PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK BIJI ANGGUR (Vitis vinifera) TERHADAP EKSPRESI INTERLEUKIN-1-BETA (IL-1β) DAN GAMBARAN HISTOPATOLOGI TESTIS TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus) STRAIN Wistar YANG DIBERIKAN PAPARAN ASAP ROKOK The Influence of Grape (Vitis vinifera) Seed Extract Treatment on The Expression of Interleukin-1-Beta (IL-1β) and Testis Histopathology Appearence of Wistar strain Rat (Rattus norvegicus) Exposed by Cigarette Smoke Ditya Sulanda B.*, Agung Pramana W.M., Dyah Ayu Oktavianie A.P. Program Studi Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya E-mail:
[email protected],
[email protected] ABSTRAK Radikal bebas yangdihasilkan oleh asap rokok telah diketahuidapat mengganggu fungsi organ reproduksi termasukjaringan testis. Efek lokal maupun sistemik dari paparan asap rokok dapat dijelaskan melalui mekanisme stres oksidatif dan inflamasi. Biji anggur (Vitis vinifera) diketahuimengandung proantosianidin, flavonoid, katekin, dan epikatekinyang memiliki aktivitas sebagai antioksidan.Penelitian inibertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak biji anggur(Vitis vinifera) terhadap ekspresi Interleukin-1-Beta (IL-1β) dan gambaran histopatologi testis tikus yang diberi paparan asap rokok. Penelitian menggunakan rancangan acak lengkap dengan 20 ekor tikus putih (Rattus norvegicus) strain Wistar jantan umur 12 minggu dan BB 175-200 gram dibagi menjadi 5 kelompok: K1 (kelompok negatif), K2 (kelompok positif yang dipaparan asap rokok selama 14 hari pertama), P1 (kelompok perlakuan pasca pemaparan asap rokok yangdiberikan ekstrak air biji anggur (Vitis vinifera) dosis 0,9 mg/200 gram BB tikus selama 14 hari), P2 (dosis 2,7/200 gram BB tikus), dan P3 (dosis 5,4/200 gram BB tikus). Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian ekstrak biji anggur (Vitis vinifera) dapat menurunkan ekspresi IL-1β testis tikus pada kelompok terapi dibandingkan dengan kelompok kontrol positif. Penurunan ekspresi IL-1β yang paling rendah ditemukan pada kelompok P3 (dosis 5,4 mg/200 gram BB tikus) sebesar 48% dibandingkan dengan kelompok kontrol positif yaitu sebesar (0.979±0.009). Pemberian ekstrak biji anggur (Vitis vinifera) dengan dosis 5,4 mg/200 gram BB tikus juga paling efektif dapat memperbaiki kerusakan sel sertoli, sel leydig dan diameter tubulus seminiferus yang ditandai dengan perkembangan sel spermatogenik pada jaringan testis tikus. Kata kunci :Vitis vinifera, antioksidan, radikal bebas, sel Leydig, sel Sertoli, diameter Tubulus seminiferus, sel Spermatogenik, asap rokok, IL-1β. ABSTRACT Free radicals produced by cigarette smoke can disturb the function of reproductive organs, including testis. Local and systemic influences of cigarette smoke exposure may be through the occurrence of oxidative stress and inflammation. Grape (Vitis vinifera) seed contains of porantocyanidin, flavonoid, catechin, and epycathecin which have antioxidant activity. This research is was aimed to understand the influence of treatment by grape (Vitis vinifera) seed extract on the expression of Interleukin-1-Beta (IL-1β) and testis histopathology appearence of 1
rat exposed by cigarette smoke. Research design is complete random planning. The object of research is 20 Wistar strain rat (Rattus norvegicus) with 12 weeks old and 175-200 grams body weight. Rat are assigned into 5 groups which are K1 (negative group), K2 (positive group exposed by cigarette smoke for 14 days), P1 (that group were given therapy using dose 0.9 mg/200 grams body weight), P2 (that group were given therapy using dose 2.7 mg/200 grams body weight), and P3 (that group were given therapy usingdose 5.4/200 grams body weight). The research result indicated that the treatment of grape (Vitis vinifera) seed extract can reduce the expression of IL-1β of rat testis in therapy group if compared to positive control group. The lowest reduction of IL-1β expression is found at P3 (at dose 5.4 mg/200 grams body weight) by 48 % if compared to positive control group which reaches 0.979±0.009. Treating mouse with grape (Vitis vinifera) see extract at dose 5.4 mg/200 grams body weight is the most effective method to repair the damages on sertoli cells, leydig cells, and tubulus seminiferus diameter which is signed by the development of spermatogenic cells in rat testis. Keywords: Vitis vinifera, antioxidant, free radicals, leydig cell, sertoli cell, tubulus seminiferus