PENAPISAN BAKTERI LIPOLITIK ASAL FRUKTOSFER KELAPA SAWIT
ALLIA LAKSMI NURDINI
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
ABSTRAK ALLIA LAKSMI NURDINI. Penapisan Bakteri Lipolitik asal Fruktosfer Kelapa Sawit. Dibimbing oleh ANTONIUS SUWANTO dan ESTI PUSPITASARI. Lipase (EC 3.1.1.3, gliserol ester hidrolase) didefinisikan sebagai karboksilesterase yang mengkatalisis hidrolisis rantai panjang asilgliserol. Enzim lipase dapat dihasilkan oleh bakteri lipolitik yang tumbuh dengan baik pada substrat mengandung minyak seperti buah kelapa sawit. Tujuan penelitian ini ialah menapis bakteri lipolitik asal fruktosfer kelapa sawit, melakukan karakterisasi pH, dan suhu lipase dari isolat terpilih. Sebanyak tujuh isolat bakteri lipolitik dengan morfologi koloni berbeda berhasil ditapis secara kualitatif dari fruktosfer kelapa sawit menggunakan media penapisan Rhodamin B. Bakteri diisolasi dari eksokarp dan mesokarp buah kelapa sawit yang matang. Aktivitas lipolitik dari tiap isolat diukur dan diseleksi berdasarkan besar aktivitasnya. Tiga isolat memiliki aktivitas terbaik dengan hasil sebagai berikut EP2.22 (0.912 U/mg), F2 (0.792 U/mg), dan F6 (0.650 U/mg). Isolat-isolat tersebut mempunyai aktivitas yang tinggi pada rentang pH dan suhu yang bervariasi. Isolat EP2.22 memiliki pH optimum 7.5 dan memiliki suhu optimum 40 oC atau 70 oC. Isolat F2 memiliki pH optimum 8.5 dan memiliki suhu optimum 70 oC. Isolat F6 memiliki pH optimum 8.5 dan memiliki suhu optimum 30 oC atau 70 oC. Dua puncak aktivitas yang tinggi disebabkan enzim yang dipakai merupakan enzim ekstrak kasar. Analisis gen 16S rRNA mengidentifikasikan EP2.22, F2, dan F6 berkolerasi dekat dengan Staphylococcus klosii, Enterobacter sp., dan Buttiauxella izardii.
ABSTRACT ALLIA LAKSMI NURDINI. Screening of Lipolytic Bacteria from Oil Palm Fructosphere. Supervised by ANTONIUS SUWANTO and ESTI PUSPITASARI. Lipase (EC 3.1.1.3, glycerol ester hidrolase) is defined as carboxylesterase that catalyzes the hydrolysis of long chain asilgliserol. Lipase produced by lipolytic bacteria that grow well in substrates containing oils such as oil palm fruit. The purpose of this study was to screen lipolytic bacteria from oil palm fructosphere and to characterize optimal pH and temperature of lipase enzyme from selected isolates. Seven isolates of lipolytic bacteria with different morphology were qualitatively screened from oil palm fructosphere using Rhodamin B media. Bacteria were isolated from the exocarp and mesocarp of ripe oil palm fruits. Lipolytic activity each isolates were measured and selected based on their activity. Three isolates possessed the best activity with result as follows EP2.22 (0.912 U/mg), F2 (0.792 U/mg), and F6 (0.650 U/mg). These isolates showed high activity at various range of pH and temperature. Isolate EP2.22 showed optimum pH at 7.5 and optimum temperature at either 40 oC or 70 oC. Isolate F2 showed optimum pH 8.5 and optimum temperature 70 oC. Isolate F6 showed optimum pH 8.5 and optimum temperature at 30 o C and 70 oC. Two peaks of high activity due to the use of crude enzyme extract. 16S rRNA gene sequencing indicated that isolates EP2.22, F2, and F6 closely related to Staphylococcus klosii Enterobacter sp., and Buttiauxella izardii.
PENAPISAN BAKTERI LIPOLITIK ASAL FRUKTOSFER KELAPA SAWIT
ALLIA LAKSMI NURDINI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
Judul : Penapisan Bakteri Lipolitik asal Fruktosfer Kelapa Sawit Nama : Allia Laksmi Nurdini NIM : G34061578
Disetujui, Pembimbing I
Pembimbing II
Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc. NIP. 19581130 198503 1 003
Esti Puspitasari, M.Si. NIK.6209009839
Diketahui, Ketua Departemen Biologi
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si. NIP. 19641002 198903 1 002
Tanggal Lulus :
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan ke kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karuniaNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul “Penapisan Bakteri Lipolitik asal Kelapa Sawit”. Penelitian ini dilakukan mulai Februari 2010 sampai dengan Juni 2010”, di laboratorium Bioteknologi, PT Wilmar Benih Indonesia, Cikarang. Penulis mengucapkan terima kasih kepada berbagai pihak yang telah membantu selama berlangsungnya penelitian ini. Ucapan terima kasih disampaikan kepada Bapak Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc. selaku dosen pembimbing kesatu dan Ibu Esti Puspitasari, M.Si. selaku pembimbing kedua, dan Griselda Herman Natadiputri, S.Si selaku pembimbing lapang atas segala bimbingan, saran, dan masukan selama berlangsungnya kegiatan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Ibu Dra. Sri Listiyowati, M.Si. selaku dosen penguji wakil komisi pendidikan yang memberikan masukan penulisan karya ilmiah. Tak lupa juga penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Kak Budi, Kak Syamsul, Kak Jesi, dan Pak Jo atas bantuan dan diskusinya, rekan-rekan penelitian (Rio, Dimas, dan Aida), serta semua staf laboratorium Bioteknologi PT Wilmar Benih Indonesia, Cikarang. Terima kasih kepada keluarga besar saya yang telah memberikan dukungannya baik moril maupun materil. Selain itu, tak lupa pula penulis ucapkan terima kasih kepada keluarga besar OWA, teman-teman Biologi 43 (Risa, Dara, Nunuz, dan Mala), teman-teman Biologi 42, dan keluarga pondok kos ACC (Risti, Abe, Amal, dan Gendis) yang telah memberikan dukungan, semangat, dan kebersamaannya. Semoga skripsi ini bermanfaat bagi semua pembacanya.
