasztint hasító MMP-2 enzim mRNS-ének relatív mennyisége jelentősen több volt a nagyobb invazivitású HT168-M1 sejtvonalban, míg az MMP-3 esetében épp ellenkezőleg, a primer tumorból származó WM35 sejtek expresszálták nagyobb mennyiségben. Mindkét peptid szignifikánsan növelte az elasztint hasító MMP-2 és MMP-3 expresszióját (pozitív feed-back) mRNS és fehérje szinten egyaránt. A kevert peptidek hatástalanok voltak. A galektin-3 és EBP receptorok kombinált blokkolása esetén nem növekedett az expresszió. Kísérleteinkkel igazoltuk a galektin-3 és EBP receptorok szerepét (18. ábra).
18. ábra Elasztin eredetű peptidek hatása humán melanómasejtek MMP2 és MMP3 expressziójára. A: az MMP2 expressziója a WM35 és a HT168-M1 sejtvonalakon, baloldalon: az áramlási citometria eredménye, jobb oldalon a TaqMan valósidejű PCR eredménye; B: az MMP3 expressziója a WM35 és a HT168-M1 sejtvonalakon, baloldalon: az áramlási citometria eredménye, jobb oldalon a TaqMan valósidejű PCR eredménye.
66
6.2.3.3. Az adhézió vizsgálata Mindkét peptid szignifikánsan növelte a három vizsgált adhéziós molekula (CD44, CD54/ICAM-1 és CD56/NCAM1 sejtfelszíni expresszióját mRNS és fehérje szinten egyaránt mindkét sejtvonalon. A scrambled peptideknek semmilyen hatása nem volt. A CD44 és a CD54 mRNS szintű expressziója mindkét sejtvonal esetében közel azonos volt, míg a CD56 adhéziós molekula mRNS-ének relatív mennyisége jelentősen több volt a nagyobb invazivitású HT168-M1 sejtvonalban. A galektin-3 és az integrin αvβ3 receptorok blokkolása esetén nem változott az expresszió, így ez a két receptor felelős a hatásért (19. ábra).
D
67
E
19. ábra Elasztin eredetű peptidek hatása humán melanómasejtek adhéziójára A: az adhézió assay eredménye; B: a CD44 expressziója a WM35 és a HT168-M1 sejtvonalakon, baloldalon: az áramlási citometria eredménye, jobb oldalon a TaqMan valósidejű PCR eredménye; C: a CD54 (ICAM1) expressziója a WM35 és a HT168-M1 sejtvonalakon, baloldalon: az áramlási citometria eredménye, jobb oldalon a TaqMan valósidejű PCR eredménye; D: a CD56 (NCAM1) expressziója a WM35 és a HT168-M1 sejtvonalakon, baloldalon: az áramlási citometria eredménye, jobb oldalon a TaqMan valósidejű PCR eredménye.
68
6.2.3.4. A lymphangiogenetikus VEGF-C expressziójának vizsgálata A tumorok túlélésének és terjedésének alapvető feltétele az angiogenesis, az érképzés. Ez a folyamat egyrészt a stróma sejtjei, másrészt a tumorsejtek által termelt angiogenetikus képességgel rendelkező molekulák felszabadulásának a következménye. Ezek a molekulák az endothelsejteket indukálva érképzést, érinvánziót indítanak el a tumorban. Kísérleteink során az elasztin eredetű VGVAPG és VAPG peptidek hatását vizsgáltuk a lymphangiogenetikus képességgel rendelkező VEGF-C expressziójára. Nagyobb expressziót mértünk a HT168-M1 sejtvonalban a WM35-höz képest. A VGVAPG és VAPG peptid szignifikánsan növelte a lymphangiogenetikus VEGF-C expresszióját mindkét sejtvonalban mRNS és fehérje szinten egyaránt. A galektin-3 receptor blokkolása esetén nem növekedett az expresszió (20. ábra).
20. ábra Elasztin eredetű peptidek hatása humán melanómasejtek VEGFC expressziójára. A VEGFC expressziója (A) áramlási citometria, illetve (B) TaqMan valósidejű PCR segítségével a WM35 és a HT168-M1 sejtvonalakon.
69
7. EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE 7.1.
Az IGF1 – MAPK3 – MDR1 jelátviteli útvonal azonosítása génexpressziós microarray technológia segítségével
A nagy teljesítményű microarray módszerek elterjedése lehetővé teszi a primer és a metasztatikus vastagbéldaganatok vizsgálatát. Segítségükkel azonosíthatóvá válnak olyan gének, amelyek a daganat képződéséért, a helyi, infiltratív terjedésért, az angiogenezis
folyamatának
lokális
túlműködéséért,
a
helyi
immuntolerancia
kialakulásáért, valamint az áttétképzésért, az áttétes daganatsejtek megtelepedéséért és aktivációjáért
felelősek.
Kulcsfontosságú
gének
megtalálása
segíthet
olyan
diagnosztikus miniarray-k létrehozásában, amelyek segítségével egy szövetminta segítségével információkhoz jutunk a betegség aktuális stádiumáról és a prognózisról. A microarray vizsgálatok nem helyettesíthetik a szövettani vizsgálatot, de kiegészíthetik azt számos olyan információval, ami befolyásolhatja a klinikus döntését a terápia megválasztásában, illetve annak módosításában. Microarray vizsgálatok segítségünkre lehetnek új terápiás molekulák funkcionális vizsgálatában is, mind in vitro, mind in vivo kísérletekben. A jól beállított, standardizált microarray diagnosztika esetén lehetőség nyílik a minta feldolgozás és kiértékelés automatizációjára, ezzel a rutin számára elérhetőbbé és széles körben alkalmazhatóvá tehetők ezek a vizsgálatok. A microarray vizsgálatok nyújtotta mRNS expressziós adatok diagnosztikai célú hasznosítása már megkezdődött. A teljes genom microarray elemzések által szolgáltatott óriási adathalmaz kezelése és feldolgozása széleskörű bioinformatikai hátteret igényel. A vastagbélrák génexpressziós microarray vizsgálatának viszonylag kiterjedt irodalma van, azonban a kutatócsoportok által használt mintakezelési eljárások, microarray rendszerek, jelölési és hibridizációs technikák és elemzési módszerek nagy különbségeket mutatnak. Mindez megnehezíti az eddigi eredmények komplex megjelenítését (78).
70
A közlemények jelentős része a daganat (adenoma, carcinoma) és az ép nyálkahártya génexpressziós mintázatának összevetését tartalmazza, de született vizsgálat az áttétképző és nem áttétképző, illetve az MSI és MSS colorectális carcinomák összehasonlítására (81, 82, 142-175). Ezekben a vizsgálatokban cDNS vagy oligonukleotid microarrayt alkalmaztak, mindig valamilyen kontrollhoz viszonyítottak és ” two-way hierarchical clustering” algoritmust használtak az elemzésnél, ami során próbálják elválasztani a normál és tumoros szövetet. Az általam átnézett microarray vizsgálatokból származó adatokat táblázatba szedtem: az ép nyálkahártyához képest fokozott (11. táblázat), illetve csökkent (12. táblázat) expressziójú géneket foglaltam össze. Azokat a géneket választottam ki, amelyek az általam megvizsgált 34-ből legalább 4, egymástól független közleményben egyaránt szerepeltek.
71
11. Táblázat Fokozott génexpresszió. Az általam megvizsgált 34 microarray-tanulmány génjei, melyek fokozott expressziót mutatnak a kontrollal szemben és legalább 4, független közleményben szerepelnek.
GO kategória
Szimbólum
Gén neve
SULF1 CDH3 COL1A2 FN1 THBS2
Sulfatase 1 P-cadherin Collagen, type I, α2 Fibronectin 1 Transforming growth factor, βinduced Thrombospondin 2
CXCL3
Chemokine ligand 3
STC1
Stanniocalcin 1
TGFBI
PCNA CDC25B
RAN, member RAS oncogene family Cyclin B1 CDC28 protein kinase regulatory subunit 2 Proliferating cell nuclear antigen Cell division cycle 25B
MMP1
Mátrix metallopeptidase 1
MMP11
Mátrix metallopeptidase 11
MMP3
Mátrix metallopeptidase 3
RAN CCNB1 CKS2
EIF3S9 HSPE1 HSPCB COL3A1 SPARC ETV4 SOX4 SOX9 PRKDC TOP2A
Eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 9, 116 kDa Heat shock 10 kDa protein 1 (chaperonin 10) Heat shock 90 kDa protein 1, β Collagen, type III, alpha 1 Secreted protein, acidic, cysteine-rich (osteonectin) Ets variant gene 4 SRY (sex determining region Y)box 4 SRY (sex determining region Y)box 9 Protein kinase, DNA-activated, catalytic polypeptide Topoisomerase II alpha 170 kDa
72
Apoptosis Cell adhesion Cell adhesion Cell adhesion Cell adhesion Cell adhesion Cell–cell signaling Cell–cell signaling Signal transduction Cell cycle
Referencia 62, 65, 80, 94 62, 69, 73, 75, 81 62, 64, 65, 75, 80, 81, 94 65, 69, 81, 94 62, 63, 65, 69, 70, 73, 75, 80, 81 65, 73, 76, 81, 94 62, 80, 81, 94 73, 80, 81, 94 62, 63, 68, 69, 75, 79 70, 94, 73, 81
Cell cycle
62, 69, 75, 80, 81
DNA replication Phosphorylation Collagen catabolism Collagen catabolism Collagen catabolism
62, 65, 80, 81 62–65, 73, 75, 81 62, 65, 73, 75, 80, 81, 94 62, 65, 69, 80, 81, 94 65, 73, 81, 94
Protein biosynthesis
63, 65, 69, 80
Protein folding
62, 65, 75, 80
Protein folding Transport
62, 64, 70, 80 70, 80, 81, 94
Ossification
64, 65, 69, 78, 80, 81
Transcription
68, 73, 77, 80
Transcription
65, 68, 80, 81
Transcription
62, 68, 80, 81
DNA repair
62, 76, 80, 81
DNA replication
62, 69, 76, 81
12. Táblázat Csökkent génexpresszió. Az általam megvizsgált 34 microarray-tanulmány génjei, melyek alacsonyabb expressziót mutatnak a kontrollal szemben és legalább 4, független közleményben szerepelnek.