diameter, spermatogenic cells, cigarette smoke, IL-1β akibat senyawa kimia asap rokok dapatditandai dengan adanya gangguansel Leydig sehingga akan menghambat sekresi hormon testosteron (Pacifici et al., 1993). Senyawa kimia asap rokok juga sangat toksik pada fungsi sel Sertoli (Guven et al., 1999). Gangguan pada sel Leydig dan sel Sertoli akan berdampak buruk pada proses spermatogenesis serta differensiasi sel spermatogonium yang akan berkembang menjadi sperma. Proses spermatogenesis yang terganggu mengakibatkan terjadinya penurunan jumlah sel sperma sehingga tubulus seminiferus mengalami perubahan struktur mikroanatominya seperti penurunan ukuran diameter tubulus seminiferus (Ernawati, 2012). Anggur (Vitis vinifera) merupakan salah satu buah yang digemari di Indonesia (Setiadi, 2007).Biji anggur (Vitis vinifera) diketahuimengandung proantosianidin, flavonoid, katekin, dan epikatekinyang memiliki aktivitas sebagai antioksidan (Arora et al.,2010; Bahorun et.al., 1993). Berdasarkan latar belakang tersebut, penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui potensi antioksidan ekstrak biji buah anggur (Vitis vinifera) terhadap paparan asap rokok yang dapat
PENDAHULUAN Asap rokok merupakan polutan bagi manusia dan lingkungan sekitarnya. Perlu diketahui bahwa asap yang dihasilkan oleh perokok mengandung zat kimia yang lebih tinggi daripada yang dihisap oleh perokok sendiri, sehingga perokok pasif mempunyai risiko yang lebih tinggi untuk mengidap berbagai penyakit dari pada perokok aktif (Brewer, 2009).Senyawa kimiatersebutakanmenimbulkan efek lokal maupun sistemik yang dapat dijelaskan melalui mekanisme stres oksidatif dan inflamasi.Salah satu mediator inflamasi yang pengeluarannya dipengaruhi oleh asap rokok adalah IL-1β yang diproduksi oleh makrofag sehingga akan menstimulasi inflamasi secara terus menerus yang akan menyebabkan kerusakan jaringan (Short, 2004). Salah satu efek sistemik paparan asap rokok dapat menyebabkan gangguan pada sistem organ lain seperti jaringan testis sebagai organ vital tubuh. Mekanisme stres oksidatif yang terjadi pada organ reproduksi pada akhirnya akan menimbulkan gangguan metabolit dan kerusakan sel, bahkan dapat menyebabkan kemandulan atau infertilitas pada pria (Sikka et al., 1995).Kerusakanpada jaringan reproduksi 2
mempengaruhi ekspresi interleukin-1 beta (IL-1β) dan gambaran histopatologi testis pada tikus putih jantan (Rattus norvegicus). MATERI DAN METODE Alat dan Bahan Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: Timbangan, kandang tikus, smoking pump,scapel, blade, pinset dan papan bedah, objek glass, cover glass, spuit, mikroskop, gelas ukur 100 ml, micro pipetP1000, bluetips, rak tabung reaksi, penangas air, micro tube 1,5 ml, lemari pendingin, pH meter digital, penjepit, neraca analitik, oven, vortex, dan mikroskop Olympus BX51 serta Olympus BX53. Bahan yang digunakan: 20 ekor tikus putih jantan (Rattus norvegicus) strain Wistar berat badan 200 gram umur 12 minggu, rokok non filter 112 batang, ekstrak biji anggur hijau (Vitis vinifera), Aquades, Nacl-fisiologis, Xylol, etanol 70%, etanol 80%, etanol 90%, etanol 100%, peroxidase block-H2O2 (K0679Dako-USA), bovine serum albumin-BSA, antibodi primer anti-ratIL-1β (F162Bioworld Technology-China), antibodi sekunder berlabel biotin (Anti Rabbit IgG biotin labeled) (K0679-Dako-USA), strep avidin horse radish peroxidase-SHARP (K0679-Dako-USA), DAB+cromogen (K0679-Dako-USA), PFA 4%, Mayer Hematoxylin(S3309-Dako-USA) Eosin (CS701-Dako-USA), Entellan, Gliserin, Parafin, larutan toluol dan larutan PBS Azida. Prosedur Penelitian Persiapan Hewan Coba Tikus yang digunakan pada penelitian ini diaklimatisasi dalam kandang ukuran 50 x 40 x 20 cm selama 7 hari diberi makanan berupa ransum pakan basal. Tikus dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan. Paparan Asap Rokok Asap rokok dimasukkan dalam kotak kaca menggunakan smoking pumpsampai