Bogor, November 2010
Allia Laksmi Nurdini
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 6 Juni 1988 sebagai anak pertama dari dua bersaudara dari pasangan Bapak Bambang Mulyanto dan Ibu Herlina. Penulis lulus SD pada tahun 2000, dan SLTP pada tahun 2003. Pada tahun 2006 penulis lulus dari SMAN 81 Jakarta dan pada tahun yang sama diterima di Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB). Penulis melakukan Studi Lapang pada tahun 2008 mengenai Eksplorasi Rhizobakteria asal Perakaran Legum dari Kawasan Taman Wisata Alam Situ Gunung-Sukabumi. Penulis melakukan Praktik Lapang pada tahun 2009 mengenai Konservasi Ex-Situ Beruk (Macaca nemestrina) di International Animal Rescue (IAR) Indonesia, Ciapus-Bogor. Penulis pernah mendapat beasiswa Peningkatan Prestasi Akademik (PPA) yang diberikan oleh Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi pada tahun ajaran 2008/2009 dan menjadi kandidat penerima program beasiswa Indonesia English Language Program (IESLP) yang diadakan oleh The Indonesian International Education Foundation (IIEF) pada tahun 2009. Selama masa perkuliahan penulis aktif menjadi asisten praktikum mata kuliah Perekembangan Hewan tahun pada tahun ajaran 2008/2009, Biologi Dasar pada tahun ajaran 2010/2011, Struktur Tumbuhan Berpembuluh pada tahun ajaran 2010/2011, dan Mikrobiologi Dasar pada tahun ajaran 2010/2011. Penulis juga menjadi pengajar Biologi Dasar pada bimbingan belajar B’Expert pada tahun 2008. Di bidang kemahasiswaan, penulis aktif sebagai anggota Observasi Wahana Alam (OWA) Himabio periode 2007/2008 sebagai sekretaris, dan periode 2008/2009 sebagai anggota.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR .....................................................................................................................viii DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................................................viii PENDAHULUAN............................................................................................................................. 1 Latar Belakang ............................................................................................................................. 1 Waktu dan Tempat ....................................................................................................................... 2 BAHAN DAN METODE ................................................................................................................. 2 Bahan............................................................................................................................................ 2 Isolasi dan Penapisan bakteri lipolitik .......................................................................................... 2 Preparasi Enzim Ekstrak Kasar .................................................................................................... 2 Spesifikasi Enzim ......................................................................................................................... 2 Identifikasi Strain ......................................................................................................................... 3 HASIL ............................................................................................................................................... 3 Isolasi dan Penapisan Bakteri Lipolitik ........................................................................................ 3 Uji Aktivitas Enzim ...................................................................................................................... 4 Karakterisasi pH dan Suhu Optimum Enzim................................................................................ 5 Identifikasi Strain ......................................................................................................................... 5 SIMPULAN ...................................................................................................................................... 8 DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................................... 8 LAMPIRAN .................................................................................................................................... 10
DAFTAR GAMBAR
Halaman 1 Reaksi enzimatik lipase dalam mengkatalisis hidrolisis dan sintesis substrat triasilgliserol...... 1 2 Struktur buah kelapa sawit........................................................................................................
2
3 Aktivitas lipase isolat bakteri lipolitik asal fruktosfer kelapa sawit aadan S. epidermidis....................................................................................................................
4
4 Aktivitas spesifik lipase isolat bakteri lipolitik asal fruktosfer kelapa sawit Aadan S.epidermidis....................................................................................................................
4
5 Pengaruh pH terhadap aktivitas lipase isolat EP2.22, F2, F6, dan S9......................................
5
6 Pengaruh suhu terhadap aktivitas lipase isolat EP2.22, F2, F6, dan S9...................................
5
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1 Hasil penapisan bakteri lipolitik pada fruktosfer kelapa sawit...............................................
11
2 Karakterisasi morfologi isolat dan pewarnaan Gram bakteri lipolitik asal fruktosfer kelapa Asawit......................................................................................................................................
11
3 Bagan alir pembuatan reagen cupric-acetate pyridine..........................................................
11
4 Kurva standar asam palmitat..................................................................................................
12
5 Data standar asam palmitat.....................................................................................................
12
6 Kurva standar kadar protein....................................................................................................
13
7 Data standar kadar protein.....................................................................................................
13
8 Pengukuran aktivitas enzim, kadar protein, dan aktivitas spesifik enzim lipase ekstrak....... aakasar bakteri lipolik asal frukosfer kelapa sawit dan S. epidermidis.....................................
14
9 Pengukuran suhu optimum enzim..........................................................................................
14
10 Pengukuran pH optimum enzim...........................................................................................
15
11 Protokol Qiaquick® PCR purification kit dengan menggunakan microcentrifuge..............
16
12 Protokol Big Dye® X-Terminator Purification Kit.............................................................
16
1
PENDAHULUAN Latar Belakang Enzim telah digunakan secara luas dan terus berkembang dalam bidang industri. Hal ini berkaitan dengan keuntungan dari pengaplikasian enzim, antara lain: ongkos produksi menjadi lebih rendah dalam jangka panjang; bereaksi secara spesifik; dapat bekerja dalam kondisi dengan tekanan dan suhu yang lebih rendah dibandingkan dengan cara fisik dan kimiawi;; dan ramah lingkungan. Salah satu enzim yang mempunyai peranan penting dalam industri ialah lipase. Lipase (EC 3.1.1.3, gliserol ester hidro hidrolase) didefinisikan sebagai gai karboksilesterase yang mengkatalisis talisis hidrolisis rantai panjang asilgliserol dengan trioleogliserol sebagai substrat standar (Jaeger & Eggert 2002). Lipase mengkatalisis atalisis hidrolisis ikatan ester pada antarmuka antara fase yang tidak larut dalam air (substrat) dan fase akua pada enzim tersebut larut.. Hidrolisis ini menghasilkan digliserida, monogliserida, gliserol, dan asam lemak. Pada kondisi keterbatasan air, lipase dapat mengkatalisis reaksi balik yang disebut esterifikasi. Reaksi ini mensintesis gliserida dari asam lemak dan gliserol (Saxena et al. 1999). Skema reaksi si tersebut dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1 Reaksi enzimatik lipase dalam mengkatalisis hidrolisis dan sintesis substrat triasilgliserol (Jaeger et al al. 1994). Penggunaan enzim lipase ipase dapat diterapkan dalam industri kelapa sawit sawit. Indonesia merupakan salah satu negara penghasil minyak kelapa sawit terbesar di dunia dan bersama-sama sama Malaysia menguasai 85% minyak kelapa sawit di dunia (FAO 2010). Oleh karena itu, pengolahan lebih lanjut minyak kelapa sawit dapat meningkatkan nilai jual produk dan potensinya sebagai sumber devisa. Oleokimia merupakan produk ol olahan kelapa sawit yang non edible. Produk ini digunakan sebagai bahan pada berbagai industri seperti sabun, detergen, makanan, kosmetik, farmasi, plastik, dan kertas (Rupilius & Ahmad 2006 2006). Produk oleokimia
dasar terdiri atas asam lemak, asam alkohol, metil ester, dan gliserida yang merupakan hasil dari pemecahan trigliserida. Pemakaian lipase untuk memecah trigliserida dalam industri oleokimia dapat menghemat energi dan mencegah denaturasi akibat panas tinggi selama proses hidrolisis, alkoholisis, dan gliserolisis (Hasan et al.. 2006). 2006) Selain untuk pengolahan produk non edible kelapa sawit, lipase juga dapat dapa digunakan dalam pengolahan produk edible atau pangan. Untuk menghindari resiko penyakit yang disebabkan oleh produk pangan yang mengandung asam lemak trans akibat proses hidrogenasi maka industri minyak dan lemak mulai menerapkan proses interinter esterifikasii dengan menggunakan enzim lipase. Produk tersebut berupa margarin, shortening, pastry,, dan minyak untuk menggoreng (Pandiangan 2008). 2008) Reaksi esterifikasi lipase juga dapat mengkonversi triasilgliserol kelapa sawit menjadi biodiesel. Dalam bidang lingkungan, lingkungan reaksi hidrolisis lipase dapat mendegradasi limbah yang mengandung lipid, minyak, dan hidrokarbon (Hasan et al. 2006). Lipase banyak tersedia di alam, enzim ini dapat diproduksi oleh tumbuhan, hewan, dan mikrob. Mikrob penghasil asil lipase antara lain bakteri Gram positif maupun Gram negatif, negatif aktinomiset, khamir, dan kapang (Sharma et al. 2001). Produksi enzim yang berasal dari mikroorganisme me memiliki beberapa kelebihan antara lain waktu generasi yang pendek dan kebutuhan butuhan nutrisi yang sederhana (Hasan et al. 2006). Tumbuhan menyediakan lingkungan yang mendukung pertumbuhan mikrob mikro terutama di tempat yang lembap dan kaya kay nutrisi seperti buah. Daerah buah dan mikrob berinteraksi disebut juga sebagai fruktosfer. Buah merupakan perkembangan lebih lanjut dari ovari bunga dan merupakan struktur penting pada siklus hidup seksual tumbuhan angiospermae. Buah melindungi biji, membantu dalam penyerbukan, dan dapat menjadi faktor biji untuk berkecambah (Rost et al. 2006). Buah kelapa sawit (Elaeis ( guineensis Jacq.)) merupakan buah drupe, berwarna merah atau jingga kemerahan ketika ke matang. Dinding buahnya terdiri atas tiga bagian yaitu kulit luar (exocarpium exocarpium), kulit tengah (mesocarpium), dan kulit dalam (endocarp( ium). Buah ini memiliki eksokarp tipis dengan mesokarp mengelilingi kernel atau biji, dan memiliki parenkima yang mengandung tubuh minyak (Bewley et al.. 2006, Tjitrosoepomo
2
1985). Minyak kelapa sawit dapat diekstrasi dari mesokarp (crude palm oil) dan kernel yang berada dalam endokarp (palm kernel oil).