GO kategória
Szimbólum
Gén neve
FCGBP
Fc fragment of IgG binding protein Hydroxysteroid 11-β dehydrogenase 2
HSD11B2 GCG ADH1A ADH1C
Glucagon Alcohol dehydrogenase 1A, α polypeptide Alcohol dehydrogenase 1C, γ polypeptide
CA1
Carbonic anhydrase I
CA2
Carbonic anhydrase II
CA4
Carbonic anhydrase IV
CES2 UGT1A6 SEPP1 SLC26A2 SLC26A3 ANPEP CEACAM1 CEACAM7 CKB GPA33 SELENBP1
Carboxylesterase 2 (intestine, liver) UDP glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide A9 Selenoprotein P, plasma, 1 Solute carrier family 26 (sulfate transporter), member 2 Solute carrier family 26 (sulfate transporter), member 3 Alanyl (membrane) aminopeptidase Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 7 Creatine kinase, brain Glycoprotein A33 (transmembrane) Selenium binding protein 1
73
Referencia
Cell adhesion Cell–cell signaling Signal transduction Alcohol metabolism Alcohol metabolism 1-carbon compound metabolism 1-carbon compound metabolism 1-carbon compound metabolism
63, 65, 68, 75, 80, 81, 94
Catabolism
65, 80, 81, 94
Xenobiotic metabolism Response to oxidative stress
65, 75, 80, 81, 94 65, 71, 80, 94 73, 75, 80, 81, 94 62, 65, 75, 94 62, 63, 75, 80 62–64, 75, 80, 81, 94 62, 65, 68, 80, 94
75, 80, 81, 94 64, 65, 70, 80, 94
Transport
64, 65, 73, 81, 94
Transport
62, 65, 80, 81, 94
Angiogenesis
65, 69, 70, 73, 81, 94
Immune response
62, 65, 75, 80, 81
Unknown
65, 75, 80, 81, 94
Unknown
63, 65, 75, 80, 81
Unknown
65, 75, 81, 94
Unknown
64, 65, 80, 81
Az általam végzett irodalomkutatás következtetéseit az alábbiak szerint foglalhatom össze: 1. a gének nagyon kis hányada (kb. 2%-a) különül el a normál és tumoros szövetek között, 2. nagyon kevés az átfedés a független tanulmányok között. A génexpressziós microarray technikával történő kísérletek megtervezésére többféle megközelítési mód létezik. A biológiai útvonalak részben ismert funkciójú génjeinek kifejeződését vizsgálhatjuk kis, illetve közepes méretű array-ken (ún. útvonal-specifikus array-k). A megközelítőleg 1000 célszekvenciát tartalmazó cDNS array-hez nem szükséges különleges hibridizáció, mosási lépés és speciális leolvasó készülék. Ezek a nyitott rendszerű, jó minőségű és reprodukálható array-k hozzájárultak a microarray technológia elterjedéséhez. A kis, illetve közepes méretű, ún. általános microarray-ken a legfontosabb sejtfolyamatokkal kapcsolatos cél cDNS szekvenciák találhatók. Ezért ezek az array-k lehetőséget adnak különböző, az egyes betegségekkel összefüggő sejtfiziológiai folyamatok vizsgálatára. A teljes genomot lefedő expressziós elemzést a betegségek kialakulását, progresszióját jellemző vagy a gyógyszeres kezelés hatására bekövetkező génexpressziós változások nagy teljesítményű elemzésére, génexpressziós markerek, mintázatok azonosítására használhatjuk. A potenciális expressziós markerek validálásával és független betegcsoporton való tesztelésével a teljes genom microarray elemzések hozzájárulhatnak az emberi tumorok és más betegségek diagnosztikájához és kezeléséhez. A fenti szempontok figyelembevételével, vizsgálataimban a még kevésbé elterjedt felhasználású Agilent Whole Human Genome Oligo Microarray 4x44K (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) lemezét használtuk. A PubMed és a Google Tudós adatbázisokban végzett irodalomkutatás során megállapítottuk, hogy Agilent Whole Human Genome Oligo Microarray 4x44K platformon még nem született vastag- és végbéldaganat témában microarray vizsgálat. Kétcsatornás oligonukleotid microarray rendszerben dolgoztunk. A hibridizáció során a mintákból származó különböző fluoreszcens jelöléssel rendelkező cRNS molekulák versengenek a microarray felületén lévő, velük komplementer 60 nukleotid hosszúságú próbákhoz való kötődésért. A hibridizáció során kialakult Cy5/Cy3 jelintenzitás arány megmutatja, hogy egy adott
74
transzkriptum a tumoros szövetben milyen mértékben fejeződött ki a saját, normál nyálkahártyájához képest. A kísérleti rendszerünkben az adott beteg tumoros és a hozzá tartozó tumormenetes mintáját hasonlítottuk össze kétszínű microarray segítségével. A szigorú statisztikai értékelés mellett is jelentős génexpressziós változásokat tapasztaltunk: a nyirokcsomóáttét negatív csoportban 2314 gén, míg a távoli áttét pozitív csoportban 1496 gén változott szignifikánsan az adott beteg nem tumoros nyálkahártyájához képest. Az irodalmi adatokkal összevetve kimagaslóan sok eltérően regulálódott gént találtunk. Eredményeinket
összehasonlítottuk
a
fentebb
részletezett
34
tudományos
közleményben talált génlistákkal és azt tapasztaltuk, hogy a mások által elvégzett microarray vizsgálatok adatai alátámasztják a mi eredményeinket. Az alábbiakban felsorolom a mi kísérletünkben szignifikánsan változó top géneket, melyeket mások is megtaláltak, igazoltak különböző génexpressziós microarray kísérleteikben: 1. a tumorban túlműködő gének: a. CXCL1 (70, 81, 97, 174-176) b. CXCL2 (80, 81, 94); c. CDH3 (62, 69, 73, 75, 81); d. MMP1 (62, 65, 73, 75, 80, 81, 94); e. MMP3 (65, 73, 81, 94); f. MMP11 (62, 65, 69, 80, 81, 94). 2. a tumorban csökkent expressziót mutató gének: a. ADH1A (73, 75, 80, 81, 94); b. CXCL12 (177-179); c. CA2 (62–64, 75, 80, 81, 94). Ekkora nagyságú adtahalmazt önmagában azonban nagyon nehéz feldolgozni, interpretálni, ezért van szükség a bioinformatika segítségére. A hagyományos génexpressziós adatértékelési munkafolyamat elsősorban a statisztikailag eltérően regulálódó gének felismerésére helyezi a hangsúlyt, mely esetleg számos, valamilyen betegséghez, illetve fenotípushoz szorosan kapcsolódó gén figyelmen kívül hagyásához
75
vezethet. Emiatt a microarray kísérletekből származó adathalmazok kiterjedtebb elemzése gyakran más, alternatív statisztikai módszerek alkalmazását követeli meg, különösképpen olyan esetekben, amikor a különbözőképpen regulálódó gének száma túl alacsony vagy túl magas, mely nehézkessé teszi a biológiailag helytálló következtetések levonását. A kapott génlistákat ezért tovább elemeztük az Ingenuity Pathway Analysis (IPA) program segítségével és így vizsgáltuk a biológiai hálózatokat. Az Ingenuity Pathway Analysis program segítségével a kanonikus útvonalakat vizsgáltuk. Jól karakterizált biológiai jelátviteli utakra (”cell signaling” és ”metabolic pathways”) vetítettük rá a listánkon szereplő génexpressziós adatokat. A következő kérdésre kerestük a választ: melyik ismert jelátviteli útvonal elemei a leginkább reprezentáltak, relevánsak a listánkon. Több érdekes biológiai jelátviteli útvonalat találtunk, de ezeket már jól ismertük az irodalomból, így egy új, humán vonatkozásban eddig még egyáltalán nem vizsgált útvonal hipotézisét vizsgáltuk: az IGF1 – MAPK3 – MDR1 szignalizáció lehetőségét. Az általunk feltételezett jelátviteli út génjeinek expresszióját mind a 24-24 beteg mintáján validáltuk. Rendkívül érdekes megfigyelés volt számunkra a kemoterápiában nem részesült betegek csökkent bazális MDR1 expressziója. Az irodalmi adatoknak megfelelően jelentősen emelkedett IGFBP3 és csökkent IGF1 expressziót mértünk vissza a tumoros szövetben a hozzá tartozó tumormentes nyálkahártyához képest. Kisfokú, de szignifikáns eltérést detektáltunk a szignáltranszdukciós molekulák között: a csökkent MAPK3, p90 RSK és c-FOS expresszió mellett a MAPK3 foszfatázainak (PAC1/DUSP2 és MKP2/DUSP4) emelkedett mRNS szintjét mértük a TaqMan valósidejű PCR módszer segítségével. Feltételezéseinket fehérje szinten is igazoltuk immunhisztokémia és Western blot segítségével: az IGF-1 és a P-gp csökkent, míg az IGFBP-3 emelkedett expressziót mutatott a tumoros szövetben a hozzá tartozó nem tumoros nyálkahártyához képest. Feltételezésünket három humán vastagbéltumor-sejtvonal (HCT-116 - carcinoma, a HT-29 – adenocarcinoma, a WiDr - adenocarcinoma) esetében is bizonyítottuk Az IGF1 kezelés hatására az MDR1 által kódolt fehérje, a P-glycoprotein (P-gp, ABCB1) expressziója megnőtt mRNS és fehérje szinten egyaránt. Ezt követően MAPK inhibitorokkal igazoltuk a MAPK3 szignalizáció érintettségét. Végül funkcionális
76
vizsgálataink során azt találtuk, hogy az anti-MDR1 funkcionális gátlószer növeli a tumorsejtek adhézióját és migrációját. Az irodalomban egyedüliként Guo és munkatársai 1998-ban közöltek egy cikket (180), melyben leírták az IGF-1 P-glycoprotein aktivációt indukáló hatását az MCLM egér vastagbéltumor-sejtvonalon. De természetesen az általunk bizonyított útvonal több eleme szerepelt már tudományos cikkekben, ugyanilyen összehasonlításban és azonos irányú változást írtak le. Az IGF-1 szerepét a CRC patogenezisében már többen vizsgálták. Jenkins és munkatársai 2005-ben leírták az emelkedett IGFBP-3 és a csökkent IGF-1 expressziót a tumorsejtekben a normál nyálkahártyához képest (181). Az MDR1 expressziójának a tumorsejetekben megfigyelt csökkenését az ép nyálkahártyához képest Nakamura és munkatársai már 2002-ben leírták (182), de megtalálható Suzuki és munkatársai által közölt azoxymethane és dextran sodium sulfate (DSS) által indukált egér colon carcinoma modell globális génexpressziós vizsgálatában is (183). Az irodalmi adatok alapján elmondhatjuk, hogy nem volt minden előzmény nélküli az általunk bizonyított jelátviteli útvonal, de teljes részletességében mi igazoltuk és dolgoztuk ki először az irodalomban.
7.2.
