HASIL PENELITIAN PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK BIJI ANGGUR (Vitis vinifera L.) SEBAGAI ANTIOKSIDAN TERHADAP PENURUNAN KADAR MDA PLASMA DARAH TIKUS PUTIH (Rattus novergicus strain wistar) YANG DIPAPAR ASAP ROKOK SECARA AKUT
Oleh : Nandy Mayangsari 09020016
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH MALANG FAKULTAS KEDOKTERAN 2013
HASIL PENELITIAN PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK BIJI ANGGUR (Vitis vinifera L.) SEBAGAI ANTIOKSIDAN TERHADAP PENURUNAN KADAR MDA PLASMA DARAH TIKUS PUTIH (Rattus novergicus strain wistar) YANG DIPAPAR ASAP ROKOK SECARA AKUT
KARYA TULIS AKHIR Diajukan kepada Universitas Muhammadiyah Malang untuk Memenuhi Salah Satu Persyaratan dalam Menyelesaikan Program Sarjana Fakultas Kedokteran
Oleh : Nandy Mayangsari 09020016
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH MALANG FAKULTAS KEDOKTERAN 2013
i
LEMBAR PENGESAHAN LAPORAN HASIL PENELITIAN Telah disetujui sebagai hasil penelitian untuk memenuhi persyaratan Pendidikan Sarjana Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang
16 Maret 2013
Pembimbing I
dr. Isbandiyah Sp.PD
Pembimbing II
dr. Indah Serinurani Efendi
Mengetahui Fakultas Kedokteran Dekan,
dr. Irma Suswati M.Kes ii
LEMBAR PENGUJIAN
Karya Tulis Akhir oleh Nandy Mayangsari ini telah diuji dan dipertahankan di depan Tim Penguji pada tanggal 16 Maret 2013
Tim Penguji
Prof. Dr. dr. Djoni Djunaedi Sp. PD , KPTI
,Ketua
dr. Isbandiyah Sp. PD
,Anggota
dr. Indah Serinurani Efendi
,Anggota
iii
KATA PENGANTAR Assalamua’alikum wr. bb Segala puji bagi Allah SWT atas segala rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan Karya Tulis Akhir yang berjudul “ Pengaruh Pemberian Ekstrak Biji Anggur (Vitis vinifera) Sebagai Antioksidan Terhadap Penurunan Kadar MDA Plasma Darah Tikus Putih (Rattus novergicus strain wistar) Yang Dipapar Asap Rokok Secara Akut ” Ketertarikan penulis akan topik ini didasari oleh semakin banyaknya jumlah perokok di Indonesia sedangkan peran antioksidan alami yang masih belum banyak diketahui oleh masyarakat umum. Dalam penulisan Karya Tulis Akhir ini penulis banyak mendapatkan bimbingan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang tak terhingga kepada : 1. dr. Irma Suswati M.Kes, selaku Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang 2. dr. Meddy Setiawan Sp.PD, selaku Pembantu Dekan I Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang 3. dr. Fathiyah Safithri M.Kes, selaku Pembantu Dekan II Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang 4. dr. Iwan Sys Sp.KJ, selaku Pembantu Dekan III Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang 5. dr. Isbandiyah Sp.PD, selaku pembimbing I atas segala waktu saran, dukungan sehingga Karya Tulis Akhir ini dapat terselesaikan iv
6. dr. Indah Serinurani Efendi, selaku pembimbing II atas segala waktu saran, dukungan sehingga Karya Tulis Akhir ini dapat terselesaikan 7. Prof. Dr. dr. Djoni Djunaedi Sp.PD, KPTI, selaku penguji atas segala saran kritik dan tambahan ilmu demi kesempurnaan penelitian ini 8. Orang tua dan Keluarga penulis yang senantiasa memberikan do’a, kasih sayang, nasehat, serta dukungan moril maupun materiil sehingga penulis dapat menyelesaikan Karya Tulis Akhir ini. 9. Para dosen pengajar, Staff Tata Usaha, Lab. Biomedik dan Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang yang telah memberikan ilmu dan pengetahuan serta segala fasilitas dan kemudahan dalam penelitian ini. 10. Best friend “ Geng Goong” untuk semua dukungan, bantuan, masukan sehingga penulis dapat menyelesaikan Karya Tulis Akhir ini. 11. Teman-teman angkatan 2009 Fakultas Kedoteran Universitas Muhammadiyah Malang dan semua pihak yang telah membantu dan memberi dukungan yang tidak bisa penulis sebutkan satu persatu. Penulis menyadari bahwa penulisan Karya Tulis Akhir ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu penulis membuka diri untuk segala saran dan kritik yang membangun, serta penulis berharap agar Karya Tulis Akhir ini dapat berguna dan bermanfaat bagi semua pihak. Wassalamua’laikum wr. wb Malang, Maret 2013
Penulis v
ABSTRAK Nandy Mayangsari. 2013. Pengaruh Pemberian Ekstrak Biji Anggur (Vitis vinifera) Terhadap Penurunan Kadar MDA Plasma Darah Tikus Putih ( Rattus novergicus strain wistar) yang dipapar Asap Rokok secara Akut. Tugas Akhir. Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang. Pembimbing : (I) Isbandiyah*, (II) Indah Serinurani Efendi**. Latar Belakang: Asap rokok merupakan sumber radikal bebas. Biji anggur (Vitis vinifera) mengandung proantocyanidin yang berfungsi sebagai antioksidan yang dapat menurunkan kadar MDA. MDA adalah parameter radikal bebas dalam tubuh yang merupakan hasil peroksidasi lipid Tujuan: Membuktikan pengaruh ekstrak biji anggur (Vitis vinifera) terhadap penurunan kadar MDA plasma tikus putih yang dipapar asap rokok secara akut. Metode: eksperimental , The Post Test Only Control Group Design. Sampel dibagi 5 kelompok. Kelompok 1 ( kontrol negatif), kelompok 2 ( kontrol positif) diberi paparan asap rokok 2 batang selama 15menit/ hari selama 14 hari, dan 3 kelompok diberi ekstrak biji anggur (Vitis vinifera) dosis 0,9 mg/200gBB/hari, 2,7 mg/200gBB/hari, 5,4 mg/200gBB/hari selama 14 hari. Hasil penelitian dan Diskusi: Uji One Way Anova didapatkan pengaruh yang bermakna (nilai sig = 0,000 < p (0,05)) antar kelompok perlakuan. Hasil uji Tukey 5%, didapatkan notasi yang berbeda antar kelompok perlakuan, berarti didapat pengaruh pemberian ekstrak biji anggur dan penurunan kadar MDA plasma. Kesimpulan: Pemberian ekstrak biji anggur (Vitis vinifera) dapat menurunkan kadar MDA plasma darah tikus putih (Rattus novergicus strain wistar) yang dipapar asap rokok secara akut. Kata Kunci: Ekstrak biji anggur, Proanthocyanidin, MDA, Asap Rokok *Staff pengajar Ilmu Penyakit Dalam FK UMM **Staff pengajar FK UMM
vi
ABSTRACT Nandy Mayangsari , 2013. Effect of Grape Seed Extract (Vitis vinifera) to Decrease Blood Plasma MDA White Rat (Rattus novergicus strain wistar) were exposed in Acute Cigarette Smoke. Final Assigment. Faculty of Medicine, University of Muhammadiyah Malang. Supervisor: (I) Isbandiyah *, (II) Indah Seinurani Efendi**. Background: Tobacco smoke is a source of free radicals. Grape seed (Vitis vinifera) contains proantocyanidin that act as antioxidants that can reduce levels of MDA. MDA is a parameter of free radicals in the body which is the result of lipid peroxidation. Objective: Demonstrate the effect of grape seed extract (Vitis vinifera) to decrease plasma MDA levels of white rats acutely exposed to cigarette smoke. Methods: Experimental, The Post Test Only Control Group Design. Samples were divided 5 groups. Group 1 (negative control), group 2 (positive control) were given 2 sticks of cigarette smoke exposure for 15 minutes / day for 14 days, and the third group was given a grape seed extract (Vitis vinifera) dose of 0.9 mg/200 gBB / day , 2.7 mg / 200 gBB / day, 5.4 mg/200 gBB / day for 14 days. Results and Discussion: One Way ANOVA test found a significant effect (sig = 0.000
vii
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN JUDUL ........................................................................................................... i LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................................ i LEMBAR PENGUJI .......................................................................................................... ii KATA PENGANTAR ...................................................................................................... iii ABSTRAK ....................................................................................................................... vii ABSTRACT .................................................................................................................... viii DAFTAR TABEL ............................................................................................................. ix DAFTAR GAMBAR .......................................................................................................... x DAFTAR SINGKATAN .................................................................................................. xi BAB 1 PENDAHULUAN ................................................................................................. 1 1.1 Latar Belakang ...................................................................................................... 2 1.2 Rumusan Masalah ................................................................................................. 2 1.3 Tujuan Penelitian .................................................................................................. 2 1.3.1 Tujuan Umum .............................................................................................. 3 1.3.2 Tujuan Khusus ............................................................................................. 3 1.4 Manfaat Penelitian ................................................................................................ 3 1.4.1 Manfaat Akademis ...................................................................................... 3 1.4.2
Manfaat Masyarakat ................................................................................. 3
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................................ 4
viii
2.1 Rokok .................................................................................................................... 4 2.1.1 Kandungan Rokok....................................................................................... 4 2.1.2 Asap Rokok sebagai Radikal Bebas............................................................ 9 2.1.4