memenuhi kotak. Pemaparan asap rokok sebanyak 2 batang per hari selama 15 menit selama 14 hari(Fowles et.al.,2000). Ekstraksi Air Biji Anggur Biji anggur dikeringkan dan dihaluskan menjadi simplisia.Sinplisia yang sudah ditentukan dikalikan dengan jumlah tikus pada setiap kelompok. Setiap dosis kemudian dilarutkan dalam 100 mL aquades lalu dipanaskan dengan suhu 80ºC selama 4-5 jam. Diperoleh larutan ekstrak biji anggur dengan pelarut air sebanyak 12 ml. Selama proses maserasi dilakukan pengadukan sehingga diperoleh endapan. Endapan yang diperoleh dipisahkan.Kemudian hasil ekstraksi ditampung 8 ml dan diberikan 2 ml per ekor tikus. Perhitungan Dosis Perhitungan dosis menggunakan dosis bertingkat yaitu 50, 150, 300 mg/kg berat badan. Dosis tersebut dikonversikan kepada hewan coba dengan perhitungan Laurence dan Bacharach (1964).Sehingga dosis diberikan untuk hewan coba adalah0,9, 2,7 dan 5,4 mg/200 gram berat badan tikus. Pemberian Terapi Ekstrak Biji Anggur Ekstrak diberikan selama 2 minggu setelah pemaparan asap rokok menngunakan sonde lambung. Ekstrak biji anggur diberikan hewan coba sebanyak 2 ml per ekor tikus dengan kandungan dosis yang sudah ditentukan. Pengambilan Organ Testis Tikus Tikus dieutanasia dengan dislokasi leher, kemudian dibedah dengan membuat sayatan pada bagian abdomen kemudian organ testis dipotong dan diisolasi. Testis dibilas dengan NaCl fisiologis 0,9% dingin dan dimasukkan dalam PFA 4%sebagai larutan fiksatif untuk pembuatan preparat histologi. Pembuatan Preparat Histopatologi Proses pembuatan preparat histopatologi terdiri dari fiksasi, dehidrasi dan infiltrasi, penjernihan, infiltrasi parafin, embedding,
3
sectioning, penempelan di gelas objek (Amin, dkk, 2009). Pewarnaan Preparat dengan HematoxylinEosin Preparat jaringan testis dimasukkan dalam xylol (5 menit), lalu dimasukkan dalam alkohol absolut, alkohol 100%, 90%, 80% dan 70% (3 menit). Jaringan dicuci dengan aquades 1x dan dengan PBS pH 7,4 (3x5 menit). Jaringan diwarnai dengan Mayer’s Hematoxylin-Eosin (5 menit) dan dicuci aquadest (3x5menit). Preparat dikering anginkan, mounting dan ditutup dengan cover glass (Ramos-Vara, 2005). Pewarnaan Preparat dengan Imunohistokimia - Interleukin 1 (IL-1) Preparat dimasukkan xylol (5 menit) kemudian dalam alkohol absolut, alkohol 100%, 90%, 80% dan 70% (3 menit). Dicuci dengan aquades dan PBS pH 7,4 (3x5 menit).Direndam dalam H2O2 (45 menit). Dicuci dengan PBS pH 7,4 (3x5 menit). Diblocking dengan BSA 1% (45 menit) lalu dicuci dengan PBS pH 7,4 (3x5 menit). Ditetesi antibodi primer mouse anti-IL-1 dan diinkubasi selama semalam pada suhu 4°C dicuci dengan PBS pH 7,4 (3x5 menit). Ditetesi antibodi sekunder rabbit anti-mouse IgG berlabel biotin dan diinkubasi selama 1 jam.Dicuci dengan PBS pH 7,4 (3x5 menit). Ditetesi SAHRP (45 menit).Dicuci dengan PBS pH 7,4 (3x5 menit). Ditetesi DAB (7 menit). Preparat dicuci dengan aquades selama 3x5 menit. Preparat dicounterstaining dengan Mayer’s Hematoxylin selama 5 menit lalu dicuci dengan stilled water 3x5menit. Preparat kemudian dikeringanginkan dilan-jutkan dimounting dan ditutup dengan cover glass (Ramos-Vara, 2005). Pengamatan Preparat Histopatologi dan Ekpresi Interleukin 1 (IL-1) Preparat histopatologi jaringan testis diamati menggunakan mikroskop cahaya Olympus BX51 mulai perbesaran 40x1000x sebanyak 5 lapang pandang untuk
melihat adanya kerusakan struktural dari sel leydig, sel sertoli yang mengarah pada nekrosis sel dan penurunan jumlah sel spermatogonium yang akan berkembang menjadi sperma serta perubahan mikroanatomui tubulus seminiferus dengan menggunakan mikroskop cahaya Olympus BX53.Perhitungan presentase area eks-presi IL-1 menggunakanperbesaran 400x dan dianalisa dengan software Axio Vision. Analisis Data Data penelitian ini berupa data kualitatif dan data kuantitatif. Data kualitatif berupa pengamatan histopatologi jaringan testis yang disajikan dan analisis secara deskriptif. Presentase area ekspresi IL-1 yang ditabulasi menggunakan Microsoft Office Excel kemudian dianalisa menggunakan analysis of variance (ANOVA) dengan software SPPS 16 for Windows.Apabila terdapat perbedaan nyata dilanjutkan uji Beda Nyata Jujur (Tukey) dengan α= 0.05%. HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh Pemberian Ekstrak Biji Anggur (Vitis vinifera) Terhadap Ekspresi IL-1βTikus Putih (Rattus norvegicus) Strain Wistar Yang Dipapar Asap Rokok Ekspresi IL-1βditunjukkan oleh warna coklat pada preparat immunohistokimia.Ikatan antigen berupa IL-1β pada jaringan testis dengan antibodi primer anti-rat IL-1β kemudian diikat antibodi sekunder berlabel biotin (Anti Rabbit IgG biotin labeled) dengan penambahan enzim SA-HRP (Strepta avidin-Horseradish Peroxidase) dan substrat yang berisi kromogen serta H2O2akan memunculkan endapan berwarna coklat dan H2O. Hasil pengamatan secara kualitatif menunjukkan ekspresi IL-1β terlihat pada semua kelompok tikus percobaan. Pada kelompok A, B, C, D dan E ditemukan ekspresi IL-1β dengan intensitas yang berbeda (Gambar 1).