A tumor és a stróma kapcsolatának egy aspektusa: az elasztin eredetű peptidek növelik a melanómasejtek inváziós képességét
A múlt század nyolcvanas éveitől egyre nagyobb figyelem övezte a szövetek extracelluláris mátrixállományát, mivel egyértelművé vált, hogy ennek alapvető szerepe van többek között a daganatos progresszió folyamatában is, mint a gazdaszervezet egyik olyan alkotórésze, amely állandó gátló vagy megengedő jellegű kapcsolatban van a fejlődő rosszindulatú daganattal. A folyamatban döntő szerepet játszó tényezők a mátrixreceptorok
(elsősorban
az
integrinreceptorok),
a
mátrixbontó
enzimek
(metalloproteázok, katepszinek és a plazminogénaktivátorrendszer) valamint a sejtmozgást
szabályozó
motilitási
receptorok,
illetve
az
azt
kivitelező
sejtvázmechanizmusok. A szervi mátrix fő komponensei a bazális membránok (nemcsak a hámszövet esetében) (184–186), az intersticiális kollagének, az elasztin
77
(187–189), a csont-mátrix, a keringés vitronektinje és fibrinogénje (190). Ezek az alkotóelemek szövetspecifikusak. Ugyanakkor számos mátrixfehérje mintegy ubikviter módon a legtöbb szövetben jelen van, mint a fibronektin (191) vagy a proteoglikánok (192). Ennek eredményeként a progresszió során végül is az egyes szövetekben terjedő daganatsejtek igen sokrétű és sokféle mátrixkölcsönhatásban vesznek részt. A terjedés szempontjából nem feltétlenül az adott szövet domináló mátrixfehérjéje játsza a meghatározó szerepet, sokszor jelentéktelennek tűnő, ún. minor komponens szerepe értékelődik fel. Az irodalomból ismert, hogy a melanómasejtek képesek bizonyos extracelluláris mátrix (ECM) fehérjékkel, így az elasztinnal is közvetlen, specifikus kapcsolatot létrehozni (189, 193). Feinmasser és munkatársai megállapították, hogy a nagyobb mennyiségű elasztin korrelál a melanóma rosszabb prognózisával: nyirokcsomó, vagy távoli áttét jelenlétével, magasabb Clark-level-lel, illetve nagyobb TNM értékkel (136). Több, a mátrix metalloproteináz (MMP) szupercsaládba tartozó enzim képes az elasztin fehérjét hasítani (194-196). Ezeknek az enzimeknek az expressziója különböző patológiás állapotokban megemelkedik (197, 198), elősegítve ezzel az elasztin eredetű peptidek keletkezését, melyek befolyásolják a környező sejtek homeosztázisát. Az elmúlt évtizedben több kutatócsoport is vizsgálta az elasztin eredetű peptidek hatását többféle modellsejten. Jelentős biológiai változásokat detektáltak normál és tumorsejteken egyaránt: az elasztin eredetű peptidek befolyásolták a sejtek proliferációját (199, 200), migrációját és a kemotaxist (201, 202), a tumorprogressziót (134, 203, 204) és az angiogenezist (139). Kísérleteink során az elasztin és a melanómasejtek interakciójának molekuláris részleteit próbáltuk több módszer segítségével felderíteni. Munkánk kezdetén igazoltuk az elasztin fehérje és a degradációs peptidek jelenlétét melanómás betegekből származó mintákon és elsőként bizonyítottuk a VGVAPG és VAPG elasztin eredetű peptidek és a galektin-3, integrin αvβ3, illetve elasztin-kötő fehérje (EBP) közvetlen kapcsolatát. Eredményeink azt mutatják, hogy az elasztin és a melanómasejtek interakciója meghatározó a progresszió szempontjából. Megállapítottuk, hogy a humán elasztinban többször ismétlődő, így a fehérje hasítása során nagy valószínűséggel keletkező VGVAPG és VAPG peptidek jelentősen befolyásolják a melanómasejtek biológiai viselkedését, növelik az inváziós potenciált. A tumor inváziós zónájában keletkező
78
elasztin
eredetű
peptidek
növelik
a
sejtek
migrációs
képességét
közvetlen
(kemotaktikus) és közvetett (kemokinek) hatások útján, elősegítve ezzel a tumor centrumában lévő sejtek mozgását. Az elasztin eredetű VGVAPG és VAPG peptidek jelentősen növelik az elasztint hasító MMP-2 és MMP-3 expresszióját (pozitív visszacsatolás), amivel bontják az extracelluláris mátrixot, megkönnyítik a tumor terjedését és további molekulák felszabadulását eredményezik a tumorsejtek közelében. A melanómasejtek inváziós és metasztatikus képességét erősíti a VGVAPG és VAPG elasztin eredetű peptidek adhézióra kifejtett direkt és indirekt hatása is: növelik közvetlenül a sejtek adhéziós képességét és a közvetett hatás részeként a CD44, CD54 (ICAM1), illetve a CD56 (NCAM1) adhéziós molekulák expresszióját. Az érképzés a tumorprogresszió egyik kulcsmozzanata és ebben kiemelt szerep jut az angiogenetikus molekuláknak. A melanómasejtek túlélését és érinvázióját segítheti elő az a tény, hogy az elasztin eredetű peptidek jelentősen növelték a VEGF-C expresszióját a melanómasejtekben. Eredményeinkből és más kutatócsoportok, a tumor-stróma interakció tárgykörében végzett vizsgálataiból is kitűnik, hogy át kell értékelnünk az extracelleláris mátrix rendszerének a tumorprogresszióban betöltött szerepét. A molekuláris kölcsönhatások felderítése új, lehetséges gyógyszer-támadáspontokat jelenthetnek: például a sejtmatrikin (olyan molekula, ami a mátrix hasítása során keletkezik és megváltoztatja a sejtek biológiai működését) kapcsolatban résztvevő receptorok specifikus gátlása egy ilyen új célpont lehet (205). Más extracelluláris mátrix összetevőről (laminin és fibronektin) is leírták már, hogy módosítja a sejtek fiziológiás működését: befolyásolja a sejtek adhézióját, migrációját, proliferációját, differenciációját, vagy az angiogenezis folyamatát (206). Egy fibronektin hasítása során felszabaduló fragmentumról (matrikin) leírták, hogy gátolja a tumorok növekedését, az angiogenezist és az áttétképzést (207). Az elasztin - de feltehetően más mátrix fehérjék - degradációs termékeinek, jelen esetben a VAPG peptidnek a szérumszintje alkalmas lehet a tumorprogresszió nyomon követésére (208). Ez a mátrix fehérjék (elasztin, laminin, fibronektin) és a melanómasejtek között létrejövő kapcsolat kulcsfontosságú eseménye a tumor inváziónak és az áttétképzésnek. A bőr után a tüdőbe ad leggyakrabban áttétet a melanóma, amely elasztinban a második leggazdagabb szervünk. Ezért fontos az elasztinreceptor expressziója, hiszen az
79
áttétképzés nem véletlenszerűen történik, hanem minden mozzanatában szabályozott folyamat. A fibronektin kölcsönhatás bár fontos, de nem specifikus jelensége marad a daganatos inváziónak, ami igen sokféle receptor segítségével valósulhat meg (191). A kísérletein eredményeképpen újabb receptor kerülhet a figyelem középpontjába: a minden hatás közvetítésében résztvevő galektin-3.
80
8. KÖVETKEZTETÉSEK 1. A kétcsatornás Agilent Whole Human Genome Oligo 4x44K Microarray (nyirokcsomó-áttét negatív, illetve távoli áttét pozitív vastagbél tumoros beteg tumoros nyálkahártyájának génexpresszióját hasonlítottuk össze a hozzá tartozó, tumoros sejteket nem tartalmazó, legtávolabbi nyálkahártyával) eredményeit az alábbiakban foglalom össze: (i)
szigorú
statisztikai
értékelés
mellett
is
jelentős
génexpressziós
változásokat tapasztaltunk: a nyirokcsomó-áttét negatív csoportban 2314 gén, míg a távoli áttét pozitív csoportban 1496 gén változott szignifikánsan az adott beteg nem tumoros nyálkahártyájához képest, (ii)
génontológiai elemzéssel azt találtuk, hogy a nyirokcsomó-áttét negatív csoportot több és nagyobb mértékű kemokin, citokin és extracelluláris mátrixot bontó enzim expressziója jellemezte, míg a távoli áttéttel rendelkező csoportban az adhéziós molekulák, citoszkeletális elemek és a transzportfehérjék expressziói mutattak feldúsulást,
(iii) az IPA analízist követően és a két csoport génexpressziós változásait figyelembe véve feltételeztük az IGF1 – MAPK3 – MDR1 útvonalat a humán vastagbéltumor esetében, (iv) TaqMan valósidejű PCR és immunhisztokémia segítségével igazoltuk a feltételezett útvonal expressziós változásait 24-24 betegből származó minta esetében, (v)
igazoltuk TaqMan valósidejű PCR és áramlási citometria segítségével, hogy az IGF-1 kezelés hatására megnő a P-gp expressziója mRNS és fehérje szinten három humán vastagbéltumor-sejtvonalban (HCT-116, HT-29 és WiDr),
81
(vi) igazoltuk a MAPK útvonal érintettségét U0126 és PD098059 gátlószerek segítségével, (vii) a P-gp funkcionális gátlásának hatására nőtt a tumorsejtek adhéziós és migrációs képessége.
2. A melanóma és a stróma kölcsönhatásának vizsgálata során azokra a következtetésekre jutottunk, hogy az elasztin és a melanómasejtek interakciója meghatározó a progresszió szempontjából. Az elasztin eredetű VGVAPG és VAPG peptidekről megállapítottuk: (i)
hogy kapcsolódnak a melanómasejtek felszínén található elasztinkötő fehérjéhez (EBP), a galektin-3 és az integrin αvβ3 receptorokhoz;
(ii)
direkt kemotaktikus hatást gyakorolnak a melanómasejtekre;
(iii)
indirekt módon is módosítják a migrációt: jelentősen növelik a CXCR-4 és CXCL-12 kemokinek expresszióját;
(iv)
jelentősen megnövelik az elasztint hasító MMP-2 és MMP-3 enzimek expresszióját;
(v)
növelik a sejtek adhéziós képességét és a vizsgált adhéziós molekulák expresszióját;
(vi)
és
jelentősen
növelik
expresszióját.
82
a
lymphangiogenetikus
VEGF-C
9. ÖSSZEFOGLALÁS Az elmúlt évtizedek egyik fontos kutatási területévé váltak a colorectális daganatokkal foglakozó vizsgálatok. Ennek egyik oka, hogy a vastag- és végbélrák ma is
az
egészségügy
egyik
legsúlyosabb problémája
(világszerte
a
harmadik
leggyakrabban előforduló rosszindulatú megbetegedés és a második leggyakoribb daganatos halálok). Másrészt viszonylag könnyű mintához jutni a daganat bármelyik stádiumában, sebészi, vagy endoszkópos beavatkozást követően egyaránt. Ez a tény megkönnyítette a különböző genomikai módszerek alkalmazhatóságát. Kutatásunk során a nyirokcsomó-áttét negatív és a távoli áttét pozitív vastagbéldaganatok tumoros és hozzá tartozó tumormentes szövetének génexpressziós profilját vizsgáltuk, új mechanizmusokat kerestünk a carcinogenesis folyamatában és új potenciális tumormarkereket próbálunk azonosítani, melyek hasznosak a klinikai gyakorlatban. Kétszínű, teljes genom oligonukleotid expressziós microarray-vizsgálatot terveztünk, értékeltük a szignifikánsan változó géneket és a kapott eredményeket validáltuk egy kibővített mintahalmazon, illetve humán vastagbéltumor-sejtvonalakon. Az útvonalelemzés során azt találtuk, hogy a csökkent IGF-1 expresszió csökkent MDR-1/P-gp expresszióval jár együtt, amely a MAPK-kaszkádon keresztül regulálódik. A szöveteken történt vizsgálat után eredményeinket három sejtvonalon is bizonyítottuk: az IGF-1 adását követően nőtt az MDR-1/P-gp expressziója a MAPK3 útvonalon keresztül. A tumor és a stróma kölcsönhatásának vizsgálata során az elasztin eredetű peptidek hatását tanulmányoztuk a melanómasejtek inváziós képességére. Bizonyítottuk, hogy az elasztin eredetű VGVAPG és VAPG peptidek kapcsolódnak a melanómasejtek felszínén található galektin-3, integrin αvβ3 és az elasztin-kötő fehérje receptorokhoz. Azt találtuk, hogy az elasztin eredetű peptidek növelték a melanómasejtek migrációs képességét, adhézióját, az elasztint hasító MMP-2 és MMP-3 enzimek és a lymphangiogenetikus VEGF-C expresszióját a galektin-3 receptoron keresztül. Eredményeinktől azt reméljük, hogy új megközelítést hoztak a vastagbéldaganat keletkezésének pathomechanizmusában és új alapokra helyezték az elasztin fehérje és a melanómasejtek kapcsolatát.
83
10.