Gambar 2 Struktur buah kelapa sawit (Poku 2002). Bakteri lipolitik dapat ditemukan di banyak tempat yang mengandung minyak. Lingkungan yang mengandung minyak merupakan substrat yang baik terhadap bakteri lipolitik untuk tumbuh (Rahman et al. 2007). Hal ini membuat bakteri ini memiliki potensi untuk mengolonisasi buah kelapa sawit. Tujuan Tujuan penelitian ini ialah menapis bakteri lipolitik asal fruktosfer kelapa sawit dan melakukan karakterisasi pH dan suhu lipase dari isolat terpilih. Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Bioteknologi, PT Wilmar Benih Indonesia, Cikarang. Penelitian ini berlangsung mulai bulan Februari hingga Juni 2010.
BAHAN DAN METODE Bahan Bahan yang digunakan ialah buah kelapa sawit berasal dari pohon berumur 5 tahun yang berasal dari PT. Tania Selatan, Palembang. Isolasi dan Penapisan bakteri lipolitik Bakteri fruktosfer diisolasi dari tiga bagian buah yaitu: eksokarp; pengelupasan bagian eksokarp dan mesokarp; dan mesokarp sisa pengelupasan. Sebanyak lima buah kelapa sawit yang matang dicuci menggunakan air steril sebanyak lima kali volume buah selama satu menit. Kemudian bagian eksokarp diusap dengan cotton bud steril yang telah dibasahi larutan NaCl 0.85% sebanyak 100 µl. Cotton bud tersebut dimasukkan ke dalam 5 ml larutan NaCl 0.85% dan dihomogenisasi menggunakan vortex.
Setelah diusap, eksokarp dan sedikit mesokarpnya dikelupas, ditambah larutan NaCl 0.85% dengan perbandingan 100:1, dan dihancurkan dengan menggunakan mortar. Ekstrak dari pengelupasan kemudian dimasukkan ke dalam tabung steril. Mesokarp sisa pengelupasan ditambah dengan larutan NaCl 0.85% dengan perbandingan 100:1 dan dihancurkan menggunakan blender. Kemudian daging yang telah dihancurkan tersebut diambil ekstraknya dan dipisahkan ke dalam tabung steril. Ekstrak buah dari tiap sampel disebar sebanyak 10 µl, 50 µl, dan 100 µl pada media agar Rhodamin B (Kouker & Jaeger 1987) yang mengandung minyak zaitun Filippo Berio® (Italia). Media diinkubasi selama 48 jam pada suhu 30 oC. Aktivitas lipolitik pada media penapisan dapat dideteksi di bawah sinar UV (λ =350 nm) sebagai zona berpendar berwarna jingga di sekitar koloni. Koloni bakteri lipolitik yang secara morfologi berbeda dikoleksi dan digores pada media yang sama serta dilakukan pewarnaan Gram mengikuti Hadioetomo (1993). Preparasi Enzim Ekstrak Kasar Preparasi enzim ekstrak kasar menggunakan metode Handayani dan Sulistyo (2005) dengan modifikasi. Sebanyak satu koloni dari tiap isolat masing-masing diperkaya pada 4 ml media kaldu Luria Bertani, diagitasi selama 24 jam pada suhu 30 o C dengan kecepatan 150 rpm. Kemudian biakan dituang ke media produksi dan diinkubasi selama 72 jam pada suhu 30 oC dengan kecepatan 175 rpm menggunakan inkubator bergoyang. Media produksi merupakan media yang sama dengan media penapisan ditambah minyak zaitun (25:1), namun tanpa menggunakan Rhodamin B, agar-agar, dan pengemulsi. Media produksi yang dipakai untuk tiap isolat ialah sebanyak 50 ml. Biakan disentrifugasi dengan kecepatan 12500 g pada suhu 4 oC selama 12 menit. Supernatan hasil sentrifugasi dari biakan pada media produksi mengandung enzim lipase ekstrak kasar. Sebanyak 1 mM phenyl methyl sulfonyl fluoride ditambahkan ke dalam supernatan sebagai penghambat protease. Supernatan disimpan pada suhu 4 oC dan akan dipakai untuk tahap selanjutnya. Spesifikasi Enzim Pengukuran aktivitas lipase dilakukan dengan metode Kwon dan Rhee (1986) dengan modifikasi pada suhu inkubasi. Sebanyak 1.25 ml minyak zaitun, 1.25 ml
3
bufer fosfat pH 7, dan 20 µL CaCl2 0.02 M dihomogenisasi menggunakan vortex. Kemudian sebanyak 1 ml enzim lipase ekstrak kasar dimasukkan ke campuran tersebut dan diinkubasi dengan menggunakan inkubator bergoyang pada suhu 40 oC dengan kecepatan 200 rpm selama 30 menit. Reaksi enzim dihentikan dengan menambahkan 1 ml HCl 6 N. Campuran ditambah 5 ml isooktana sebagai pelarut organik. Kemudian campuran dihomogenisasi selama 30 detik menggunakan vortex. Sebanyak 4 ml lapisan atas isooktana dipindahkan ke tabung baru dan ditambah reagen cupric acetate-pyridine dan dihomogenisasi selama 30 detik menggunakan vortex. Sebanyak 1.5 ml lapisan atas dipindahkan ke tabung baru dan disentrifus dengan kecepatan 10000 g selama 20 detik. Supernatan diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 715 nm, menggunakan SmartSpec Plus Spectrophotometer (BioRad, Amerika Serikat). Nilai absorbansi kemudian dikonversi ke dalam satuan unit/ml menggunakan kurva standar asam palmitat. Satu unit lipase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang membebaskan 1 µmol asam lemak per ml tiap menit pada kondisi uji aktivitas yang dideskripsikan. Kadar protein diukur dengan metode Bradford (1976) menggunakan bovine serume albumine sebagai kurva standar. Aktivitas spesifik lipase dihitung dengan membagi aktivitas lipase dengan kadar protein. Lipase ekstrak kasar yang memiliki aktivitas yang paling baik dipilih untuk karakterisasi enzim dan identifikasi strain. Pada uji ini, lipase ekstrak kasar Staphylococcus epidermidis digunakan sebagai referensi. Bakteri S. epidermidis yang digunakan merupakan kultur koleksi laboratorium Bioteknologi PT. Wilmar Benih Indonesia, Cikarang. Penentuan pH optimum dari aktivitas lipase diuji pada kisaran pH yang berbeda dari pH 5.0 sampai 9.0 dengan skala kenaikan sebesar 0.5. Bufer yang digunakan ialah: 0.1 M bufer asetat (pH 5.0-6.0), 0.1 M bufer fosfat (pH 7.0-8.0), dan 0.1 M bufer tris HCl (pH 8.0-9.0). Aktivitas lipase diuji pada kisaran suhu yang berbeda untuk menentukan suhu optimum dari suhu 30 hingga 80 oC dengan skala kenaikan sebesar 10 oC pada pH optimum. Identifikasi Strain Identifikasi molekular strain bakteri menggunakan metode sekuensing DNA koloni tunggal pada gen 16S rRNA (Frothingham et al. 1991). Templat DNA