4
Gambar 1.Ekspresi Interleukin-1-Beta (IL-1ß) pada jaringan testis tikus. Keterangan: (A) kontrol negatif; (B) kontrol positif; (C) perlakuan 1 (dosis 0,9 mg/200 gram BB tikus); (D) perlakuan 2 (dosis 2,7 mg/200 gram BB tikus); (E) perlakuan 3 (dosis 5,4 mg/200 gram BB tikus). Keterangan ( ) = ekspresi IL-1β. Perbesaran 400x. Tabel 1.Rata-rata persentase area ekspresi IL-1β Rata-rata Kelompok persentase area ekspresi IL-1β ± SD
Ekspresi lL-1β Peningkatan Penurunan Terhadap Kontrol Terhadap Kontrol Negatif Positif
A (Kontrol Negatif)
0.67±0.032a
-
-
B (Kontrol Positif)
10.77±0.816d
1508%
-
C (Perlakuan 1 ekstrak biji anggur dosis 0,9 mg/200 gram BB tikus) D (Perlakuan 2 ekstrak biji anggur dengan dosis 2,7 mg/200 gram BB tikus) E (Perlakuan 3 ekstrak biji anggur dengan dosis 5,4 mg/200 gram BB tikus)
3.44±0.103c
-
414%
2.6±0.076b
-
289%
0.98±0.009a
-
47%
Keterangan : Perbedaan notasi (a,b,c,d) menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan antar perlakuan terhadap ekspresi IL-1β (α<0.05).
Ekspresi IL-1β pada A (kelompok negatif) memperlihatkan rata-rata persentase area dengan intensitas rendah. Ekspresi IL-1β pada kelompok negatif untuk memicu kerja fagositosis sel yang
mengalami apoptosis dalam jaringan testis.Apoptosis secara seluler merupakan proses normal yang terjadi selama perkembangan embrional. Selama spermatogenesis, kematian sel secara 5
terprogram (apoptosis) memainkan peran penting untuk menghilangkan sel-sel germinal yang cacat atau yang membawa mutasi DNA. Sel-sel germinal yang mengalami apoptosis selanjutnya akan difagositosis oleh makrofag. Pada proses fisiologi ini dapat terjadi disregulasi sehingga apoptosis sel germinal dapat menyebabkan infertilitas pejantan ( Susinet al., 1998) Hasil pengamatan ekspresi IL-1β pada kelompok B, C, D dan E memiliki intensitas warna coklat dengan luas area yang lebih besar dari kelompok A. Kelompok B sebagai kontrol positif memiliki intensitas warna coklat dengan luas area yang paling besar dibandingkan kelompok kontrol negatif, kelompok perlakuan 1,2 dan 3. Peningkatan ekspresi IL-1β pada testis tikus yang diberi paparan asap rokok (kelompok kontrol positif) menunjukkan kemampuan radikalbebas asap rokok untuk menginduksi terjadinya inflamasi pada testis. Salah satu sel inflamasi yang pengeluarannya dipengaruhi oleh asap rokok adalah makrofag (Short, 2004). Makrofagmerupakan sistem pertahanan tubuh pertamaakan direkrut untuk menghancurkan benda asing (fagositosis). Makrofag akan meningkatkan produksi sitokin proinflamasi seperti IL-1β yang berfungsi sebagai poliferasi sel dan akan membantu perlekatan sel-sel inflamatori ke lokasi inflamasi. Pada kelompok terapi C, D dan E yang memiliki intensitas warna coklat dengan luas area lebih sedikit dari kelompok kontrol positif.Penurunan ekspresi IL-1β pada testis tikus yang diberi terapi ekstrak biji anggur menunjukkan kemampuanantioksidan ekstrak biji anggur untuk membantu sistem pertahanan antioksidan tubuh dalam menstabilkan radikal bebas dari asap rokok dengan cara melengkapi kekurangan elektron yang dimiliki radikal bebas dan menghambat terjadinya reaksi berantai dari
pembentukan radikal bebas yang dapat merangsang proses inflamasi (Halliwell dan Gutteridge, 2000). Pada kelompok terapi juga terlihat memiliki intensitas warna coklat dengan luas area yang berbedadikarenakan terdapat perbedaan dosis ekstrak biji anggur yang diberikan pada setiap kelompok perlakuan untuk menghambat efek radikal bebas dalam tubuh dan melindungi kerusakan jaringan akibat paparan asap rokok serta menurunkan ekspresi IL-1β (Gambar 1). Perhitungan rata-rata persentase area ekspresi IL-1β pada testis tikus kelompok kontrol positif lebih besar dibandingkan dengan tikus kelompok negatif, hal ini ditunjukkan adanya peningkatan yang signifikan antara ekspresi IL-1βpada testis tikus di kelompok kontrol positif terhadap kelompok kontrol negatif,.kelompok perlakuan 1,2 dan 3. Rata-rata persentase area ekspresi IL-1β pada jaringan testis tikus kontrol positif mengalami peningkatan mencapai 1510% terhadap tikus kelompok kontrol negatif (Tabel 1). Sifat reaktif yang dimiliki oleh radikal bebas menyebabkan peroksidasi lipid dan