SUMMARY
In the past decades, colorectal cancer became one of the main foci of cancer research. One of the reasons of this is that colorectal cancer is one of the most serious problems of the public health (the third most common cancers and the second common cause of cancer death in developed countries). On the other hand, the relative ease with which pathological specimens can be obtained by either surgery or endoscopy from different stages of tumor progression has facilitated the application of genomic technologies. In our study, we have investigated the gene expression profiles of lymph-node metastasis negative and distant metastasis positive colon cancer tissues compared to the adjacent non-cancerous mucosa from surgical resections, in order to improve our understanding of the genetic mechanism of carcinogenesis in human colorectal cancer and to identify new potential tumor markers useful for clinical practice. Two-colour whole human genome oligonucleotide microarray was carried out and significantly deregulated genes were analyzed. Our results were validated on extended pieces of specimens of human colorectal cancer and on colon cancer cell lines. In the course of pathway analysis we found that the decreased level of IGF-1 was associated with the decreased level of MDR1/P-gp and regulated via the MAPK-cascade. After the validation on tissue samples we provided evidence that increased IGF-1 resulted in the increased expression of MDR1/P-gp via the MAPK signaling pathway in three human colon cancer cell lines. We focused on the tumor-stroma interaction as well and we investigated the effects of elastin-derived peptides on the invasion potential of melanoma cells. We provide evidence that VGVAPG and VAPG elastin-derived peptides bind directly to three cell surface receptors: galectin-3, integrin αvβ3 and elastin-binding protein. We found that EDPs increase the migration, the adhesion, the expression of the elastin-degrading MMP-2 and MMP-3 enzymes and the expression of the lymphangiogenic VEGF-C of melanoma cells via the galectin-3 receptor. Our data gives new insights into the genetic mechanisms underlying neoplastic transformation of colorectal cells and into the interaction of elastin protein and melanoma cells.
84
11. 1.
IRODALOMJEGYZÉK Ferlay J, Autier P, Boniol M, Heanue M, Colombet M and Boyle P. (2007) Estimates of the cancer incidence and mortality in Europe in 2006. Ann Oncol, 18: 581–592.
2.
Bosetti C, Bertuccio P, Levi F, Lucchini F, Negri E, La Vecchia C. (2008) Cancer mortality in the European Union, 1970-2003, with a joinpoint analysis. Ann Oncol, 19: 631-40.
3.
Jemal A, Siegel R, Ward E, Hao Y, Xu J, Thun MJ. (2009) Cancer statistics, 2009 CA Cancer J Clin, 59: 225-49.
4.
Quinn MJ, d'Onofrio A, Møller B, Black R, Martinez-Garcia C, Møller H, Rahu M, Robertson C, Schouten LJ, La Vecchia C, Boyle P. (2003) Cancer mortality trends in the EU and acceeding states up to 2015. Ann Oncol, 14: 1148–1152.
5.
Weitz J, Koch M, Debus J, Hohler T, Galle PR, Buchler MW. (2005) Colorectal cancer. Lancet, 365: 153-65.
6.
Parkin DM. (2001) Global cancer statistics in the year 2000. Lancet Oncol, 2: 533-543.
7.
Kasler M. (2005) Current state and future perspectives of oncology care in Hungary based on epidemiologic data. Orv Hetil, 146: 1519-30.
8.
Otto S, Kasler M. (2005) Trends in cancer mortality and morbidity in Hungarian and international statistics. Characteristics and potential outcome of public health screening programmes. Magy Onkol, 49: 99-101.
9.
Gaudi I, Kásler M. (2002) A rosszindulatú daganatos halálozás változása 1975 és 2001 között Magyarországon. Magyar Onkol, 4: 291-296.
10.
Grady WM. (2003) Genetic testing for high-risk colon cancer patients. Gastroenterology, 124: 1574-1594.
11.
Kemp Z, Thirlwell C, Sieber O, Silver A, Tomlinson I. (2004) An update on the genetics of colorectal cancer. Hum Mol Genet, Vol. 13, Review Issue R177– R185
12.
Howell WM, Calder PC, Grimble RF. (2002) Gene polymorphisms, inflammatory diseases and cancer. Proc Nutr Soc, 61: 447-56. Review.
85
13.
Rozen P, Fireman Z, Figer A, Legum C, Ron E, Lynch HT. (1987) Family history of colorectal cancer as a marker of potential malignancy within a screening program. Cancer, 60: 248-54.
14.
Johns LE, Houlston RS. (2001) A systematic review and meta-analysis of familial colorectal cancer risk. Am J Gastroenterol, 96: 2992-3003.
15.
Fuchs CS, Giovannucci EL, Colditz GA, Hunter DJ, Speizer FE, Willet WC. (1994) A prospective study of family history and the risk of colorectal cancer. N Engl J Med, 331: 1669-74.
16.
Kewenter J, Ahlman H, Hultén L. (1978) Cancer risk in extensive ulcerative colitis. Ann Surg, 188: 824-8
17.
Hendriksen C, Kreiner S, Binder V. (1985) Long term prognosis in ulcerative colitis-based on results from a regional patient group from the county of Copenhagen. Gut, 26: 158-63.
18.
Gyde SN, Prior P, Allan RN, Stevens A, Jewell DP, Truelove SC, Lofberg R, Brostrom O, Hellers G. (1988) Colorectal cancer in ulcerative colitis: a cohort study of primary referrals from three centres. Gut, 29: 206-17.
19.
Gillen CD, Walmsley RS, Prior P, Andrews HA, Allan RN. (1994) Ulcerative colitis and Crohn's disease: a comparison of the colorectal cancer risk in extensive colitis. Gut, 35: 1590-2.
20.
Campos FG, Logullo Waitzberg AG, Kiss DR, Waitzberg DL, Habr-Gama A, Gama-Rodrigues J. (2005) Diet and colorectal cancer: current evidence for etiology and prevention. Nutr Hosp, 20: 18-25. Review.
21.
Brink M, de Goeij AF, Weijenberg MP, Roemen GM, Lentjes MH, Pachen MM, Smits KM, de Bruïne AP, Goldbohm RA, van den Brandt PA. (2003) K-ras oncogene mutations in sporadic colorectal cancer in The Netherlands Cohort Study. Carcinogenesis, 24: 703-710
22.
Hawk ET, Umar A, Viner JL. (2004) Colorectal cancer chemoprevention--an overview of the science. Gastroenterology, 126: 1423-47.
23.
Glade MJ. (1999) Food, nutrition, and the prevention of cancer: a global perspective. Nutrition, 15: 523-6.
24.
Singh PN, Fraser GE. (1998) Dietary risk factors for colon cancer in a low-risk population. Am J Epidemiol, 148: 761-74.
86
25.
Slattery ML, Potter J, Caan B, Edwards S, Coates A, Ma KN, Berry TD. (1997) Energy balance and colon cancer-beyond physical activity. Cancer Res, 57: 7580.
26.
Willet WC,Stampfer MJ, Colditz GA, Rosner BA, Speizer FE. (1990) Relation of meat, fat and fiber intake to the risk of colon cancer in a prospective study among women. N Engl J Med, 323: 1664.
27.
Key TJ, Fraser GE, Thorogood M, Appleby PN, Beral V, Reeves G, Burr ML, Chang-Claude J, Frentzel-Beyme R, Kuzma JW, Mann J, McPherson K. (1999) Mortality in vegetarians and nonvegetarians: detailed findings from a collaborative analysis of 5 prospective studies. Am J Clin Nutr, 70: 516S-524S.
28.
Howe GR, Aronson KJ, Benito E, Castelleto R, Cornee J, Duffy S, Gallagher RP, Iscovich JM, Deng-ao J, Kaaks R, Kune GA, Kune S, Lee HP, Lee M, Miller AB, Peters RK, Potter JD, Riboli E, Slattery ML, Trichopoulos D, Tuyns A, Tzonou A, Watson LF, Whittemore AS, Shu Z. (1997) The relationship between dietary fat intake and risk of colorectal cancer: evidence from the combined analysis of 13 case-control studies. Cancer Causes Control, 8: 215-28.
29.
Schatzkin A, Lanza E, Corle D, Lance P, Iber F, Caan B, Shike M, Weissfeld J, Burt R, Cooper MR, Kikendall JW, Cahill J. (2000) Lack of effect of a low-fat, high-fiber diet on the recurrence of colorectal adenomas. Polyp Prevention Trial Study Group. N Engl J Med, 342: 1149-55.
30.
Alberts DS, Martinez ME, Roe DJ, Guillen-Rodriguez JM, Marshall JR, van Leeuwen JB, Reid ME, Ritenbaugh C, Vargas PA, Bhattacharyya AB, Earnest DL, Sampliner RE. (2000) Lack of effect of a high-fiber cereal supplement on the recurrence of colorectal adenomas. Phoenix Colon Cancer Prevention Physicians' Network. N Engl J Med, 342: 1156-62.
31.
Potter JD. (1999) Colorectal cancer: molecules and populations. J Natl Cancer Inst, 91: 916-32.
32.
Halpern AC, Altman JF. (1999) Genetic predisposition to skin cancer. Curr Opin Oncol, 11: 132-138.
33.
Schneider I: A bőr daganatos betegségei. In: Dobozy A, Farkas B, Horváth A, Hunyadi J, Schneider I. (2004) Bőrgyógyászt. 3. kiadás Eklektikon Kiadó Budapest, 10: 262-265.
87
34.
Slominski A, Wortsman J, Carlson AJ, Matsuoka LY, Balch CM, Mihm CM. (2001) Maliganant melanoma. Arch Pathol Lab Med, 125: 1295-1306.
35.
Weedon D: Lentigines, nevi, and melanomas. (2002) In Weedon D: Skin pathology, 2nd ed. Edinburgh, Churchill Livingstone, 803-858.
36.
Lens
MB,
Dawes
M.
(2004)
Global
perspectives
of
contemporary
epidemiological trends of cutaneous malignant melanoma. Br J Dermatol, 150: 179-85. 37.
Chin L, Merlino G, DePinho RA. (1998) Malignant melanoma: modern black plague and genetic black box. Genes Dev, 12: 3467-81.
38.
Boukamp P. UV-induced skin cancer: similarities--variations. (2005) J Dtsch Dermatol Ges, 3: 493-503.
39.
Bardeesy N, Kim M, Xu J, Kim RS, Shen Q, Bosenberg MW, Wong WH, Chin L. (2005) Role of epidermal growth factor receptor signaling in RAS-driven melanoma. Mol Cell Biol, 25: 4176-88.
40.
Hurks HM, Metzelaar-Blok JA, Barthen ER, Zwinderman AH, De WolffRouendaal D, Keunen JE, Jager MJ. (2000) Expression of epidermal growth factor receptor: risk factor in uveal melanoma. Invest Ophthalmol Vis Sci, 41: 2023-7.
41.
Olah J, Dobozy A. (2003) [The new TNM classification of malignant melanoma]. Magy Onkol, 47: 59-61.
42.
Somlai B. (2003) [Clinical characteristics of melanoma metastasis]. Magy Onkol, 47: 85-8.
43.
Wolmark N, Fisher B, Rockette H, Redmond C, Wickerham DL, Fisher ER, Jones J, Glass A, Lerner H, Lawrence W. (1988) Postoperative adjuvant chemotherapy or BCG for colon cancer: results from NSABP protocol C-01. J Natl Cancer Inst, 80: 30-6.
44.