berasal dari koloni tunggal yang diambil dengan tusuk gigi steril dan dimasukan ke dalam 100 µl dd H2O. Gen 16S rRNA diamplifikasi menggunakan primer 63f (5’CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC - 3’) dan 1387r (5’ - GGG CGG WGT GTA CAA GGC - 3’) (Marchesi et al. 1998). Siklus PCR menggunakan C1000TM Thermal Cycle (Bio Rad) dengan kondisi: pre-denaturasi 94 oC, 7 menit; denaturasi 94 oC, 30 detik; annealing 56 oC, 30 detik; elongasi 1 menit 30 detik, 72 o C; dan pasca elongasi 7 menit. Denaturasi, annealing, dan elongasi berlangsung selama 30 siklus sedangkan pre-denaturasi dan pasca elongasi berlangsung selama satu kali. Reaksi PCR dilakukan dengan komposisi sebagai berikut: 10 µl GoTaq Green Mastermix (Promega, USA), 7 µl nuclease-free water, 1 µl primer 63f (10 pmol/ µl), 1 µl primer 1387r (10 pmol/µl) dan 1 µl template. Hasil PCR dipurifikasi dengan Qiaquick® PCR purification kit (Qiagen, Valencia, California). Cycle sequencing menggunakan BigDye® Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem, Foster city, California) dan diamplifikasi dengan Bio Rad C1000TM Thermal Cycle dengan kondisi sebagai berikut: pre-denaturasi 94 oC, 3 menit; denaturasi 94 oC, 30 detik; annealing 56 oC , 30 detik; elongasi 60 oC, 1 menit 15 detik; dan pasca elongasi 60 oC, 5 detik. Denaturasi, annealing dan elongasi berlangsung selama 25 siklus sedangkan pre-denaturasi dan pasca elongasi berlangsung selama satu kali. Hasil dari cycle sequensing dipurifikasi menggunakan Big Dye® X-Terminator Purification Kit (Applied Biosystem, Foster city, California) dan disekuensing dengan ABI PRISMTM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystem, Foster City, California). Hasil dari sekuensing dianalisis dengan BLAST-N (Basic Local Alignment Search Tool Nucleotida) dari situs NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
HASIL Isolasi dan Penapisan Bakteri Lipolitik Dari penelitian ini telah berhasil diisolasi tujuh koloni bakteri lipolitik yang berbeda morfologinya dari fruktosfer kelapa sawit. Bakteri tersebut adalah EP2.22 dan FFB1 yang diisolasi dari eksokarp buah kelapa sawit; serta EPN2, F1, F2, F4, dan F6 yang diisolasi dari eksokarp dan mesokarp buah kelapa sawit (Lampiran 1). Berdasarkan hasil pewarnaan Gram, lima isolat (EP2.22, FFB1,
4
EPN2, F1, dan F4) merupakan Gram positif. Sedangkan dua isolat lainnya merupakan Gram negatif. Berdasarkan pengamatan mikroskopis sel bakteri, lima isolat (FFB1, EPN2, F2, F4, dan F6) memiliki bentuk batang dan dua isolat berbentuk kokus. Penampakan morfologi dari tiap koloni menunjukkan bentuk bundar dengan keragaman pada warna, diameter, elevasi, dan tepian (Lampiran 2).
isolat F2 (0.044 U/ml). Sedangkan lipase isolat F1 (0.023 U/ml), F4 (0.017 U/ml), FFB1 (0.011 U/ml), dan EPN2 (0.013 U/ml) memiliki aktivitas yang rendah (Gambar 3). Aktivitas spesifik S. epidermidis (0.452 U/mg) lebih rendah dibandingkan dengan bakteri fruktosfer dengan nilai aktivitas spesifik tertinggi yaitu berturut-turut: isolat EP2.22 (0.912 U/mg), F2 (0.792 U/mg), dan F6 (0.659 U/mg). Lipase isolat lainnya yaitu F1 (0.374 U/mg) memiliki aktivitas spesifik yang sedang, sedangkan lipase isolat F4 (0.054 U/mg), FFB1 (0.126 U/mg), dan EPN2 (0.063 U/mg) memiliki aktivitas spesifik yang rendah (Gambar 4). Berdasarkan hasil nilai aktivitas dan aktivitas spesifik, isolat EP2.22, F2, dan F6 dipilih untuk tahap selanjutnya.
Aktivitas lipase (U/ml)
Uji Aktivitas Enzim Bakteri referensi, S. epidermidis yang ditandai oleh kode S9 mempunyai aktivitas lipase terbesar (0.117 U/ml). Aktivitas lipase terbesar dari isolat bakteri fruktosfer dimiliki oleh EP2.22 (0.084 U/ml) dan F6 (0.100 U/ml). Aktivitas lipase sedang dimiliki oleh
0.140 0.117 0.120 0.100 0.100 0.084 0.080 0.060 0.044 0.040 0.023 0.017 0.011 0.013 0.020 0.000
Isolat Gambar 3 Aktivitas lipase isolat bakteri lipolitik asal fruktosfer kelapa sawit dan S. epidermidis.
Aktivitas spesifik lipase (U/mg)
1.000
0.912 0.792
0.800
0.659
0.600 0.400 0.200
0.452
0.374 0.054
0.126 0.063
0.000
Isolat Gambar 4 Aktivitas spesifik lipase isolat bakteri lipolitik asal fruktosfer kelapa sawit dan S. epidermidis.
5
Identifikasi Strain Berdasarkan analisis gen 16S rRNA, isolat EP2.22 diidentifikasi sebagai Staphylococcus kloosii dengan kemiripan sebesar 97% terhadap Staphylococcus kloosii strain FR2_36con (No. akses EU934080.1); isolat F2 diidentifikasi sebagai Enterobacter sp. dengan kemiripan sebesar 97% terhadap Enterobacter sp. FMB-1 (No. akses DQ855282.1); dan isolat F6 diidentifikasi sebagai Buttiauxella izardii dengan kemiripan sebesar 98% terhadap Buttiauxella izardii strain S3/2-161 (No. akses NR_025331.1).
Karakterisasi pH dan Suhu Optimum Enzim Lipase isolat EP2.22, F2, F6, dan S9 memiliki aktivitas optimum berturut-turut yaitu pada pH 7.5, 8.5, 8.5, dan 7 (Gambar 5). Suhu optimum lipase isolat F2 dan S9 berturut-turut ialah 70 oC dan 50 oC. Pengukuran lipase isolat Ep2.22 memperlihatkan dua puncak aktivitas pada suhu 40 o C (100%) dan 70 oC (85%). Lipase isolat F6 juga memperlihatkan dua puncak aktivitas yaitu pada suhu 70 oC (100%) dan 30 oC (90%) (Gambar 6). Puncak aktivitas ditandai dengan lebih tingginya aktivitas relatif dibandingkan aktivitas relatif disampingnya pada diagram batang.