Efek Asap Rokok terhadap Tubuh Manusia ............................................ 9
2.1.4 Penyakit akibat Asap Rokok ..................................................................... 11 2.2 Radikal Bebas ................................................................................................ 13 2.2.1 Pembentukan Radikal Bebas ..................................................................... 13 2.2.2 Tipe Radikal Bebas dalam Tubuh ............................................................. 13 2.2.3 Sumber Radikal Bebas .............................................................................. 14 2.2.4 Reaksi Perusakan oleh Radikal Bebas ...................................................... 16 2.2.5 Peranan Radikal Bebas pada Proses Peroksidasi Lipid ............................ 18 2.3 Antioksidan ......................................................................................................... 19 2.4 Anggur ................................................................................................................ 21 2.4.1 Taksonomi ................................................................................................. 21 2.4.2 Morfologi .................................................................................................. 21 2.4.3 Kandungan Anggur ................................................................................... 22 2.4.5
Biji Anggur ............................................................................................ 23
2.4.5 PAC sebagai Antioksidan ......................................................................... 25 2.5 Malondialdehida ........................................................................................... 26 2.5.1 Malondialdehida sebagai Produk Peroksidasi Lipid ................................. 28 2.5.2
Pengukuran Kadar Radikal Bebas.......................................................... 29
2.5.3
Mekanisme Kerja Radikal Bebas, Peroksidasi Lipid dan Malondialdehida..................................................................................... 30 ix
BAB 3 KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS ........................................................ 32 3.1 Kerangka Konsep ........................................................................................... 32 3.2 Hipotesis ......................................................................................................... 34 BAB 4 METODE PENELITIAN ..................................................................................... 35 4.1 Rancangan Penelitian ..................................................................................... 35 4.2 Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................................ 35 4.3 Populasi dan Sampel Penelitian ..................................................................... 35 4.3.1 Populasi ..................................................................................................... 35 4.3.2 Sampel....................................................................................................... 35 4.3.3 Replikasi.................................................................................................... 35 4.3.4 Teknik Pengambilan Sampel .................................................................... 36 4.3.5 Karakteristik Sampel Penelitian ................................................................ 36 4.3.5.1 Kriteria Inklusi .................................................................................. 37 4.3.5.2 Kriteria Eksklusi ................................................................................ 37 4.3.6 Variabel Penelitian .................................................................................... 37 4.3.6.1 Variabel Bebas .................................................................................. 37 4.3.6.2 Variabel Tergantung .......................................................................... 37 4.3.7 Definisi Operasional ................................................................................. 37 4.4 Alat dan Bahan ............................................................................................... 38 4.4.1 Alat ............................................................................................................ 38 4.4.2 Bahan ........................................................................................................ 39 4.5 Prosedur Penelitian ......................................................................................... 40 4.5.1 Ekstrak Biji Anggur .................................................................................. 40 x