Hofbauer GGL, Kamarashev J, Geertsen R, Boni R, Dummer R. (1998) Melan A/MART-1 immunoreactivity in formalin-fixed paraffin-embedded primary and metastatic melanoma: frequency and distribution. Melanoma Res, 8: 337-343.
45.
Sutton HE. (1965) Quantitative gene action in man. Ann.Genet, 8: 87-88
46.
Jackson SP, Bartek J. (2009) The DNA-damage response in human biology and disease. Nature 461: 1071-8. Review.
88
47.
Heavey PM, McKenna D, Rowland IR. (2004) Colorectal cancer and the relationship between genes and the environment. Nutr Cancer, 48: 124-41. Review.
48.
Fearon ER, Vogelstein B. (1990) A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell, 61: 759-67.
49.
Vogelstein B, Fearon ER, Hamilton SR, Kern SE, Preisinger AC, Leppert M, Nakamura Y, White R, Smits AM, Bos JL. (1988) Genetic alterations during colorectal-tumor development. N Engl J Med, 319: 525-32.
50.
Markowitz SD, Bertagnolli MM. (2009) Molecular origins of cancer: Molecular basis of colorectal cancer. N Engl J Med, 361: 2449-60. Review.
51.
Giles RH, van Es JH, Clevers H. (2003) Caught up in a Wnt storm: Wnt signaling in cancer. Biochim Biophys Acta, 1653: 1-24. Review.
52.
Eberhart CE, Coffey RJ, Radhika A, Giardiello FM, Ferrenbach S, DuBois RN. (1994) Up-regulation of cyclooxygenase 2 gene expression in human colorectal adenomas and adenocarcinomas. Gastroenterology, 107: 1183-8.
53.
Span M, Moerkerk PT, De Goeij AF, Arends JW. (1996) A detailed analysis of K-ras point mutations in relation to tumor progression and survival in colorectal cancer patients. Int J Cancer, 69: 241-5.
54.
Ranaldi R, Gioacchini AM, Manzin A, Clementi M, Paolucci S, Bearzi I. (1995) Adenoma-carcinoma sequence of colorectum. Prevalence of K-ras gene mutation in adenomas with increasing degree of dysplasia and aneuploidy. Diagn Mol Pathol, 4: 198-202.
55.
Zhou S, Buckhaults P, Zawel L, Bunz F, Riggins G, Dai JL, Kern SE, Kinzler KW, Vogelstein B. (1998) Targeted deletion of Smad4 shows it is required for transforming growth factor beta and activin signaling in colorectal cancer cells. Proc Natl Acad Sci, 95: 2412-6.
56.
Riggins GJ, Kinzler KW, Vogelstein B, Thiagalingam S. (1997) Frequency of Smad gene mutations in human cancers. Cancer Res, 57: 2578-80.
57.
Eppert K, Scherer SW, Ozcelik H, Pirone R, Hoodless P, Kim H, Tsui LC, Bapat B, Gallinger S, Andrulis IL, Thomsen GH, Wrana JL, Attisano L. (1996) MADR2 maps to 18q21 and encodes a TGFbeta-regulated MAD-related protein that is functionally mutated in colorectal carcinoma. Cell, 86: 543-52.
89
58.
Jen J, Powell SM, Papadopoulos N, Smith KJ, Hamilton SR, Vogelstein B, Kinzler KW. (1994) Molecular determinants of dysplasia in colorectal lesions. Cancer Res, 54: 5523-6.
59.
Rupnarain C, Diamini Z, Naicker S, Bhoola K. (2004) Colon cancer: genomics and apoptotic events. Biol Chem, 385: 449-64.
60.
Shih IM, Zhou W, Goodman SN, Lengauer C, Kinzler KW, Vogelstein B. (2001) Evidence that genetic instability occurs at an early stage of colorectal tumorigenesis. Cancer Res, 61: 818-22.
61.
Houlston RS. (2001) What we could do now: molecular pathology of colorectal cancer. Mol Pathol, 54: 206-14.
62.
Caron de Fromentel C, Soussi T. (1992) TP53 tumor suppressor gene: a model for investigating human mutagenesis. Genes Chromosomes Cancer, 4: 1-15.
63.
Oren M, Rotter V. (1999) Introduction: p53-the first twenty years. Cell Mol Life Sci, 55: 9-11.
64.
May P, May E. (1999) Twenty years of p53 research: structural and functional aspects of the p53 protein. Oncogene, 18: 7621-36.
65.
Lane DP. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 1992 Jul 2;358(6381):15-6.
66.
Menke H. Gasztroenterológia. Belgyógyászat, szerkesztı: Herold G. Budapest: B+V Medical Kiadó; 2001. 347-485.
67.
Fearnhead NS, Wilding JL, Bodmer WF. Genetics of colorectal cancer: hereditary aspects and overview of colorectal tumorigenesis. Br Med Bull. 2002;64:27-43.
68.
Lakatos Péter László, Lakatos László. (2006) A herediter és sporadikus colorectalis daganatok genetikája és a genetikai ismeretek jelentősége a mindennapi gyakorlatban. Orv Hetil, 147: 363-8.
69.
Itzkowitz SH, Yio X. (2004) Inflammation and cancer IV. Colorectal cancer in inflammatory bowel disease: the role of inflammation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 287: G7-17.
70.
Brentnall TA, Crispin DA, Rabinovitch PS, Haggitt RC, Rubin CE, Stevens AC, Burmer GC. (1994) Mutations in the p53 gene: an early marker of neoplastic progression in ulcerative colitis. Gastroenterology, 107: 369-78.
90
71.
Chin L. (2003) The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nat Rev Cancer, 3: 559.
72.
Cannon-Albright LA. (1992) Assignment of a locus for familial melanoma, MLM, to chromosome 9p13-p22. Science, 258: 1148.
73.
Hussussian CJ, et al. (1994) Germline p16 mutations in familial melanoma. Nature Genet, 8: 15.
74.
Soufir N, et al. (1998) Prevalence of p16 and CDK4 germline mutations in 48 melanoma-prone families in France. The French Familial Melanoma Study Group. Hum Mol Genet, 7: 209.
75.
Davies H, et al. (2002) Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature, 417: 949.
76.
Pollock PM, et al. (2002) High frequency of BRAF mutations in nevi. Nat Genet, 33: 19.
77.
Iványi A: Bőrpatológia. In: Kopper L, Schaff Zs. (2004) Patológia. 1. kiadás Medicina Könyvkiadó Budapest, 27: 1352-1356.
78.
Cardoso J, Boer J, Morreau H, Fodde R. (2007) Expression and genomic profiling of colorectal cancer. Biochim Biophys Acta, 1775: 103-37. Review.
79.
Knosel T, Schluns K, Dietel M, Petersen I. (2005) Chromosomal alterations in lung metastases of colorectal carcinomas: associations with tissue specific tumor dissemination. Clin Exp Metastasis, 22: 533-538,
80.
Nosho K, Yamamoto H, Takamaru H, Hamamoto Y, Goto A, Yoshida Y, Arimura Y, Endo T, Hirata K, Imai K. (2005) A case of colorectal carcinoma in adenoma analyzed by a cDNA array. Int J Colorectal Dis, 20: 287-91.
81.
Nosho K, Yamamoto H, Adachi Y. (2005) Gene expression profiling of colorectal adenomas and early invasive carcinomas by cDNA array analysis. Br J Cancer, 92: 1193–1200.
82.
Agrawal D, Chen T, Irby R. (2002) Osteopontin identified as lead marker of colon cancer progression, using pooled sample expression profiling. J Natl Cancer Inst, 94: 513–521.
83.
Van der Flier LG, Sabates-Bellver J, Oving I, Haegebarth A, De Palo M, Anti M, Van Gijn ME, Suijkerbuijk S, Van de Wetering M, Marra G, Clevers H. (2007) The Intestinal Wnt/TCF Signature. Gastroenterology, 132: 628-32.
91
84.
Langmann T, Moehle C, Mauerer R, Scharl M, Liebisch G, Zahn A, Stremmel W, Schmitz G. (2004) Loss of detoxification in inflammatory bowel disease: dysregulation of pregnane X receptor target genes. Gastroenterology, 127: 2640.
85.
Lawrance IC, Fiocchi C, Chakravarti S. (2001) Ulcerative colitis and Crohn's disease: distinctive gene expression profiles and novel susceptibility candidate genes. Hum Mol Genet, 10: 445-56.
86.
Okahara S, Arimura Y, Yabana T, Kobayashi K, Gotoh A, Motoya S, Imamura A, Endo T, Imai K. (2005) Inflammatory gene signature in ulcerative colitis with cDNA macroarray analysis. Aliment Pharmacol Ther, 21: 1091-7.
87.
Uthoff SM, Eichenberger MR, Lewis RK, Fox MP, Hamilton CJ, McAuliffe TL, Grimes HL, Galandiuk S. (2001) Identification of candidate genes in ulcerative colitis and Crohn's disease using cDNA array technology. Int J Oncol, 19: 80310.
88.
Puleston J, Cooper M, Murch S, Bid K, Makh S, Ashwood P, Bingham AH, Green H, Moss P, Dhillon A, Morris R, Strobel S, Gelinas R, Pounder RE, Platt A. (2005) A distinct subset of chemokines dominates the mucosal chemokine response in inflammatory bowel disease. Aliment Pharmacol Ther, 21: 109-20.
89.
Mannick EE, Bonomolo JC, Horswell R, Lentz JJ, Serrano MS, Zapata-Velandia A, Gastanaduy M, Himel JL, Rose SL, Udall JN Jr, Hornick CA, Liu Z. (2004) Gene expression in mononuclear cells from patients with inflammatory bowel disease. Clin Immunol, 112: 247-57.
90.
de Wit NJ, Rijntjes J, Diepstra JH, van Kuppevelt TH, Weidle UH, Ruiter DJ, van Muijen GN. (2005) Analysis of differential gene expression in human melanocytic tumour lesions by custom made oligonucleotide arrays. Br J Cancer, 92: 2249-61.
91.
Pavey S, Johansson P, Packer L, Taylor J, Stark M, Pollock PM, Walker GJ, Boyle GM, Harper U, Cozzi SJ, Hansen K, Yudt L, et al. (2004) Microarray expression profiling in melanoma reveals a BRAF mutation signature. Oncogene, 23: 4060-7.
92.
Mirmohammadsadegh A, Baer A, Nambiar S, Bardenheuer W, Hengge UR. (2004) Rapid identification of dysregulated genes in cutaneous malignant
92
melanoma metastases using cDNA technology. Cells Tissues Organs, 177: 11923. 93.
Wang E, Panelli MC, Zavaglia K, Mandruzzato S, Hu N, Taylor PR, Seliger B, Zanovello P, Freedman RS, Marincola FM. (2004) Melanoma-restricted genes. J Transl Med, 2: 34.
94.
Hoek K, Rimm DL, Williams KR, Zhao H, Ariyan S, Lin A, Kluger HM, Berger AJ, Cheng E, Trombetta ES, Wu T, Niinobe M, et al. (2004) Expression profiling reveals novel pathways in the transformation of melanocytes to melanomas. Cancer Res, 64: 5270-82.
95.
Nambiar S, Mirmohammadsadegh A, Doroudi R, Gustrau A, Marini A, Roeder G, Ruzicka T, Hengge UR. (2005) Signaling networks in cutaneous melanoma metastasis identified by complementary DNA microarrays. Arch Dermatol, 141: 165-73.
96.
Gyorffy B, Lage H. (2007) A Web-based data warehouse on gene expression in human malignant melanoma. J Invest Dermatol, 127: 394-9.