Aktivitas relatif (%)
120 100 80 EP2.22
60
F2
40
F6
20
S9
0 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 pH
Aktivitas relatif (%)
Gambar 5 Pengaruh pH terhadap aktivitas lipase isolat EP2.22, F2, F6, dan S9.
110 100 90 80 70 60 50 40 30 20
EP2.22 F2 F6 S9 30
40
50
60
70
80
Suhu (oC) Gambar 6 Pengaruh suhu terhadap aktivitas lipase isolat EP2.22, F2, F6, dan S9.
6
PEMBAHASAN Tujuh isolat bakteri lipolitik yang berbeda morfologinya telah berhasil ditapis dari fruktosfer kelapa sawit yang matang. Isolat ditapis menggunakan media Rhodamin B dengan minyak zaitun sebagai sumber minyak. Hidrolisis minyak zaitun oleh bakteri lipolitik pada media penapisan menghasilkan asam lemak bebas, monogliserida, dan digliserida yang akan berikatan dengan pewarna Rhodamin B. Hasil pengikatan ini akan menghasilkan zona berpendar berwarna jingga di sekitar koloni yang dapat dilihat setelah media diradiasi dengan sinar UV. Terdapat korelasi positif antara pendaran jingga dan aktivitas lipolitiknya (Kouker & Jaeger 1987; Hou & Johnston 1992). Oleh karena itu, ketujuh isolat bakteri lipolitik tersebut dipilih berdasarkan kuatnya pendaran pada koloni. Buah kelapa sawit yang digunakan pada penelitian ini merupakan buah yang matang. Menurut Poku (2002) buah kelapa sawit yang matang memiliki kadar minyak yang tinggi dan mesokarp yang lunak. Hal ini mengakibatkan buah akan mudah terserang enzim lipolitik. Enzim lipolitik yang menyerang kelapa sawit berasal dari lipase endogenous mesokarp dan lipase eksogenous mikroorganisme (Ebongue et al. 2006). Mikroorganisme yang telah dilaporkan meng hasilkan lipase eksogenous pada buah kelapa sawit antara lain cendawan Rhizopus oryzae, Mucor hiemalis f. hiemalis, dan Mucor sp. (Hiol et al. 1999; Hiol et al. 2000; Abbas et al. 2002). Hasil dari pengelupasan eksokarp dan mesokarp di sekitar permukaan kelapa sawit merupakan penghasil bakteri lipolitik dengan ragam terbanyak dibandingkan permukaan buah. Pada mesokarp kelapa sawit bagian dalam, tidak ada bakteri lipolitik yang diisolasi. Hal ini disebabkan karena kolonikoloni bakteri yang berasal dari mesokarp kelapa sawit tersebut tidak menghasilkan pendaran oranye dan juga pendaran yang kuat pada media penapisan dan diindikasikan tidak memiliki aktivitas lipolitik yang besar. Uji biokimia pada isolat yang menghasilkan pendaran kurang kuat dan juga tidak menunjukkan keberadaan aktivitas lipase. Sehingga dapat dikatakan pada mesokarp bagian dalam tidak terdapat aktivitas lipolitik pada bakteri fruktosfer. Sebelumnya Djafar et al. (2010) berhasil mengisolasi bakteri penghasil lipase dari daging buah kelapa sawit. Bakteri yang
berhasil diisolasi dan diidentifikasi ialah Bacillus brevis dan B. laterosporus. Hasil identifikasi bakteri pada penelitian ini berbeda dengan penelitian Djafar et al. (2010). Hal ini bisa disebabkan karena jenis, tingkat kematangan, dan penanganan contoh buah yang berbeda. Perbedaan waktu pengambilan buah juga dapat berpengaruh terhadap keragaman bakteri. Pengambilan sampel dilakukan pada bulan Februari (musim hujan). Curah hujan akan mempengaruhi kelimpahan serangga yang menjadi pembawa bakteri antar tanaman, dan kandungan air pada buah juga dapat menjadi faktor kelimpahan bakteri. Jadi bakteri lipolitik yang terisolasi pada musim hujan kemungkinan berbeda dengan bakteri yang terisolasi pada musim kemarau. Selain itu, metode yang digunakan untuk identifikasi bakteri pada penelitian sebelumnya ialah dengan mengarakterisasi ciri-ciri morfologi dan fisiologisnya, sedangkan metode yang digunakan pada penelitian ini ialah dengan menganalisis sekuen gen 16S rRNA. Menurut McInerney et al. (2001) penggunaan identifikasi molekular memberikan hasil yang lebih jelas untuk studi klasifikasi prokariot. Keberadaan mikroorganisme lipolitik telah dilaporkan menaikkan kadar asam lemak bebas pada buah kelapa sawit (Abbas et al. 2002). Buah kelapa sawit mempunyai potensi sebagai habitat bakteri lipolitik. Hal ini diduga karena minyak yang terkandung pada buah tersebut dapat menginduksi lipase ekstraselular pada bakteri lipolitik. Menurut Sharma et al. (2001) minyak merupakan penginduksi yang baik untuk enzim lipase. Lipase ekstraselular yang dilepas dari sel bakteri lipolitik ke lingkungan dapat menghidrolisis molekul triasilgliserol menjadi asam lemak dan gliserol yang berguna untuk nutrisi bakteri. Asam lemak dapat dimetabolime oleh bakteri melalui siklus beta oksidasi menjadi asetil Koenzim A, kemudian masuk ke siklus tricarboxylic acid (TCA). Gliserol dapat dimetabolisme menjadi dihidroksi aseton fosfat yang kemudian masuk ke tahap glikolisis (Pelczar & Chan 1986). Sisi aktif enzim lipase diselubungi oleh polipeptida heliks yang akan membuka jika lipase berinteraksi dengan lipid. Hal ini disebut juga interfacial activation. Selama reaksi, terjadi pembentukan senyawa tetrahedral intermediate asil-enzim. Reaksi hidrolisis ikatan ester dimediasi oleh air. Molekul air akan berperan sebagai nukleofil yang menyerang senyawa asil-enzim. Sedangkan pada kondisi air yang terbatas,
7