4.5.2 Pembagian Kelompok Tikus ..................................................................... 41 4.5.3 Aklimatisasi .............................................................................................. 41 4.5.4 Pemaparan Asap Rokok ............................................................................ 41 4.5.5 Proses Anatesi dan Pembedahan Hewan Coba ......................................... 42 4.5.6 Perhitungan Kadar MDA .......................................................................... 42 4.6 Analisis Data .................................................................................................. 43 4.7 Alur Penelitian ................................................................................................ 44 BAB 5 HASIL PENELITIAN DAN ANALISIS DATA ................................................ 45 5.1 Hasil Penelitian............................................................................................... 45 5.2 Analisi Data .................................................................................................... 46 BAB 6 PEMBAHASAN .................................................................................................. 50 BAB 7 KESIMPULAN DAN SARAN............................................................................ 53 7.1 Kesimpulan ..................................................................................................... 53 7.2 Saran ............................................................................................................... 53 DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN
xi
DAFTAR TABEL Tabel
Halaman
5.1 Rerata Kadar MDA Plasma Darah Tikus .................................................................... 51 5.2 Hasil Uji Lanjut Tukey Honesty Significant Diffrences 5% MDA ............................. 52
xii
DAFTAR GAMBAR Gambar
Halaman
2.1 Kandungan Rokok ...................................................................................................... 10 2.2 Mekanisme Peroksidasi Lipid .................................................................................... 17 2.3 Buah Anggur .............................................................................................................. 20 2.4 Kandungan Buah Anggur ........................................................................................... 21 2.5 Biji Anggur................................................................................................................. 24 2.6 Struktur Kimia MDA ................................................................................................. 26 2.7 Reaksi Pembentukan TBA–MDA .............................................................................. 28 4.1 Konversi Dosis antar Spesies ..................................................................................... 30 5.1 Grafik Rerata Kadar MDA Plasma Darah Tikus Putih .............................................. 46 5.2 Grafik Regresi antara Dosis Ekstrak Biji Anggur dengan Penurunan Kadar MDA Plasma Darah Tikus.............................................................................................. 50
xiii
DAFTAR SINGKATAN
ANOVA
: Analysis of Variance
ADP
: Adenosine Diphospate
ATP
: Adenosine Triphospate
BHA
: Butylatedhydroxyanisole
BHT
: Butylatedhydroxytoluene
DNA
: DeoxyribonucleicAcid
GSPE
: Grape Seed Proanthocyanidins Extract
LDL
: Low Density Lipoprotein
NAD
: Nicotinamide adenine dinucleotide
MDA
: Malondialdehyde
OPC
: Oligomeric Proanthocyanidin Complex
PACs
: Proanthocyanidins
PG
: Propyl gallate
PUFA
: Poly Unsaturated Fatty Acid
ROI
: Reactive Oxygen Intermediate
ROS
: Reactive Oxygen Species
SOD
: Superoxyde dismutase
TBARS
: Thiobarbituratic Acid Reactive Substance
TBHQ
: Tertiary Butylhydroquinone
WHO
: World Health Organization
xiv
DAFTAR PUSTAKA
Arief
S,
2002,
Radikal
Bebas,
diakses
September
2012,
http://www.pediatrik.com/buletin/06224113752-x0zu6I.doc Arkhaesi N, 2008, Kadar Malondialdehis (MDA) Serum sebagai Indikator Prognosis Keluaran
pada
Sepsis
Neonatorum,
diakses
Januari
2013,
http://eprints.undip.ac.id/18343/1/Nahwa_Arkhaesi.pdf . Bagchi D, Bagchi M, Stohs SJ, et al, 2001, proanthocyanidin
extract:
importance
Free in
radicals human
and
health
grape and
seed
disease
prevention, Gen. Phar, pp. 771-776. Budiman, 2009, Masalah Kesehatan Akibat Alkohol dan Merokok, dalam : Sudoyo,AW, Bambang S, Idrus A, dkk, Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam, Edisi V, Interna Publishing, Jakarta, hal.83-88. Chen Z.Y., Chan P.T., Ho K.Y. ,et al, 1996, Antioxidative activity of natural flavonoids is gov-erned by number and location of their aromatic hydroxyl groups, Chem. Phys. Lipids 79, 157–163. Ceska, Arte , P., 2000, Pengaruh Rumput Laut (Euchema spinosum) terhadap Aktivitas Radikal Bebas pada Hepar Tikus, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang. Dalimartha, S, 2009, Atlas Tumbuhan Obat Indonesia Jilid 6, Pustaka Bunda, Grup Puspa Swara, Anggota IKAPI, Jakarta.