97.
Zhou Y, Dai DL, Martinka M, Su M, Zhang Y, Campos EI, Dorocicz I, Tang L, Huntsman D, Nelson C, Ho V, Li G. (2005) Osteopontin expression correlates with melanoma invasion. J Invest Dermatol, 124: 1044-52.
98.
Haqq C, Nosrati M, Sudilovsky D, Crothers J, Khodabakhsh D, Pulliam BL, Federman S, Miller JR, 3rd, Allen RE, Singer MI, Leong SP, Ljung BM, et al. (2005) The gene expression signatures of melanoma progression. Proc Natl Acad Sci, 102: 6092-7.
99.
Winnepenninckx V, Lazar V, Michiels S, Dessen P, Stas M, Alonso SR, Avril MF, Ortiz Romero PL, Robert T, Balacescu O, Eggermont AM, Lenoir G, et al. (2006) Gene expression profiling of primary cutaneous melanoma and clinical outcome. J Natl Cancer Inst, 98: 472-82.
100. Bittner M, Meltzer P, Chen Y, Jiang Y, Seftor E, Hendrix M, Radmacher M, Simon R, Yakhini Z, Ben-Dor A, Sampas N, Dougherty E, et al. (2000) Molecular classification of cutaneous malignant melanoma by gene expression profiling. Nature, 406: 536-40. 101. Hofmann UB, Westphal JR, van Muijen GNP, Ruiter DJ. (2000) Mátrix metalloproteinases in human melanoma. J Invest Dermatol, 115: 337-344.
93
102. Nikkola J, Vihinen P, Vlaykova T, Hahka-Kemppinen M, Kahari VM, Pyrhonen S. (2002) High expression levels of collagenase-1 and stromelysin-1 correlate with shorter disease-free survival in human metastatic melanoma. Int J Cancer, 97: 432-8. 103. Itoh T, Tanioka M, Yoshida H et al. (1998) Reduced angiogenesis and tumor regression in gelatinase A deficient mice. Cancer Res, 58: 1048-51. 104. Seiki M. (2002) The cell surface: the stage for mátrix metalloproteinase regulation of migration. Curr Opin Cell Biol, 14: 624-632. 105. Dietrich A, Tanczos E, Vanscheidt W, Schopf E, Simon JC. (1997) The cell surface glycoprotein CD44 has been implicated in the progression and metastasis of certain human tumours including malignant melanoma (MM). Eur J Cancer, 33: 926-930. 106. Ahrens T, Assmann V, Fieber C, Termeer CC, Herrlich P, Hofmann M, Simon JC. (2001) CD44 is the principal mediator of hyaluronic-acid-induced melanoma cell proliferation. J Invest Dermatol, 116: 93-101. 107. Weber GF, Bronson RT, Hagan J, Cantor H, Schmits R, Mak TW. (2002) Absence of the CD44 gene prevents sarcoma metastasis. Cancer Res; 62: 22812286. 108. Takahashi K, Eto H, Tanabe KK. (1999) Involvement of CD44 in mátrix metalloproteinase-2 regulation in human melanoma cells. Int J Cancer, 80: 387395. 109. Yu Q, Stamenkovic I. (1999) Localization of mátrix metalloproteinase 9 to the cell surface provides a mechanism for CD44-mediated tumor invasion. Genes Dev, 13: 35-48. 110. Johnson JP, Stade BG, Holzmann B, Schwäble W, Riethmüller G. (1989) De novo expression of intercellular-adhesion molecule 1 in melanoma correlates with increased risk of metastasis. Proc Natl Acad Sci, 86: 641-644. 111. Cunningham BA, Hemperly JJ, Murray BA, Prediger EA, Brackenbury R, Edelman
GM.
(1987)
Neural
cell
adhesion
molecule:
structure,
immunoglobulin-like domains, cell surface modulation, and alternative RNA splicing. Science, 236: 799-806.
94
112. Miettinen M, Cupo W. (1993)Neural cell adhesion molecule distribution in soft tissue tumors. Hum Pathol, 24: 62-66. 113. Cardones AR, Murakami T, Hwang ST. (2003) CXCR4 enhances adhesion of B16 tumor cells to endothelial cells in vitro and in vivo via β(1) integrin. Cancer Res, 63: 6751-7. 114. Robledo MM, Bartolome RA, Longo N, et al. (2001) Expression of functional chemokine receptors CXCR3 and CXCR4 on humanmelanoma cells. J Biol Chem, 276: 45098-105. 115. Bartolomé RA, Gálvez BG, Longo N, Baleux F, Van Muijen GNP, SánchezMateos P, Arroyo AG, Teixidó J. (2004) Stromal cell-derived factor-1α promotes melanoma cell invasion across basement membranes involving stimulation of membrane-type 1 mátrix metalloproteinase and Rho GTPase activities. Cancer Res, 64: 2534-2543. 116. Simonetti O, Lucarini G, Brancorsini D, et al. (2002) Immunohistochemical expression of vascular endothelial growth factor, mátrix metalloproteinase 2 and mátrix metalloproteinase 9 in cutaneous melanocytic lesions. Cancer, 95: 19631970. 117. Goydos JS and Gorski DH. (2003) Vascular endothelial growth Factor C mRNA expression correlates with stage of progression in patients with melanoma. Clin Cancer Res, 9: 5962-5967. 118. Ruiter D, Bogenrieder T, Elder D, Herlyn M. (2002) Melanoma-stroma interactions: structural and functional aspects. Lancet Oncol, 3: 35-43. 119. Fiedler IJ. (1995) Modulation of the organ microenvironment for treatment of cancer metastasis. J Natl Cancer Inst, 87: 1588-92. 120. Liotta LA, Kohn EC. (2001) The microenvironment of the tumor-hos interface. Nature, 411: 375-9. 121. Park CC, Bissell MJ Barcellos-Hoff MH. (2000) The influence of the microenvironment on the malignant phenotype. Mol Med Today, 6: 324-9. 122. Lazar-Molnar E, Hegyesi H, Toth S, Falus A. (2000) Autocrine and paracrine regulation of cytokines and growth factors in melanoma. Cytokine, 12: 547-554. 123. Forsberg K, Valyi-Nagy I, Heldin CH, Herlyn M, Westermark B. (1993) Platelet-derived growth factor (PDGF) in oncogenesis: development of a
95
vascular connective tissue stroma in xenotransplanted human melanoma producing PDGF-BB. Proc Natl Acad Sci USA, 90: 393-397. 124. Stamenkovic I. (2003) Extracellular mátrix remodelling: the role of mátrix metalloproteinases (review article). J Pathol; 200: 448-64. 125. Le Poole IC, Riker AI, Quevedo ME. (2002) Interferon-gamma reduces melanosomal antigen expression and recognition of melanoma cells by cytotoxic T cells Am J Pathol, 160: 521-528. 126. Sandberg LB, Soskel NT, Leslie JG. (1981) Elastin structure, biosynthesis, and relation to disease states. N Engl J Med, 304: 566-579. 127. Senior RM, Griffin GL, Mecham RP, Wrenn DS, Prasad KU, Urry DW. (1984) Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly, a repeating peptide in elastin, is chemotactic for fibroblasts and monocytes. J Cell Biol, 99: 870-874. 128. Hornebeck W, Tixier JM, Robert L. (1986) Inducible adhesion of mesenchymal cells to elastic fibers: elastonectin. Proc Natl Acad Sci, 83: 5517-5520. 129. Netland PA, Zetter BR (1986) Melanoma cell adhesion to defined extracellular mátrix components. Biochem Biophys Res Commun, 139: 515-522. 130. Tobias JW, Bern MM, Netland PA, Zetter BR (1987) Monocyte adhesion to subendothelial components Blood, 69: 1265-1268. 131. Robert L, Jacob MP, Fülöp T, Tímár J, Hornebeck W (1989) Elastonectin and the elastin receptor. Pathol Biol, 37: 736-741. 132. Hinek A, Wrenn DS, Mecham RP, Barondes SH. (1988) The elastin receptor: a galactoside binding protein. Science, 239: 1539-1541. 133. Mecham RP, Hinek A, Entwistle R, Wrenn DS, Griffin GL, Senior RM. (1989) Elastin binds to a multifunctional 67 kDa peripheral membrane protein. Biochemistry, 28: 3716-3722. 134. Tímár J, Lapis K, Fülöp T, Tixier JM, Robert L, Hornebeck W. (1991) Interaction between elastin and tumor cell lines with different metastatic potential, in vitro and in vivo studies. J Cancer Clin Oncol, 117: 232-238. 135. Silletti S, Paku S, Raz A. (1997) Tumor cell motility and metastasis. Pathol Oncol Res, 3: 230-254. 136. Feinmesser M, Schachter JM, Tobar A, Sulkes J, Gutman H, Kruk N, Okon E (2002) Relationship of tumorigenic malignant melanomas to dermal elastin: An
96
expression of tumor/stromal Interaction that may be related to prognosis. Am J Dermatopathol, 24: 108-17. 137. Ntayi C, Labrousse AL, Debret R, Birmbault P, Bellon G, Antonicelli F, Hornebeck W and Bernard P. (2004) Elastin-derived peptides up-regulate mátrix metalloproteinase-2 (MMP-2)-mediated melanoma cells invasion through elastin binding protein. J Invest Dermatol, 122: 256-265. 138. Brassart B, Fuchs P, Huet E, Alix AJ, Wallach J, Tamburro AM, Delacoux F, Haye B, Emonard H and Hornebeck W. (2001) Conformational dependence of collagenase (mátrix metalloproteinase-1) up-regulation by elastin peptides in cultured fibroblasts. J Biol Chem, 276: 5222-5227. 139. Robinet A, Fahem A, Cauchard JH, Huet E, Vincent L, Lorimier S, Antonicelli F, Soria C, Crepin M, Hornebeck W and Bellon G. (2005) Elastin-derived peptides enhance angiogenesis by promoting endothelial cell migration and tubulogenesis through upregulation of MT1-MMP. J Cell Sci, 118: 343-356. 140. Lapis K, Timar J. (2002) Role of elastin-mátrix interactions in tumor progression. Semin Cancer Biol, 12:209-17. 141. Labrousse AL, Ntayi C, Hornebeck W, Bernard P. (2004) Stromal reaction in cutaneous melanoma. Crit Rev Oncol Hematol, 49: 269-275. 142. Alon U, Barkai N, Notterman DA. (1999) Broad patterns of gene expression revealed by clustering analysis of tumor and normal colon tissues probed by oligonucleotide arrays. Proc Natl Acad Sci, 96: 6745–6750. 143. Notterman DA, Alon U, Sierk AJ, Levine AJ. (2001) Transcriptional gene expression profiles of colorectal adenoma, adenocarcinoma, and normal tissue examined by oligonucleotide arrays. Cancer Res. 61: 3124–3130. 144. Kitahara O, Furukawa Y, Tanaka T. (2001) Alterations of gene expression during colorectal carcinogenesis revealed by cDNA microarrays after lasercapture microdissection of tumor tissues and normal epithelia. Cancer Res, 61: 3544–3549. 145. Takemasa I, Higuchi H, Yamamoto H. (2001) Construction of preferential cDNA microarray specialized for human colorectal carcinoma: molecular sketch of colorectal cancer. Biochem Biophys Res Commun, 285: 1244–1249.