gugs asil akan ditransfer ke nukleofil lain seperti gliserol atau ester sehingga terjadi pertukaran gugus asil (Jaeger et al. 1994; Hariyadi 1995 di dalam Adiandri 2001). Penapisan pada media Rhodamin B hanya menunjukkan aktivitas lipase secara kualitatif. Untuk mengetahui aktivitasnya secara kuantitatif, maka dilakukan uji aktivitas lipase secara biokimia. Aktivitas lipase diukur berdasarkan metode kolorimetri (Kwon & Rhee 1986). Asam lemak bebas hasil hidrolisis lipase selama masa inkubasi akan bereaksi dengan reagen cupric-acetate pyridine membentuk sabun tembaga yang akan diukur nilai absorbansinya. Nilai ini akan disetarakan dengan kurva standar asam palmitat. Penggunaan asam palmitat disebabkan komposisi asam lemak paling terbanyak pada minyak sawit ialah palmitat diikuti oleat (Pahan 2008). Penambahan phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF) pada enzim ekstraselular bertujuan menghambat protease yang akan merusak enzim. Pereira-Meirelles et al. (1997) melaporkan aktivitas maksimum lipase dapat dicapai dengan menambahkan PMSF pada media kuktur. PMSF merupakan inhibitor protease serin dan lipase pada umumnya. Penghambatan lipase oleh PMSF berkaitan dengan sisi katalitik lipase yang sama dengan sisi katalitik protease serin, yaitu serin, histidin, dan asam aspartat (Jaeger et al. 1994). Namun, penambahan PMSF pada lipase ekstraselular bakteri fruktosfer kelapa sawit mengakibatkan kenaikan aktivitas enzim lipase (data tidak ditampilkan). Hal ini mungkin bisa diakibatkan residu serin tidak berperan penting pada sisi aktif lipase isolat bakteri fruktosfer kelapa sawit. Uji aktivitas lipase ini menggunakan S. epidermidis sebagai referensi. Produksi lipase oleh S. epidermidis telah dilaporkan oleh Farrell et al. (1993) dan Simons et al. (1998). Esakkiraj et al. (2010) melaporkan enzim lipase bakteri ini mempunyai aktivitas optimum pada suhu 50 oC dan pH 7.0. Suhu dan pH optimum tersebut sesuai dengan suhu dan pH enzim lipase S. epidermidis yang diukur pada penelitian ini. Bakteri referensi, S. epidermidis memiliki aktivitas lipase terbesar (0.117 U/ml) kemudian diikuti oleh tiga isolat yaitu F6 (0.100 U/ml), EP2.22 (0.084 U/ml), dan F2 (0.044 U/ml). Aktivitas spesifik enzim tertinggi dimiliki oleh isolat EP2.22 (0.912 U/mg), F2 (0.792 U/mg), dan F6 (0.659 U/mg) yang lebih tinggi dibandingkan bakteri referensi (0.452 U/mg). Oleh karena itu,
ketiga isolat bakteri fruktosfer tersebut dipilih untuk tahap selanjutnya yaitu penentuan pH dan optimum enzim serta identifikasi strain bakteri. Kerja enzim ditentukan oleh beberapa faktor, antara lain pH dan suhu. Reaksi enzim dengan substrat akan terus meningkat seiring dengan meningkatnya suhu hingga pada suhu optimum. Setelah pada suhu optimum, enzim akan mengalami penurunan aktivitas karena terjadi denaturasi protein. Hal ini akan membuat enzim menjadi rusak atau kehilangan sifat alaminya (Bettelheim et al. 2007). Aktivitas enzim meningkat pada pH optimum. pH optimum enzim dipengaruhi oleh sekurangnya dua hal, yaitu gugus ion pada sisi katalitik enzim dan muatan pada struktur protein (Bisswanger 2008). Aktivitas enzim meningkat pada pH optimum disebabkan perubahan gugus ionik enzim pada sisi aktif, sehingga konformasi sisi aktif lebih efektif dalam mengikat dan mengubah substrat menjadi produk. Enzim merupakan molekul yang mengandung sejumlah besar gugus asam dan basa. Muatan pada gugus tersebut akan bervariasi tergantung pada konstanta disosiasi asam gugus tersebut terhadap pH lingkungan. Hal ini akan berpengaruh pada muatan total enzim dan gugus katalitik sehingga perubahan pH akan mempegaruhi aktivitas, stabilitas struktur, dan kelarutan enzim (Chaplin & Bucke 1990). Berdasarkan pH optimum, lipase isolat EP2.22 dapat digolongkan sebagai lipase netral, sedangkan lipase F2 dan F6 dapat digolongkan sebagai lipase alkalin. Dua puncak aktivitas yang tinggi lipase isolat EP2.22 dan F6 pada penentuan suhu optimum (Gambar 6) disebabkan enzim yang dipakai merupakan enzim ekstrak kasar dan belum dipurifikasi. Oleh karena itu, diduga kedua isolat menghasilkan lebih dari satu jenis enzim lipase dengan suhu optimum yang berbeda. Lipase yang memiliki aktivitas tinggi pada 70 oC merupakan lipase termofil, yaitu pada lipase isolat EP2.22, F2, dan F6. Hal ini unik karena ketiga lipase tersebut diekstrasi dari bakteri mesofil yang berhabitat pada fruktosfer kelapa sawit. Lipase termofil lain yang berhasil diekstraksi dari bakteri mesofil juga telah dilaporkan Sulong et al. (2006) pada Bacillus sphaericus. Analisis gen 16S rRNA mengidentifikasikan EP2.22, F2, dan F6 berkolerasi erat dengan Staphylococcus klosii, Enterobacter sp., F6 sebagai Buttiauxella izardii. Buttiauxella izardiii merupakan salah satu
8
spesies dari genus baru pada famili Enterobacteriaceae yang diisolasi dari moluska (Muller et al. 1996). Bakteri ini dikeetahui dapat mereduksi logam berat (Sharma & Fulekar 2009). Kemampuan mereduksi logam dan lipolitik membuatnya berpotensi sebagai bioremediator lingkungan tercemar. Genus Enterobacter dan Staphylococcus telah diketahui sebagai bakteri lipolitik (Zhang & Guan 2009; Rosenstein & Götz 2000). Sampai saat ini, belum ada publikasi ilmiah yang melaporkan tentang keberadaan Buttiauxella izardii sebagai bakteri lipolitik, sehingga penelitian ini yang pertama kali melaporkan adanya aktivitas lipolitik pada Buttiauxella izardii.
SIMPULAN Sebanyak tujuh isolat bakteri lipolitik berhasil diisolasi dari fruktosfer kelapa sawit berdasarkan zona pendaran jingga yang kuat pada media penapisan. Isolat EP2.22, F2, dan F6 merupakan isolat terpilih yang memiliki aktivitas terbaik. Isolat-isolat tersebut mempunyai aktivitas yang tinggi pada rentang pH dan suhu yang bervariasi. Analisis gen 16S rRNA mengidentifikasikan EP2.22, F2, dan F6 berkolerasi erat dengan Staphylococcus klosii, Enterobacter sp., dan Buttiauxella izardii.
DAFTAR PUSTAKA Abbbas H, Hiol A, Deyris V, Comeau L. 2002. Isolation and characterization of an extracellular lipase from Mucor sp. strain isolated from palm fruit. Enzyme Microb Tech 31:968-975. Adiandri. 2002. Eksplorasi dan isolasi kapang penghasil enzim lipase dengan aktivitas esterifikasi dari berbagai bahan pangan [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Bettelheim FA, Brown WH. Campbell MK. 2007. Introduction to General Organic and Biochemistry 8th ed. USA: Thompson Brooks/Cole. Bisswanger H. 2008. Enzyme Kinetic: Principles and Methods. Weinheim: Wiley-VCH. Bewley JD, Black M, Halmer P. 2006. The Encyclopedia of Seeds: Science, Technology and Uses. UK: CAB International. Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal Biochem 71:248-254.