kerusakan pada struktur makromolekul sel, sehingga mengubah karakter membran menjadi seperti antigen. Substansi antigen tersebut akan menimbulkan respon inflamasi sebagai respon fisiologis tubuh terhadap respon pertahanan terhadap antigen yang ditandai dengan peningkatan perekrutan sel-sel inflamatori antara lain makrofag untuk menghancurkan benda asing. Mekanisme inflamasi juga akan ditandai dengan adanya pengeluaran sitokin proinfmalasi seperti IL-1β yang diproduksi oleh sel makrofag. Peningkatan inflamasi serta destruksi jaringan yang timbul karena radikal bebas asap rokok akan lebih besar apabila tidak dinetralkan oleh sistem antioksidan tubuh (Uslu et al., 2003). Pengaruh terapi ekstrak biji anggur pada kelompok perlakuan C, D, dan E adalah 6
penurunan ekspresi IL-1β terhadap tikus kelompok kontrol positif yang ditunjukkan adanya penurunan signifikan antara ekspresi IL-1β pada testis tikusdi kelompok perlakuan 1,2 dan 3 dengan kelompok kontrol positif (Tabel 1). Kelompok perlakuan 1 dengan terapi ekstrak biji anggur dengan dosis 0,9 mg/200 gram BB tikus menunjukkan perbedaan ekspresi IL1β yang signifikan terhadap kelompok kontrol negatif, kontrol positif, perlakuan 2 dan 3. Kelompok perlakuan 2 dengan dosis biji anggur 2,7 mg/200 gram BB tikus menunjukkan perbedaan ekspresi IL-1β yang signifikan terhadap kelompok kontrol negatif, kontrol positif, perlakuan 1 dan 3. Kelompok perlakuan 3 dengan dosis biji anggur 5,4 mg/200 gram BB tikus menunjukkan perbedaan ekspresi IL-1β yang signifikan terhadap kelompok kontrol negatif, kontrol positif, perlakuan 1 dan 2 (Tabel 1). Penurunan ekspresi IL-1β yang signifikan pada testis tikus yang diberi terapi ekstrak biji anggur menunjukkan kemampuanantioksidan ekstrak biji anggur untuk menghalangi rantai initiation dan mengahancurkan rantai propagation radikal bebas untuk merusak sel, sehingga dapat membatasi kerusakan yang diakibatkan oleh radikal bebas dalam jaringan testis(Bagchi et al., 2000). Menurunnya reaktivitas dari radikal bebas akan menurunkan aktivitas makrofag dan produksi IL-1β seiring dengan menurunnya kerusakan oksidatif dalam jaringan (Short, 2004). Pengaruh peningkatan dosis terapi ekstrak biji anggur pada hewan coba tikus yangdipapar asap rokok akan meningkatkan aktivitas antioksidan dalam tubuh yang dapat menghambat inisiasi infiltrasi sel-sel mononuklear dan menurunkan stes oksidatif dalam jaringan testis (Sastrohamidjojo, 1996). Terbukti bahwa pemberian ekstrak biji anggur pada kelompok terapi 3 dengan dosis yang paling besar (5,4 mg/200 gram BB tikus)
mengalami penurunan rata-rata persentase area ekspresi IL-1β yang paling signifikan pada jaringan testis tikus mencapai 48% terhadap tikus kontrol positif (Tabel 1). Berdasarkan hasil penelitian ini, diketahui bahwa pemberian ekstrak biji anggur (Vitis vivifera) dapat menurunkan kadar interleukin-1-beta (IL-1β) yang merupakan faktor inflamasi pada testis tikus putih (Rattus norvegicus) strain Wistar yang diberi paparan asap rokok. Pengaruh Pemberian Ekstrak Biji Anggur (Vitis vinifera) Terhadap Gambaran Histopatologi TestisTikus Putih (Rattus norvegicus) Strain Wistar Yang Dipapar Asap Rokok Pengaruh terapi ekstrak biji anggur (Vitis vinifera) terhadap gambaran histopatologi testis tikus putih (Rattus norvegicus) strain Wistaryang diberi paparan asap rokokakan diamati secara deskriptif yang dapat diketahui melalui pewarnaan Hemaktosilin-Eosin (HE) (Gambar 2). Struktur histologi normal dari sel sertoli menunjukkan warna nukleus yang lebih pucat dari sel-sel germinal yang terdapat dalam tubulus seminiferus, bentuk selnya yang tidak beraturan serta batas antar sel yang tidak jelas, asosiasi yang kompak, terlihat menempel dengan sel spermatid.Pada struktur histologi normal sel leydig terlihat memiliki inti yang bulat dan sitoplasma granular pada pewarnaan HE. Gambaran mikroanatomi tubulus seminiferus testis yang normal akan menunjukkan asosiasi sel spermatogenik tersusun berlapis sesuai dengan tingkat perkembangannya dari membran basalis menuju ke arah lumen tubulus yakni spermatogonia, spermatosit, dan spermatid. Lumen normal dari tubulus seminiferus akan tampak terisi penuh oleh spermatozoa.