97
146. Birkenkamp-Demtroder K, Christensen LL, Olesen SH. (2002) Gene expression in colorectal cancer. Cancer Res, 62: 4352–4363. 147. Zou TT, Selaru FM, Xu Y. (2002) Application of cDNA microarrays to generate a molecular taxonomy capable of distinguishing between colon cancer and normal colon. Oncogene, 21: 4855–4862. 148. Ichikawa Y, Ishikawa T, Takahashi S. (2002) Identification of genes regulating colorectal carcinogenesis by using the algorithm for diagnosing malignant state method. Biochem Biophys Res Commun, 296: 497–506. 149. Bertucci F, Salas S, Eysteries S. (2004) Gene expression profiling of colon cancer by DNA microarrays and correlation with histoclinical parameters. Oncogene, 23: 1377–1391. 150. Koehler A, Bataille F, Schmid C. (2004) Gene expression profiling of colorectal cancer and metastases divides tumours according to their clinicopathological stage. J Pathol, 204: 65–74. 151. Kwon HC, Kim SH, Roh MS. (2004) Gene expression profiling in lymph nodepositive and lymph node-negative colorectal cancer. Dis Colon Rectum, 47: 141–152. 152. Barrier A, Lemoine A, Boelle PY. (2005) Colon cancer prognosis prediction by gene expression profiling. Oncogene, 24: 6155-64. 153. D'Arrigo A, Belluco C, Ambrosi A. (2005) Metastatic transcriptional pattern revealed by gene expression profiling in primary colorectal carcinoma. Int J Cancer, 115: 256-62. 154. Birkenkamp-Demtroder K, Olesen SH, Sorensen FB. (2005) Differential gene expression in colon cancer of the caecum versus the sigmoid and rectosigmoid. Gut, 54: 374–384. 155. Komuro K, Tada M, Tamoto E. (2005) Right- and left-sided colorectal cancers display distinct expression profiles and the anatomical stratification allows a high accuracy prediction of lymph node metastasis. J Surg Res, 124: 216–224. 156. Lin YM, Furukawa Y, Tsunoda T. (2002) Molecular diagnosis of colorectal tumors by expression profiles of 50 genes expressed differentially in adenomas and carcinomas. Oncogene, 21: 4120–4128.
98
157. Lechner S, Muller-Ladner U, Renke B. (2003) Gene expression pattern of laser microdissected colonic crypts of adenomas with low grade dysplasia. Gut, 52: 1148–1153. 158. Williams NS, Gaynor RB, Scoggin S. (2003) Identification and validation of genes involved in the pathogenesis of colorectal cancer using cDNA microarrays and RNA interference. Clin Cancer Res, 9: 931–946. 159. Banerjea A, Ahmed S, Hands RE. (2004) Colorectal cancers with microsatellite instability display mRNA expression signatures characteristic of increased immunogenicity. Mol Cancer, 3: 21. 160. Kim H, Nam SW, Rhee H. (2004) Different gene expression profiles between microsatellite instability—high and microsatellite stable colorectal carcinomas. Oncogene, 23: 6218–6225. 161. Scherl-Mostageer M, Sommergruber W, Abseher R. (2001) Identification of a novel gene, CDCP1, overexpressed in human colorectal cancer. Oncogene, 20: 4402–4408. 162. Wang Y, Jatkoe T, Zhang Y. (2004) Gene expression profiles and molecular markers to predict recurrence of Dukes' B colon cancer. J Clin Oncol, 22: 1564– 1571. 163. Tusher VG, Tibshirani R, Chu G. (2001) Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc Natl Acad Sci, 98: 5116–5121. 164. Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR. (1998) A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res, 58: 5248–5257. 165. Yuan Sotsky Z, Kent T, Weber TK. (2003) Differential expression of DOC-1 in microsatellite-unstable human colorectal cancer. Oncogene, 22: 6304–6310. 166. Giacomini CP, Leung SY, Chen X. (2005) A gene expression signature of genetic instability in colon cancer. Cancer Res, 65: 9200–9205. 167. Aguirre AJ, Brennan C, Bailey G. (2004) High-resolution characterization of the pancreatic adenocarcinoma genome. Proc Natl Acad Sci, 101: 9067–9072.
99
168. Pollack JR, Sorlie T, Perou CM. (2002) Microarray analysis reveals a major direct role of DNA copy number alteration in the transcriptional program of human breast tumors. Proc Natl Acad Sci, 99: 12963–12968. 169. Platzer P, Upender MB, Wilson K. (2002) Silence of chromosomal amplifications in colon cancer. Cancer Res, 62: 1134–1138. 170. Graeber TG, Sawyers CL. (2005) Cross-species comparisons of cancer signaling. Nat Genet, 37: 7–8. 171. Reya T, Morrison SJ, Clarke MF, Weissman IL. (2001) Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature, 414: 105–111. 172. Bonnet D, Dick JE. (1997) Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med, 3: 730– 737. 173. Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, Morrison SJ, Clarke MF. (2003) Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci, 100: 3983–3988. 174. Croner RS, Foertsch T, Brueckl WM, Guenther K, Siebenhaar R, Stremmel C, Matzel KE, Papadopoulos T, Kirchner T, Behrens J, Klein-Hitpass L, Stuerzl M, Hohenberger W, Reingruber B. (2005) Common denominator genes that distinguish colorectal carcinoma from normal mucosa. Int J Colorectal Dis, 20: 353-62. 175. Okuno K, Yasutomi M, Nishimura N, Arakawa T, Shiomi M, Hida J, Ueda K, Minami K. (2001) Gene expression analysis in colorectal cancer using practical DNA array filter. Dis Colon Rectum, 44: 295-9. 176. Zhang L, Zhou W, Velculescu VE, Kern SE, Hruban RH, Hamilton SR, Vogelstein B, Kinzler KW. (1997) Gene expression profiles in normal and cancer cells. Science, 276: 1268-72. 177. Abad C, Juarranz Y, Martinez C, Arranz A, Rosignoli F, García-Gómez M, Leceta J, Gomariz RP. (2005) cDNA array analysis of cytokines, chemokines, and receptors involved in the development of TNBS-induced colitis: homeostatic role of VIP. Inflamm Bowel Dis, 11: 674-84. 178. Galamb O, Sipos F, Dinya E, Spisak S, Tulassay Z, Molnar B. (2006) mRNA expression, functional profiling and multivariate classification of colon biopsy
100
specimen by cDNA overall glass microarray. World J Gastroenterol. 12: 69987006. 179. Galamb O, Györffy B, Sipos F, Spisák S, Németh AM, Miheller P, Tulassay Z, Dinya E, Molnár B. (2008) Inflammation, adenoma and cancer: objective classification of colon biopsy specimens with gene expression signature. Dis Markers, 25: 1-16. 180. Guo YS, Jin GF, Houston CW, Thompson JC, Townsend CM Jr. (1998) Insulinlike growth factor-I promotes multidrug resistance in MCLM colon cancer cells. J Cell Physiol, 175: 141-8. 181. Jenkins PJ, Khalaf S, Ogunkolade W, McCarthy K, David T, Hands RE, Davies D, Bustin SA. (2005) Differential expression of IGF-binding protein-3 in normal and malignant colon and its influence on apoptosis. Endocr Relat Cancer, 12: 891-901. 182. Nakamura T, Sakaeda T, Ohmoto N, Tamura T, Aoyama N, Shirakawa T, Kamigaki T, Nakamura T, Kim KI, Kim SR, Kuroda Y, Matsuo M, Kasuga M, Okumura K. (2002) Real-time quantitative polymerase chain reaction for MDR1, MRP1, MRP2, and CYP3A-mRNA levels in Caco-2 cell lines, human duodenal
enterocytes,
normal
colorectal
tissues,
and
colorectal
adenocarcinomas. Drug Metab Dispos, 30: 4-6. 183. Suzuki R, Miyamoto S, Yasui Y, Sugie S, Tanaka T. (2007) Global gene expression analysis of the mouse colonic mucosa treated with azoxymethane and dextran sodium sulfate. BMC Cancer, 7: 84. 184. Tímár J, Csuka O, Orosz Z, Jeney A, Kopper L. (2001) Molecular pathology of tumor metastasis I. Predictive pathology. Pathol Oncol Res, 7: 217-230. 185. Tímár J, Csuka O, Orosz Z, Jeney A, Kopper L. (2002) Molecular pathology of tumor metastasis II. Molecular staging and differential diagnosis. Pathol Oncol Res, 8: 204-219. 186. Tímár J, Ladányi A, Peták I, Jeney A, Kopper L. (2003) Molecular pathology of tumor metastasis III. Target array and combinatorial therapies. Pathol Oncol Res, 9: 49-72.
101
187. Tímár J, Lapis K, Fülöp T, Tixier JM, Robert L, Hornebeck W. (1991) Interaction between elastin and tumor cell lines with different metastatic potential; in vitro and in vivo studies. J Cancer Res Clin Oncol, 117: 232-238. 188. Tímár J, Diczházi C, Ladányi A, Rásó E, Hornebeck W, Robert L, Lapis K. (1995) Interaction of tumour cells with elastin and the metastatic phenotype. Ciba Found Symp, 192: 321-335. 189. Lapis K, Tímár J. (2002) Role of elastin-mátrix interactions in tumor progression. Semin Cancer Biol, 12: 209-217. 190. Tímár J, Trikha M, Szekeres K, Bazaz R, Honn KV. (1998) Expression and function of the high affinity αIIbβ3 integrin in murine melanoma cells. Clin Exp Metast, 16:437-445. 191. Tímár J, Chen YQ, Liu B, Bazaz R, Fitzgerald LA, Taylor JD, Honn KV. (1992) The lipoxygenase metabolite 12-(S)-HETE promotes αIIbβ3 mediated tumor cell spreading on fibronectin. Int J Cancer, 52: 594-603. 192. Tóvári J, Paku S, Rásó E, Pogány G, Kovalszky I, Ladányi A, Lapis K, Tímár J. (1997) Role of sinusoidal heparan sulfate proteoglycan in liver metastasis formation. Int J Cancer, 72: 1-7. 193. Svitkina TM, Parsons DF. (1993) Binding of some metastatic tumor cell lines to fibrous elastin and elastin peptides. Int J Cancer, 53: 824–8. 194. Werb Z, Banda MJ, McKerrow JH, Sandhaus RA. (1982) Elastases and elastin degradation. J Invest Dermatol, 79 Suppl 1: 154S–9S. 195. Hofmann UB, Westphal JR, Van Muijen GN, Ruiter DJ. (2000) Mátrix metalloproteinases in human melanoma. J Invest Dermatol, 115: 337–44. 196. Sternlicht MD, Werb Z. (2001) How mátrix metalloproteinases regulate cell behavior? Annu Rev Cell Dev Biol, 17: 463–516. 197. Johansson N, Ahonen M, Kahari VM. Mátrix metalloproteinases in tumor invasion. Cell Mol Life Sci 2000;57:5–15. 198. Visse R, Nagase H. Mátrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases:
structure,
function,
and
biochemistry.
Circ
Res
2003;92:827–39. 199. Ghuysen-Itard AF, Robert L, Jacob MP. Effect of elastin peptides on cell proliferation. C R Acad Sci III 1992;315:473–8.