Chaplin MF, Bucke C. 1990. Enzyme Technology. Cambridge. Cambridge Univ. Pr. Djafar F, Purwadari T, Sinurat AP. 2010. Isolation of endophytic bacteria from palm oil fruits and characterization of their lipases. Microbiol Indones: 4:69-74. Ebongue GFN, Dhouib R, Carriere F, Zollo PHM, Arondel V. 2006. Assaying lipase activity from oil palm fruit (Elaeis guineensis Jacq.) mesocarp. Plant Physiol Bioch 44:616-617. Esakkiraj P, Rajkumarbharathi M, Palavesam A, Immanuel G. 2010. Lipase production by Staphylococcus epidermidis CMST-Pi 1 isolated from the gut of shrimp Penaeus indicus. Ann of Microb 60:37-42. [FAO] Food and Agriculture Organization. 2010. Top Production Palm Oil 2008. [terhubung berkala]. http://faostat.fao. org/site/339/default.aspx. [6 Jun 2010]. Farrell AM, Foster TJ, Holland KT. 1993. Molecular analysis and expression of the lipase of Staphylococcus epidermidis. J Gen Microbiol 139:267–77. Frothingham R, Allen RL, Wilson KH. 1991. Rapid 16S ribosomal DNA sequencing from a single colony without DNA extraction or purification. Biotechniques 11:40-44. Hadioetomo RS. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta: Gramedia. Handayani R, Sulistyo J. 2005. Transesterifikasi ester asam lemak melalui pemanfaatan teknologi lipase. Biodiversitas 6:164167. Hasan F, Shah AA, Hameed A. 2006. Industrial application of microbial lipases [review]. Enzyme Microb Technol 39:235251. Hiol A, Jonzo MD, Druet D, Comeau LC. 1999. Production, purification and characterization of an extracellular lipase from Mucor hiemalis f. hiemalis. Enzyme Microb Techn 25:80-7. Hiol A, Jonzo MD, Rugani N, Druet D, Sarda L, Comeau L. 2000. Purification and characterization of an extracellular lipase from a thermophilic Rhizopus oryzae strain isolated from palm fruit. Enzyme Microb Technol 26:421-30. Hou CT, Johnston TM. 1992. Screening of lipase activities with cultures from the agricultural research service culture collection. J Am Oil Chem Soc 69:10881097. Jaeger KE, Eggert T. 2002. Lipases for biotechnology [review]. Curr Opin Biotech 14:390–397.
9
Jaeger KE, Djikstra BW, Reetz MT. 1994. Bacterial biocatalysts: molecular biology, three-dimensional structures, and biotechnological applications of lipase [review]. Annu Rev Microbiol 53:315-351. Kouker G, Jaeger KE. 1987. Specific and sensitive plate assay for bacterial lipases. Appl Environ Microbiol 53:211-213. Kwon YD, Rhee JS. 1986. A simple and rapid calorimetric method for determination of free fatty acid for lipase assay. J Am Oil Chem Soc 63:89-92. Marchesi JR et al. 1998. Design and evaluation of useful bacterium specific PCR primer that amplify genes coding for bacterial 16S-rRNA. Appl Environ Microbiol 64:795-799. McInerney JO, Mullarkey M, Wernecke ME, Powell R. 2001. Bacteria and archea: molecular techniques reveal astonishing diversity. Biodiversity 3:3-10. Muller HF, Brenner DJ, Fanning GR, Grimont PAD, Kampfer P. 1996. Emended description of Buttiamella agrestis with recognition of six new species of Buttiamella and two new species of Kluyvera: Buttiamella ferragutiae sp. nov., Buttiamella gaviniae sp. nov., Buttiamella brennerae sp. nov., Buttiamella izardii sp. nov., Buttiamella noackiae sp. nov., Buttiamella warmboldiae sp. nov., Kluyvera cochleae sp. nov., and Kluyvera georgiana sp. nov. Int J Syst Bacteriol 46:50-63. Pereira-Meirelles FV, Rocha-Leão MH, Sant Anna GL Jr. 1997. A stable lipase from Candida lipolytica. Appl Biochem Biotech. 63:73-85. Pahan I. 2008. Panduan Lengkap Kelapa Sawit: Manajemen Agribisnis dari Hulu ke Hilir. Jakarta: Penebar Swadaya. Pandiangan P. 2008. Studi proses interesterifikasi enzimatik (EIE) campuran minyak sawit dan minyak kelapa untuk produksi bahan baku margarin bebas asam lemak trans [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Pelczar MJ Jr, Chan ECS. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Volume ke-1. Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL,
penerjemah; Jakarta: UI Pr. Terjemahan dari Elements of Microbiology. Poku K. 2002. Small-Scale Palm Oil Processing in Africa. Rome: FAO. Rahman RNZRA, Leow TC, Salleh AB, Basri M. 2007. Geobacillus zalihae sp. nov., a thermophilic lipolytic bacterium isolated from palm oil mill effluent in Malaysia. BMC Microbiol 7:77-86. Rosenstein R, Götz F. 2000. Staphylococcal lipases: Biochemical and molecular charac-terization. Biochimie 82:10051014. Rost TL, Barbour MG, Stocking CR, Murphy TM. 2006. Plant Biology 2nd ed. USA: Thompson Brooks/Cole. Rupilius W, Ahmad S. 2006. The changing world of oleochemicals. Palm Oil Developments 44:15-28. Saxena RK, Ghosh PK, Gupta R, Davidson WS, Bradoo S, Gulati R. 1999. Microbial Lipases: Potential biocatalysts for the future industry [review]. Current Sci 77:101-115. Sharma R, Chisti Y, Banerjee UC. 2001. Production, purification, and applications of lipases [review]. Biotechnol Adv 19:627-662. Sharma J, Fulekar MH. 2009. Phylo-genetic analysis of the potential micro-organism for remediation of heavy metals from the contaminated environment. IJBB 3:19-30. Simons JW, van Kampen MD, Riel S, Gotz F, Egmond MR, Verhey HM. 1998. Cloning, purification and characterization of the lipase from Staphylococcus epidermidis comparison of the substrate selectivity with those of other microbial lipases. Eur J Biochem 253:675-83. Sulong MR, Abd. Rahman RN, Salleh AB, Basri M. 2006. A novel organic solvent tolerant lipase from Bacillus sphaericus 205y: Extracellular expression of a novel OST-lipase gene. Protein Expres Purif 49:190-195. Tjitrosoepomo G. 1985. Morfologi Tumbuhan. Yogyakarta. Gajah Mada Univ Pr. Zhang ZQ, Guan CY. 2009. Screening for lipase-producing Enterobacter agglomerans for biodiesel catalyzation. J Biotechnol 8:1273–1279.