7
Gambar 2.Penampang melintang histopatologi testis tikus.K1 (A).K2 (B) P1 (C).P2 (D). P3 (E).(1) Membran basalis. (2) Spermatogonium. (3) Spermatosit. (4) Spermatid. (5) Spermatozoa. (6) Sel Leydig. (7) Sel Sertoli. (8) Lumen. Ket. Panah ( ) = perubahan lumen tubulus seminiferus; Panah ( ) = perubahan histopatologi sel sertoli; Panah ( ) = perubahan histopatlogi sel leydig (piknotik). Perbesaran mikroskop: 400×; Pewarnaan Haematoksilin-Eosin Hasil pengamatan pada jaringan testis tikus kelompok negatif (A) memperlihatkan struktur sel sertoli, sel leydig dan tubulus seminiferus yang tampak normal dengan susunan sel yang rapat dan kompak, serta terlihat perkembangan sel spermatogenik mulai dari membran basalis ke arah lumen yaitu spermatogonia, spermatosit primer, spermatosit sekunder, spermatid dan spermatozoa yang menutupi lumen dari tubulus seminiferus pada jaringan testis tikus(Gambar 2.A). Hasil pengamatan pada jaringan testis tikus pada kelompok positif (B) terlihat adanya kerusakan sel yang mengarah pada kematian sel sertoli berupa membran sel yang mengalami fragmentasi (vakoulisasi) akibatradikal bebas asap rokok (Gambar 2.B). Kerusakan membran sel akibat radikal bebas akan mengubah seluruh struktur
makromolekul membran sel dan menyebabkan gangguan pada proses metabolisme sel. Proses metabolisme sel yang terganggu menyebabkan sel tidak dapat mempertahankan fluiditas dan komponen yang berada dalam intrasel sehingga sel mengalami kematian (nekrosis). Hasil pengamatan pada kelompok positif juga menunjukkan terjadi kerusakan sel leydig yang mengarah pada nekrosis(Gambar 2.B). Terlihat gambaran mikroskopis diameter inti sel leydig mengalami pengecilan serta inti yang terbagi atas fragmen-fragmen yang padat (karioreksis) akibat kematian sel. Kerusakan sel leydig yang terjadi akibat paparan asap rokok dapat dijadikan sebagai indikator bahwa aktivitas jaringan interstitial atau sel leydig mengalami penurunan.Pada 8
kelompok positif (B) juga terlihat susunan Adanya pengaruh terapi ekstrak biji sel-sel spermatogenik yang longgar dan anggur pada kelompok perlakuan (C,D dan tidak teratur.Lumen pada kelompok ini E) menunjukkan adanya regenerasi sel pada mengandung sel spermatogenik yang lebih jaringan testis (Gambar 2). Pada kelompok sedikit sehingga lumen terlihat tidak perlakuan 1,2 dan 3 terlihat adanya penuh.(Gambar 2.B). perbaikan sel yang ditunjukkan kembalinya Hasil pengamatan jumlah sel struktur normal sel sertoli dan sel leydig spermatogenik pada preparat histopatologi serta serta memperlihatkan struktur tubulus secara deskriptif menunjukkan terjadi seminiferus tampak terlihat adanya penurunan jumlah sel spermatogenik pada peningkatan perkembangan sel tahap spermatosit pakiten (Gambar 2). spermatogenik Penurunan jumlah spermatosit pakiten juga Untuk mengetahui pengaruh terapi didukung penelitian Sukmaningsih (2009) ekstrak biji anggur terhadapjumlah sel bahwa didapakan paparan asap rokok spermatogenik dan diameter tubulus menyebabkan penurunan jumlah spermatosit seminiferus dilakukan pengukuran secara pakiten dan spermatid pada kuantitatif dengan hasil dapat dilihat pada spermatogenesis. tabel 2. Tabel 2. Rata-rata jumlah sel spermatogenik dan diameter tubulus seminiferus Kelompok Jumlah Sel Diameter Tubulus Spermatogenik Seminiferus (µm) [Mean ± SD (%)] [Mean ± SD (%)] A (Kontrol Negatif) 9.75±0.957e 34.22±0.049e B (Kontrol Positif) 6±0.816a 25.09±0.324a C (Perlakuan 1 ekstrak biji anggur dosis 6.5±0.577b 25.89±0.334b 0,9 mg/200 gram BB tikus) D (Perlakuan 2 ekstrak biji anggur dengan 8.25±0.5c 26.38±0.429c dosis 2,7 mg/200 gram BB tikus) E (Perlakuan 3 ekstrak biji anggur dengan 9±0.816d 26.78±0.128d dosis 5,4 mg/200 gram BB tikus) Keterangan : Perbedaan notasi (a,b,c,d,e) menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan antar perlakuan terhadap jumlah sel spermatogenik dan diameter tubulus seminiferus (α<0.05) Kerusakan pada sel sertoli dan sel leydig akan menghambat kemampuan sel untuk berdiferensiasi, dampaknya adalah jumlah sel spermatogenik di dalam tubulus seminiferus testis mengalami penurunan. Hal ini dibuktikan dengan perhitunganratarata jumlah sel spermatogenik pada testis tikuskelompok kontrol positif yang lebih kecil dibandingkan dengan tikus kelompok negatif (Tabel 2).Hasil perhitunganterhadap jumlah sel spermatogenik pada kelompok perlakuan yang diberi terapi ekstrak biji anggur memperlihatkan rata-rata jumlah sel spermatogenik yang lebih
besardibandingkan dengan kelompokkontrol positif yang ditunjukkan adanya perbedaan nyata terhadap kelompok kontrol positif (Tabel 2). Hasil perhitungan secara kuantitatif juga terdapat penurunan diameter tubulus seminiferus pada testis tikus kelompok kontrol positif dibandingkan dengan tikus kelompok negatif yang menurun secara signifikan.Longgarnya susunan sel spermatogenik pada tubulus seminiferus testis pada penelitian ini diakibatkan oleh adanya kerusakan sel - sel spermatogenik oleh radikal bebas asap rokok yang 9
menyebabkan kematian sel (Sukmaningsih, 2009). Pengaruh pemberian terapi ekstrak biji anggur pada tikus kelompok perlakuan 1,2 dan 3 terbukti mampu menghambat kerusakan sel yang terjadi akibat paparan asap rokok, sehingga jumlah sel spermatogenik yang mengisi lumen tubulus seminiferus mengalami perkembangan yang signifikan dibandingkan dengan tikus kelompok kontrol positif. Dampak dari meningkatnya differensiasi sel spermatogenik yang mengisi lumen dalam tubulus seminiferus akan meningkatkan diameter tubulus seminiferus testis tikus kelompok perlakuan 1,2 dan 3 (Tabel 2). Aktivitas antioksidan proanthosianidin pada ekstrak biji anggur (Vitis vinifera) akan melengkapi sistem pertahanan tubuh untuk menangkal serangan radikal bebas atau oksidan sehingga dapat membatasi kerusakan yang diakibatkan oleh radikal bebas(Bagchi et al., 2000). Sistem pertahanan antioksidan bekerja dengan beberapa cara berinteraksi langsung dengan radikal bebas untuk mencegah pembentukan senyawa oksigen reaktif, atau mengubah senyawa reaktif menjadi kurang reaktif (Winarsi, 2007). Kemampuanantioksidan ekstrak biji anggur terbukti mampu untuk memperbaiki sel dengan cara membantu regenerasi sel dan melindungijaringan testis dari efek radikal bebas asap rokok dalam tubuh(Shafie, 2011). Efek terapi antioksidan akan memperlihatkan struktur tubulus seminiferus normal dengan susunan sel yang rapat dan kompak, serta terlihat perkembangan sel spermatogenik mulai dari membran basalis ke arah lumen.Pemberian ekstrak biji anggur yang paling besar pada kelompok perlakuan 3 dengan dosis 5,4 mg/200 gram BB tikus mengalami peningkatan rata-rata persentase area jumlah sel spermatogenik dan diameter tubulus seminiferus yang paling signifikan dari kelompok tikus kontrol positif dan
mendekali normal dari kelompok tikus sehat (Tabel 2). Berdasarkan hasil penelitian ini, diketahui bahwa aktivitas antioksidan dari ekstrak biji anggur dapat memperbaiki kerusakan jaringan testis yang disebabkan oleh radikal bebas asap rokok berupa peningkatan jumlah sel sprematogenik dan peningkatan diameter tubulus seminiferus. KESIMPULAN Berdasarkan hasil dan pembahasan di atas, dapat disimpulkan : 1. Pemberian terapi ekstrak biji anggur (Vitis vinifera) dapat menurunkan ekspresi IL-1β pada jaringan testis tikus pasca pemaparan asap rokok. Pemberian ekstrak biji anggur dengan dosis 5,4 mg/200 gram BB tikus menyebabkan penurunan rata-rata persentase area ekspresi IL-1β paling signifikan pada jaringan testis tikus yang mendekati normal sebesar 48%. 