xv
Depkes RI, 2008, Rokok Membunuh Lima Juta Orang Setiap Tahun, diakses Desember 2012.
(http://www.depkes.go.id/index.php/berita/press-release/447-rokok-membunuh-
lima-juta-orang-setiap-tahun.html)
Fajarwati, E , I., 2001, Pengaruh Rumput Laut (Euchema spinosum) Terhadap Aktivitas Radikal Bebas pada Hepar Tikus (Rattus novergitus) yang Mendapat Diet Kolesterol Tinggi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang. Francisca A. Tjakradidjaja, Anita S. Tjakradidjaja, 2011, Pomegranate (Punica granatum L) powder reduced malondialdehyde (MDA) level in cigarette smoke exposed rats, Med J Indonesia, 20:34-9. Hancock,
1999,
Lipid
peroxidation-DNA
Damage
by
Malondialdehyde.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Pub Med&list_uids=10064852&dopt=Abstract. Harnita, Agnes Nora I, 2006, Uji Penangkapan Radikal Hidroksil Oleh Fraksi Air Dari Ekstrak Teh Hitam dan Vitamin C Secara Invitro Dengan Metode Deoksiribosa, Universitas Sanata Darma Yogyakarta, jurnal , hal. 152-161. Harmita, Maksum Radji, Buku Ajar Analisis Hayati, 2008, Edisi 3, Jakarta, EGC. Hassan, Nahla, 2010, In Vitro Antioxidant And Free Radical Scavenging Activities Of Red Grape Seed Extracts, Global Journal Of Biotecnology & Biochemistry Egypt, Vol.27, pp. 106-155. Hardjo M, 2004, Studi in Vivo Pengaruh Pemberian Tomat pada Tikus yang Diracuni dengan Karbon Tetraklorida terhadap Kerusakan Hati, Program Pascasarjana Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. xvi
Kemper K, 1999, Oligomeric Proanthocyanidin Complex (OPC)-Pycnogenols. Pine Bark Extract, Grape Seed Extract, The Center for Holistic Pediatric Education and Research, diakses pada Mei 2012 http://www.mcp.edu/herbal/default.htm. Mansouri, Marzieh Panahi, Mohammad Ali Ghaffariand, 2011, Effects of Grape Seed Proanthocyanidin Extract on Oxidative Stress Induced by Diabetes in Rat Kidney, Biomedical Journal Vol.15, pp. 100-106. Murray RK, Granner DK, Mayes PA, et al, 2003, Harper’s Biochemistry 26th Edition, California: Lange Medical. Naito Y, Yoshikawa T, Matsuyama K, et al, 1995, Effect of a novel histamine H2 – receptor antagonist, IT-066 on acute gastric injury induced by ischemia reperfusion in rats and its antioxidative properties, Eur J Pharmacol, 294 (1), pp. 47-54 Nelson , David, E., Paul Mowery, Scott Tomar, et al, 2006, Trends in Smokeless Tobacco Use Among Adults and Adolescents in the United States, US. Am J Public Health, 96(5): 897–905. Notoatmodjo S., 2005, Metodologi Penelitian Kesehatan, Asdi Mahasatya, Jakarta. Perricone Nicholas, 2007, The Perricone Prescription, Serambi, Jakarta. Powers SK , Jackson MJ, 2008, Exercise-Induced Oxidative Stress: CeLlular Mechanism and Impact on Muscle Force Production. Physiol Rev 88, pp. 12431276. Rahmantini, 2010, Pengaruh pemberian Vitamin C terhadap kadar MDA serum pada Lansia, Majalah kedokteran Andalas 29 (2).