10
LAMPIRAN
11
Lampiran 1 Hasil penapisan bakteri lipolitik pada fruktosfer kelapa sawit Isolat F1 F2 F4 F6 EP2.22 EPN2 FFB1
Asal Eksokarp dan mesokarp Eksokarp dan mesokarp Eksokarp dan mesokarp Eksokarp dan mesokarp Eksokarp Eksokarp dan mesokarp Eksokarp
Lampiran 2 Karakterisasi morfologi isolat dan pewarnaan Gram bakteri lipolitik asal fruktosfer kelapa sawit Isolat
Makroskopis Diameter (cm)
Elevasi
Margin
Bentuk
Bentuk sel
Pewarnaan Gram
kuning merah muda merah muda merah muda merah muda
0.1
datar
keriting
bundar
kokus
positif
0.5
cembung
licin
bundar
batang
negatif
1
licin
bundar
batang
positif
licin
bundar
batang
negatif
1
datar seperti tombol seperti tombol
licin
bundar
batang
positif
kuning merah muda
0.1
cembung
berombak
bundar
kokus
positif
0.5
timbul
licin
bundar
batang
positif
Warna F1 F2 F4 F6 EPN2 EP2.22 FFB1
0.1
Lampiran 3 Bagan alir pembuatan reagen cupric-acetate pyridine 5 gram cupric-acetate
Larutkan dengan 100 ml akuades hingga homogen
Sesuaikan pH larutan dengan pyridine hingga mencapai pH 6
12
Lampiran 4 Kurva standar asam palmitat absorbansi (715 nm)
0.6 y = 0.137x + 0.029 R² = 0.990
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0
1
2
3
4
konsentrasi lemak bebas (µmol/ml)
Lampiran 5 Data standar asam palmitat Volume asam palmitat 1% (ml)
Volume Isooktan (ml)
Konsentrasi asam lemak bebas µmol/ml
Absorbansi 715 nm
0.001
3.999
0.01
0.004
0.010
3.990
0.08
0.035
0.050
3.950
0.39
0.084
0.100
3.900
0.78
0.127
0.150
3.850
1.17
0.198
0.200
3.800
1.56
0.223
0.250
3.750
1.95
0.330
0.300
3.700
2.34
0.369
0.350
3.650
2.73
0.394
0.400
3.600
3.12
0.448
0.450
3.550
3.51
0.504
Konsentrasi lemak bebas dihitung dengan rumus: Konsentrasi asam lemak bebas (μmol/ml) =
V asam palmitat × [asam palmitat] × 1000 volume total
Keterangan: V asam palmitat = Volume asam palmitat yang digunakan (ml) Volume total = volume total asam palmitat, isooktan, dan cupric-acetate pyridine (5 ml) [asam palmitat] = Molaritas asam palmitat dengan konsentrasi 1% (b/v) dan berat molekul 256. 43, yaitu sebesar 0.039 M 1000 = konversi M ke mM Aktivitas lipase dihitung dengan rumus: Aktivitas lipase (Unit/ml) = Keterangan: X T
X T
= konsentrasi asam lemak bebas (µmol/ml) yang perhitungannya diperoleh dari persamaan linear standar asam palmitat y = 0.137x + 0.029 = waktu inkubasi (30 menit)
13
Lampiran 6 Kurva standar kadar protein absorbansi (595 nm)
2.000 1.500
y = 0.007x + 0.130 R² = 0.981
1.000 0.500 0.000 0
50
100
150
200
250
konsentrasi protein (µg/mL)
Lampiran 7 Data standar kadar protein [BSA] µg/mL
Volume BSA (µl)
Bufer fosfat (µl) Absorbansi 595 nm
5
2.5
997.5
0.063
10
5
995
0.139
25
12.5
987.5
0.387
50
25
975
0.641
75
37.5
962.5
0.789
100
50
950
0.875
125
62.5
937.5
1.082
150
75
925
1.375
175
87.5
912.5
1.506
200
100
900
1.631
Aktivitas spesifik lipase dihitung dengan rumus: Aktivitas spesiϐik lipase (Unit/mg) = Keterangan: X T
X T
= aktivitas lipase (U/ml) = kadar protein (ml/mg) yang perhitungannya diperoleh dari persamaan linear astandar kadar protein y = 0.007x + 0.130 dikali dengan faktor pengenceran
14
Lampiran 8 Pengukuran aktivitas enzim, kadar protein, dan aktivitas spesifik enzim lipase ekstrak kasar bakteri lipolik asal frukosfer kelapa sawit dan S. epidermidis.
Isolat
Aktivitas Enzim (Unit/ml)
Kadar Protein (µg/mL)
Aktivitas Spesifik Enzim (Unit/mg)
F1
0.023
61.57
0.374
F2
0.044
55.57
0.792
F4
0.017
312.86
0.054
F6
0.100
151.79
0.659
FFB1
0.011
87.00
0.126
EPN2
0.013
206.86
0.063
EP2.22
0.084
92.14
0.912
S9
0.117
258.57
0.452
Lampiran 9 Pengukuran suhu optimum enzim Isolat
Suhu
Aktivitas Lipase (U/ml) Ulangan 1
EP2.22
F2
F6
S9
Ulangan 2
Rata-rata
Standar
Aktivitas
Deviasi
relatif (%)
30
0.063
0.065
0.064
0.002
88
40
0.075
0.071
0.073
0.003
100
50
0.043
0.053
0.048
0.007
65
60
0.052
0.052
0.052
0.000
70
70
0.060
0.064
0.062
0.002
85
80
0.028
0.034
0.031
0.004
42
30
0.088
0.074
0.081
0.010
71
40
0.088
0.089
0.088
0.001
78
50
0.097
0.091
0.094
0.004
83
60
0.109
0.107
0.108
0.001
95
70
0.113
0.114
0.113
0.001
100
80
0.105
0.077
0.091
0.019
80
30
0.084
0.079
0.082
0.003
90
40
0.074
0.070
0.072
0.003
79
50
0.064
0.066
0.065
0.001
72
60
0.081
0.079
0.080
0.001
88
70
0.087
0.095
0.091
0.005
100
80
0.079
0.084
0.082
0.004
90
30
0.085
0.064
0.074
0.014
42
40
0.165
0.149
0.157
0.012
89
50
0.185
0.168
0.176
0.013
100
60
0.160
0.146
0.153
0.010
87
70
0.103
0.109
0.106
0.004
60
80
0.067
0.057
0.062
0.007
35
15
Lampiran 10 Pengukuran pH optimum enzim Isolat
pH
Aktivitas Lipase (U/ml) Ulangan 1
EP2.22
F2
F6
S9
Ulangan 2
Rata-rata
Standar
Aktivitas
Deviasi
relatif (%)
5
0.036
0.047
0.041
0.008
61
5.5
0.034
0.048
0.041
0.010
60
6
0.041
0.053
0.047
0.008
69
6.5
0.043
0.061
0.052
0.013
76
7
0.047
0.067
0.057
0.014
84
7.5
0.062
0.074
0.068
0.009
100
8
0.033
0.062
0.048
0.021
70
8.5
0.031
0.050
0.041
0.014
60
9
0.038
0.046
0.042
0.006
62
5.0
0.016
0.024
0.020
0.006
34
5.5
0.021
0.024
0.023
0.002
39
6.0
0.024
0.023
0.024
0.001
41
6.5
0.025
0.025
0.025
0.000
43
7.0
0.029
0.024
0.026
0.003
45
7.5
0.023
0.034
0.028
0.008
48
8.0
0.033
0.038
0.035
0.004
60
8.5
0.051
0.065
0.058
0.010
100
9.0
0.036
0.037
0.037
0.001
63
5
0.016
0.005
0.011
0.008
21
5.5
0.024
0.005
0.014
0.013
28
6
0.047
0.024
0.035
0.016
69
6.5
0.046
0.020
0.033
0.018
64
7
0.044
0.019
0.031
0.018
62
7.5
0.043
0.040
0.041
0.002
81
8
0.054
0.035
0.044
0.014
87
8.5
0.060
0.041
0.051
0.013
100
9
0.059
0.027
0.032
0.022
84
5.0
0.022
0.048
0.035
0.019
25
5.5
0.023
0.050
0.037
0.019
26
6.0
0.061
0.098
0.079
0.026
57
6.5
0.073
0.110
0.091
0.026
66
7.0
0.109
0.169
0.139
0.042
100
7.5
0.083
0.121
0.102
0.027
73
8.0
0.023
0.075
0.049
0.037
35
8.5
0.039
0.072
0.056
0.024
40
9.0
0.036
0.062
0.049
0.019
35
16
Lampiran 11 Protokol Qiaquick® PCR Purification Kit menggunakan microcentrifuge 5x volume PCR larutan PB Taruh di kolom Sentrifus 13000, 1 menit Buang supernatan Ditambah 750 µl larutan PE Sentrifus 13000, 1 menit, 2x Taruh di tabung baru, diamkan 10-15 detik Ditambah 20 µl larutan EP Diamkan 10-15 detik Sentrifus 13000 rpm, 1 menit Simpan supernatan
Lampiran 12 Protokol Big Dye® X-Terminator Purification Kit Hasil cycle sequencing Ditambah 18 µl SAM solution Ditambah 4 µl x-terminator solution Vorteks 30 menit Sentrifus 1000 rpm (microcentrifuge), 2 menit 15 µl supernatan di loading ke plate sequencer Run