102
200. Kamoun A, Landeau JM, Godeau G, Wallach J, Duchesnay A, Pellat B, Hornebeck W. Growth stimulation of human skin fibroblasts by elastin-derived peptides. Cell Adhes Commun 1995;3: 273–81. 201. Senior RM, Griffin GL, Mecham RP. Chemotactic activity of elastinderived peptides. J Clin Invest 1980;66:859–62. 202. Hinek A, Boyle J, Rabinovitch M. Vascular smooth muscle cell detachment from elastin and migration through elastic laminae is promoted by chondroitin sulfate-induced ‘‘shedding’’ of the 67-kDa cell surface elastin binding protein. Exp Cell Res 1992;203:344–53. 203. Huet E, Brassart B, Cauchard JH, Debelle L, Birembaut P, Wallach J, Emonard H, Polette M, Hornebeck W. Cumulative influence of elastin peptides and plasminogen on mátrix metalloproteinase activation and type I collagen invasion by HT-1080 fibrosarcoma cells. Clin Exp Metastasis 2002;19:107–17. 204. Hornebeck W, Robinet A, Duca L, Antonicelli F, Wallach J, Bellon G. The elastin connection and melanoma progression. Anticancer Res 2005;25:2617– 25. 205. Duca L, Floquet N, Alix AJ, Haye B, Debelle L. Elastin as a matrikine. Crit Rev Oncol Hematol 2004;49:235–44. 206. Givant-Horwitz V, Davidson B, Reich R. Laminin-induced signaling in tumor cells: the role of the M(r) 67,000 laminin receptor. Cancer Res 2004;64:3572–9. 207. Yi M, Ruoslahti E. A fibronectin fragment inhibits tumor growth, angiogenesis, and metastasis. Proc Natl Acad Sci USA 2001;98:620–4. 208. Price LS, Roos PJ, Shively VP, Sandberg LB. Valyl-alanyl-prolyl-glycine (VAPG) serves as a quantitative marker for human elastins. Mátrix 1993;13:307–11.
103
12. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK 1. Pocza P., Suli-Vargha H., Darvas Zs., Falus A.: Locally generated VGVAPG and VAPG elastin-derived peptides amplify melanoma invasion via the galectin3 receptor. Int J Cancer. 2008 May 1; 122(9):1972-80. IF= 4,734 2.
Pos Z., Wiener Z., Pocza P., Racz M., Toth S., Darvas Zs., Molnar V., Hegyesi H., Falus A.:Histamine coordinately suppresses fibulin-5 and insulin-like growth factor 2 receptor expression in melanoma. Cancer Res. 2008 Mar 15; 68(6):1997-2005. IF= 7,514
3. Boer K., Hellinger E., Helinger A., Pocza P., Pos Z., Demeter P., Baranyai Zs., Dede K., Darvas Zs., Falus A.: Decreased expression of histamine H1 and H4 receptors suggests disturbance of local regulation in human colorectal tumours by histamine. Eur J Cell Biol. 2008 Apr; 87(4):227-36. Epub 2008 Feb 6. IF=3,955 Impakt Faktor összesen: 16,203
104
13. EGYÉB KÖZLEMÉNYEK 1. Szabo PM., Wiener Z., Tömböl Z., Kovacs A., Pocza P., Horanyi J., Kulka J., Riesz P., Toth M., Patocs A., Gaillard RC., Falus A., Racz K., Igaz P.: Differences in the expression of histamine-related genes and proteins in normal human adrenal cortex and adrenocortical tumors. Virchows Arch. 2009 Aug; 455(2):133-42. Epub 2009 Jul 1. IF= 2,082 2. Tolgyesi G., Molnar V.,Semsei A., Kiszel P., Ungvari I., Pocza P., Wiener Z., Komlosi Zs., Kunos L., Galffy G., Losonczy Gy., Seres I., Falus A., Szalai Cs.: Gene expression profiling of experimental asthma reveals a possible role of paraoxonase-1 in the disease. Int Immunol. 2009 Aug; 21(8):967-75. Epub 2009 Jun 25. IF= 3,181 3. Pasztoi M., Nagy G., Geher P., Lakatos T., Toth K., Wellinger K., Pocza P., Gyorgy B., Holub MC., Kittel A., Paloczy K., Mazan M., Nyirkos P., Falus A., Buzas EI.: Gene expression and activity of cartilage-degrading glycosidases in human rheumatoid arthritis and osteoarthritis synovial fibroblasts. Arthritis Res Ther. 2009; 11(3):R68. Epub 2009 May 14. IF=4,485 4. Wiener Z., Pocza P., Racz M., Nagy G., Tolgyesi G., Molnar V., Jaeger J., Buzas E., Gorbe E., Papp Z., Rigo J., Falus A.: IL-18 induces a marked gene expression profile change and increased Ccl1 (I-309) production in mouse mucosal mast cell homologs. Int Immunol. 2008 Dec; 20(12):1565-73. Epub 2008 Oct 21. IF=3,181 5. Gyorgy B., Tothfalusi L., Nagy Gy., Pasztoi M., Geher P., Lorincz Zs., Polgar A., Rojkovich B., Ujfalussy I., Poor Gy., Pocza P., Wiener Z., Misjak P., Koncz A., Falus A., Buzas EI.: Natural autoantibodies reactive with glycosaminoglycans in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther. 2008; 10(5):R110. Epub 2008 Sep 12. IF=4,485 6. Molnár K., Karádi I., Sugár I., Sápi Z., Marschalkó M., Pálinger E., Darvas Z., Pócza P., Falus A., Vereczkei A., Várkonyi J.: Plasmacytic skin infiltration in multiple myeloma. Orv Hetil. 2008 May 11; 149(19):877-81. Hungarian. 7. Gilicze A., Kohalmi B., Pocza P., Keszei M., Jaeger J., Gorbe E., Papp Z., Toth S., Falus A., Wiener Z.: HtrA1 is a novel serine protease in murine mucosal and
105
in human mast cells. Mol Immunol. 2007 Apr; 44(11):2961-8. Epub 2007 Feb 12. IF=3,742 8. Wiener Z., Kohalmi B., Pocza P., Jeager J., Tolgyesi G., Toth S., Gorbe E., Papp Z., Falus A.: The immunoregulatory TIM-3 is expressed in melanoma cells and is upregulated in TGF-beta stimulated mast cells. J Invest Dermatol. 2007 Apr; 127(4):906-14. Epub 2006 Nov 9. IF=4,829 Összes publikáció IF: 42,188
106
14.
TUDOMÁNYOS KONFERENCIÁK
1. Előadás – Pócza P., Wiener Z., Tölgyesi G., Molnár V., Falus A.: ”Nyirokcsomó-áttét negatív és távoli áttét pozitív colorectális daganatok génexpressziós vizsgálata” Magyar Patológus Társaság 67. Kongresszusa (Keszthely, 2008) 2. Előadás – Pocza P., Wiener Z., Tolgyesi G., Pos Z., Molnár V., Darvas Zs., Dede K., Mersich T., Baranyai Zs., Jakab F., Falus A.: Microarray profiling and pathway analysis of colorectal cancer. EHRS Meeting (Stockholm, 2008) 3. Előadás – Pócza P., Wiener Z., Pos Z., Pócza K, Dede K., Mersich T., Baranyai Zs., Jakab F., Darvas Zs., Falus A.: ”Teljes genomszűrésen alapuló onkogenomikai vizsgálatok a vastagbéldaganatok keletkezésének és áttétképző mechanizmusának pontosabb megismerése céljából” Magyar Onkológus Társaság 27. Jubileumi Kongresszusa (Budapest, 2007) 4. Poszter – Pócza P., Pocza K., Darvas Zs., Falus A.: ”Locally generated elastin peptides increase invasive potential of melanoma cells dominantly by galectin3” 14th European Cancer Conference (Barcelona, 2007) 5. Poszter – Pócza P., Darvas Zs., Falus A.: ”Locally generated elastin peptides increase invasive potential of melanoma cells dominantly by galectin-3” Focus On Microscopy Conference (Valencia, 2007) 6. Poszter – Pócza P., Darvas Zs., Pócza K., Falus A.: “The effects of locally generated elastin-derived peptides and TGF-ß1on melanoma progression" International Conference of Immunogenomics and Immunomics (Budapest, 2006) 7. Poszter – Pócza P., Darvas Zs., Pócza K., Falus A.: “Transforming Growth Factor ß1 (TGF-ß1) has paradox effects on melanoma progression"16th European Congress of Immunology (Paris, 2006) 8. Poszter – Pócza P., Pócza K., Kovács P., Pállinger É., Falus A., Darvas Zs.: “Locally generated elastin peptides increase invasive potential of melanoma cells"19th Congress of the European Association for Cancer Research (Budapest, 2006) 9. Poszter – Pocza P., Kovacs P., Pallinger E., Pocza K., Kohidai L., Falus A., Darvas Zs.: “Locally generated elastin peptides increase invasive potential of melanoma cells"31st FEBS Congress (Istanbul, 2006) 10. Előadás – Pocza P., Kovacs P., Pallinger E., Pocza K., Kohidai L., Falus A., Darvas Zs.: “Locally generated elastin peptides increase invasive potential of melanoma cells" FEBS Young Scientist Forum (Istanbul, 2006) 11. Poszter – Pocza P., Kovacs P., Pallinger E., Pocza K., Kohidai L., Falus A., Darvas Zs.: “Elastin peptides increase invasive potential of melanoma cells"30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference (Budapest, 2005) 12. Poszter – Pocza P., Keresztesi M., Kovacs P., Pallinger E., Kohidai L., Falus A., Darvas Zs.: “Histamine influences on the migration, expression of adhesion molecules and MMPs in human melanoma cell lines” 34th Annual Meeting of European Histamine Research Society (Bled, 2005)
107
15.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Köszönetemet szeretném kifejezni a doktori munkám elkészítésével kapcsolatban: •
Dr. Falus András Professzor Úrnak, témavezetőmnek, aki tanított, a munkámat végig figyelemmel követte, lehetőséget biztosított a kutatási munkám elvégzésére, valamint lelkesedésével és támogatásával nagymértékben segítette munkámat;
•
Dr. Darvas Zsuzsának, aki személyiségével a kutatói pályára irányított és ott megtartott, és rengeteg szakmai segítséget nyújtott a melanómától a vastagbéltumorig,
•
Dr. Jakab Ferenc Professzor Úrnak, Dr. Baranyai Zsolt Főorvos Úrnak, Dr. Mersich Tamásnak, Dr. Dede Kristófnak, Dr. Besznyák Istvánnak, Dr. Atkári Bencének és Dr. Zaránd Attilának, akik a sebészi hátteret biztosították és szakmai észrevételeikkel segítették munkánkat,
•
Dr. Wiener Zoltánnak, Dr. Pós Zoltánnak, Dr. Tölgyesi Gergőnek, Dr. Éder Katalinnak és Dr. Molnár Viktornak, akik rengeteg hasznos tanáccsal és építő kritikával sokat segítettek a kísérletek tervezésében és értékelésében;
•
Farkasné Nagy Krisztina, Kovács Andrea és Orbán Andrea asszisztenseknek a szövettenyésztési és egyéb munkákban nyújtott segítségükért;
•
Rácz Melindának a microarray mérések során nyújtott segítségéért;
•
Köszönettel tartozom továbbá a Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet összes dolgozójának, hogy barátsággal és szeretettel vettek körül, megtanították szinte az összes módszert, ami elérhető volt és segítettek mindenben.
Végül, de semmiképpen sem utolsó sorban külön köszönettel tartozom családomnak, elsősorban feleségemnek Pócza-Molnár Virágnak és természetesen fiamnak, Pócza Mártonnak, hogy munkám elkészítése során mindvégig türelemmel és szeretettel támogattak.
108