xvii
Rapport L, Lockwood B, 2001, Proanthocyanidins and grape seed extract,
The
Pharmaceutical Journal, 266, 581-584. Rimando, Agnes M, Suh, Nanjoo, 2008, Biological/Chemopreventive Activity of Stilbenes and their Effect on Colon Cancer, United States Departement of Agriculture, Agricultural Research Service, Natural Products Utilization Research Unit, University, USA. http://evidencebasednaturalhealth.weebly.com/stillbenes.html Rukmana, Rahmat, 2009, Anggur Budidaya dan Penanganan Pasca Panen, Kanisius, Yogyakarta. Setijowati, Nanik, 1998, Pengaruh Raikal Bebas dan Vitamin E terhadap Jumlah Circulating Endothel pada Darah Tikus yang Dipapar Asap Rokok Kretek Secara Kronik, Majalah Kedokteran Unibraw, (XIV) 3 : 94-99. Sharon, 2007, Bahaya Tembakau dan Bentuk – Bentuk Sediaan Tembakau, diunduh September 2012
. Shi John, Yu Jianmel, Pohorly Joseph E et al, 2003, Polyphenolics in Grape Seed Biochemistry and Functionality, Food, Agriculture & Environment, Vol.1(2), pp. 42-47. Sikka S, Rajasekaran M, Hellstrom, 1995 ,Role of Oxidative Stress and Antioxidants in Male Infertility. Journal of Andrology, 16, 8-464. Silalahi J, 2006, Antioksidan dalam Diet dan Karsinogenesis, Cermin Dunia Kedokteran,153, hal 42-47.
xviii
Subandi, 1999, Efek Antioksidan (Vit.C) Terhadap Jumlah Makrofag Alveoli serta Kadar SOD Jaringan Paru Tikus yang Dipapar dengan Asap Rokok Kronis (Thesis), Malang, Universitas Brawijaya. Sudjari,1996, Rat Wistar as a Laboratory Animal on Tetanus Toxoid Research (Tikus Wistar sebagai Hewan Coba untuk Penelitian dengan Toksoid Tetanus), Majalah Kedokteran Universitas Brawijaya,12(3). Supranto J, 2007, Teknik Sampling Survey & Eksperimen, Rineka Cipta, Jakarta, hal 127. Suryohudoyo P, 2000, Oksidan antioksidan dan radikal bebas. Dalam: Suryohudoyo P, Kapita Selekta Ilmu Kedokteran Molekuler, Jakarta: CV Sagung Seto;h.31-47. WHO, 2008, Global Adult Tobacco Survey Indonesia, World Health Organization, Indonesia. Diakses Desember 2012. (http://www.who.int/tobacco/surveillance/gats/en/index.html) Widodo, MA, 1997, Xenobiotik dan Radikal Bebas Pada Patogenesa Penyakit Paru, Kumpulan Makalah Seminar dan Lokakarya, Fakultas Kedokteran Brawijaya. Malang Wikipedia , 2007, Struktur Kimia MDA, http: // wikipedia.com/ struktur kimia MDA/ (20 November 2012) Winarsi, Hery, 2007, Antioksidan Alami dan Radikal Bebas, Kanisius, Yogyakarta, hal.80. Wiriyanta, Bernard T, Wahyu, 2008, Membuahkan Anggur di Dalam Pot dan Pekarangan, Agro Media Pustaka, Jakarta.
xix
Yuneawati Y, Ali M 2004, Pengaruh paparan asap rokok kretek terhadap peroksidasi lemak dan system proteksi superoksid dismutase hepar tikus wistar, Jurnal Kedokteran Yarsi. Yuniastuti A, 2008, Gizi dan Kesehatan, Graha Ilmu, Yogyakarta.
xx