2. Pemberian terapi ekstrak biji anggur (Vitis vinifera) juga dapat melindungi jaringan testis dari kerusakan akibat radikal bebas asap rokok serta memperbaiki gambaran histopatologi testis tikus yang ditunjukkan dengan berkembangnya jumlah sel spermatogenik dan peningkatan diameter dari tubulus seminiferus. Pemberian terapi ekstrak biji anggur (Vitis vinifera) dengan dosis 5,4 mg/200 gram BB tikus memberikan hasil lebih baik pada perbaikan jaringan testis tikus yang dipapar asap rokok. UCAPAN TERIMA KASIH Peneliti mengucapkan terima kasih kepada analis dan staf Laboratorium Biokimia, Laboratorium Molekuler dan Laboratorium Fisiologi Hewan FMIPA Universitas Brawijaya serta Laboratorium Patologi RS. Dr. Soetomo Surabaya yang telah membantu dalam penelitian ini
10
Hydroxycotinine Levels in Seminal Plasma of Smpkers. Effect on Sperm Parameters. Terapeutic Drug Monitoring. 15 : 358 – 363. Ramos-Vara, J.A. 2005. Technical Aspects of Immunohistochemistry. Veterinary Pathology, Vol. 42, No. 4, pp. 405426. Sastrohamidjojo Hardjono, 1996 , Sintesis Bahan Alam FMIPA Universitas Gadjah Mada, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. Shafie, F. M. 2011. Hubungan Radikal Bebas Dan Antioksidan Terhadap Penyakit Periodontal. Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Sumatra Utara, Medan. Short, M.A. Linking the Sepsis Triad of Inflammation, Coagulation, and Suppressed Fibrinolysis to Infants. Adv Neonatal Care 2004; 5: 258-73 Sikka, S., Rajasekaran, M., Hellstrom, W.J.G. 1995. Role of Oxidative Stress and Antioxidants in Male Infertility. Journal of Andrology, 16, 8-464 Sukmaningsih, A.A.Sg A. 2009. Penurunan Jumlah Spermatosit Pakiten Dan Spermatid Tubulus Seminiferus Testis Pada Mencit (Mus Musculus) Yang Dipaparkan Asap Rokok. Jurusan Biologi, FMIPA, Universitas Udayana. Jurnal Biologi XIII (2) : 31 – 35. Susin, S. A., Zamzami, N. and Kroemer, G. (1998). Mitochondria as regulators of apoptosis: doubt no more. Biochim. Biophys. Acta 1366, 151-165. Uslu C, Karasen MR, Sahin F, Taysi S, Akcay (2003). Effect Of Aqueous Extracts Of Satureja Hortensis L. On Rhinosinusitis Treatment In Rabbit. Journal of Ethnopharmacology 88, 225-228.
DAFTAR PUSTAKA Amin, M.H.F, A.P.W. Marhendra dan Aulanni’am. 2009. Pengaruh Paparan Lipopolosakarida pada Rongga Mulut dan Assisted Drainage Therapy (Adt) terhadap Kadar S-Ige dan Profil Radikal Bebas Pada Tikus Asma, Paper Presentasi pada Seminar Nasional Biologi XX dan Kongres PBI XIV UIN Maliki, Malang, 24-25 Juli. Arora, Poonam and Ansari, S.H. 2010. BioFunctional Aspects of Grape Seeds-A Review.International Journal of Phytomedicine. Vol. 2:177-185. Bagchi, D., Bagchi M., Stohs SJ., 2000, Free Radicals And Grape Seed Proanthocyanidin Extract: Importance In Human Health And Disease Prevention, Toxicol 148(2-3):187–97. Bahorun, T. Antioxidant Activites of Crataegus Monogyna Extracts. J. Planta Medicinal; 1993; 12: 323-325 Brewer, Holly. 2009. Passive Smoking Effectshttp://www.healthguidance.org/ entry/15742/1/PassiveSmokingEffects. html.Diakses tanggal 28 Nopember 2013. Ernawati, Anni Nurliani. 2012. Efek Antioksidan Ekstrak Etanol Bulbus Bawang Dayak (Eleutherine Americana Merr.) Terhadap Struktur Mikroanatomi Tubulus Seminiferus Testis Tikus Yang Dipapar Asap Rokok. [Skripsi]. Program Studi Biologi FMIPA Universitas Lambung Mangkurat. Kalimantan Selatan. Guven, M.C., B. Can, A., Ergun, Y. Saran, Aydos. 1999. Ultrastructure Effect of Cigarette Smoke on Rat testis. European Urology 36 : 645 -649. Halliwell, B. and Gutteridge, J.M.C., 2000. Free Radical in Biology and Medicine. Oxford University Press. New York. Pacifici, R., I. Altieri, L. Gandini, A. Lenzi, Simena, and P. Zuccaro. 1993. Nicotine, Cotinine and Trans -311
